Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Лицо Подготовка эндокардиальной подушки к анализу планарного морфогенеза у эмбрионов мышей

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64207
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

Классически эндокард примордия эмбрионального клапана мыши был проанализирован с использованием поперечного, коронального или сагиттального сечений. Наш новый подход к двумерной визуализации эндокарда в вальвулогенных областях позволяет проводить анализ плоской полярности и клеточной перестройки эндокарда во время развития клапана.

Abstract

Изучение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе развития сердца млекопитающих, имеет важное значение для лечения врожденных пороков сердца человека. Развитие примитивных сердечных клапанов включает эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМТ) клеток эндокарда из атриовентрикулярного канала (АВК) и оттоковых путей (ОФТ) сердца в ответ на местные индуктивные сигналы миокарда и эндокарда. Как только клетки расслаиваются и вторгаются во внеклеточный матрикс (сердечный желе), расположенный между эндокардом и миокардом, образуются примитивные эндокардиальные подушки (ЭК). Этот процесс подразумевает, что эндокард должен заполнить пробелы, оставленные расслоенными клетками, и должен реорганизоваться, чтобы сойтись (сузить) или расширить (удлинить) вдоль оси. Текущие исследования показали, что путь полярности плоских клеток (PCP) регулирует субклеточную локализацию факторов, участвующих в этом процессе. Классически, начальные фазы развития сердечного клапана были изучены в поперечных сечениях эмбриональных сердец или эксплантатов in vivo AVC или OFT, культивируемых на коллагеновых гелях. Эти подходы позволяют анализировать апико-базальную полярность, но не позволяют анализировать поведение клеток в плоскости эпителия или морфологические изменения мигрирующих клеток. Здесь мы показываем экспериментальный подход, позволяющий визуализировать эндокард в вальвулогенных областях как плоское поле клеток. Такой экспериментальный подход дает возможность изучать ПЦП, планарную топологию и межклеточную связь в эндокарде OFT и AVC при разработке клапана. Расшифровка новых клеточных механизмов, участвующих в морфогенезе сердечного клапана, может способствовать пониманию врожденных пороков сердца, связанных с дефектами эндокардиальной подушки.

Introduction

Сердце является первым функциональным органом эмбриона млекопитающего. Около эмбрионального дня (E) 7,5 у мышей двусторонние клетки прекардиальной мезодермы образуют сердечный полумесяц в вентральной стороне1. Сердечный полумесяц содержит две популяции прекардиальных клеток, которые включают предшественников миокарда и эндокарда2. Около E8.0 сердечные предшественники сливаются в средней линии, образуя примитивную сердечную трубку, состоящую из двух эпителиальных тканей, наружного миокарда и внутреннего эндокарда, который представляет собой специализированный эндотелий, разделенный внеклеточным матриксом, называемым сердечным желе. Позже, при E8.5, сердечная трубка подвергается правой петле. Петлевое сердце имеет различные анатомические области со специфическими молекулярными сигнатурами, такими как отток (OFT), желудочки и атрио-желудочковый канал (AVC)3. Хотя первоначально сердечная трубка расширяется на стороне притока за счет добавления клеток4, при E9.5 интенсивная пролиферация сердца приводит к раздуванию камер и созданию трабекулярной сети5. Образование клапанов происходит в АВК (будущие митральные и трикуспидальные клапаны) и в ОФТ (будущие аортальные и легочные клапаны).

Эндокард играет решающую роль в развитии клапанов. Клетки эндокарда подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМТ) в АВК и ОФТ с образованием эндокардиальных подушек, структуры, которая появляется в начале развития клапана. Различные сигнальные пути активируют этот процесс; при E9.5 у мышей NOTCH активируется в эндокарде в ответ на BMP2, полученный из миокарда, способствует инвазивной ЭМТ эндокардиальных клеток в областях AVC и OFT посредством активации TGFβ2 и SNAIL (SNAI1), что непосредственно подавляет экспрессию сосудистого эндотелиального кадгерина (VE-кадгерина), трансмембранного компонента адгезивных переходов (AJs)6,7,8 . В OFT активация эндокарда для инициирования EMT опосредована FGF8 и BMP4, экспрессия которых активируется NOTCH 9,10,11,12.

