Summary
Classicamente, l'endocardio del primordium della valvola embrionale di topo è stato analizzato utilizzando sezioni trasversali, coronali o sagittali. Il nostro nuovo approccio per l'imaging bidimensionale dell'endocardio nelle regioni valvulogeniche consente l'analisi della polarità planare e del riarrangiamento cellulare dell'endocardio durante lo sviluppo della valvola.
Abstract
Lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo del cuore dei mammiferi è essenziale per affrontare la cardiopatia congenita umana. Lo sviluppo delle valvole cardiache primitive comporta la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) delle cellule endocardiche dalle regioni del canale atrioventricolare (AVC) e del tratto di efflusso (OFT) del cuore in risposta a segnali miocardici ed endocardici induttivi locali. Una volta che le cellule si delaminatono e invadono la matrice extracellulare (gelatina cardiaca) situata tra l'endocardio e il miocardio, si formano i cuscinetti endocardici primitivi (EC). Questo processo implica che l'endocardio deve riempire gli spazi vuoti lasciati dalle cellule delaminate e deve riorganizzarsi per convergere (stretto) o estendersi (allungarsi) lungo un asse. La ricerca attuale ha implicato il percorso di polarità cellulare planare (PCP) nella regolazione della localizzazione subcellulare dei fattori coinvolti in questo processo. Classicamente, le fasi iniziali dello sviluppo valvolare cardiaco sono state studiate in sezioni trasversali di cuori embrionali o in espianti ex vivo AVC o OFT coltivati su gel di collagene. Questi approcci permettono l'analisi della polarità apico-basale ma non permettono l'analisi del comportamento cellulare all'interno del piano dell'epitelio o dei cambiamenti morfologici delle cellule migranti. Qui, mostriamo un approccio sperimentale che consente la visualizzazione dell'endocardio nelle regioni valvulogeniche come un campo planare di cellule. Questo approccio sperimentale offre l'opportunità di studiare PCP, topologia planare e comunicazione intercellulare all'interno dell'endocardio dell'OFT e dell'AVC durante lo sviluppo della valvola. Decifrare nuovi meccanismi cellulari coinvolti nella morfogenesi delle valvole cardiache può contribuire alla comprensione della cardiopatia congenita associata a difetti del cuscino endocardico.
Introduction
Il cuore è il primo organo funzionale di un embrione di mammifero. Intorno al giorno embrionale (E) 7,5 nei topi, le cellule bilaterali del mesoderma precardiaco formano la mezzaluna cardiaca nel lato ventrale1. La mezzaluna cardiaca contiene due popolazioni di cellule precardiache che includono progenitori del miocardio e dell'endocardio2. Intorno a E8.0, i precursori cardiaci si fondono nella linea mediana, formando il tubo cardiaco primitivo costituito da due tessuti epiteliali, il miocardio esterno e l'endocardio interno, che è un endotelio specializzato separato da una matrice extracellulare chiamata gelatina cardiaca. Successivamente, a E8.5, il tubo cardiaco subisce un ciclo verso destra. Il cuore ad anello ha diverse regioni anatomiche con firme molecolari specifiche come il tratto di efflusso (OFT), i ventricoli e il canale atrio-ventricolare (AVC)3. Sebbene inizialmente il tubo cardiaco si espanda sul suo lato di afflusso attraverso l'aggiunta di cellule4, a E9.5, un'intensa proliferazione cardiaca provoca il palloncino delle camere e la creazione della rete trabecolare5. La formazione valvolare avviene nell'AVC (future valvole mitrale e tricuspide) e nell'OFT (future valvole aortica e polmonare).
L'endocardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della valvola. Le cellule endocardiche subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nell'AVC e nell'OFT per formare i cuscini endocardici, una struttura che appare all'inizio dello sviluppo valvolare. Diverse vie di segnalazione attivano questo processo; a E9.5 nei topi, NOTCH attivato nell'endocardio in risposta al BMP2 derivato dal miocardio promuove l'EMT invasiva delle cellule endocardiche nelle regioni AVC e OFT attraverso l'attivazione di TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), che reprime direttamente l'espressione della caderina endoteliale vascolare (VE-caderina), una componente transmembrana delle giunzioni aderenti (AJ)6,7,8 . Nell'OFT, l'attivazione dell'endocardio per iniziare l'EMT è mediata da FGF8 e BMP4, la cui espressione è attivata da NOTCH 9,10,11,12.
