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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

एन फेस माउस भ्रूण में प्लानर मोर्फोजेनेसिस विश्लेषण के लिए एंडोकार्डियल कुशन तैयारी

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64207
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

शास्त्रीय रूप से, माउस भ्रूण वाल्व प्रिमोर्डियम के एंडोकार्डियम का विश्लेषण ट्रांसवर्सल, कोरोनल या धनु वर्गों का उपयोग करके किया गया है। वाल्वुलोजेनिक क्षेत्रों में एंडोकार्डियम की दो-आयामी इमेजिंग के लिए हमारा नया दृष्टिकोण वाल्व विकास के दौरान एंडोकार्डियम के प्लानर पोलैरिटी और सेल पुनर्व्यवस्था विश्लेषण की अनुमति देता है।

Abstract

स्तनधारी हृदय के विकास को अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन मानव जन्मजात हृदय रोग को संबोधित करने के लिए आवश्यक है। आदिम कार्डियक वाल्व के विकास में स्थानीय प्रेरक मायोकार्डियल और एंडोकार्डियल संकेतों के जवाब में हृदय के एट्रियोवेंट्रिकुलर नहर (एवीसी) और बहिर्वाह पथ (ओएफटी) क्षेत्रों से एंडोकार्डियल कोशिकाओं के उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) शामिल हैं। एक बार जब कोशिकाएं एंडोकार्डियम और मायोकार्डियम के बीच स्थित बाह्य मैट्रिक्स (कार्डियक जेली) पर आक्रमण करती हैं, तो आदिम एंडोकार्डियल कुशन (ईसी) का गठन होता है। इस प्रक्रिया का तात्पर्य है कि एंडोकार्डियम को डिलेमिनेटेड कोशिकाओं द्वारा छोड़े गए अंतराल को भरना पड़ता है और एक अक्ष के साथ अभिसरण (संकीर्ण) या विस्तार (लंबा) करने के लिए खुद को पुनर्गठित करना पड़ता है। वर्तमान शोध ने इस प्रक्रिया में शामिल कारकों के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को विनियमित करने में प्लानर सेल पोलैरिटी (पीसीपी) मार्ग को फंसाया है। शास्त्रीय रूप से, कार्डियक वाल्व विकास के प्रारंभिक चरणों का अध्ययन भ्रूण के दिल के क्रॉस-सेक्शन में या कोलेजन जैल पर संवर्धित विवो एवीसी या ओएफटी खोजों में किया गया है। ये दृष्टिकोण एपिको-बेसल ध्रुवीयता के विश्लेषण की अनुमति देते हैं लेकिन उपकला के तल के भीतर या माइग्रेटिंग कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों के सेल व्यवहार के विश्लेषण की अनुमति नहीं देते हैं। यहां, हम एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण दिखाते हैं जो कोशिकाओं के प्लानर क्षेत्र के रूप में वाल्वुलोजेनिक क्षेत्रों में एंडोकार्डियम के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। यह प्रयोगात्मक दृष्टिकोण वाल्व विकास के दौरान ओएफटी और एवीसी के एंडोकार्डियम के भीतर पीसीपी, प्लानर टोपोलॉजी और इंटरसेलुलर संचार का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। कार्डियक वाल्व मोर्फोजेनेसिस में शामिल नए सेलुलर तंत्र को समझना एंडोकार्डियल कुशन दोषों से जुड़े जन्मजात हृदय रोग को समझने में योगदान कर सकता है।

