Sonda de β-galactosidasa asociada a senescencia fluorescente de color rojo lejano para la identificación y el enriquecimiento de células tumorales senescentes mediante citometría de flujo

Summary

Se presenta un protocolo para la cuantificación citométrica de flujo fluorescente de células cancerosas senescentes inducidas por fármacos de quimioterapia en cultivo celular o en modelos tumorales murinos. Los procedimientos opcionales incluyen la co-inmunotinción, la fijación de muestras para facilitar el análisis de lotes grandes o puntos de tiempo, y el enriquecimiento de células senescentes viables mediante clasificación citométrica de flujo.

Abstract

La senescencia celular es un estado de detención proliferativa inducido por daño biológico que normalmente se acumula durante años en las células envejecidas, pero también puede emerger rápidamente en las células tumorales como respuesta al daño inducido por diversos tratamientos contra el cáncer. La senescencia de las células tumorales generalmente se considera indeseable, ya que las células senescentes se vuelven resistentes a la muerte y bloquean la remisión tumoral al tiempo que exacerban la malignidad tumoral y la resistencia al tratamiento. Por lo tanto, la identificación de células tumorales senescentes es de interés continuo para la comunidad de investigación del cáncer. Existen varios ensayos de senescencia, muchos basados en la actividad del conocido marcador de senescencia, beta-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-Gal).

Típicamente, el ensayo SA-β-Gal se realiza utilizando un sustrato cromogénico (X-Gal) en células fijas, con la enumeración lenta y subjetiva de células senescentes "azules" por microscopía óptica. Los ensayos mejorados que utilizan sustratos SA-β-Gal fluorescentes permeantes a las células, incluidos C_12-FDG (verde) y DDAO-Galactósido (DDAOG; rojo lejano), han permitido el análisis de células vivas y han permitido el uso de plataformas de análisis fluorescentes de alto rendimiento, incluidos citómetros de flujo. C_12-FDG es una sonda bien documentada para SA-β-Gal, pero su emisión fluorescente verde se superpone con la autofluorescencia celular intrínseca (FA) que surge durante la senescencia debido a la acumulación de agregados de lipofuscina. Al utilizar la sonda SA-β-Gal DDAOG de color rojo lejano, la autofluorescencia celular verde se puede usar como parámetro secundario para confirmar la senescencia, agregando confiabilidad al ensayo. Los canales de fluorescencia restantes se pueden utilizar para la tinción de viabilidad celular o el inmunomarcaje fluorescente opcional.

Usando citometría de flujo, demostramos el uso de DDAOG y autofluorescencia de lipofuscina como un ensayo de doble parámetro para la identificación de células tumorales senescentes. Se realiza la cuantificación del porcentaje de células senescentes viables. Si se desea, se puede incluir un paso opcional de inmunomarcaje para evaluar los antígenos de la superficie celular de interés. Las células senescentes identificadas también se pueden clasificar citométricamente y recolectar para el análisis posterior. Las células senescentes recolectadas pueden ser inmediatamente lisadas (por ejemplo, para inmunoensayos o análisis ómico) o cultivadas adicionalmente.

Introduction

Las células senescentes normalmente se acumulan en los organismos durante años durante el envejecimiento biológico normal, pero también pueden desarrollarse rápidamente en las células tumorales como respuesta al daño inducido por diversos tratamientos contra el cáncer, incluida la radiación y la quimioterapia. Aunque ya no proliferan, las células tumorales senescentes inducidas por el tratamiento (TIS) pueden contribuir a la resistencia al tratamiento y conducir a la recurrencia ^1,2,3. Los factores secretados por las células TIS pueden exacerbar la malignidad tumoral al promover la evasión inmune o la metástasis ^4,5. Las células TIS desarrollan fenotipos complejos y específicos del contexto, perfiles metabólicos alterados y respuestas inmunes únicas ^6,7,8. Por lo tanto, la identificación y caracterización de las células tumorales TIS inducidas por diversos enfoques de tratamiento del cáncer es un tema de interés continuo para la comunidad de investigación del cáncer.

Para detectar células tumorales TIS, los ensayos convencionales de senescencia son ampliamente utilizados, basados principalmente en la detección de una mayor actividad de la enzima marcador de senescencia, la beta-galactosidasa lisosomal GLB1⁹. La detección a un pH lisosomal casi neutro (en lugar de ácido) permite la detección específica de beta-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-Gal)¹⁰. Un ensayo estándar de SA-β-Gal que se ha utilizado durante varias décadas utiliza X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido), un sustrato de beta-galactosidasa cromogénica azul, para detectar SA-β-Gal en células fijas por microscopía óptica¹¹. El ensayo X-Gal permite la confirmación visual cualitativa de TIS utilizando reactivos y equipos de laboratorio comúnmente disponibles. Un microscopio básico de luz transmitida es la única instrumentación necesaria para evaluar la presencia del cromógeno azul. Sin embargo, el procedimiento de tinción X-Gal puede carecer de sensibilidad, a veces requiere más de 24 h para que se desarrolle el color. La tinción es seguida por una puntuación subjetiva de bajo rendimiento de las células senescentes individuales basada en el recuento de las células que exhiben algún nivel de intensidad del cromógeno azul bajo un microscopio óptico. Como X-Gal es impermeable a las células, este ensayo requiere células fijas con disolvente, que no se pueden recuperar para el análisis posterior. Cuando se trabaja con muestras limitadas de animales o pacientes, esto puede ser un gran inconveniente.

Ensayos mejorados de SA-β-Gal utilizando sustratos enzimáticos fluorescentes permeantes a las células, incluyendo C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside, verde) y DDAOG (9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl) β-D-Galactopyranoside, far-red) han aparecido previamente en la literatura^12,13,14,15. La estructura de la sonda química y las características ópticas de DDAOG se muestran en la figura suplementaria S1. Estas sondas permisas de células permiten el análisis de células vivas (en lugar de fijas), y las sondas fluorescentes en lugar de cromogénicas facilitan el uso de plataformas de análisis fluorescentes rápidas de alto rendimiento, incluidos instrumentos de detección de alto contenido y citómetros de flujo. Los citómetros de flujo de clasificación permiten la recuperación de poblaciones enriquecidas de células senescentes vivas de cultivos celulares o tumores para el análisis posterior (por ejemplo, western blotting, ELISA o 'ómicas). El análisis de fluorescencia también proporciona una señal cuantitativa, lo que permite una determinación más precisa del porcentaje de células senescentes dentro de una muestra dada. Se pueden agregar fácilmente sondas fluorescentes adicionales, incluidas sondas de viabilidad y anticuerpos marcados con fluoróforos, para el análisis multiplexado de objetivos más allá de SA-β-Gal.

Similar a DDAOG, C_12-FDG es una sonda fluorescente para SA-β-Gal, pero su emisión fluorescente verde se superpone con AF celular intrínseca, que surge durante la senescencia debido a la acumulación de agregados de lipofuscina en las células¹⁶. Al utilizar la sonda DDAOG de color rojo lejano, el AF celular verde se puede usar como parámetro secundario para confirmar la senescencia¹⁷. Esto mejora la fiabilidad del ensayo mediante el uso de un segundo marcador además de SA-β-Gal, que a menudo puede ser poco fiable como marcador único para la senescencia¹⁸. Como la detección de FA endógena en células senescentes es un enfoque sin etiquetas, es una forma rápida y sencilla de ampliar la especificidad de nuestro ensayo basado en DDAOG.

En este protocolo, demostramos el uso de DDAOG y FA como un ensayo rápido de citometría de flujo de doble parámetro para la identificación de células tumorales TIS viables de cultivos in vitro o aisladas de tumores tratados con fármacos establecidos en ratones (Figura 1). El protocolo utiliza fluoróforos compatibles con una amplia gama de analizadores y clasificadores de citometría de flujo comerciales estándar (Tabla 1). Se habilita la cuantificación del porcentaje de células senescentes viables mediante el análisis de citometría de flujo estándar. Si se desea, se puede realizar un paso opcional de inmunomarcaje para evaluar los antígenos de la superficie celular de interés simultáneamente con la senescencia. Las células senescentes identificadas también pueden enriquecerse utilizando la metodología estándar de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Figura 1: Flujo de trabajo experimental. Un esquema que resume los puntos clave del ensayo DDAOG. (A) Se agrega un fármaco inductor de SIS a las células cultivadas en mamíferos o se administra a ratones portadores de tumores. Luego se permite tiempo para el inicio de TIS: para las células, 4 días después del tratamiento; para ratones, 22 días en total, con tres tratamientos cada 5 días más 7 días de recuperación. Las células se cosechan o los tumores se disocian en suspensión. (B) Las muestras se tratan con Baf para ajustar el pH lisosomal para la detección de SA-β-Gal durante 30 minutos; luego, se agrega una sonda DDAOG durante 60 minutos para detectar SA-β-Gal. Las muestras se lavan 2 veces en PBS, y se agrega brevemente una tinción de viabilidad (15 min). Opcionalmente, las muestras pueden teñirse con anticuerpos fluorescentes en canales de fluorescencia abiertos y/o fijarse para su posterior análisis. (C) Las muestras se analizan utilizando un citómetro de flujo estándar. Las células viables se visualizan en diagramas de puntos que muestran DDAOG rojo (que indica SA-β-Gal) versus autofluorescencia verde (lipofuscina). Se establece una puerta para determinar el porcentaje de células TIS en función de las muestras de control no tratadas (no mostradas). Si se utiliza un citómetro de clasificación (FACS), las células TIS se pueden recolectar y volver a colocar en cultivo para ensayos in vitro adicionales o lisarse y procesarse para ensayos de biología molecular. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; TIS = senescencia inducida por terapia; FL-Ab = anticuerpo conjugado con fluoróforos; Baf = Bafilomicina A1; SA-β-Gal = beta-galactosidasa asociada a senescencia; PBS = solución salina tamponada con fosfato; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fluoróforo	Detecta	Ex/Em (nm)	Citómetro láser (nm)	Detector de citómetro / filtro de paso de banda (nm)
DDAOG	SA-β-Gal	645/6601	640	670 / 30
AF	Lipofuscina	< 600	488	525 / 50
CV450	Viabilidad	408/450	405	450 / 50
PEI	Marcador de anticuerpos/superficie	565/578	561	582 / 15

Tabla 1: Especificaciones ópticas de fluoróforos y citómetros. Las especificaciones del citómetro utilizadas en este protocolo se enumeran para un instrumento con un total de 4 láseres y 15 detectores de emisión. DDAOG detectado a 645/660 nm es la forma de la sonda escindida por SA-β-Gal¹. Uncleaved DDAOG puede exhibir fluorescencia de bajo nivel a 460/610 nm, pero se elimina mediante pasos de lavado en el protocolo. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; FA = autofluorescencia; PE = ficoeritrina; SA-β-Gal = beta-galactosidasa asociada a senescencia.

