Summary
Klassiek is het endocardium van de embryonale klep primordium van de muis geanalyseerd met behulp van transversale, coronale of sagittale secties. Onze nieuwe benadering voor en face, tweedimensionale beeldvorming van het endocardium in valvulogene gebieden maakt planaire polariteit en celherschikkingsanalyse van het endocardium mogelijk tijdens de ontwikkeling van de klep.
Abstract
De studie van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het hart van zoogdieren is essentieel om aangeboren hartaandoeningen bij de mens aan te pakken. De ontwikkeling van de primitieve hartkleppen omvat de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) van endocardiale cellen uit het atrioventriculaire kanaal (AVC) en het uitstroomkanaal (OFT) van het hart als reactie op lokale inductieve myocardiale en endocardiale signalen. Zodra de cellen delamineren en de extracellulaire matrix (cardiale gelei) tussen het endocardium en het myocardium binnendringen, worden de primitieve endocardiale kussens (EC) gevormd. Dit proces houdt in dat het endocardium de gaten moet opvullen die de gedelamineerde cellen hebben achtergelaten en zichzelf moet reorganiseren om te convergeren (smal) of uit te breiden (verlengen) langs een as. Huidig onderzoek heeft de planaire celpolariteit (PCP) -route betrokken bij het reguleren van de subcellulaire lokalisatie van de factoren die bij dit proces betrokken zijn. Klassiek zijn de eerste fasen van de ontwikkeling van hartkleppen bestudeerd in doorsneden van embryonale harten of in ex vivo AVC- of OFT-explantaten gekweekt op collageengels. Deze benaderingen maken de analyse van apico-basale polariteit mogelijk, maar maken de analyse van celgedrag binnen het vlak van het epitheel of van de morfologische veranderingen van migrerende cellen niet mogelijk. Hier tonen we een experimentele benadering die de visualisatie van het endocardium in valvulogene regio's mogelijk maakt als een planair veld van cellen. Deze experimentele aanpak biedt de mogelijkheid om PCP, planaire topologie en intercellulaire communicatie binnen het endocardium van de OFT en AVC te bestuderen tijdens de ontwikkeling van de klep. Het ontcijferen van nieuwe cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de morfogenese van de hartklep kan bijdragen aan het begrijpen van aangeboren hartaandoeningen geassocieerd met endocardiale kussendefecten.
Introduction
Het hart is het eerste functionele orgaan van een zoogdierembryo. Rond embryonale dag (E) 7,5 bij muizen vormen bilaterale precardiale mesodermcellen de cardiale halve maan in de ventrale kant1. De cardiale halve maan bevat twee populaties van precardiale cellen die voorlopers van het myocardium en het endocardium2 omvatten. Rond E8.0 smelten de cardiale voorlopers samen in de middellijn en vormen de primitieve hartbuis bestaande uit twee epitheliale weefsels, het buitenste myocardium en het binnenste endogarium, een gespecialiseerd endotheel gescheiden door een extracellulaire matrix genaamd cardiale gelei. Later, bij E8.5, ondergaat de hartbuis een rechterwaartse lus. Het lusvormige hart heeft verschillende anatomische regio's met specifieke moleculaire handtekeningen zoals het uitstroomkanaal (OFT), de ventrikels en het atrio-ventrikelkanaal (AVC)3. Hoewel aanvankelijk de hartbuis aan de instroomzijde uitzet door de toevoeging van cellen4, resulteert intensieve hartproliferatie bij E9,5 in ballonvorming van de kamers en vestiging van het trabeculaire netwerk5. Klepvorming vindt plaats in de AVC (toekomstige mitralis- en tricuspidaliskleppen) en in de OFT (toekomstige aorta- en longkleppen).