Introduction

हृदय एक स्तनधारी भ्रूण का पहला कार्यात्मक अंग है। चूहों में भ्रूण दिवस (ई) 7.5 के आसपास, द्विपक्षीय प्रीकार्डियक मेसोडर्म कोशिकाएं उदर पक्ष1 में कार्डियक अर्धचंद्र बनाती हैं। कार्डियक अर्धचंद्र में प्रीकार्डियक कोशिकाओं की दो आबादी होती है जिसमें मायोकार्डियम और एंडोकार्डियम2 के पूर्वज शामिल होते हैं। ई 8.0 के आसपास, कार्डियक अग्रदूत मध्य रेखा में फ्यूज होते हैं, जो आदिम हृदय ट्यूब का निर्माण करते हैं जिसमें दो उपकला ऊतक, बाहरी मायोकार्डियम और आंतरिक एंडोकार्डियम शामिल होते हैं, जो कार्डियक जेली नामक बाह्य मैट्रिक्स द्वारा अलग किया गया एक विशेष एंडोथेलियम है। बाद में, E8.5 पर, हृदय ट्यूब दाईं ओर लूपिंग से गुजरती है। लूप किए गए दिल में विशिष्ट आणविक हस्ताक्षर जैसे बहिर्वाह पथ (ओएफटी), वेंट्रिकल्स और एट्रियो-वेंट्रिकुलर नहर (एवीसी) 3 के साथ अलग-अलग शारीरिक क्षेत्र होते हैं। यद्यपि प्रारंभ में हृदय ट्यूब कोशिकाओं4 के अतिरिक्त, E9.5 पर अपने प्रवाह पक्ष पर फैलती है, गहन हृदय प्रसार के परिणामस्वरूप कक्षों का गुब्बारा बढ़ता है और ट्रिब्युलर नेटवर्क5 की स्थापना होती है। वाल्व गठन एवीसी (भविष्य के माइट्रल और ट्राइकसपिड वाल्व) और ओएफटी (भविष्य के महाधमनी और फुफ्फुसीय वाल्व) में होता है।

एंडोकार्डियम वाल्व विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंडोकार्डियल कोशिकाएं एंडोकार्डियल कुशन बनाने के लिए एवीसी और ओएफटी में उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरती हैं, एक संरचना जो वाल्व विकास की शुरुआत में दिखाई देती है। विभिन्न सिग्नलिंग मार्ग इस प्रक्रिया को सक्रिय करते हैं; चूहों में E9.5 पर, मायोकार्डियल-व्युत्पन्न BMP2 के जवाब में एंडोकार्डियम में सक्रिय नॉच TGF2 और SNAIL (SNAI1) के सक्रियण के माध्यम से AVC और OFT क्षेत्रों में एंडोकार्डियल कोशिकाओं के आक्रामक EMT को बढ़ावा देता है, जो सीधे संवहनी एंडोथेलियल कैडरिन (VE-कैडरिन) की अभिव्यक्ति को दबाता है, जो पालन जंक्शनों (AJs) 6,7,8 का एक ट्रांसमेम्ब्रेन घटक है। . ओएफटी में, ईएमटी शुरू करने के लिए एंडोकार्डियम की सक्रियता एफजीएफ 8 और बीएमपी 4 द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जिसकी अभिव्यक्ति नॉच 9,10,11,12 द्वारा सक्रिय होती है।

ईएमटी की प्रगति में सेलुलर गतिशीलता शामिल होती है क्योंकि कोशिकाएं आकार बदलती हैं, अपने पड़ोसियों के साथ जंक्शनों को तोड़ती हैं और रीमेक करती हैं, डीलैमिनेट करती हैं, और13 को स्थानांतरित करना शुरू करती हैं। इन परिवर्तनों में एजे रीमॉडल औरक्रमिक विघटन 14,15, प्लानर सेल पोलैरिटी (पीसीपी) सिग्नलिंग, एपिको-बेसल पोलैरिटी (एबीपी), एपिकल कसना और साइटोस्केलेटल संगठन16,17 का नुकसान शामिल है। एबीपी एक सेल के पूर्ववर्ती-पीछे की धुरी के साथ प्रोटीन के वितरण को संदर्भित करता है। विकासशील हृदय में, वेंट्रिकुलरविकास के लिए कार्डियोमायोसाइट्स में एबीपी विनियमन की आवश्यकता होती है। पीसीपी एक ऊतक के तल में कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन के ध्रुवीकृत वितरण को संदर्भित करता है और सेलुलर वितरण को नियंत्रित करता है; एक स्थिर ज्यामिति के साथ एपिथेलिया हेक्सागोन के आकार की कोशिकाओं से बना होता है, जहां केवल तीन कोशिकाएं19,20,21,22 शीर्ष पर एकत्रित होती हैं। उपकला मोर्फोजेनेसिस के दौरान होने वाली विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाएं, जैसे कोशिका विभाजन, पड़ोसी विनिमय, या डिलेमिनेशन, उन कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि का उत्पादन करती हैं जो एक शीर्ष पर अभिसरण करती हैं और पड़ोसी कोशिकाओं की संख्या जो किसी दिए गए सेल में22 होती हैं। पीसीपी से संबंधित इन सेलुलर व्यवहारों को विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों, एक्टिन गतिशीलता, या इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग23 द्वारा विनियमित किया जा सकता है।