La progressione dell'EMT coinvolge la dinamica cellulare mentre le cellule cambiano forma, rompono e ricreano le giunzioni con i loro vicini, si delaminano e iniziano a migrare13. Questi cambiamenti includono il rimodellamento di AJ e il graduale disassemblaggio 14,15, la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP), la perdita della polarità apico-basale (ABP), la costrizione apicale e l'organizzazione citoscheletrica 16,17. ABP si riferisce alla distribuzione delle proteine lungo l'asse antero-posteriore di una cellula. Nel cuore in via di sviluppo, la regolazione dell'ABP nei cardiomiociti è necessaria per lo sviluppo ventricolare18. PCP si riferisce a una distribuzione polarizzata di proteine all'interno delle cellule attraverso il piano di un tessuto e regola la distribuzione cellulare; Gli epiteli con una geometria stabile sono costituiti da cellule di forma esagonale, dove solo tre celle convergono ai vertici 19,20,21,22. Diversi processi cellulari, come la divisione cellulare, lo scambio di vicini o la delaminazione che si verificano durante la morfogenesi epiteliale, producono un aumento del numero di cellule che convergono su un vertice e il numero di cellule vicine che una data cellula ha22. Questi comportamenti cellulari correlati alla PCP possono essere regolati da diverse vie di segnalazione, dinamica dell'actina o traffico intracellulare23.
I dati generati studiando lo sviluppo valvolare nei topi sono stati ottenuti da sezioni trasversali, coronali o sagittali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l'endocardio è mostrato come una linea di cellule anziché come un campo di cellule: l'endocardio copre l'intera superficie interna del tubo cardiaco24. Le sezioni embrionali non consentono l'analisi del PCP nell'endocardio degli embrioni di topo. Il nostro nuovo metodo sperimentale consente l'analisi della distribuzione delle cellule endocardiche, dell'anisotropia AJ e dell'analisi della forma a singola cellula, come mostrato nei risultati rappresentativi. Questo tipo di dati è necessario per l'analisi del PCP, insieme alla descrizione di altre molecole correlate al PCP, non mostrate in questo rapporto. L'immunofluorescenza a montaggio intero, la preparazione di campioni specifici e l'uso di topi geneticamente modificati consentono l'analisi della polarità planare nell'endocardio all'inizio dello sviluppo valvolare nei topi.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) e dalla Comunità di Madrid (rif. PROEX 155.7/20). Tutte le procedure animali sono conformi alla direttiva UE 2010/63UE e alla raccomandazione 2007/526/CE relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici, emanata dalla legge spagnola con Real Decreto 1201/2005.
1. Ottenimento di AVC e/o OFTs (adattato da Xiao et al. 25)
- Impostare incroci nel pomeriggio tra mTmG femmina e maschio VE-Cadherin-Cre-ERT / +.
- La mattina dopo, controlla la presenza di un tappo vaginale. Se c'è un tappo vaginale, contalo come mezza giornata (E0.5). A seconda dell'esperimento di interesse, contare 8 giorni o 9 giorni.
- 24 ore prima della dissezione, sonda la donna incinta per via orale con 50 μL di 5 mg/mL di 4-OH-Tamoxifene diluito in olio di mais.
NOTA: Questa dose indurrà una quantità limitata di ricombinazione mediata da CRE rivelata dalla presenza di cloni GFP-positivi. La dose appropriata dovrà essere determinata con ogni nuovo lotto di 4-OH-Tamoxifene. - Sacrificare la femmina incinta a E8.5 o E9.5 per dislocazione cervicale.
- Aprire l'addome dei topi gravidi usando le forbici e rimuovere l'utero contenente gli embrioni usando forbici e pinze sottili.
- Posizionare l'utero in una capsula di Petri contenente soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato 1x (PBS) con 0,1% di Tween-20 (PBT).
- Rimuovere le singole decidue dall'utero al microscopio da dissezione e usando una pinza fine.
- Usando una pinzetta sottile, fai un'incisione nella parte bianca della decidua, che è dove si trova l'embrione, rimuovilo delicatamente, evitando di tirare, e trasferisci gli embrioni in una nuova capsula di Petri con PBT fresco usando un P1000 con la punta tagliata, lasciando un diametro abbastanza grande da consentire a un embrione di passare attraverso senza rompersi.
- Per la genotipizzazione, prendere un piccolo pezzo del sacco vitellino (0,5 mm2) o un pezzo della coda (dall'estremità posteriore, contando da 5 a 10 somiti verso la testa) e digerirlo in 100 μL di tampone appropriato.
- Sotto la cappa aspirante, trasferire gli embrioni in paraformaldeide ghiacciata al 4% (4% PFA) in PBS filtrato sterile in una provetta di microcentrifuga (2 ml) a 4 °C. Fissare gli embrioni da 2 ore a una notte (O/N) a 4 °C su un nutatore.