Прогрессирование ЭМТ включает в себя клеточную динамику, поскольку клетки меняют форму, ломают и переделывают соединения со своими соседями, расслаиваются и начинают мигрировать13. Эти изменения включают ремоделирование AJ и постепенную разборку 14,15, передачу сигналов полярности плоских клеток (PCP), потерю апико-базальной полярности (ABP), апикальное сужение и цитоскелетную организацию 16,17. ABP относится к распределению белков вдоль передне-задней оси клетки. В развивающемся сердце регуляция АБП в кардиомиоцитах необходима для развития желудочков18. PCP относится к поляризованному распределению белков внутри клеток по всей плоскости ткани и регулирует клеточное распределение; эпителии со стабильной геометрией состоят из шестиугольных клеток, где только три клетки сходятся в вершинах 19,20,21,22. Различные клеточные процессы, такие как деление клеток, обмен соседей или расслоение, происходящие во время эпителиального морфогенеза, приводят к увеличению числа клеток, которые сходятся на вершине, и количества соседних клеток, которые данная клетка имеет22. Это клеточное поведение, связанное с PCP, может регулироваться различными сигнальными путями, динамикой актина или внутриклеточным трафиком23.

Полученные данные, изучающие развитие клапанов у мышей, были получены из поперечных, корональных или сагиттальных срезов эмбриональных сердец Е8,5 и Е9,5, где эндокард показан в виде линии клеток, а не как поле клеток — эндокард покрывает всю внутреннюю поверхность сердечной трубки24. Эмбриональные срезы не позволяют проводить анализ ПЦП в эндокарде эмбрионов мышей. Наш новый экспериментальный метод позволяет анализировать распределение клеток эндокарда, анизотропию AJ и анализ формы одной клетки, как показано в репрезентативных результатах. Этот тип данных необходим для анализа PCP вместе с описанием других молекул, связанных с PCP, не показанных в этом отчете. Цельная иммунофлуоресценция, специфическая пробоподготовка и использование генетически модифицированных мышей позволяют проводить планарный анализ полярности в эндокарде в начале развития клапана у мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Исследования на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) и Сообществом Мадрида (ref. PROEX 155.7/20). Все процедуры для животных соответствовали Директиве ЕС 2010/63EU и Рекомендации 2007/526/EC о защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, принятым в испанском законодательстве в соответствии с Real Decreto 1201/2005.

1. Получение AVC и/или OFT (адаптировано из Xiao et al. 25)

  1. Устанавливайте кресты во второй половине дня между женским mTmG и мужским VE-Cadherin-Cre-ERT/+.
  2. На следующее утро проверьте наличие влагалищной пробки. Если есть вагинальная пробка, считайте ее как полдня (Е0,5). В зависимости от интересующего эксперимента, считайте 8 дней или 9 дней.
  3. За 24 ч до рассечения беременную женщину перорально разводят 50 мкл 5 мг/мл 4-ОН-тамоксифена, разведенного в кукурузном масле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта доза будет индуцировать ограниченное количество CRE-опосредованной рекомбинации, выявленной присутствием GFP-положительных клонов. Соответствующую дозу необходимо будет определять с каждой новой партией 4-ОН-тамоксифена.
  4. Принесите беременную самку в Е8,5 или Е9,5 при вывихе шейки матки.
  5. Откройте брюшко беременных мышей с помощью ножниц и удалите матку, содержащую эмбрионы, с помощью ножниц и тонких щипцов.
  6. Поместите матку в чашку Петри, содержащую ледяной 1x фосфат-буферный физиологический раствор (PBS) с 0,1% Tween-20 (PBT).
  7. Удалите отдельные децидуи из матки под рассекающим микроскопом и с помощью тонких щипцов.
  8. Используя тонкий пинцет, сделайте разрез в белой части децидуа, где находится эмбрион, аккуратно удалите его, избегая вытягивания, и перенесите эмбрионы в новую чашку Петри со свежим ПБТ, используя P1000 с отрезанным наконечником, оставив диаметр достаточно большим, чтобы эмбрион мог пройти, не ломаясь.
  9. Для генотипирования возьмите небольшой кусочек желточного мешочка (0,5мм2) или кусочек хвоста (от заднего конца, считая от 5 до 10 сомитов по направлению к голове) и переварите его в 100 мкл соответствующего буфера.
  10. Под вытяжным капюшоном перенесите эмбрионы в ледяную 4% параформальдегид (4% PFA) в стерильно-фильтрованном PBS в микроцентрифуге (2 мл) трубке при 4 °C. Зафиксируйте эмбрионы от 2 ч до ночи (O/N) при 4 °C на nutator.
  11. Под вытяжным капюшоном удалите 4% фиксатор PFA из трубок микроцентрифуги, не касаясь эмбрионов. Выбросьте PFA в соответствующий контейнер.
  12. Промывайте эмбрионы 5x в холодном PBT в течение 10 мин каждый при комнатной температуре (RT).
  13. Используя тонкие щипцы, удалите сердце и перенесите его в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл со свежим ПБТ.