चूहों में वाल्व विकास का अध्ययन करने वाले उत्पन्न डेटा को ई 8.5 और ई 9.5 भ्रूण के दिल के ट्रांसवर्सल, कोरोनल या धनु वर्गों से प्राप्त किया गया है, जहां एंडोकार्डियम को कोशिकाओं के क्षेत्र के बजाय कोशिकाओं की एक पंक्ति के रूप में दिखाया गया है - एंडोकार्डियम हृदय ट्यूब24 की पूरी आंतरिक सतह को कवर करता है। भ्रूण अनुभाग माउस भ्रूण के एंडोकार्डियम में पीसीपी के विश्लेषण की अनुमति नहीं देते हैं। हमारी नई प्रयोगात्मक विधि एंडोकार्डियल सेल वितरण, एजे अनिसोट्रॉपी और एकल-सेल आकार विश्लेषण के विश्लेषण की अनुमति देती है, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है। पीसीपी विश्लेषण के लिए इस प्रकार के डेटा की आवश्यकता होती है, साथ ही पीसीपी से संबंधित अन्य अणुओं के विवरण के साथ, इस रिपोर्ट में नहीं दिखाया गया है। होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, विशिष्ट नमूना तैयारी और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग चूहों में वाल्व विकास की शुरुआत में एंडोकार्डियम में प्लानर ध्रुवीयता विश्लेषण को सक्षम करता है।

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Protocol

पशु अध्ययन को सेंट्रो नेशनल डी इन्वेस्टिगेसियोन्स कार्डियोवैस्कुलर (सीएनआईसी) पशु प्रयोग नैतिकता समिति और मैड्रिड समुदाय (रेफरी प्रोएक्स 155.7/20) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी पशु प्रक्रियाएं यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63ईयू और सिफारिश 2007/526/ईसी के अनुरूप प्रयोगात्मक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा के बारे में हैं, जो वास्तविक Decreto 1201/2005 के तहत स्पेनिश कानून में अधिनियमित हैं।

1. एवीसी और / या ओएफटी का उन्मूलन (जिओ एट अल से अनुकूलित)। 25)