- Sotto la cappa aspirante, rimuovere il fissativo PFA al 4% dalle provette della microcentrifuga senza toccare gli embrioni. Gettare il PFA in un contenitore appropriato.
- Lavare gli embrioni 5 volte in PBT freddo per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente (RT).
- Utilizzando una pinza sottile, rimuovere il cuore e trasferirlo in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con PBT fresco.
2. Immunofluorescenza a montaggio intero del cuore embrionale del topo
- Sostituire PBT con PBSTr (0,4% Triton X-100 in PBS) e lavare i campioni 3x, 5 minuti ciascuno, a RT su uno shaker orbitale.
- Sostituire PBSTr con una soluzione bloccante (PBSTr con siero bovino inattivato termicamente al 10%). Incubare da 2 h a O/N a 4 °C su un agitatore orbitale.
- Sostituire la soluzione bloccante con una soluzione bloccante contenente anticorpi primari alla concentrazione desiderata (per anticorpo anti-GFP o anti-VE-caderina, usare la diluizione 1:1000). Incubare O/N su uno shaker orbitale a 4 °C.
- Dopo l'incubazione O/N a 4 °C, incubare per 1,5 ore a RT su uno shaker orbitale. Questo passaggio è molto importante per aumentare il rapporto segnale-rumore.
- Rimuovere e mantenere a 4 °C la soluzione anticorpale primaria per un massimo di tre esperimenti futuri (aggiungere azoturo di sodio a una concentrazione finale dello 0,02% per una migliore conservazione).
- Lavare gli embrioni 3 volte con PBSTr per 3 minuti ciascuno.
- Lavare gli embrioni con PBSTr 3x per 30 minuti ciascuno su uno shaker orbitale a 4 °C.
- Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 1 mL di soluzione bloccante contenente 1:1000 anticorpi secondari coniugati con fluorescenza contro la specie ospite di anticorpi primari. Aggiungere anche 1:3000 DAPI alla soluzione e incubare gli embrioni O/N su uno shaker orbitale a 4 °C.
- Dopo l'incubazione O/N a 4 °C, incubare per 1,5 ore a RT su uno shaker orbitale. Questo passaggio è molto importante per aumentare il rapporto segnale-rumore.
- Lavare gli embrioni 3 volte con PBSTr per 3 minuti ciascuno.
- Lavare gli embrioni con PBSTr 3x-5x per 30 minuti ciascuno su uno shaker orbitale a RT.
3. Montaggio dell'AVC o degli OFT embrionali di topo
- Mettere i cuori su una capsula di Petri (35 mm) contenente PBS.
- Utilizzando un filo di tungsteno e una pinza sottile, isolare l'AVC o l'OFT e tagliarli longitudinalmente26.
- Preparare vetrini (22 mm x 22 mm), vetrini (60 mm x 24 mm), pinze, una pipetta P200 con le punte appropriate, tovagliolo di carta e qualsiasi mezzo di montaggio a base acquosa a base di glicerolo per fluorescenza, senza DAPI.
- Utilizzando un approccio simile a quello di Xiao, C. et al.25, incollare due strisce di nastro adesivo su un vetrino, separate da 0,3-0,6 cm per creare uno spazio 3D che consentirà ai campioni di conservare la forma originale senza schiacciarli.
- Con attenzione, e utilizzando il volume minimo di tampone, rilasciare i campioni sulla slitta tra le strisce del nastro utilizzando una pipetta a punta P200 tagliata. Utilizzare un microscopio da dissezione per aumentare la precisione.
- Usando una pinza fine, posizionare i campioni con l'endocardio rivolto verso l'alto (miocardio verso il basso sul vetrino).
- Rimuovere il PBS in eccesso con un tovagliolo di carta (evitare di toccare il campione), quindi asciugare i campioni per 1-2 minuti a RT per far aderire i campioni al vetrino.
- Aggiungere 40 μL di media di montaggio a base acquosa sul tessuto.
- Posizionare il coprislip sopra i due pezzi di nastro adesivo e abbassarlo lentamente sul fazzoletto con un ago o una pinza. Evitare di creare bolle d'aria.
- Sigillare il coprivetrino con una goccia di smalto su ciascun vertice del vetrino.
- Una volta che lo smalto è asciutto, pulire il supporto di montaggio in eccesso dai lati della vetrina utilizzando un tovagliolo di carta assorbente. Evitare di spostare il vetrino.
- Aggiungere lo smalto lungo i bordi del coprislip per sigillarlo completamente, evitando l'evaporazione del supporto di montaggio.