Protocol

Todo el trabajo con animales descrito fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago.

1. Preparación y almacenamiento de soluciones madre

NOTA: Si las células se clasifican por flujo, todas las soluciones deben prepararse utilizando técnicas estériles y filtrarse a través de un dispositivo de filtro de 0,22 μm.

1. Preparar una solución madre de DDAO-galactósido a 5 mg/ml en DMSO. Alícuota a 50 μL por tubo (o volumen deseado). Conservar a -20 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 año.
2. Preparar una solución madre de bafilomicina A1 a 1 mM en DMSO. Alícuota a 50 μL por tubo (o volumen deseado). Conservar a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
3. Preparar una solución madre de Calcein Violet 450 AM a 1 mM en DMSO. Alícuota a 50 μL por tubo (o volumen deseado). Conservar a -20 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 año.
4. Para el tratamiento de células cultivadas in vitro, preparar soluciones madre concentradas de 10 mM de agentes inductores de senescencia en el disolvente apropiado y esterilizar utilizando filtros de jeringa de 0,2 μm. Conservar a -20 °C o según las indicaciones del fabricante.
   NOTA: Para la administración de agentes de quimioterapia inductores de senescencia in vivo (a ratones con tumores establecidos), los agentes deben ser de grado USP y diluidos en solución salina de stock concentrado justo antes de la inyección.
5. Preparar el medio de cultivo completo para la(s) línea(s) celular(es) utilizada(s).
   NOTA: Por ejemplo, prepare el medio para las células B16-F10 o A549 con DMEM 1x + 10% FBS + 1x sustituto de glutamina + 1x penicilina/estreptomicina. Los medios deben mantenerse estériles. Se pueden utilizar otras formulaciones de medios específicos de líneas celulares. Ciertos componentes como el glutatión pueden, en algunos casos, interferir con el inicio de la senescencia. Se deben realizar pruebas empíricas de diversas formulaciones de medios si el inicio de la senescencia es menor de lo esperado o no se observa con los agentes de quimioterapia de control.
6. Prepare los tampones de tinción y lave.
   1. Prepare albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en 1x PBS para su uso en procedimientos de tinción. Disuelva 2 g de BSA en 200 ml de PBS y revuelva durante 10 minutos, o hasta que se disuelva completamente, a temperatura ambiente.
   2. Prepare BSA al 0,5% en 1x PBS como tampón de lavado. Diluir 100 ml del BSA al 1% preparado en el paso 1.6.1 en 100 ml de 1x PBS para BSA al 0,5%.
   3. Conservar los tampones a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
7. Preparar paraformaldehído al 4% en 1x PBS. Use ampollas de paraformaldehído selladas disponibles comercialmente (por ejemplo, 16% v/v) para mayor comodidad y estabilidad: 2.5 ml de PFA al 16% + 7.5 ml de 1x PBS (= 10 ml de PFA al 4%). Ajuste el volumen preparado en función del volumen total necesario para cada experimento.
   NOTA: Prepárese según sea necesario para la fijación celular solamente; Prepárelo fresco cada vez.
8. Preparar tampón de clasificación FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7.2). Filtro estéril a través de un dispositivo de filtración de 0,22 μm y conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   NOTA: Prepárese según sea necesario para la clasificación FACS solamente. Las formulaciones tampón de clasificación por flujo pueden variar entre los instrumentos FACS. La formulación anterior es compatible con el instrumento utilizado en este estudio (ver Tabla de Materiales). Consulte las directrices del fabricante.
9. Preparar solución de disociación tumoral: 20 μg/mL Liberase TL + 100 μg/mL DNAsa I en medios RPMI-1640 (sin FBS u otros suplementos). Las soluciones madre son útiles para tener a mano de Liberase TL (preparada y almacenada según las indicaciones del fabricante) y DNAsa I (100 mg/ml en agua de doble destilación [_ddH2O], almacenada a -20 °C).
   NOTA: Prepárese según sea necesario si usa tumores solamente; Prepárelo fresco cada vez.

2. Inducción de senescencia por fármacos quimioterapéuticos en células cancerosas cultivadas

NOTA: Todos los pasos de manipulación celular en esta sección deben realizarse en un gabinete de bioseguridad utilizando prácticas estériles. Esta sección está escrita para tipos de células adherentes. Las células de suspensión se pueden usar con las modificaciones apropiadas como se indica.

1. Cultive la(s) línea(s) celular(es) de cáncer de acuerdo con el protocolo estándar del proveedor o del laboratorio que proporcionó la(s) línea(s) celular(es) específica(s) utilizada(s).
   NOTA: Las células de paso bajo (p < 10) son generalmente preferidas ya que habrá niveles más bajos de senescencia replicativa, es decir, fondo más bajo, en muestras de células no tratadas.
2. Un día antes de la inducción de la senescencia por medicamentos, recolectar células con tripsina-EDTA al 0,25% (o como se recomienda). Neutralizar la tripsina añadiendo un volumen igual de medio de cultivo completo, y transferir la suspensión celular a un tubo cónico estéril.
   NOTA: Este paso no es necesario para las celdas de suspensión.
3. Contar las células utilizando el método estándar del hemacitómetro y registrar células/ml. Células en placa a 1 × 10 3-10 × 10³ células/^cm2 en placas de cultivo plástico estándar de 6 pocillos.
   NOTA: La densidad óptima de recubrimiento depende de la tasa de proliferación de las células y debe ser determinada por el usuario. Las células deben estar en fase logarítmica de crecimiento a aproximadamente 10% -20% de confluencia en el momento del tratamiento (es decir, después de 18-24 h de incubación después del recubrimiento). La densidad inicial (células/ml) de las células de suspensión debe ser determinada por el usuario. Las placas de seis pocillos generalmente producen suficientes células senescentes por pocillo para una muestra de análisis de citometría de flujo estándar. Si se clasifica el flujo, se debe utilizar un área de superficie mucho mayor (por ejemplo, múltiples placas P150) para permitir la recuperación de un número suficiente de células senescentes para ensayos posteriores (≥1 × 10⁶).
4. Incubar las células plateadas durante la noche (18-24 h) en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2 y una bandeja de humedad.
5. Tratar las células plateadas con medicamentos de quimioterapia inductores de senescencia. Incluya al menos un control positivo, por ejemplo, etopósido (ETO) o bleomicina (BLM). Prepare pocillos duplicados por medicamento. Incluya un conjunto tratado con vehículo solo como control.
   NOTA: El usuario debe probar una curva de dosis para cada agente experimental para determinar la concentración óptima para la inducción de senescencia en la(s) línea(s) celular(es) utilizada(s).
6. Incubar las células durante 4 días en una incubadora a 37 °C con 5% de_CO2 y una bandeja de humedad para permitir el inicio de la senescencia. Examine diariamente los cambios morfológicos esperados con un microscopio óptico.
   NOTA: Los tiempos de incubación de 3-5 días pueden ser aceptables dependiendo de la tasa de inicio de la senescencia. Los medios pueden cambiarse y el agente se puede volver a aplicar (o no), según se desee, para promover condiciones de crecimiento saludables mientras se logra un porcentaje aceptable de células senescentes.
7. Después del inicio de la senescencia, cosechar las células añadiendo tripsina-EDTA 0,25% durante 5 min a 37 °C. Cuando las células se disocian en suspensión, neutralizar la tripsina con un volumen igual de medio completo.
   NOTA: Este paso no es necesario para las células que crecen en suspensión. Si se va a realizar una tinción de marcadores de superficie, evite el uso de tripsina-EDTA, ya que puede destruir temporalmente los antígenos de superficie en las células. En su lugar, disocie suavemente la monocapa utilizando un raspador celular de plástico estéril (o un reactivo de disociación alternativo diseñado para preservar los antígenos de superficie).
8. Cuente las células en cada muestra usando un hemacitómetro. Calcule las células/ml para cada muestra.
   NOTA: Se puede agregar azul de tripano para evaluar el porcentaje de células muertas en este punto (es decir, debido al tratamiento farmacológico), pero la muerte celular también se determinará con un tinte de viabilidad fluorescente durante el flujo de trabajo de tinción DDAOG.
9. Alícuota ≥0,5 × 10⁶ células por muestra en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml.
   NOTA: El número de celdas por muestra debe estandarizarse en todas las muestras.
10. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 × g en una microcentrífuga a 4 °C. Retire el sobrenadante.
    NOTA: Si una microcentrífuga refrigerada no está disponible, puede ser aceptable realizar centrifugaciones a temperatura ambiente para ciertos tipos de células resistentes.
11. Proceda a la tinción DDAOG en la sección 4.