  1. महिला mTmG और पुरुष VE-कैडरिन-Cre-ERT / + के बीच दोपहर में क्रॉस सेट करें।
  2. अगली सुबह, योनि प्लग की जांच करें। यदि योनि प्लग है, तो इसे आधे दिन (E0.5) के रूप में गिनें। ब्याज के प्रयोग के आधार पर, 8 दिन या 9 दिन की गिनती करें।
  3. विच्छेदन से 24 घंटे पहले, गर्भवती महिला को मौखिक रूप से 5 मिलीग्राम / एमएल 4-ओएच-टैमोक्सीफेन के 50 μL के साथ मकई के तेल में पतला करें।
    नोट: यह खुराक जीएफपी-पॉजिटिव क्लोन की उपस्थिति से प्रकट सीआरई-मध्यस्थता पुनर्संयोजन की सीमित मात्रा को प्रेरित करेगी। 4-ओएच-टैमोक्सीफेन के प्रत्येक नए बैच के साथ उचित खुराक निर्धारित करनी होगी।
  4. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा ई 8.5 या ई 9.5 पर गर्भवती महिला का बलिदान करें।
  5. कैंची का उपयोग करके गर्भवती चूहों के पेट को खोलें और कैंची और बारीक बल का उपयोग करके भ्रूण युक्त गर्भाशय को हटा दें।
  6. गर्भाशय को 0.1% ट्वीन -20 (पीबीटी) के साथ बर्फ-ठंडा 1 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) युक्त पेट्री डिश में रखें।
  7. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत और बारीक बल का उपयोग करके गर्भाशय से व्यक्तिगत निर्णय को हटा दें।
  8. बारीक चिमटी का उपयोग करके, निर्णायक के सफेद भाग में एक चीरा लगाएं, जो कि भ्रूण है, इसे धीरे से हटा दें, खींचने से बचें, और भ्रूण को पी 1000 का उपयोग करके ताजा पीबीटी के साथ एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें नोक कटी हुई हो, जिससे भ्रूण का व्यास इतना बड़ा हो जाता है कि वह बिना टूटे गुजर सके।
  9. जीनोटाइपिंग के लिए, जर्दी थैली का एक छोटा टुकड़ा (0.5 मिमी2) या पूंछ का एक टुकड़ा (पीछे के छोर से, सिर की ओर 5 से 10 सोमाइट गिनते हुए) लें और इसे उचित बफर के 100 μL में पचाएं।
  10. फ्यूम हुड के तहत, भ्रूण को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज (2 एमएल) ट्यूब में बाँझ-फ़िल्टर किए गए पीबीएस में बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (4% पीएफए) में स्थानांतरित करें। भ्रूण को 2 घंटे से रात भर (ओ / एन) 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पोषक तत्व पर ठीक करें।
  11. फ्यूम हुड के तहत, भ्रूण को छूने के बिना माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों से 4% पीएफए फिक्सेटिव को हटा दें। पीएफए को एक उपयुक्त कंटेनर में फेंक दें।
  12. कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए ठंडे पीबीटी में भ्रूण को 5 गुना धोएं।
  13. ठीक बल का उपयोग करके, दिल को हटा दें और इसे ताजा पीबीटी के साथ एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

2. माउस भ्रूण के दिल के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. पीबीटी को पीबीएसटीआर (पीबीएस में 0.4% ट्राइटन एक्स -100) के साथ बदलें और एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर प्रत्येक में 3 x, 5 मिनट के नमूने धोएं।
  2. पीबीएसटीआर को ब्लॉकिंग समाधान (10% गर्मी-निष्क्रिय गोजातीय सीरम के साथ पीबीएसटीआर) के साथ बदलें। कक्षीय शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे से ओ / एन तक इनक्यूबेट करें।
  3. ब्लॉकिंग समाधान को वांछित एकाग्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त ब्लॉकिंग समाधान के साथ बदलें (एंटी-जीएफपी या एंटी-वीई-कैडरिन एंटीबॉडी के लिए, 1: 1000 कमजोर पड़ने का उपयोग करें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर कक्षीय शेकर पर ओ / एन को इनक्यूबेट करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन इनक्यूबेशन के बाद, कक्षीय शेकर पर आरटी पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को तीन भविष्य के प्रयोगों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निकालें और रखें (सर्वोत्तम संरक्षण के लिए 0.02% की अंतिम एकाग्रता में सोडियम एज़ाइड जोड़ें)।
  6. प्रत्येक 3 मिनट के लिए PBSTR के साथ भ्रूण को 3x धोएं।
  7. भ्रूण को 4 डिग्री सेल्सियस पर कक्षीय शेकर पर 30 मिनट के लिए पीबीएसटीआर 3x के साथ धोएं।
  8. अंतिम धोने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी मेजबान प्रजातियों के खिलाफ 1: 1000 प्रतिदीप्ति-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त ब्लॉकिंग समाधान का 1 एमएल जोड़ें। समाधान में 1: 3000 DAPI भी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर कक्षीय शेकर पर भ्रूण O / N को इनक्यूबेट करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन इनक्यूबेशन के बाद, कक्षीय शेकर पर आरटी पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है।
  10. प्रत्येक 3 मिनट के लिए PBSTR के साथ भ्रूण को 3x धोएं।
  11. आरटी में कक्षीय शेकर पर प्रत्येक 30 मिनट के लिए पीबीएसटीआर 3x-5x के साथ भ्रूण धोएं।