- Utilizzando un microscopio confocale verticale o invertito, scattare immagini a 10x per la visualizzazione generale e a 63x con zoom 3x per immagini dettagliate.
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Representative Results
I dati generati utilizzando questo protocollo mostrano che è possibile eseguire l'imaging en face dell'endocardio dell'AVC. Il primo obiettivo era quello di analizzare la forma cellulare dell'endocardio durante la formazione delle valvole ad una risoluzione cellulare (Figura 1). Al fine di evidenziare le singole cellule endocardiche a E9.5, abbiamo utilizzato due ceppi di topo transgenici. (1) ROSA mT/mG è un allele reporter Cre fluorescente a due colori (tdTomato/mT e EGFP/mG) la cui fluorescenza viene rilevata sulla membrana cellulare. Senza attivazione Cre-mediata, il transgene esprime tdTomato (mT). Dopo l'attivazione mediata da Cre, l'espressione di tdTomato viene sostituita dall'espressione di fluorescenza di EGFP (mG) in cellule specifiche e derivati clonali27. (2) La linea murina Cdh5CreERT2/+ esprime la CRE-ricombinasi inducibile dal tamoxifene (CreERT2) sotto la regolazione del promotore della caderina endoteliale vascolare (Cdh5), che è espresso nell'endotelio vascolare e nell'endocardio negli stadi embrionali28. Abbiamo incrociato un maschio e una femmina di ogni genotipo per ottenere embrioni portatori dei due transgeni al fine di attivare l'espressione di GFP in singole cellule dell'endocardio. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo inoculato bassi dosaggi di tamoxifene per attivare l'espressione di CRE in un numero ridotto di cellule. Di conseguenza, singole cellule, o cloni di poche cellule, hanno espresso GFP nell'endocardio (Figura 1A). L'espressione di GFP (Figura 1A,B) in combinazione con la localizzazione subcellulare VE-Cadherin (Figura 1C) è un approccio efficace per studiare la relazione tra la dinamica di AJ e la formazione di filopodi nelle cellule pre-EMT poiché queste cellule sviluppano protrusioni di membrana quando gli AJ si dissolvono29. I segnali PCP possono conferire contrattilità anisotropa agli AJ, producendo forze cellulari che promuovono la morfogenesi polarizzata negli epiteli30. Abbiamo trovato differenze nell'intensità della colorazione VE-Cadherin nell'endocardio (Figura 2), indicando che non possiamo scartare la contrattilità anisotropa nell'endocardio embrionale di AVC nelle fasi pre-valvolari.
Il secondo obiettivo era analizzare la topologia planare dell'endocardio durante lo sviluppo della valvola (Figura 2). Al fine di definire il numero di cellule convergenti in un singolo vertice, abbiamo colorato l'intero cuore con l'anticorpo VE-Cadherin a E8.5 ed E9.5 (Figura 2A,B). Altre molecole localizzate a contatto cellula-cellula della cellula endocardica sarebbero utili anche per questo scopo (ad esempio, β-catenina). A E8.5, l'endocardio dell'AVC tende ad avere un'organizzazione epiteliale stabile e non siamo riusciti a rilevare vertici formati da più di quattro cellule (Figura 2A,C). Più tardi a E9.5, abbiamo trovato vertici costituiti da un massimo di sei cellule che formano strutture simili a rosette (Figura 2B, D), simili all'organizzazione cellulare precedentemente descritta negli epiteli sottoposti a riarrangiamenti cellulari attivi31, suggerendo che l'endocardio AVC sta subendo un riarrangiamento cellulare attivo durante lo sviluppo della valvola.