Het endocardium speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van kleppen. Endocardiale cellen ondergaan epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT) in de AVC en OFT om de endocardiale kussens te vormen, een structuur die verschijnt bij het begin van de klepontwikkeling. Verschillende signaleringsroutes activeren dit proces; bij E9,5 bij muizen bevordert NOTCH geactiveerd in het endocardium als reactie op van myocards afgeleide BMP2 invasieve EMT van endocardcellen in de AVC- en OFT-regio's door activering van TGFβ2 en SNAIL (SNAI1), die de expressie van vasculair endotheel cadherine (VE-cadherine), een transmembraancomponent van adherens junctions (AJs)6,7,8 direct onderdrukt . In de OFT wordt de activering van het endocardium om EMT te initiëren gemedieerd door FGF8 en BMP4, waarvan de expressie wordt geactiveerd door NOTCH 9,10,11,12.
Progressie van EMT omvat cellulaire dynamiek als cellen van vorm veranderen, kruispunten met hun buren verbreken en opnieuw maken, delamineren en beginnen te migreren13. Deze veranderingen omvatten AJ-remodellering en geleidelijke demontagevan 14,15, planaire celpolariteit (PCP) signalering, het verlies van apico-basale polariteit (ABP), apicale vernauwing en cytoskeletale organisatie16,17. ABP verwijst naar de verdeling van eiwitten langs de voorste-achterste as van een cel. In het zich ontwikkelende hart is ABP-regulatie in cardiomyocyten vereist voor ventriculaire ontwikkeling18. PCP verwijst naar een gepolariseerde verdeling van eiwitten in cellen over het vlak van een weefsel en reguleert de cellulaire distributie; epithelia met een stabiele geometrie bestaan uit zeshoekige cellen, waarbij slechts drie cellen samenkomen op de hoekpunten 19,20,21,22. Verschillende cellulaire processen, zoals celdeling, burenuitwisseling of delaminatie die plaatsvindt tijdens epitheliale morfogenese, produceren een toename van het aantal cellen dat convergeert op een hoekpunt en het aantal naburige cellen dat een bepaalde cel heeft22. Dit cellulaire gedrag gerelateerd aan PCP kan worden gereguleerd door verschillende signaalroutes, actinedynamiek of intracellulaire handel23.
De gegevens die zijn gegenereerd bij het bestuderen van de klepontwikkeling bij muizen zijn verkregen uit transversale, coronale of sagittale secties van E8,5 en E9,5 embryonale harten, waar het endocardium wordt weergegeven als een lijn van cellen in plaats van als een veld van cellen - het endocardium bedekt het hele binnenoppervlak van de hartbuis24. Embryonale secties staan de analyse van PCP in het endocardium van muizenembryo's niet toe. Onze nieuwe experimentele methode maakt de analyse van endocardiale celverdeling, AJ-anisotropie en eencellige vormanalyse mogelijk, zoals weergegeven in de representatieve resultaten. Dit type gegevens is vereist voor PCP-analyse, samen met de beschrijving van andere moleculen die verband houden met PCP, niet weergegeven in dit rapport. Immunofluorescentie op de hele berg, specifieke monstervoorbereiding en het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen maken planaire polariteitsanalyse in het endocardium mogelijk bij het begin van de klepontwikkeling bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies werden goedgekeurd door het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Animal Experimentation Ethics Committee en door de Gemeenschap van Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Alle dierprocedures zijn in overeenstemming met EU-richtlijn 2010/63EU en Aanbeveling 2007/526/EG betreffende de bescherming van dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden, vastgesteld in de Spaanse wetgeving onder Real Decreto 1201/2005.
1. Obtention van AVC en/of OFTs (aangepast van Xiao et al. 25)
- Zet 's middags kruisingen op tussen vrouwelijke mTmG en mannelijke VE-Cadherin-Cre-ERT/+.
- Controleer de volgende ochtend op een vaginale plug. Als er een vaginale plug is, tel deze dan als een halve dag (E0.5). Afhankelijk van het experiment van belang, tel 8 dagen of 9 dagen.
- 24 uur voor de dissectie, maagsonde de zwangere vrouw oraal met 50 μL van 5 mg / ml 4-OH-Tamoxifen verdund in maïsolie.