3. Inducción de senescencia por fármacos quimioterapéuticos en tumores establecidos en ratones

NOTA: Si las células tumorales se clasificarán con FACS, asegure la esterilidad en cada paso trabajando en un gabinete de bioseguridad y trabajando con instrumentos, procedimientos y reactivos estériles.

1. Crear modelos de tumores de ratón inyectando células cancerosas por vía subcutánea, de acuerdo con métodos estándar (por ejemplo, Appelbe et ^al.19).
   NOTA: El número de células cancerosas que se inyectarán, el sitio de inyección y la cepa de ratón apropiada deben optimizarse para cada protocolo. Aquí, las células B16-F10 se inyectaron por vía subcutánea a 1 × 10⁶ células en 0,1 ml de solución salina (1 × 10⁷ células/ml).
   1. Verifique que la viabilidad de las células que utilizan azul de tripano es del >90% antes de realizar las inyecciones. Anestesiar a los ratones con isoflurano.
   2. Anestesiar ratones hembra C57/BL6 de 6-7 semanas de edad con una mezcla de isoflurano al 3% y aire y mantener en estas condiciones en una cámara de inducción colocada dentro de un gabinete estéril de bioseguridad. Confirme la anestesia pellizcando suavemente el pie del ratón. Aplique ungüento veterinario estéril en ambos ojos para evitar el secado de la córnea durante el procedimiento. Durante el procedimiento, mantenga la temperatura corporal del ratón con una lámpara de calefacción.
   3. Trabajando dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, retire el ratón de la cámara de inducción y colóquelo en contacto con un cono nasal que proporciona un suministro de isoflurano al 3%. Afeite el área del flanco en el lugar de la inyección con una máquina de afeitar eléctrica limpia. Mezclar brevemente la suspensión celular preparada invirtiendo manualmente el tubo justo antes de la inyección, e inyectar la suspensión celular por vía subcutánea en los flancos afeitados utilizando una jeringa estéril de 0,5 ml equipada con una aguja estéril de 27 G. Retire el ratón de la capucha y transfiéralo a la jaula de recuperación.
   4. En la jaula de recuperación, monitoree los signos vitales de los ratones continuamente hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal, demostrar el reflejo de enderezamiento y puedan moverse con seguridad en la jaula. No deje ratones desatendidos ni devuelva a los animales que se hayan sometido a la inoculación de células tumorales a la compañía de otros animales hasta que se recuperen por completo. Monitoree todos los ratones inoculados diariamente para detectar pérdida de peso, actividad / movilidad reducida y síntomas neurológicos; Eutanasia ratones que exhiben síntomas severos en cualquier categoría. Para los ratones que presentan síntomas de dolor después de la inoculación, administrar buprenorfina (0,1-0,2 mg / kg) una vez por vía subcutánea.
      NOTA: Los ratones que presentan dolor persistente después de la buprenorfina deben ser sacrificados.
2. Comenzando 5-7 días después de la inoculación de células cancerosas, mida el crecimiento tumoral con calibradores cada 2-3 días. Iniciar el tratamiento prosenescente cuando el tumor haya alcanzado 50 mm 3 ± 10 mm³ de volumen.
   NOTA: En este trabajo, se administraron dosis de clorhidrato de doxorrubicina grado USP (DOX) o doxorrubicina liposomal pegilada (DLP) a 10 mg/kg en inyección de cloruro de sodio al 0,9% (USP). Los fármacos se inyectaron por vía intraperitoneal 3x, una vez cada 5 días, comenzando cuando los tumores alcanzaron 50 mm 3 ± 10 mm³. Los ratones se recuperaron durante 7 días después del tratamiento final para permitir la aparición de TIS en tumores. Se deben optimizar las dosis de inducción de la senescencia y las condiciones para otros tratamientos y/o modelos tumorales.
3. A los 7 días después del tratamiento farmacológico final, sacrifique a los ratones por sobredosis de_CO2 y dislocación cervical u otros métodos aprobados de acuerdo con las pautas de trabajo con animales de laboratorio. Extirpar los tumores y recogerlos en tubos estériles o placas de 6 pocillos llenas con medio de crecimiento RPMI estéril (para preservar la viabilidad durante el procesamiento).
   NOTA: Si se realiza un examen histológico (p. ej., X-Gal o inmunohistoquímica), los tumores se pueden dividir aquí, con la mitad congelada a presión en un medio de incorporación de TCO y crioseccionada utilizando procedimientos estándar para la histología del tejido congelado. La mitad tumoral restante debe producir abundante material para la disociación y la tinción DDAOG.
4. Transfiera un tumor a un plato de plástico P100 que contenga 5 ml de medio RPMI. Picar el tumor en pedazos con un bisturí.
5. Transfiera 5 ml de la suspensión de piezas tumorales que contienen células suspendidas y desechos a un tubo cónico de 15 ml. Utilice la punta más ancha de una pipeta serológica de 25 ml para transferir esta suspensión si hay residuos grandes. Enjuague el plato con un volumen adicional de RPMI estéril para recoger materiales. Tapa y coloca el tubo cónico sobre hielo.
6. Repita los pasos 3.45-3.5 para los tumores restantes. Use una placa y un bisturí separados para cada tumor para evitar la contaminación cruzada, o enjuague bien con PBS entre los tumores. Use 5 ml de medio fresco para picar cada tumor.
7. Preparar la solución de disociación tumoral: 20 μg/mL Liberase TL + 100 μg/mL DNAsa I en medios RPMI-1640 (sin FBS).
   NOTA: Existen muchas formulaciones efectivas para soluciones de disociación tumoral y pueden incluir una variedad de enzimas y otros componentes de diferentes fabricantes. Las concentraciones óptimas de componentes pueden variar mucho entre los tipos de tumores. Si los glóbulos rojos están muy presentes en el tumor, se puede realizar adicionalmente la lisis de glóbulos rojos; Si las células muertas son un problema, se puede usar un kit de eliminación de células muertas. Se recomienda encarecidamente que el usuario determine de forma independiente las condiciones óptimas de disociación tumoral que proporcionan una alta viabilidad y baja presencia de células contaminantes, material conectivo y desechos.
8. Centrifugar todas las muestras tumorales en tubos cónicos durante 5 min a 1.000 × g (4 °C). Retire el sobrenadante.
9. Agregue 1-5 ml de solución de disociación tumoral a cada muestra tumoral, dependiendo del volumen de material tumoral. Asegúrese de que haya 1-2 ml en exceso de la cápsula de material tumoral en el tubo. Vórtice a una velocidad moderada para mezclar.
10. Colocar las muestras en una incubadora a 37 °C con rotación rápida durante 45 min. Vórtice brevemente cada 15 min.
11. Filtrar cada muestra a través de un filtro celular de 100 μm en un tubo cónico de 50 ml. Si las muestras son demasiado viscosas para pasar a través del filtro, agregue 10 ml de medio RPMI-1640 para diluir. Enjuague los filtros con medio RPMI para recoger las células residuales.
12. Use un hemacitómetro para contar las células/ml para cada muestra.
13. Alícuota dos o más réplicas de 5 × 10⁶ células por muestra tumoral.
14. Centrifugar durante 5 min a 1.000 × g (4 °C). Retire el sobrenadante.
15. (Opcional) Criopreservar las muestras tumorales para la tinción posterior de DDAOG si se desea.
    1. Resuspender el pellet de células tumorales disociadas en medio de criopreservación: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, preparado en condiciones estériles a 5 × 10⁶ células/mL.
    2. Alícuota 1 ml de suspensión celular en cada criovial.
    3. Congelar los crioviales durante 24 h en un recipiente de congelación de células isopropanol a −80 °C; Luego, transfiera al crioalmacenamiento de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo (> 1 semana).
    4. Cuando se desee la tinción, descongelar los crioviales en hielo y proceder a la tinción DDAOG en la sección 4.
       NOTA: Algunos tumores pueden no permanecer viables a través de la criopreservación, y la resistencia a este proceso debe ser evaluada por el usuario para el modelo tumoral de interés.
16. Continúe con la sección 4 para la tinción DDAOG.