Figura 1: Analisi della forma unicellulare nell'endocardio prevalvolare. (A) AVC da embrione di topo E9.5 aperto longitudinalmente mostrando cellule sparse GFP positive. (B) L'espressione di GFP in singole cellule definisce la forma cellulare a risoluzione cellulare. (C) Colorazione a montaggio intero di VE-Cadherin evidenzia AJs. I filopodi sono generati in domini della cellula che non localizzano VE-Cadherin (frecce viola), e viceversa, VE-Cadherin localizza in domini della cellula che sono lisci e non formano filopodia (punte di freccia blu). v, ventrale; d, dorsale. La barra di scala in A è di 100 μm; in B e C è 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: La topologia planare e l'anisotropia delle proteine localizzate planarmente possono essere definite nelle immagini en face dell'endocardio nel canale AV. VE-Cadherin è localizzata nei contatti cellula-cellula dell'endocardio. (A) E8.5 e (B) E9.5 AVC da embrioni sono stati aperti longitudinalmente. Gli ingrandimenti in (C) e (D) ci hanno permesso di osservare il numero di celle che convergono in un vertice. Inoltre, possiamo distinguere diverse intensità nella colorazione VE-Cadherin, indicando che la sua posizione nell'AVC è anisotropa. La barra di scala in A e B è di 100 μm; in C e D è 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'endocardio è un monostrato epiteliale che copre l'intera superficie interna del tubo cardiaco embrionale. Durante lo sviluppo valvolare, le cellule endocardiche nelle regioni valvolari prospettiche subiscono EMT, quindi le cellule endocardiche trasformano e riorganizzano il loro citoscheletro per delaminarsi dall'endocardio verso la gelatina cardiaca. Noi e altri abbiamo ottenuto dati rilevanti sullo sviluppo valvolare in embrioni di topo analizzando sezioni trasversali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l'endocardio è mostrato come una fila di cellule 6,8,24,32. Questo approccio ha permesso l'analisi dell'espressione delle vie di segnalazione e di altre molecole coinvolte nello sviluppo valvolare, ma non è stato possibile analizzare gli aspetti spaziali dell'endocardio pre-valvolare.
Gli espianti AVC o OFT sono stati utilizzati principalmente per studiare la trasformazione dell'EC su un gel di collagene 3D. Gli espianti sono utili per la quantificazione EMT, l'analisi della capacità di trasformazione o la sperimentazione di farmaci dopo pochi giorni in coltura 6,7,11,33. Questi esperimenti ex vivo consentono anche l'espansione dell'endocardio sopra il gel di collagene come monostrato, ma le condizioni ambientali in cui vengono coltivati gli espianti cardiaci ex vivo differiscono dalle condizioni in utero. Ad esempio, il flusso sanguigno unidirezionale è essenziale per il corretto sviluppo valvolare34,35 e si ottiene solo in espianti in utero, non ex vivo.
Questo nuovo approccio ci consente di osservare l'endocardio valvolare intatto durante l'inizio dello sviluppo valvolare senza alcuna manipolazione ambientale. Consente l'analisi della distribuzione cellulare dell'endocardio valvolare, nonché l'analisi della forma a singola cellula prima e durante l'EMT in condizioni di utero . Possiamo anche osservare e analizzare l'intensità e l'organizzazione dei contatti cellula-cellula e la distribuzione subcellulare delle molecole rilevanti durante l'EMT. Questa tecnica offre anche la possibilità di analizzare le strutture subcellulari dell'endocardio, l'attivazione delle vie di segnalazione utilizzando geni reporter, l'effetto che l'inattivazione genica può avere sul comportamento cellulare e come può influenzare le cellule vicine wild-type.
Per ottenere campioni di alta qualità, è importante prestare molta attenzione quando li si maneggia, poiché le impurità (ad esempio, microfibre) che si attaccano al tessuto possono causare artefatti durante l'acquisizione delle immagini. Inoltre, trattandosi di campioni molto piccoli, il rischio di rottura è elevato, quindi è necessario lavare il tessuto (fase 1. e fase 2.) in agitatori lenti. Durante il cambio dei fluidi con pipette, si consiglia di tagliare la punta per evitare che il tessuto collassi mentre passa attraverso la punta nel caso in cui venga accidentalmente assorbito. Per diventare un esperto in questa tecnica, è necessaria una curva di apprendimento, che sarà più lunga o più breve a seconda della precedente esperienza del ricercatore nella micromanipolazione.
La scelta del giusto fissativo e del tempo di fissazione può essere importante nel caso dell'uso di transgeni che esprimono proteine fluorescenti. La struttura anatomica non è influenzata da diversi fissativi come etanolo 70%, metanolo, PFA 4% o formalina 10%.
Per la controcolorazione dei nuclei, si consiglia l'incubazione di campioni con DAPI perché la penetrazione è molto più efficiente rispetto all'utilizzo di supporti di montaggio con DAPI.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 a J. L. P. J.G.-B. è stato finanziato dal Programa de Atracción de Talento della Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. è stato finanziato da Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Si ringraziano l'Unità CNIC di Microscopia e Imaging Dinamico, CNIC, ICTS-ReDib, co-finanziata da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FESR "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Ringraziamo anche A. Galicia e L. Méndez per l'allevamento dei topi. Il costo di questa pubblicazione è stato in parte sostenuto da fondi del Fondo europeo di sviluppo regionale. Il CNIC è sostenuto dall'ISCIII, dal MCIN e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Centro di Eccellenza Severo Ochoa (sovvenzione CEX2020-001041-S) finanziato da MCIN/AEI /10.13039/501100011033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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