OPMERKING: Deze dosis zal een beperkte hoeveelheid CRE-gemedieerde recombinatie induceren die wordt onthuld door de aanwezigheid van GFP-positieve klonen. De juiste dosis moet worden bepaald bij elke nieuwe partij 4-OH-Tamoxifen. - Offer het zwangere vrouwtje op E8,5 of E9,5 door cervicale dislocatie.
- Open de buik van de zwangere muizen met een schaar en verwijder de baarmoeder met de embryo's met een schaar en een fijne tang.
- Plaats de baarmoeder in een petrischaaltje met ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% Tween-20 (PBT).
- Verwijder de individuele deciduae uit de baarmoeder onder een ontleedmicroscoop en gebruik een fijne tang.
- Maak met behulp van een fijn pincet een incisie in het witte deel van de decidua, waar het embryo zich bevindt, verwijder het voorzichtig, vermijd trekken en breng de embryo's over naar een nieuwe petrischaal met verse PBT met behulp van een P1000 met de punt afgesneden, waardoor een diameter overblijft die groot genoeg is voor een embryo om door te gaan zonder te breken.
- Neem voor genotypering een klein stukje van de dooierzak (0,5 mm2) of een stuk van de staart (vanaf het achterste uiteinde, 5 tot 10 somites naar de kop) en verteer het in 100 μL geschikte buffer.
- Breng de embryo's onder de zuurkast over in ijskoude 4% paraformaldehyde (4% PFA) in steriel gefilterd PBS in een microcentrifugebuis (2 ml) bij 4 °C. Bevestig de embryo's van 2 uur tot een nacht (O/N) bij 4 °C op een nutator.
- Verwijder onder de zuurkast het 4% PFA-fixatief uit de microcentrifugebuizen zonder de embryo's aan te raken. Gooi de PFA weg in een geschikte container.
- Was de embryo's 5x in koude PBT gedurende 10 minuten elk op kamertemperatuur (RT).
- Verwijder met een fijne tang het hart en breng het over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml met verse PBT.
2. Immunofluorescentie van het embryonale hart van de muis
- Vervang PBT door PBSTr (0,4% Triton X-100 in PBS) en was de monsters 3x, elk 5 minuten, op RT op een orbitale shaker.
- Vervang PBSTr door een blokkerende oplossing (PBSTr met 10% warmte-geïnactiveerd runderserum). Incubeer van 2 uur tot O/N bij 4 °C op een orbitale schudder.
- Vervang de blokkerende oplossing door een blokkerende oplossing die primair antilichaam bevat in de gewenste concentratie (voor anti-GFP of anti-VE-Cadherine-antilichaam, gebruik 1:1000 verdunning). Incubeer O/N op een orbitale shaker bij 4 °C.
- Na O/N-incubatie bij 4 °C incuberen gedurende 1,5 uur bij RT op een orbitale schudder. Deze stap is erg belangrijk om de signaal-ruisverhouding te verhogen.
- Verwijder en bewaar de primaire antilichaamoplossing op 4 °C voor maximaal drie toekomstige experimenten (voeg natriumazide toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor de beste conservering).
- Was de embryo's 3x met PBSTr gedurende 3 min per stuk.
- Was de embryo's met PBSTr 3x gedurende 30 minuten elk op een orbitale schudder op 4 °C.
- Voeg na de laatste wasbeurt 1 ml blokkerende oplossing toe die 1:1000 fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam bevat tegen de primaire antilichaamgastheersoort. Voeg ook 1:3000 DAPI toe aan de oplossing en incubeer de embryo's O/N op een orbitale shaker bij 4 °C.
- Na O/N-incubatie bij 4 °C incuberen gedurende 1,5 uur bij RT op een orbitale schudder. Deze stap is erg belangrijk om de signaal-ruisverhouding te verhogen.
- Was de embryo's 3x met PBSTr gedurende 3 min per stuk.