4. Tinción DDAOG de SA-β-Gal en muestras celulares o tumorales

1. Diluir 1 mM de bafilomicina A1 a 1:1.000x en medio DMEM (sin FBS) para una concentración final de 1 μM.
2. Añadir la solución preparada de Baf-DMEM a las muestras de pellets celulares (a partir de la etapa 2.11 o la etapa 3.16) para una concentración de 1 × 10⁶ células/ml.
   NOTA: Por ejemplo, si utiliza 0,5 × 10⁶ células por muestra, añadir 0,5 ml de Baf-DMEM. Para los tumores, se pueden teñir 5 × 10⁶ células en 5 ml de Baf-DMEM.
3. Incubar durante 30 min a 37 °C (sin_CO2) en un rotador/agitador ajustado a velocidad lenta.
   NOTA: Evite las incubadoras de_CO2 para el proceso de tinción, que pueden acidificar las soluciones y, por lo tanto, interferir con la tinción de Baf y DDAOG.
4. Sin lavar, añadir la solución madre DDAOG (5 mg/ml) a 1:500x (10 μg/ml final) a cada muestra. Pipeta para mezclar. Sustituir en un rotador/agitador a 37 °C (sin_CO2) durante 60 min. Proteger de la luz directa.
5. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante.
6. Lavar con 1 ml de BSA al 0,5% helado por tubo y pipeta para mezclar. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces para lavar bien las células. Retire el sobrenadante y continúe.
   NOTA: Es importante realizar los pasos de lavado en el paso 4.6 para eliminar el DDAOG uncleaved, que puede presentar una emisión de fluorescencia no deseada (460/610 nm).
   NOTA: Si se trata de inmunotinción para marcadores de superficie celular, continúe con la sección 5 a continuación.
7. (Opcional) Fijación y almacenamiento de células teñidas con DDAOG para su posterior análisis
   1. Agregue 0,5 ml de paraformaldehído helado al 4% gota a gota a cada muestra lavada. Pipeta para mezclar.
   2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
   3. Lave las células 2 veces con 1 ml de PBS.
   4. Conservar las muestras durante un máximo de 1 semana a 4 °C antes del análisis por citometría de flujo.
      NOTA: Para muestras fijas, omita el paso 4.8.
8. Diluir Calcein Violet 450 AM stock (1 mM) a 1:1.000x en 1% BSA-PBS (1 μM final). Añadir 300 μL (para muestras de células cultivadas) o 1.000 μL (para muestras de tumores) a los gránulos de células lavadas del paso 4.6. Incubar durante 15 minutos en hielo en la oscuridad.
9. Proceda a la configuración de la citometría de flujo (sección 6).

5. (Opcional) Inmunotinción para marcadores de superficie celular en combinación con DDAOG

NOTA: Al igual que con cualquier experimento de citometría de flujo, las muestras de control de una sola tinción con DDAOG solo y solo anticuerpos fluorescentes deben prepararse para determinar la diafonía (si la hay) a través de los canales de fluorescencia. Si se observa diafonía, se debe realizar una compensación de citometría de flujo estándar²⁰.

1. Resuspender los pellets celulares obtenidos en el paso 4.6 en 100 μL de tampón de tinción (1% BSA en 1x PBS).
2. Agregue el reactivo bloqueador del receptor Fc apropiado para la especie celular (ratón o humano) en la valoración recomendada por el fabricante. Incubar durante 10 min a 24 °C.
3. Agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos en la titulación recomendada por el fabricante (o determinada por el usuario). Incubar durante 20 minutos sobre hielo, protegido de la luz.
4. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante.
5. Lavar con 1 ml de tampón de lavado helado (0,5% BSA-PBS) por tubo y pipeta para mezclar. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 × g a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces para lavar bien las células.
6. Diluir 1 mM Calcein Violet 450 AM a 1:1,000x en 1% BSA-PBS. Añadir 300 μL a los gránulos de células lavadas a partir del paso 5.5. Incubar durante 15 minutos en hielo en la oscuridad.
7. Proceder al análisis de citometría de flujo (secciones 6-7).

6. Configuración del citómetro de flujo y adquisición de datos

1. Transfiera las muestras celulares a tubos compatibles con el instrumento de citometría de flujo. Coloque los tubos sobre hielo y manténgalos protegidos de la luz.
   NOTA: Si se observan agregados en las suspensiones celulares, pase la suspensión a través de filtros celulares de 70-100 μm antes del análisis. No utilice filtros de 40 μm porque pueden excluir algunas de las células senescentes más grandes.
2. En el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales), abra los siguientes gráficos: 1) gráfico de puntos FSC-A vs SSC-A, 2) histograma de canal violeta, 3) canal rojo lejano (por ejemplo, APC-A) versus canal verde (por ejemplo, FITC-A).
   NOTA: También se pueden utilizar gráficos de exclusión de dobletes e histogramas de un solo canal, pero no son estrictamente necesarios.
3. Iniciar la adquisición de datos del citómetro.
   1. Coloque la muestra de control solo para vehículos teñida con DDAOG en el puerto de admisión. A una velocidad de ingesta baja, comience a adquirir datos de muestra.
   2. Ajuste los voltajes FSC y SSC para que el >90% de los eventos estén contenidos dentro de la gráfica. Si las celdas no encajan bien en la gráfica, reduzca la configuración de escala de área a 0,33-0,5 unidades.
   3. Retire la muestra solo del vehículo sin registrar datos.
   4. (Opcional) Agregue una gota de microesferas de calibración arco iris a un tubo citómetro con 1 ml de PBS. Coloque el tubo en el puerto de admisión del citómetro. Comience a adquirir datos de muestra.
   5. Ajuste los voltajes de canal violeta, verde y rojo lejano para que el pico superior de la microesfera del arco iris esté en el rango de 10^{4-10 5} unidades de fluorescencia relativa en cada canal y todos los picos estén bien separados en cada canal. Récord de 10.000 eventos. Retire el tubo.
4. Coloque la muestra de control positivo (por ejemplo, BLM, ETO) teñida con DDAOG en el puerto de admisión. A baja velocidad, adquiera datos de muestra. Observe los eventos en los canales FSC, SSC, violeta, verde y rojo lejano para asegurarse de que más del 90% de los eventos estén contenidos dentro de todas las tramas. Busque un aumento en la señal AF y DDAOG en comparación con el control solo del vehículo.
5. Si utiliza un citómetro de clasificación, inicie la clasificación en este paso.
   1. Para fines de mantenimiento de registros, registre 10,000 celdas para la muestra de control y cada muestra clasificada.
   2. Clasificar la cantidad deseada de células (≥1 × 10⁶ es típicamente adecuado) en un tubo de recolección apropiado para el instrumento con 3-5 ml de medio de cultivo.
   3. Después de la clasificación, proceda a la cultura o análisis posterior.
   4. Vaya a la sección 7 para el análisis rutinario de muestras clasificadas.
6. Si utiliza anticuerpos fluorescentes, optimice los voltajes del canal aquí utilizando las muestras sin teñir, de una sola tinción y de doble tinción preparadas en la sección 5.
   NOTA: Para el citómetro de flujo calibrado utilizado en este documento, los voltajes óptimos del canal generalmente cayeron entre 250 y 600 (rango medio), pero los voltajes óptimos y los rangos de voltaje del canal variarán entre los instrumentos. Evite usar voltajes en rangos muy bajos o altos, que pueden suprimir la señal o amplificar el ruido.
7. Después de completar los pasos 6.1-6.5 y hacer ajustes a la configuración del citómetro según sea necesario, registre los datos de todas las muestras. Asegúrese de que la configuración permanezca uniforme para todas las grabaciones de muestra. Registrar ≥10,000 eventos por muestra de células cultivadas o ≥100,000 eventos por muestra de células tumorales.
   NOTA: Aunque la compuerta y el análisis se pueden realizar utilizando software de adquisición de datos (por ejemplo, FACSDiva), en la sección 7 a continuación se describe un flujo de trabajo completo de acceso y análisis que se llevará a cabo después de la adquisición utilizando un software de análisis separado (FlowJo). Se prefiere el análisis posterior a la adquisición para reducir el tiempo en la estación de trabajo del citómetro y aprovechar las herramientas adicionales incluidas en el software de análisis dedicado.
8. Guarde los datos de ejemplo en formato de archivo .fcs. Exporte los archivos a una computadora de estación de trabajo equipada con software de análisis de citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo). Continúe con la sección 7.

7. Análisis de datos de citometría de flujo

NOTA: El flujo de trabajo presentado utiliza el software FlowJo. Se puede utilizar un software alternativo de análisis de datos de citometría de flujo si se siguen de manera similar los pasos clave descritos en esta sección.

1. Con el software FlowJo, abra los archivos de datos .fcs del paso 6.7.
2. Abra la ventana de diseño.
3. Arrastre y suelte todas las muestras en la ventana de diseño.
4. Celdas viables de puerta.
   1. En primer lugar, haga doble clic en los datos de ejemplo para el control solo del vehículo para abrir su ventana de datos.
   2. Visualice los datos como un histograma de canal violeta. Identificar las células viables teñidas por CV450 en función de su fluorescencia más brillante que las células muertas.
   3. Dibuje una puerta con la herramienta de histograma de puerta única para incluir solo celdas viables. Asigne a la puerta un nombre viable.
   4. A continuación, desde la ventana de diseño de muestra, arrastre la puerta viable a las otras muestras de celda para aplicar la puerta de manera uniforme.
   5. En la ventana de diseño, visualice todas las muestras como histogramas de canal violeta (viabilidad). Verifique que la activación celular viable sea apropiada en todas las muestras antes de continuar; Si no es así, haga los ajustes necesarios.
      NOTA: La tinción de viabilidad puede presentar variaciones entre tratamientos o tumores.
5. Puerta de células senescentes.
   1. Haga doble clic en los datos de celda viable cerrada para el control solo del vehículo para abrir su ventana de datos.
   2. Visualice los datos como un diagrama de puntos para el canal rojo lejano (DDAOG) frente al canal verde (AF).
   3. Dibuje una puerta con la herramienta de activación rectangular para incluir el <5% de las celdas que son DDAOG+ y AF⁺ (cuadrante superior derecho). Nombra la puerta senescente.
   4. A continuación, desde la ventana de diseño de muestra, arrastre la puerta senescente a los subconjuntos viables de las otras muestras de celda para aplicar la puerta de manera uniforme.
   5. En la ventana de diseño, arrastre y suelte todos los subconjuntos de celdas viables cerrados en la sección 7.4. Visualice todas las muestras viables como diagramas de puntos de color rojo lejano (por ejemplo, APC-A) versus canal verde (por ejemplo, FITC-A).
   6. Asegúrese de que la puerta senescente dibujada en el paso 7.5.3 sea visible en todas las parcelas y que la puerta para el control solo del vehículo exhiba ≤5%-10% de celdas senescentes.
6. Una vez que se haya determinado el porcentaje de células senescentes siguiendo los pasos anteriores, presente los datos resultantes utilizando los gráficos FlowJo, resumidos en una tabla de datos y/o analizados estadísticamente utilizando software estándar.