3. माउस भ्रूण AVC या OFTs को बढ़ाना

  1. दिल को पेट्री डिश (35 मिमी) पर रखें जिसमें पीबीएस होता है।
  2. टंगस्टन तार और महीन बल का उपयोग करके, एवीसी या ओएफटी को अलग करें, और उन्हें अनुदैर्ध्य रूप से26 काट लें।
  3. डीएपीआई के बिना, प्रतिदीप्ति के लिए कवरलिप्स (22 मिमी x 22 मिमी), स्लाइड (60 मिमी x 24 मिमी), फोर्सप्स, उपयुक्त युक्तियों के साथ एक पी 200 पिपेट, पेपर तौलिया, और प्रतिदीप्ति के लिए किसी भी जलीय ग्लिसरॉल-आधारित माउंटिंग मीडिया तैयार करें।
  4. जिओ, सी. एट अल.25 की तरह एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, 3 डी कमरे की जगह बनाने के लिए 0.3-0.6 सेमी से अलग एक स्लाइड पर टेप की दो स्ट्रिप्स चिपकाएं जो नमूनों को स्क्वैश किए बिना इसे मूल आकार में संरक्षित करने की अनुमति देगा।
  5. सावधानी से, और बफर की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करके, नमूने को कट पी 200 टिप पिपेट का उपयोग करके टेप धारियों के बीच स्लाइड पर छोड़ दें। सटीकता बढ़ाने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  6. ठीक बल का उपयोग करके, नमूनों को एंडोकार्डियम के साथ रखें (मायोकार्डियम स्लाइड पर नीचे)।
  7. पेपर टॉवल के साथ अतिरिक्त पीबीएस निकालें (नमूने को छूने से बचें), और फिर नमूने को स्लाइड पर चिपकने के लिए आरटी में 1-2 मिनट के लिए नमूने सुखाएं।
  8. ऊतक पर जलीय-आधारित माउंटिंग मीडिया के 40 μL जोड़ें।
  9. टेप के दो टुकड़ों पर कवरस्लिप रखें और इसे धीरे-धीरे सुई या बल के साथ ऊतक पर कम करें। हवा के बुलबुले बनाने से बचें।
  10. कवरस्लिप के प्रत्येक शीर्ष पर नेल पॉलिश की एक बूंद का उपयोग करके कवरस्लिप को सील करें।
  11. एक बार जब नेल पॉलिश सूख जाती है, तो एक शोषक पेपर तौलिया का उपयोग करके कवरस्लिप के किनारों से अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को साफ करें। कवरस्लिप को स्थानांतरित करने से बचें।
  12. इसे पूरी तरह से सील करने के लिए कवरस्लिप किनारों के साथ नेल पॉलिश जोड़ें, जिससे बढ़ते मीडिया वाष्पीकरण को रोका जा सके।
  13. एक सीधा या उलटा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सामान्य दृश्य के लिए 10x पर और विस्तृत छवियों के लिए 3x ज़ूम के साथ 63x पर छवियां लें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न डेटा से पता चलता है कि एवीसी के एंडोकार्डियम की फेस इमेजिंग करना संभव है। पहला उद्देश्य सेलुलर रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 1) पर वाल्व के गठन के दौरान एंडोकार्डियम के सेल आकार का विश्लेषण करना था। E9.5 पर व्यक्तिगत एंडोकार्डियल कोशिकाओं को उजागर करने के लिए, हमने दो ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग किया। (1) ROSAmT / mG एक दो-रंग फ्लोरोसेंट Cre रिपोर्टर एलील (tdTomato / mT और EGFP / mG) है जिसकी प्रतिदीप्ति कोशिका झिल्ली पर पाई जाती है। क्रे-मध्यस्थता सक्रियण के बिना, ट्रांसजीन टीडीटोमेटो (एमटी) व्यक्त करता है। क्रे-मध्यस्थता सक्रियण पर, टीडीटोमेटो अभिव्यक्ति को विशिष्ट कोशिकाओं और क्लोनल डेरिवेटिव27 में ईजीएफपी फ्लोरेसेंस अभिव्यक्ति (एमजी) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। (2) सीडीएच 5 सीआरईआरटी2 / + माउस लाइन संवहनी एंडोथेलियल कैडरिन प्रमोटर (सीडीएच 5) के विनियमन के तहत टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल सीआरई-रिकोम्बिनेस (सीआरईआरटी 2) को व्यक्त करती है, जिसे भ्रूण चरण28 में संवहनी एंडोथेलियम और एंडोकार्डियम में व्यक्त किया जाता है। हमने एंडोकार्डियम की अलग-अलग कोशिकाओं में जीएफपी की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए दो ट्रांसजेन ले जाने वाले भ्रूण प्राप्त करने के लिए प्रत्येक जीनोटाइप के एक पुरुष और एक महिला को पार किया। इसे प्राप्त करने के लिए, हमने कोशिकाओं की कम संख्या में सीआरई अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए टैमोक्सीफेन की कम खुराक का टीका लगाया। नतीजतन, एकल कोशिकाओं, या कुछ कोशिकाओं के क्लोन, एंडोकार्डियम (चित्रा 1 ए) में जीएफपी व्यक्त करते हैं। वीई-कैडरिन उपकोशिकीय स्थानीयकरण (चित्रा 1 सी) के साथ संयोजन में जीएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 1 ए, बी) पूर्व-ईएमटी कोशिकाओं में एजे गतिशीलता और फिलोपोडिया गठन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण है क्योंकि ये कोशिकाएं झिल्ली प्रोट्रूशियंस विकसित करती हैं क्योंकि एजे29 भंग होते हैं। पीसीपी सिग्नल एजे पर अनिसोट्रोपिक सिकुड़न प्रदान कर सकते हैं, सेलुलर बलों का उत्पादन करते हैं जो एपिथेलिया30 में ध्रुवीकृत मोर्फोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं। हमें एंडोकार्डियम (चित्रा 2) में वीई-कैडरिन धुंधला होने की तीव्रता में अंतर मिला, यह दर्शाता है कि हम पूर्व-वाल्वुलर चरणों में एवीसी के भ्रूण एंडोकार्डियम में अनिसोट्रोपिक सिकुड़न को त्याग नहीं सकते हैं।