- Was de embryo's met PBSTr 3x-5x gedurende 30 minuten elk op een orbitale shaker op RT.
3. Montage van de embryonale AVC of OFTs van de muis
- Leg de hartjes op een petrischaaltje (35 mm) met PBS.
- Isoleer met behulp van een wolfraamdraad en een fijne tang de AVC of de OFT en snijd ze in de lengterichting26.
- Bereid coverslips (22 mm x 22 mm), dia's (60 mm x 24 mm), een tang, een P200-pipet met de juiste uiteinden, papieren handdoek en alle waterige op glycerol gebaseerde montagemedia voor fluorescentie, zonder DAPI.
- Gebruik een vergelijkbare aanpak als in Xiao, C. et al.25, plak twee stroken tape op een dia, gescheiden door 0,3-0,6 cm om een 3D-ruimte te creëren waarmee de monsters de oorspronkelijke vorm kunnen behouden zonder ze te verpletteren.
- Laat de monsters voorzichtig en met behulp van het minimale buffervolume op de schuif tussen de tapestrepen vallen met behulp van een gesneden P200-tippipet. Gebruik een ontleedmicroscoop om de nauwkeurigheid te verhogen.
- Plaats de monsters met behulp van een fijne tang met het endocardium naar boven gericht (myocardium naar beneden op de dia).
- Verwijder overtollig PBS met een papieren handdoek (vermijd het aanraken van het monster) en droog de monsters vervolgens gedurende 1-2 minuten op RT om de monsters aan de dia te laten kleven.
- Voeg 40 μL waterige montagemedia toe aan het weefsel.
- Plaats de afdeksel over de twee stukjes tape en laat deze langzaam met een naald of tang op het weefsel zakken. Vermijd het creëren van luchtbellen.
- Sluit de coverslip af met één druppel nagellak op elk hoekpunt van de coverslip.
- Zodra de nagellak droog is, reinigt u de overtollige bevestigingsmedia van de zijkanten van de afdekplaat met behulp van een absorberend keukenpapier. Vermijd het verplaatsen van de coverslip.
- Voeg nagellak toe langs de randen van de afdeklip om het volledig af te dichten, waardoor verdamping van montagemedia wordt voorkomen.
- Gebruik een rechtopstaande of een omgekeerde confocale microscoop om foto's te maken op 10x voor algemeen zicht en op 63x met 3x zoom voor gedetailleerde beelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gegevens die met behulp van dit protocol worden gegenereerd, laten zien dat het mogelijk is om en face imaging van het endocardium van de AVC uit te voeren. Het eerste doel was om de celvorm van het endocardium te analyseren tijdens de vorming van de kleppen met een cellulaire resolutie (figuur 1). Om individuele endocardcellen op E9.5 te benadrukken, gebruikten we twee transgene muizenstammen. (1) ROSAmT/mG is een tweekleurig fluorescerend Cre reporter-allel (tdTomato/mT en EGFP/mG) waarvan fluorescentie wordt gedetecteerd op het celmembraan. Zonder Cre-gemedieerde activering drukt het transgen tdTomato (mT) uit. Na Cre-gemedieerde activering wordt tdTomato-expressie vervangen door EGFP-fluorescentie-expressie (mG) in specifieke cellen en klonale derivaten27. (2) De Cdh5CreERT2/+ muislijn brengt tamoxifen-induceerbare CRE-recombinase (CreERT2) tot expressie onder de regulatie van de vasculaire endotheel cadherinepromotor (Cdh5), die tot expressie komt in het vasculaire endotheel en endogarium in de embryonale stadia28. We kruisten een mannetje en een vrouwtje van elk genotype om embryo's te verkrijgen die de twee transgenen dragen om de expressie van GFP in individuele cellen van het endocardium te activeren. Om dit te bereiken, hebben we lage doseringen tamoxifen ingeënt om CRE-expressie in een verminderd aantal cellen te activeren. Als gevolg hiervan drukten enkele cellen, of klonen van enkele cellen, GFP tot expressie in het endocardium (figuur 1A). GFP-expressie (figuur 1A, B) in combinatie met VE-Cadherine subcellulaire lokalisatie (figuur 1C) is een effectieve benadering om de relatie tussen AJ-dynamica en filopodiavorming in pre-EMT-cellen te bestuderen, omdat deze cellen membraanuitsteeksels ontwikkelen als AJs29 oplossen. PCP-signalen kunnen anisotrope contractiliteit verlenen aan de AJ's en cellulaire krachten produceren die gepolariseerde morfogenese in de epithelia bevorderen30. We vonden verschillen in de intensiteit van VE-Cadherine-kleuring in het endocardium (figuur 2), wat aangeeft dat we anisotrope contractiliteit in het embryonale endocardium van AVC in pre-valvulaire stadia niet kunnen weggooien.