Representative Results

Se realizaron varios experimentos para demostrar la comparabilidad de DDAOG con X-Gal y C_12-FDG para la detección de senescencia por SA-β-Gal. Primero, X-Gal se usó para teñir células de melanoma senescentes B16-F10 inducidas por ETO (Figura 2A). Un color azul intenso se desarrolló en un subconjunto de células tratadas con ETO, mientras que otras células exhibieron tinción azul menos intensa. La morfología se amplió en la mayoría de las células tratadas con ETO. La tinción de células tratadas con ETO con sustrato fluorescente SA-β-Gal C_12-FDG (verde) o DDAOG (rojo lejano) demostró patrones de tinción y variaciones de intensidad comparables a X-Gal (Figura 2B). Sin embargo, la emisión verde de C_12-FDG se superpuso con la FA celular (Figura 2C), que se sabe que se acumula en las células senescentes¹⁷. Por el contrario, la FA fue insignificante en el rango de emisión de color rojo lejano de DDAOG.

En lugar de usar un microscopio de fluorescencia para marcar y contar las células senescentes, era más conveniente aprovechar las capacidades de alto rendimiento de un citómetro de flujo para adquirir datos de miles de células por muestra en poco tiempo (<5 minutos por muestra). En primer lugar, se implementaron una serie de parámetros estándar de configuración de citometría de flujo para garantizar una adquisición óptima de datos (Figura 3). Siguiendo un enfoque típico, se establecieron parámetros de dispersión de luz para visualizar el volumen (dispersión directa, FSC) y la granularidad (dispersión lateral, SSC) de las celdas (Figura 3A). Aquí, observamos la tendencia al aumento del volumen de células tratadas con ETO, que concordaba con la morfología agrandada típicamente observada para las células senescentes utilizando microscopía. Fue necesaria una reducción en la configuración de escala de área predeterminada (a 0.33-0.50 unidades dependiendo del tipo de celda y el tratamiento) para visualizar más de las celdas más grandes en la gráfica. Para algunas líneas celulares/tratamientos, el aumento de la granularidad (SSC) también fue evidente (datos no mostrados). En general, la evaluación de dispersión se utilizó como un paso de control de calidad para verificar que los datos de dispersión celular aparecieran como se esperaba, que no hubiera restos celulares excesivos y que las células se procesaran a través del citómetro a velocidades de flujo apropiadas (~ 100-1000 células / s). Como paso de control de calidad utilizado solo para la configuración del instrumento, aquí no se realizó ninguna puerta o análisis.

Un segundo paso (opcional) en la configuración de la citometría de flujo fue analizar brevemente una muestra de partículas de calibración "arco iris" disponibles comercialmente para garantizar que los voltajes de detección fluorescentes se establecieran en rangos aceptables (Figura 3B). El pico más brillante se estableció entre 1 × 10⁴ unidades y 1 × 10⁵ unidades de intensidad fluorescente relativa en cada canal, con picos de menor intensidad claramente definidos, suficiente separación entre cada pico y sin superposición de picos vecinos. Se registró una muestra de control de 10.000 microesferas utilizando estos ajustes de voltaje. Las microesferas se utilizaron de esta manera en cada sesión de citometría para mejorar la uniformidad de la adquisición de datos en el transcurso del protocolo.

A continuación, se visualizaron muestras de células solo para vehículos o tratadas con ETO en cada canal fluorescente, y se establecieron puertas. Las puertas de viabilidad celular se establecieron en función de la señal de tinción de viabilidad CV450 en el canal violeta (Figura 3C). Las células tratadas solo con vehículo mostraron una viabilidad del 88%, y las células tratadas con ETO exhibieron una viabilidad del 75% (en la muestra celular final; es probable que las células muertas adicionales se eliminaran inicialmente en medios de cultivo desechados y se desintegraran mecánicamente durante el proceso de tinción). A continuación, se visualizaron celdas cerradas viables en los canales de emisión verde (Figura 3D) y rojo lejano (Figura 3E). Las puertas para AF^HI verde y DDAOG^HI rojo lejano se establecieron en el <5% de las celdas solo para vehículos, y estas puertas se aplicaron a las células tratadas con ETO. Utilizando este enfoque, se determinó que el 46% de las células tratadas con ETO eran FA HI y el 33% eran^{DDAOG HI;} Estos valores estaban en el rango esperado basado en la literatura y en los resultados de numerosos experimentos replicados en nuestro laboratorio. Una vez que se completó la configuración del citómetro, todas las muestras celulares en el experimento se ejecutaron utilizando configuraciones de adquisición de datos idénticas. Se obtuvieron datos para 10.000 eventos por muestra.

Los datos representativos del ensayo se muestran en la Figura 4. Se utilizaron células de melanoma murino B16-F10 o células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 como modelos de línea celular de cáncer. Cada línea celular se trató con un agente quimioterapéutico conocido por inducir senescencia (ETO o BLM) durante 4 días para inducir senescencia o solo vehículo. Además, el conocido agente senolítico ABT-263²¹ se agregó a las células senescentes inducidas durante 2 días para demostrar la especificidad de la sonda DDAOG. Solo se prepararon muestras ABT-263 como controles adicionales. Aquí, los datos se visualizan como diagramas de puntos 2D con DDAOG (emisión de 670 nm) frente a AF (525 nm). El flujo de trabajo de la Figura 3 se utilizó para la configuración del citómetro, y se estableció una puerta TIS de tal manera que el <5% de las células solo del vehículo calificaron como TIS. Los resultados utilizando células B16-F10 (Figura 4A) mostraron que ETO indujo TIS en el 35% de las células B16-F10 viables (similar a los datos comparables mostrados en la Figura 2D, E) y el agente senolítico eliminó casi por completo las células TIS (<2%). En las células A549 (Figura 4B), BLM indujo TIS en el 66% de las células viables, y ABT-263 redujo el porcentaje al 15%. ABT-263 por sí solo no fue tóxico para las células no tratadas que proliferan.

Además, nuestro objetivo fue demostrar que la tinción conjunta de anticuerpos fluorescentes fue compatible con el ensayo de senescencia DDAOG para facilitar el cribado de marcadores de superficie nuevos o asociados al TIS. Aquí, las células de melanoma de ratón B16-F10 se trataron nuevamente con ETO inductor de TIS (o vehículo) durante 4 días. Luego, las células se tiñeron con DDAOG para evaluar TIS y con un anticuerpo fluorescente para detectar el marcador de superficie asociado a TIS DPP4²² (Figura 5). Se utilizó anti-DPP4 conjugado con R-ficoeritrina (PE) y se confirmó una superposición insignificante de PE con DDAOG y FA en el citómetro de flujo utilizado (Figura suplementaria S2). Un histograma de datos del canal PE (Figura 5A) para >5,000 células viables mostró que el 42% de las células tratadas con ETO eran DPP4 ⁺ (utilizando la muestra solo del vehículo para establecer la puerta de positividad). La visualización de diagramas de puntos 2D para las mismas muestras (Figura 5B, C) indicó que el 44% de las células tratadas con ETO fueron doblemente positivas para DDAOG (es decir, senescentes) y DPP4 frente al 4% de las células solo de vehículo. Estos datos demuestran que la tinción de células vivas con anticuerpos marcadores de superficie es posible en combinación con el ensayo de senescencia DDAOG.

Las posibles preocupaciones con cualquier método de tinción de células vivas incluyen la muerte celular que ocurre durante largas sesiones de análisis (>1 h) y cómo teñir y analizar muestras de manera más eficiente en muchos puntos de tiempo diferentes (hasta días de diferencia). La fijación a base de solvente de las células teñidas aborda ambas preocupaciones, ya que las muestras pueden fijarse tan pronto como se tiñen y luego almacenarse en el refrigerador hasta el análisis en un lote estable a la temperatura. Por lo tanto, probamos si las células vivas teñidas con DDAOG podrían fijarse con metanol al 100% o paraformaldehído al 4% (PFA) y almacenarse hasta 1 semana a 4 °C. Indeseablemente, la fijación de metanol disminuyó la señal DDAOG y redujo significativamente la FA (datos no mostrados); Por lo tanto, debe evitarse el uso de metanol como disolvente de fijación. Sin embargo, la fijación con PFA fue mucho más exitosa, como se ve en la Figura 6 para las células fijadas en PFA al 4% durante 10 min después de la tinción con DDAOG. En comparación con las muestras de control no fijadas (Figura 6A; sin tratar, 5% y BLM, 67% DDAOG HI^{AF HI),} LAS MUESTRAS FIJAS (Figura 6B) mostraron un fondo ligeramente mayor en las células no tratadas (9%) y también un mayor porcentaje de células que puntuaron como senescentes en las células tratadas con BLM (80%). Este efecto también se observó en muestras fijas almacenadas durante la noche (Figura 6C; sin tratar, 12% y BLM, 72%) y almacenadas durante 1 semana a 4 °C (Figura 6D; 14% y 70%). A pesar de los ligeros aumentos en la fluorescencia causados por la fijación de PFA, la inducción de senescencia por BLM todavía era evidente en todas las muestras fijas frente a la muestra emparejada no tratada. Además, las células permanecieron intactas en el almacenamiento con solo un ligero deterioro para el día 7, y no se observó una agregación problemática. Concluimos que la conveniencia de poder fijar y almacenar muestras celulares para su posterior análisis por lotes justificará tolerar el fondo ligeramente más alto causado por la fijación de PFA, particularmente en experimentos con muchas muestras o puntos de tiempo.