दूसरा उद्देश्य वाल्व विकास के दौरान एंडोकार्डियम की प्लानर टोपोलॉजी का विश्लेषण करना था (चित्रा 2)। एकल शीर्ष में अभिसरण करने वाली कोशिकाओं की संख्या को परिभाषित करने के लिए, हमने पूरे दिल को ई 8.5 और ई 9.5 (चित्रा 2 ए, बी) पर वीई-कैडरिन एंटीबॉडी के साथ दाग दिया। एंडोकार्डियल सेल के सेल-सेल संपर्कों में स्थानीयकृत अन्य अणु भी उस उद्देश्य के लिए उपयोगी होंगे (उदाहरण के लिए, β-कैटेनिन)। ई 8.5 पर, एवीसी के एंडोकार्डियम में एक स्थिर उपकला संगठन होता है, और हम चार से अधिक कोशिकाओं (चित्रा 2 ए, सी) द्वारा गठित शीर्षों का पता नहीं लगा सकते हैं। बाद में E9.5 पर, हमने पाया कि रोसेट जैसी संरचनाओं (चित्रा 2B, D) का निर्माण करने वाली छह कोशिकाओं से बने शीर्ष, पहले सक्रिय सेल पुनर्व्यवस्था31 से गुजरने वाले एपिथेलिया में वर्णित सेलुलर संगठन के समान हैं, यह सुझाव देते हुए कि एवीसी एंडोकार्डियम वाल्व विकास के दौरान सक्रिय सेलुलर पुनर्व्यवस्था से गुजर रहा है।