Het tweede doel was het analyseren van de planaire topologie van het endocardium tijdens de ontwikkeling van de klep (figuur 2). Om het aantal cellen te definiëren dat convergeert in een enkele vertex, hebben we het hele hart gekleurd met VE-Cadherine-antilichaam op E8.5 en E9.5 (figuur 2A, B). Andere moleculen gelokaliseerd op cel-celcontacten van de endocardiale cel zouden ook nuttig zijn voor dat doel (bijvoorbeeld β-Catenine). Bij E8.5 heeft het endocardium van de AVC de neiging om een stabiele epitheliale organisatie te hebben en we konden geen hoekpunten detecteren die door meer dan vier cellen werden gevormd (figuur 2A, C). Later op E9.5 vonden we hoekpunten bestaande uit maximaal zes cellen die rozetachtige structuren vormen (figuur 2B, D), vergelijkbaar met de cellulaire organisatie die eerder werd beschreven in epithelia die actieve celherschikkingenondergaat 31, wat suggereert dat het AVC-endocardium een actieve cellulaire herschikking ondergaat tijdens de ontwikkeling van de klep.
Figuur 1: Eencellige vormanalyse in prevalvulair endocardium. (A) AVC van E9,5 muizenembryo dat longitudinaal is geopend met verspreide GFP-positieve cellen. (B) GFP-expressie in afzonderlijke cellen definieert de celvorm bij cellulaire resolutie. (C) Whole-mount kleuring van VE-Cadherin benadrukt AJs. Filopodia worden gegenereerd in domeinen van de cel die VE-Cadherine (paarse pijlen) niet lokaliseren, en vice versa lokaliseert VE-Cadherine in domeinen van de cel die glad zijn en geen filopodia vormen (blauwe pijlpunten). v, ventraal; d, dorsaal. Schaalbalk in A is 100 μm; in B en C is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Planaire topologie en anisotropie van planair gelokaliseerde eiwitten kunnen worden gedefinieerd in en face beelden van endocardium aan het AV-kanaal. VE-Cadherine is gelokaliseerd bij de cel-celcontacten van het endocardium. (A) E8.5 en (B) E9.5 AVC van embryo's werden in de lengterichting geopend. Vergrotingen in (C) en (D) stelden ons in staat om het aantal cellen te observeren dat convergeert in een hoekpunt. Bovendien kunnen we verschillende intensiteiten in de VE-Cadherine-kleuring onderscheiden, wat aangeeft dat de locatie in de AVC anisotroop is. Schaalbalk in A en B is 100 μm; in C en D is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het endocardium is een epitheliale monolaag die het gehele binnenoppervlak van de embryonale hartbuis bedekt. Tijdens de ontwikkeling van de klep ondergaan endocardcellen in de prospectieve valvulaire regio's EMT, dus endocardcellen transformeren en herschikken hun cytoskelet om te delamineren van het endocardium naar de cardiale gelei. Wij en anderen hebben relevante gegevens verkregen over de ontwikkeling van kleppen in muizenembryo's door transversale secties van E8.5 en E9.5 embryonale harten te analyseren, waarbij het endocardium wordt weergegeven als een rij cellen 6,8,24,32. Deze benadering maakte de analyse mogelijk van de expressie van signaalroutes en andere moleculen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van kleppen, maar het was niet mogelijk om ruimtelijke aspecten van het pre-valvulaire endocardium te analyseren.