Un desafío común en la investigación de la senescencia basada en células es el inicio heterogéneo de la senescencia en poblaciones celulares. Aquí, mostramos que DDAOG se puede utilizar para FACS de células senescentes viables y que las células recolectadas sobreviven en cultivo para ensayos in vitro aguas abajo (Figura 7). Para clasificar las células por FACS, las células se tratan y tiñen, como se describe, y se clasifican mediante un citómetro de flujo compatible con FACS utilizando la estrategia de activación DDAOG versus AF que se muestra aquí (Figura 7A). Como una sonda de viabilidad no se utiliza aquí debido a problemas de toxicidad a largo plazo, recomendamos realizar una activación de dispersión estricta antes de la activación final de células senescentes (Figura suplementaria S3) para eliminar los restos falsos positivos de las células recolectadas. Estos son procedimientos estándar de activación de FACS que deben ser familiares para un usuario moderadamente experimentado y pueden establecerse rápidamente utilizando software en el instrumento (< 10 min).

Después de clasificar una muestra de células A549 tratadas con BLM, devolvimos las células al cultivo en placas multipocillos estándar durante 5 días (n = 6 réplicas) a 10 × 10³ células/^cm2. Los controles no clasificados se colocaron en la misma densidad, se cultivaron junto a ellos y se incluyeron células no tratadas y tratadas con BLM. Las células se observaron diariamente; Para las células clasificadas, no se observó muerte celular significativa o retorno a la proliferación. Las células clasificadas permanecieron dispersas (es decir, no proliferaron) en el transcurso de 5 días en cultivo, mientras que las células no tratadas y tratadas con BLM se volvieron confluentes como se muestra. En el día 5, las células se fijaron en PFA y se tiñeron para la morfología y los marcadores de proliferación (Figura 7B). La morfología agrandada característica de las células clasificadas se reveló mediante la tinción fluorescente de faloidina de actina filamentosa, con tinción DAPI para mostrar núcleos agrandados. Las células clasificadas eran muy grandes en diámetro (>10 μm) con una apariencia redondeada característica. Como se esperaba, la tinción de anticuerpos Ki67 reveló una pérdida completa del marcador de proliferación en la muestra clasificada frente a una pérdida parcial en la muestra no clasificada tratada con BLM, y se observaron niveles normales de Ki67 en muchas células en la muestra no tratada y no clasificada. Se tomaron al menos tres imágenes por pocillo utilizando configuraciones de imagen uniformes en todas las muestras. Se muestran imágenes representativas (Figura 7B).

Finalmente, evaluamos si las células senescentes que surgen en tumores establecidos en ratones tratados con fármacos quimioterapéuticos podrían identificarse mediante DDAOG. Se indujeron tumores de melanoma B16-F10 en el flanco de ratones C57/BL6, que luego se trataron tres veces (i.p., cada 5 días) con solución salina sola (Figura 8A), DOX (Figura 8B) o PLD (Figura 8C). Después del tercer tratamiento, los ratones se recuperaron durante 7 días para permitir el inicio de la senescencia y luego fueron sacrificados y se extirparon tumores. Los tumores se redujeron a la mitad, con la mitad utilizada para preparar portaobjetos de tejido congelado para la tinción X-Gal (Figura 8) y la otra mitad disociada en suspensiones unicelulares y teñida con DDAOG (Figura 8 y Figura suplementaria S4). La tinción X-Gal en los tejidos fue bastante débil a pesar de una larga duración de la tinción (72 h), pero la tinción azul fue evidente en los tumores DOX y PLD tras una inspección minuciosa, particularmente en tumores que también obtuvieron resultados positivos para senescencia mediante el ensayo de flujo DDAOG (Figura 8B, C). Se tomaron al menos tres imágenes por portaobjetos de tejido y se muestran imágenes representativas.

En comparación con X-Gal, DDAOG fue una forma más sensible y precisa de cuantificar la senescencia en tumores (Figura 8). Para el análisis del tumor DDAOG, se utilizó el tumor tratado con solución salina con el fondo de fluorescencia más alto para establecer la puerta de senescencia en <5 %, de modo que los otros tumores tratados con solución salina no obtuvieron una puntuación superior al 5 % de senescencia. Esta puerta de senescencia se aplicó por lotes a células viables cerradas de todos los tumores. Ambos agentes quimioterapéuticos indujeron senescencia en algunos tumores (dos de cinco tumores para DOX, tres de cinco para DLP), con porcentajes de células tumorales senescentes que variaron de 3 a 36 % por tumor. Los gráficos de datos de citometría para los 15 tumores se muestran en la Figura Suplementaria S4, y un resumen de los datos de citometría tumoral se muestra en la Figura 8D (n = 5; (*) p < 0,05 vs. grupo control de solución salina sola por la prueba F de varianza). Se concluye que la citometría de flujo DDAOG versus FA es un método aceptable para el cribado de tumores y agentes quimioterapéuticos para la inducción de la senescencia in vivo.