Figure 1
चित्र 1: प्रीवल्वुलर एंडोकार्डियम में एकल-कोशिका आकार विश्लेषण( ए) ई 9.5 माउस भ्रूण से एवीसी ने बिखरे हुए जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाते हुए अनुदैर्ध्य रूप से खोला। (बी) एकल कोशिकाओं में जीएफपी अभिव्यक्ति सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर सेल आकार को परिभाषित करती है। (ग) वीई-कैडरिन के पूरे माउंट धुंधलापन पर एजे पर प्रकाश डाला गया है। फिलोपोडिया सेल के डोमेन में उत्पन्न होते हैं जो वीई-कैडरिन (बैंगनी तीर) का स्थानीयकरण नहीं करते हैं, और इसके विपरीत, वीई-कैडरिन सेल के डोमेन में स्थानीयकृत होते हैं जो चिकनी होते हैं और फिलोपोडिया (नीले तीर) नहीं बनाते हैं। v, उदर; डी, पृष्ठीय। ए में स्केल बार 100 μm है; B और C में 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्लानर टोपोलॉजी और प्लानरली स्थानीयकृत प्रोटीन की अनिसोट्रॉपी को एवी नहर पर एंडोकार्डियम की चेहरे की छवियों में परिभाषित किया जा सकता है। वीई-कैडरिन एंडोकार्डियम के सेल-सेल संपर्कों पर स्थानीयकृत है। (ए) ई 8.5 और (बी) ई 9.5 एवीसी भ्रूण से अनुदैर्ध्य रूप से खोले गए थे। (सी) और (डी) में आवर्धन ने हमें उन कोशिकाओं की संख्या का निरीक्षण करने की अनुमति दी जो एक शीर्ष में अभिसरण करते हैं। इसके अलावा, हम वीई-कैडरिन धुंधला होने में विभिन्न तीव्रताओं को अलग कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि एवीसी में इसका स्थान अनिसोट्रोपिक है। ए और बी में स्केल बार 100 μm है; C और D में 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एंडोकार्डियम एक उपकला मोनोलेयर है जो भ्रूण के हृदय ट्यूब की पूरी आंतरिक सतह को कवर करता है। वाल्व विकास के दौरान, संभावित वाल्वुलर क्षेत्रों में एंडोकार्डियल कोशिकाएं ईएमटी से गुजरती हैं, इस प्रकार एंडोकार्डियल कोशिकाएं अपने साइटोस्केलेटन को एंडोकार्डियम से कार्डियक जेली की ओर डिलैमिनेट करने के लिए बदल देती हैं और पुनर्व्यवस्थित करती हैं। हमने और अन्य लोगों ने ई 8.5 और ई 9.5 भ्रूण के दिल के ट्रांसवर्सल वर्गों का विश्लेषण करके माउस भ्रूण में वाल्व विकास के बारे में प्रासंगिक डेटा प्राप्त किया है, जहां एंडोकार्डियम को कोशिकाओंकी एक पंक्ति 6,8,24,32 के रूप में दिखाया गया है। इस दृष्टिकोण ने वाल्व विकास में शामिल सिग्नलिंग मार्गों और अन्य अणुओं की अभिव्यक्ति के विश्लेषण की अनुमति दी, लेकिन प्री-वाल्वुलर एंडोकार्डियम के स्थानिक पहलुओं का विश्लेषण करना संभव नहीं था।

एवीसी या ओएफटी खोजों का उपयोग मुख्य रूप से 3 डी कोलेजन जेल पर ईसी को बदलने का अध्ययन करने के लिए किया गया था। ईएमटी परिमाणीकरण, परिवर्तन क्षमता के विश्लेषण, या संस्कृति 6,7,11,33 में कुछ दिनों के बाद दवाओं का परीक्षण करने के लिए खोज उपयोगी हैं। ये पूर्व विवो प्रयोग कोलेजन जेल के शीर्ष पर एक मोनोलेयर के रूप में एंडोकार्डियम के विस्तार की भी अनुमति देते हैं, लेकिन पर्यावरणीय परिस्थितियां जिनमें एक्स विवो कार्डियक एक्सप्लेंट उगाए जाते हैं, गर्भाशय की स्थिति से भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, उचित वाल्व विकास34,35 के लिए यूनिडायरेक्शनल रक्त प्रवाह आवश्यक है और केवल गर्भाशय में प्राप्त किया जाता है, न कि एक्स विवो, खोजों में।