AVC- of OFT-explantaten werden voornamelijk gebruikt om transformerende EC op een 3D-collageengel te bestuderen. Explantaten zijn nuttig voor EMT-kwantificering, de analyse van transformatiecapaciteit of het testen van geneesmiddelen na enkele dagen in cultuur 6,7,11,33. Deze ex vivo experimenten maken ook de uitbreiding van het endocardium bovenop de collageengel als monolaag mogelijk, maar de omgevingsomstandigheden waarin ex vivo cardiale explantaten worden gekweekt, verschillen van in utero-omstandigheden. Unidirectionele bloedstroom is bijvoorbeeld essentieel voor een goede klepontwikkeling34,35 en wordt alleen bereikt in utero, niet in ex vivo, explantaten.
Deze nieuwe benadering stelt ons in staat om het intacte valvulaire endocardium en gezicht te observeren tijdens het begin van de klepontwikkeling zonder enige omgevingsmanipulatie. Het maakt analyse van de cellulaire distributie van het valvulaire endocardium mogelijk, evenals eencellige vormanalyse voor en tijdens EMT in utero-omstandigheden . We kunnen ook de intensiteit en organisatie van de cel-celcontacten en de subcellulaire verdeling van relevante moleculen tijdens EMT observeren en analyseren. Deze techniek biedt ook de mogelijkheid om subcellulaire structuren van het endocardium te analyseren, de activering van signaalroutes met behulp van reportergenen, het effect dat geninactivatie kan hebben op cellulair gedrag en hoe het naburige cellen van het wildtype kan beïnvloeden.
Om monsters van hoge kwaliteit te verkrijgen, is het belangrijk om zeer voorzichtig te zijn bij het hanteren ervan, omdat onzuiverheden (bijv. Microvezels) die aan het weefsel kleven, kunnen resulteren in artefacten tijdens het vastleggen van afbeeldingen. Bovendien, omdat het zeer kleine monsters zijn, is het risico op breken hoog, dus moet men het weefsel (stap 1. en stap 2.) in langzame schudders wassen. Tijdens het wisselen van media met pipetten, raden we aan de punt af te snijden om te voorkomen dat het weefsel instort terwijl het door de punt gaat in het geval dat het per ongeluk wordt geabsorbeerd. Om een expert in deze techniek te worden, is een leercurve nodig, die langer of korter zal zijn, afhankelijk van de eerdere ervaring van de onderzoeker met micromanipulatie.
Het kiezen van het juiste fixatief en het juiste tijdstip van fixatie kan belangrijk zijn in het geval van het gebruik van transgenen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. De anatomische structuur wordt niet beïnvloed door verschillende fixatieven zoals ethanol 70%, methanol, PFA 4% of formaline 10%.
Voor het tegengaan van kernen raden we de incubatie van monsters met DAPI aan, omdat de penetratie veel efficiënter is dan het gebruik van montagemedia met DAPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies PID2019-104776RB-I00 en CB16/11/00399 (CIBER CV) van MCIN/AEI/10.13039/501100011033 aan J. L. P. J.G.-B. werd gefinancierd door Programa de Atracción de Talento uit Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. werd gefinancierd door Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). We danken de CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, medegefinancierd door MCIN/AEI /10.13039/501100011033 en FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). We bedanken ook A. Galicia en L. Méndez voor het houden van muizen. De kosten van deze publicatie werden gedeeltelijk ondersteund door middelen van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling. De CNIC wordt ondersteund door de ISCIII, de MCIN en de Pro CNIC Foundation en is een Severo Ochoa Center of Excellence (subsidie CEX2020-001041-S) gefinancierd door MCIN/AEI /10.13039/501100011033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