Figura 2: DDAOG es una tinción sensible y específica para SA-β-Gal. (A) Tinción convencional para SA-β-Gal usando X-Gal que muestra células de melanoma murino B16-F10 no tratadas (izquierda) o tratadas con ETO (derecha). Senescencia inducida por ETO: las células exhiben morfología agrandada y tinción azul debido a la escisión de X-Gal por SA-β-Gal elevada. Barras de escala = 10 μm. (B) Tinción fluorescente para SA-β-Gal en células tratadas con ETO utilizando C_12-FDG (emisión de 515 nm, verde) o DDAOG (660 nm, rojo). La distribución de la tinción es similar para ambas sondas, lo que indica que DDAOG detecta SA-β-Gal de manera similar a C_12-FDG. (C) Evaluación de FA en células no teñidas, tratadas con ETO, ya sea en el canal de emisión verde (emisión de 525 nm, izquierda) o rojo lejano (660 nm, derecha). La FA de la lipofuscina es alta en el canal de emisión verde e insignificante en el canal rojo lejano. Tiempo de exposición = 2.000 ms para cada imagen. Barras de escala = 10 μm. Esta cifra se reimprime de Flor y Kron²³. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido; UNT = no tratada; ETO = etopósido; FA = autofluorescencia; C_12-FDG = 5-dodecanoilaminofluoresceína di-β-D-galactopiranosido; SA-β-Gal = beta-galactosidasa asociada a senescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Configuración de adquisición de datos del citómetro de flujo. (A) Distribución representativa del diagrama de dispersión de las células. FSC-A es una lectura del volumen celular, y SSC-A indica granularidad celular. Panel izquierdo, tratamiento exclusivo del vehículo de las células A549. Panel derecho, tratamiento ETO para inducir senescencia. Tenga en cuenta la tendencia hacia el volumen celular agrandado de las células tratadas con ETO, de acuerdo con la morfología ampliada evidente de la microscopía. (B) Uso opcional de microesferas de calibración fluorescentes comerciales "arco iris" de 5 picos para ajustar los voltajes del detector del citómetro. En cada canal de fluorescencia utilizado, el pico máximo debe establecerse ≤1 x 10⁵ unidades fluorescentes relativas ajustando el voltaje del detector del citómetro mientras las muestras están funcionando. Panel izquierdo, canal BV421 (violeta); centro, canal FITC (verde); derecha, canal APC (rojo). Los cinco picos fluorescentes deben exhibir un espaciado distinto como se muestra. (C-E) Datos representativos de fluorescencia de un solo canal para (C) tinción de viabilidad utilizando colorante violeta CV450; (D) autofluorescencia verde de las células; (E) señal roja lejana de DDAOG, detectando SA-β-Gal. Histograma de color más oscuro, tratamiento solo para vehículos; histograma de color más claro, tratamiento ETO. Las puertas principales se indican encima de cada parcela. Abreviaturas: FSC-A = área de pico de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; ETO = etopósido; BV421-A = área pico del canal Brilliant Violet 421; FITC-A = área pico del canal de isotiocianato de fluoresceína; APC-A = área máxima del canal de aloficocianina; FA = autofluorescencia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; VEH = vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Datos representativos para el ensayo de senescencia por citometría de flujo. (A) células de melanoma murino B16-F10 tratadas solo con vehículo (superior izquierda), ETO (arriba a la derecha), ABT-263 (1 μM) solamente, o (abajo a la derecha) ETO más ABT-263. (B) Células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 tratadas solo con vehículo (superior izquierdo), BLM (arriba a la derecha), ABT-263 (abajo a la izquierda) solamente, o (abajo a la derecha) BLM más ABT-263. (A,B) Las puertas rectangulares en los cuadrantes superiores derechos de todas las parcelas definen las celdas senescentes (DDAOG HI AF^HI). El porcentaje de células senescentes (del total de células viables por muestra) se indica en cada gráfica. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; ETO = etopósido; BLM = bleomicina; VEH = vehículo; TIS = senescencia inducida por terapia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Co-tinción de un marcador de superficie celular de ejemplo con ensayo de senescencia. (A) Inmunodetección del marcador de senescencia DPP4 en la superficie de células cultivadas viables B16-F10; naranja oscuro, solo vehículo; naranja claro, ETO. (B,C) Paneles central y derecho: celdas co-teñidas con DDAOG y anti-DPP4:PE. Las células DDAOG^HI DPP4^están contenidas dentro de las puertas rectangulares que se muestran en las gráficas, y se indica el porcentaje de células doblemente positivas por muestra. Se muestra: células cerradas viables. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; ETO = etopósido; VEH = vehículo; DPP4 = dipeptidil peptidasa 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Fijación posterior a la tinción y almacenamiento de muestras de células teñidas con DDAOG para su posterior análisis. (A) Control, muestras no fijadas de células vivas A549 no tratadas (izquierda) o tratadas con BLM (derecha) para inducir senescencia, y luego teñidas y analizadas inmediatamente utilizando el protocolo DDAOG (sin fijación, Día 0). (B) Muestras preparadas como en (A) y luego fijadas inmediatamente en paraformaldehído al 4% y analizadas (Día 0). C) Muestras preparadas como en la letra A), fijadas inmediatamente en paraformaldehído al 4 % y almacenadas durante toda la noche a 4 °C antes del análisis. (D) Muestras preparadas como en (A), fijadas inmediatamente y almacenadas durante 7 días antes del análisis. Las puertas rectangulares en los cuadrantes superiores derechos de todas las parcelas definen las celdas senescentes (DDAOG HI AF^HI). El porcentaje de células senescentes se indica en cada gráfico. Abreviaturas: TIS = senescencia inducida por terapia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; BLM = bleomicina; AF = autofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Clasificación citométrica de flujo y validación de poblaciones de células senescentes enriquecidas. (A) Datos de clasificación por citometría de flujo que muestran (izquierda) el control no tratado y teñido con DDAOG utilizado para establecer la puerta para la clasificación de células senescentes (<5% de células senescentes en la región cerrada) y (derecha) la muestra tratada con BLM y teñida con DDAOG que se clasificó utilizando la puerta de clasificación como se muestra. (B) Imágenes de microscopía de fluorescencia para células (columna izquierda) teñidas con faloidina-Alexa Fluor 647 (pseudocolor naranja) para detectar F-actina y DAPI (azul) para contrarrestar núcleos de tinción, demostrando una morfología agrandada de células senescentes, o células (columna derecha) teñidas con anticuerpo Ki67 de conejo y anticonejo Alexa Fluor 594 para detectar pérdida de proliferación en células senescentes. Fila superior, células no tratadas y sin clasificar. Fila central, células tratadas con BLM y sin clasificar. Fila inferior, células tratadas con BLM y clasificadas. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TIS = senescencia inducida por terapia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; BLM = bleomicina; UNT = no tratada; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Cuantificación de la senescencia en tumores de ratones tratados con quimioterapia. Se establecieron tumores de melanoma B16-F10 en los flancos de ratones C67BL / 6, que luego se trataron con tres dosis de (A) solución salina, (B) DOX o (C) DLP cada 5 días más 1 semana para permitir el inicio de la senescencia. Los tumores se extirparon y se redujeron a la mitad; se prepararon portaobjetos de tejido congelado de una mitad para la tinción X-Gal (fila superior), y la otra mitad se disoció para la tinción DDAOG (fila inferior). En las imágenes teñidas con X-Gal, las células azules son células senescentes SA-β-Gal ^HI , mientras que las regiones marrones se deben a la melanina en los tumores. Se muestran resultados representativos para DOX y PLD de dos tumores por grupo que presentaron senescencia. Todos los tumores salinos solo exhibieron una senescencia insignificante. (D) Cuantificación de la senescencia en tumores tratados con fármacos de ratones. (*) p < 0,05 por la prueba F de varianza, n = 5 ratones por grupo. Barras de error, media ± SEM. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; DOX = doxorrubicina; DLP = doxorrubicina liposomal pegilada; X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido; AF = autofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Estructura química de la sonda DDAOG. DDAOG es un conjugado de 7-hidroxi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona) y beta galactósido. Cuando es escindido por beta-galactosidasa, el producto de escisión hidrolizado exhibe un cambio de emisión de fluorescencia de color rojo lejano de 50 nm, lo que permite su detección específica con excitación superior a 600 nm. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Escaneo espectral de diafonía DDAOG con otros canales fluorescentes del citómetro de flujo. Para identificar los canales disponibles para la detección de anticuerpos fluorescentes, se realizó un escaneo espectral en un citómetro de flujo de 4 láseres y 15 canales utilizando células A549 tratadas con BLM y teñidas con DDAOG (rojo) o sin teñir (negro). Se adquirieron datos en cada canal del citómetro de flujo para 10.000 células. (A) Canales de emisión del láser de 405 nm: de izquierda a derecha, BV421, BV510, BV605, BV660 y BV711. La diafonía observada en los canales BV605, BV660 y BV711 los hace inadecuados para la tinción conjunta con DDAOG sin compensación. BV421 y BV510 son adecuados para la tinción conjunta (tenga en cuenta que BV421 se usa típicamente para la tinción de viabilidad). (B) Canales de emisión del láser de 488 nm: FITC y PerCP-Cy5. Se observó una diafonía alta para el canal PerCP-Cy5. FITC es adecuado para la tinción conjunta; sin embargo, tenga en cuenta que el canal FITC se utiliza normalmente en el ensayo DDAOG para la evaluación de AF de emisión verde. (C) Canales de emisión del láser de 561 nm: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 y PE-Cy7. Los canales PE y PE-Dazzle 594 son adecuados para la detección de anticuerpos marcados con estos fluoróforos (PE se demuestra para la detección de DPP4 en este estudio). (D) Canales de emisión del láser de 640 nm: APC, APC-H700 y APC-Cy7. La señal DDAOG de las células senescentes es visible en el canal APC (47,8% senescente). La señal se superpone en los canales APC-H700 y APC-Cy7, lo que los hace inadecuados para la cotinción sin una compensación espectral significativa. Abreviaturas: BLM = bleomicina; BV = violeta brillante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PerCP = proteína peridina-clorofila; PE = ficoeritrina; DZ594 = Deslumbramiento 594; APC = alofiocyanina; FA = autofluorescencia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S3: Estrategia de activación celular para la clasificación FACS de células senescentes. Pasar una suspensión de células a través de un citómetro FACS sensible puede requerir una activación adicional para garantizar la pureza de la clasificación y la funcionalidad óptima del instrumento. Aquí se muestra un ejemplo de estrategia. Otras estrategias son posibles dependiendo de las recomendaciones del fabricante para el citómetro FACS que se utiliza. Columna izquierda, control de celda tratada solo para vehículos. Columna derecha, células A549 tratadas con BLM para inducir senescencia para ser clasificadas. (A) FSC-A (volumen celular) versus SSC-A (granularidad celular) de células intactas. La compuerta intacta elimina los restos celulares de la muestra clasificada. B) Pureza FSC-A frente a FSC-H; Elimina dobletes y escombros. (C) SSC-A versus SSC-H pureza gating; Elimina dobletes y escombros. (D) Gating para la población de interés utilizando el canal APC-A (excitación de 637 nm, 670 nm ± emisión de 30 nm, utilizado para DDAOG) versus canal FITC-A (excitación de 488 nm, emisión de 530 nm ± 30 nm, utilizado para FA); elimina posibles artefactos de tinción. (E) Activación de células senescentes para la clasificación final. Abreviaturas: FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; BLM = bleomicina; FSC-A = área de pico de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FSC-H = altura del pico de dispersión hacia adelante; SSC-H = altura del pico de dispersión lateral. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S4: Tinción de flujo de citometría de senescencia DDAOG de tumores. Datos de citometría de flujo para ≥50.000 células tumorales viables. Puerta de celda senescente, cuadrante superior derecho de cada parcela. El porcentaje de células tumorales senescentes (de viables) se muestra dentro de la puerta. Los tratamientos tumorales incluyeron (A) solución salina sola; b) DOX; y (C) PLD. Los ratones fueron tratados tres veces, una vez cada 5 días, con 7 días de recuperación para permitir el inicio de la senescencia antes del sacrificio. Se analizaron cinco tumores por condición. Abreviaturas: AF = autofluorescencia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; DOX = doxorrubicina; DLP = doxorrubicina liposomal pegilada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Durante la última década más o menos, la citometría de flujo se ha convertido en una plataforma de ensayo más común en la investigación del cáncer debido a la popularidad emergente de la inmunología tumoral, el desarrollo de citómetros de flujo de menor costo y la mejora de las instalaciones de instrumentación compartidas en las instituciones académicas. Los ensayos multicolor ahora son estándar, ya que la mayoría de los instrumentos más nuevos están equipados con matrices ópticas violetas, azul-verde y rojas a rojas lejanas. Por lo tanto, es probable que este protocolo DDAOG sea compatible con una amplia gama de citómetros de flujo. Por supuesto, cualquier citómetro de flujo debe ser evaluado por el usuario. Se debe tener especial cuidado al agregar fluoróforos adicionales (por ejemplo, anticuerpos fluorescentes conjugados) al ensayo DDAOG. Se debe realizar una evaluación de la diafonía de fluoróforos entre canales utilizando controles de una sola tinción visualizados en todos los demás canales relevantes. Si se observa superposición, la compensación espectral se puede realizar²⁰ para la corrección siguiendo los métodos típicos.