यह नया दृष्टिकोण हमें किसी भी पर्यावरणीय हेरफेर के बिना वाल्व विकास की शुरुआत के दौरान चेहरे पर बरकरार वाल्वुलर एंडोकार्डियम का निरीक्षण करने की अनुमति देता है। यह वाल्वुलर एंडोकार्डियम के सेलुलर वितरण के विश्लेषण की अनुमति देता है, साथ ही गर्भाशय स्थितियों में ईएमटी से पहले और दौरान एकल-कोशिका आकार विश्लेषण की अनुमति देता है। हम सेल-सेल संपर्कों की तीव्रता और संगठन और ईएमटी के दौरान प्रासंगिक अणुओं के उपकोशिकीय वितरण का भी निरीक्षण और विश्लेषण कर सकते हैं। यह तकनीक एंडोकार्डियम की उपकोशिकीय संरचनाओं का विश्लेषण करने की संभावना भी प्रदान करती है, रिपोर्टर जीन का उपयोग करके सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता, सेलुलर व्यवहार पर जीन निष्क्रियता का प्रभाव हो सकता है, और यह जंगली प्रकार की पड़ोसी कोशिकाओं को कैसे प्रभावित कर सकता है।

उच्च गुणवत्ता वाले नमूने प्राप्त करने के लिए, उन्हें संभालते समय बहुत सावधान रहना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अशुद्धियां (जैसे, माइक्रोफाइबर) जो ऊतक से चिपकी रहती हैं, छवियों के कब्जे के दौरान कलाकृतियों का परिणाम हो सकती हैं। इसके अलावा, चूंकि वे बहुत छोटे नमूने हैं, टूटने का जोखिम अधिक है, इसलिए किसी को धीमी शेकर्स में ऊतक (चरण 1 और चरण 2)को धोना चाहिए। पिपेट के साथ मीडिया के परिवर्तन के दौरान, हम ऊतक को ढहने से रोकने के लिए नोक को काटने की सलाह देते हैं क्योंकि यह गलती से अवशोषित होने की स्थिति में नोक से गुजरता है। इस तकनीक में विशेषज्ञ बनने के लिए, एक सीखने की अवस्था आवश्यक है, जो माइक्रोमैनिपुलेशन में शोधकर्ता के पिछले अनुभव के आधार पर लंबी या छोटी होगी।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेन के उपयोग के मामले में सही फिक्सेटिव और निर्धारण का समय चुनना महत्वपूर्ण हो सकता है। शारीरिक संरचना इथेनॉल 70%, मेथनॉल, पीएफए 4%, या फॉर्मेलिन 10% जैसे विभिन्न फिक्सेटिव से प्रभावित नहीं होती है।

नाभिक के काउंटरस्टेनिंग के लिए, हम DAPI के साथ नमूनों के इनक्यूबेशन की सलाह देते हैं क्योंकि DAPI के साथ बढ़ते मीडिया का उपयोग करने की तुलना में प्रवेश बहुत अधिक कुशल है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एमसीआईएन/एईआई/10.13039/501100011033 से जे.एल.पी.जे.जी.-बी. को पीआईडी 2019-104776आरबी-आई00 और सीबी16/11/00399 (सीआईबीईआर सीवी) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। कोमुनिडाड डी मैड्रिड (2020-5/ बीएमडी-19729) से प्रोग्रामा डी एट्राकिओन डी टैलेंटो द्वारा वित्त पोषित किया गया था। टी.जी.-सी. प्रोफेसर यूनिवर्सिटेरियो (एफपीयू 18/01054) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम माइक्रोस्कोपी और डायनेमिक इमेजिंग की सीएनआईसी इकाई, सीएनआईसी, आईसीटीएस-रीडिब को धन्यवाद देते हैं, जो एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033 और फेडर "यूरोप बनाने का एक तरीका" (#ICTS-2018-04-सीएनआईसी -16) द्वारा सह-वित्तपोषित है। हम माउस पालन के लिए ए गैलिसिया और एल मेन्डेज़ को भी धन्यवाद देते हैं। इस प्रकाशन की लागत यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष से धन द्वारा समर्थित थी। सीएनआईसी को आईएससीIII, एमसीआईएन और प्रो सीएनआईसी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया है और यह एक सेवेरो ओचोआ सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (अनुदान CEX2020-001041-S) है जो MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 द्वारा वित्तपोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 185
<em>एन फेस</em> माउस भ्रूण में प्लानर मोर्फोजेनेसिस विश्लेषण के लिए एंडोकार्डियल कुशन तैयारी
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Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J.… More

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

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