Los hallazgos que se muestran en este documento están destinados principalmente a demostrar que el ensayo de citometría de flujo DDAOG puede producir resultados rápidos, cuantitativos y fáciles de interpretar para TIS inducido por medicamentos de quimioterapia en células o tumores. Se ha documentado que los agentes utilizados aquí, incluidos ETO 23,24, DOX 7,25 y BLM 26,27^, inducen TIS en varias líneas celulares de cáncer ²⁴. Para demostrar la especificidad de la sonda DDAOG, se demostró que el conocido agente senolítico ABT-263²¹ elimina selectivamente las células senescentes en cultivo. Este documento demuestra el uso de una línea celular de cáncer cultivada murina (B16-F10) y una humana (A549), así como tumores B16-F10 establecidos en ratones. Sin embargo, se puede usar cualquier célula que exprese β-Gal y conserve la viabilidad a través de una preparación de muestra de citometría de flujo estándar. Ciertos tipos de células pueden ser más frágiles o menos propensas al TIS, y esto debe evaluarse antes de embarcarse en una pantalla grande o estudio. Si las células se desintegran en la preparación, la viabilidad es deficiente o el TIS es mucho menor de lo esperado utilizando controles de agentes positivos, el tipo de célula puede no ser un modelo ideal para estudios de senescencia. Los agentes y líneas celulares que se muestran aquí pueden ser utilizados por otros grupos como controles en la detección adicional de posibles agentes inductores de TIS o nuevos senolíticos, lo que sigue siendo un objetivo activo en el campo.

La toxicidad inducida por los medicamentos de quimioterapia puede variar según los tipos de células y afectar los resultados del ensayo. Si el efecto primario observado del agente y/o concentración utilizada es la muerte celular aguda, la senescencia general puede ser mínima. In vivo, se debe evitar una necrosis tumoral alta o toxicidad sistémica en animales mediante la reducción de la dosis del agente. La clave para el éxito del ensayo es la prueba de un rango de concentraciones de agentes, con una inspección cuidadosa de los datos del ensayo de viabilidad (por ejemplo, según lo proporcionado por CV450 dentro del ensayo DDAOG). In vitro, si muchas células muertas se desprenden de la placa durante el tratamiento, incluido el medio de cultivo en la muestra analizada, es importante evaluar la muerte celular en total. CV450 no es la única mancha de viabilidad compatible con este ensayo; Se pueden usar otros fluoróforos emisores de violeta/azul. Las sondas de viabilidad reparables también se pueden usar si el usuario planea fijar las muestras teñidas con PFA, siempre que la fluorescencia de la sonda no se superponga significativamente con DDAOG o AF (o el usuario realice una compensación espectral para corregir la superposición). En algunos casos donde la toxicidad del agente es baja y las células son robustas, la activación de células intactas por dispersión de luz (FSC vs. SSC) puede ser suficiente para aislar células "viables" para el análisis.

Un paso clave en este protocolo in vitro es colocar células en placa en el rango más bajo de densidad de crecimiento logarítmico (típicamente 2 × 10 3-5 × 10³ células/cm²) para permitir una rápida proliferación inicial, lo que facilita la absorción del fármaco de quimioterapia por la mayoría de las células. Una vez tratado, también es importante dar tiempo para el inicio de TIS: in vitro, 4 días ± 1 día en presencia del medicamento; In vivo, 7 días de recuperación tras el tratamiento quimioterápico final. Después de la tinción con DDAOG como se describe, se debe realizar un análisis cuantitativo de los datos citométricos como se muestra, es decir, la activación de las células DDAOG frente a las FA en cada muestra para determinar el porcentaje de células senescentes (del total viable). Los pasos opcionales incluyen el uso de microesferas fluorescentes de calibración "arco iris" para estandarizar la citometría de flujo, la fijación de PFA de muestras teñidas, la co-inmunotinción para marcadores de superficie y la clasificación de flujo para enriquecer las células senescentes para los ensayos posteriores. Sin embargo, cada uno de estos pasos opcionales proporciona ventajas clave en ciertas aplicaciones. Las microesferas de calibración estandarizan la configuración de la citometría en múltiples sesiones y permiten al usuario establecer inicialmente voltajes en un rango útil para la detección de senescencia y viabilidad, con ajustes mínimos a partir de entonces. La fijación de muestras con PFA estabiliza las células y permite el análisis por lotes de grandes conjuntos de células en un momento posterior. La co-inmunotinción para marcadores de superficie se puede utilizar para detectar nuevas proteínas relacionadas con la senescencia e interacciones inmunes. En estudios futuros, planeamos validar la tinción conjunta de los marcadores de senescencia intracelular con DDAOG.

La clasificación de células TIS por FACS permite el enriquecimiento de células TIS viables de poblaciones heterogéneas, lo que puede confundir las lecturas para ensayos posteriores como Western blotting, proteómica o transcriptómica. Después de la clasificación, no se observó toxicidad significativa de DDAOG en células TIS colocadas de nuevo en cultivo durante un máximo de 5 días. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las células clasificadas han sido tratadas con Baf, DDAOG internalizado (que es escindido por SA-β-Gal a DDAO, un colorante de acridina), y han sido sometidas a estrés mecánico que pasa a través del instrumento FACS. Por lo tanto, ciertas alteraciones biológicas no relacionadas con la senescencia pueden estar presentes en las células clasificadas. Sin embargo, en este estudio, las células clasificadas conservaron fuertes características de senescencia y proporcionaron resultados proteómicos y transcriptómicos característicos²⁸ en comparación con los controles no clasificados. A pesar de la utilidad algo obvia de usar FACS para recolectar y analizar células senescentes de tumores, este procedimiento rara vez se ha utilizado en la literatura. Algunos grupos han utilizado p16^Ink4a luciferasa o reporteros fluorescentes para identificar células senescentes en tejidos de ratón, con reporteros fluorescentes que permiten la clasificación FACS en algunos estudios ^29,30. Los hallazgos generalmente coinciden en que, independientemente del agente de inducción o del tipo de tumor, la TIS en los tumores es una ocurrencia parcial a rara, alcanzando raramente el 100% de las células tumorales³¹. La clasificación de células FACS utilizando el método DDAOG permite fácilmente la recolección de células TIS raras de tumores, sin la necesidad de expresar construcciones transgénicas.

Actualmente, la mayor parte de la investigación de senescencia en modelos de ratón se lleva a cabo ex vivo utilizando una combinación de X-Gal y marcadores inmunohistoquímicos^32,33. Sin embargo, la evaluación de TIS ex vivo utilizando tejidos tumorales puede ser un proceso largo, particularmente cuando se usa X-Gal. Este procedimiento requiere criopreservación de tumores, criosección en portaobjetos, tinción X-Gal, montaje de vidrio de cubierta, secado, imágenes y puntuación de células "azules", un enfoque de varios días como mínimo. La inmunohistoquímica no es mucho más rápida ni más fácil, y se deben usar y calificar diferentes secciones de tejido para cada marcador más X-Gal en cada tumor, a menos que se optimice el análisis multiplexado, agregando más tiempo en el front-end del proceso. Las secciones de tejido toman muestras de solo una sección transversal delgada del tumor, mientras que las células senescentes (como muchos tipos de células) pueden distribuirse de manera desigual en el espacio 3D a lo largo de los tumores²⁹. Se necesita urgentemente en el campo alejarse de los métodos histológicos lentos y obsoletos hacia un ensayo de senescencia más rápido y fácilmente cuantificable para tumores. Usando citometría de flujo DDAOG, un conjunto de 15 tumores podría disociarse y teñirse para obtener datos concluyentes y cuantitativos de senescencia en menos de 1 día de tiempo práctico después de la recolección del tumor. Se procesó la mitad del tumor para cada muestra, mejorando el muestreo del espacio 3D por tumor. Este enfoque de citometría de flujo DDAOG es significativamente más rápido y más confiable que los métodos basados en portaobjetos de tejido para la evaluación de TIS en tumores.

Con sus muchas ventajas sobre X-Gal y otros métodos, abogamos por que el protocolo DDAOG se convierta en el nuevo ensayo de senescencia estándar de oro. Utiliza tanto el marcador de senescencia convencionalmente aceptado, SA-β-Gal, como la detección sin etiqueta de FA asociada a la edad como segundo marcador. Estos fluoróforos son compatibles con la mayoría de los citómetros de flujo estándar. El ensayo incluye una tinción de viabilidad para excluir células muertas y desechos utilizando muestras obtenidas fácilmente de líneas celulares cultivadas o tumores tratados con medicamentos. Las muestras de células vivas pueden ser opcionalmente fijadas con disolvente o criopreservadas para facilitar el análisis por lotes de estudios grandes, por ejemplo, utilizando puntos de tiempo para evaluar el inicio de TIS a lo largo del tiempo utilizando múltiples agentes. El proceso de tinción tarda menos de medio día de trabajo de laboratorio en completarse, y la adquisición de datos suele ser de <5 minutos por muestra. El análisis de datos es igualmente rápido y directo, produciendo datos cuantitativos sobre el porcentaje de células TIS por muestra sin tediosas calificaciones y conteos de células. Las muestras se pueden clasificar con FACS para recuperar poblaciones enriquecidas de células TIS, lo que reduce el ruido de la heterogeneidad celular en los análisis posteriores. Creemos que el ensayo DDAOG puede, en muchos casos, reemplazar a X-Gal, facilitando la detección de agentes inductores de TIS y senolíticos in vitro e in vivo, lo que lleva a descubrimientos más rápidos y confiables en el campo de la investigación de la senescencia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bafilomycin A1	Research Products International	B40500
Bleomycin sulfate	Cayman	13877
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate	Biolegend	137803	Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma	American Type Culture Collection	CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma	American Type Culture Collection	CRL-6475
Cell scraper	Corning	3008
Cell strainers, 100 µm	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Etoposide	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc receptor blocking reagent	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin/Streptomycin 100x	Life Technologies	15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x	Life Technologies	11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114