2. Цельная иммунофлуоресценция эмбрионального сердца мыши

  1. Замените PBT на PBSTr (0,4% Triton X-100 в PBS) и промывайте образцы 3x, 5 мин каждый, в RT на орбитальном шейкере.
  2. Замените PBSTr блокирующим раствором (PBSTr с 10% термоинактивированной бычьей сывороткой). Инкубировать от 2 ч до O/N при 4 °C на орбитальном шейкере.
  3. Заменить блокирующий раствор блокирующим раствором, содержащим первичное антитело в нужной концентрации (для анти-GFP или анти-VE-Кадгеринового антитела, используйте в разведении 1:1000). Инкубировать O/N на орбитальном шейкере при 4 °C.
  4. После инкубации O/N при 4°C инкубируют в течение 1,5 ч при РТ на орбитальном шейкере. Этот шаг очень важен для увеличения отношения сигнал/шум.
  5. Удалите и держите при 4 °C раствор первичного антитела в течение трех будущих экспериментов (добавьте азид натрия до конечной концентрации 0,02% для наилучшего сохранения).
  6. Промывайте эмбрионы 3 раза PBSTr в течение 3 минут каждый.
  7. Промывайте эмбрионы PBSTr 3x в течение 30 мин каждый на орбитальном шейкере при 4 °C.
  8. После последней промывки добавляют 1 мл блокирующего раствора, содержащего 1:1000 флуоресцентно-конъюгированного вторичного антитела против первичного антитела-хозяина. Добавьте также 1:3000 DAPI в раствор и инкубируйте эмбрионы O/N на орбитальном шейкере при 4 °C.
  9. После инкубации O/N при 4°C инкубируют в течение 1,5 ч при РТ на орбитальном шейкере. Этот шаг очень важен для увеличения отношения сигнал/шум.
  10. Промывайте эмбрионы 3 раза PBSTr в течение 3 минут каждый.
  11. Промывайте эмбрионы PBSTr 3x-5x в течение 30 минут каждый на орбитальном шейкере в RT.

3. Установка эмбрионального АВК или ОФТ мыши

  1. Положите сердечки на чашку Петри (35 мм), содержащую PBS.
  2. Используя вольфрамовую проволоку и тонкие щипцы, изолируйте AVC или OFT и разрезайте их продольно26.
  3. Подготовьте крышки (22 мм x 22 мм), слайды (60 мм x 24 мм), щипцы, пипетку P200 с соответствующими наконечниками, бумажное полотенце и любые водные монтажные материалы на основе глицерина для флуоресценции без DAPI.
  4. Используя аналогичный подход, как в Xiao, C. et al.25, наклейте две полоски ленты на слайд, разделенные на 0,3-0,6 см, чтобы создать 3D-пространство комнаты, которое позволит образцам сохранить его первоначальную форму, не раздавливая их.
  5. Осторожно и используя минимальный объем буфера, опустите образцы на слайд между ленточными полосами, используя пипетку с наконечником P200. Используйте рассекающий микроскоп для повышения точности.
  6. Используя тонкие щипцы, поместите образцы эндокардом вверх (миокард вниз на слайде).
  7. Удалите излишки PBS бумажным полотенцем (избегайте прикосновения к образцу), а затем высушите образцы в течение 1-2 минут на RT, чтобы образцы прилипли к слайду.
  8. Добавьте на ткань 40 мкл монтажной среды на водной основе.
  9. Поместите крышку на два куска ленты и медленно опустите ее на ткань с помощью иглы или щипцов. Избегайте создания пузырьков воздуха.
  10. Запечатайте крышку, используя одну каплю лака для ногтей на каждой вершине крышки.
  11. Как только лак для ногтей высохнет, очистите лишние монтажные материалы с боковых сторон крышки с помощью впитывающего бумажного полотенца. Избегайте перемещения крышки.
  12. Добавьте лак для ногтей вдоль краев крышки, чтобы полностью запечатать его, предотвращая испарение монтажной среды.
  13. Используя вертикальный или перевернутый конфокальный микроскоп, делайте снимки в 10 раз для общего обзора и в 63 раза с 3-кратным зумом для получения подробных изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Данные, сгенерированные с использованием этого протокола, показывают, что можно выполнить визуализацию лица эндокарда АВК. Первая цель состояла в том, чтобы проанализировать клеточную форму эндокарда во время формирования клапанов при клеточном разрешении (рисунок 1). Чтобы выделить отдельные клетки эндокарда при E9.5, мы использовали два трансгенных штамма мышей. (1) ROSAmT/mG представляет собой двухцветный флуоресцентный репортерный аллель Cre (tdTomato/mT и EGFP/mG), флуоресценция которого обнаруживается на клеточной мембране. Без cre-опосредованной активации трансген экспрессирует tdTomato (mT). При cre-опосредованной активации экспрессия tdTomato заменяется экспрессией флуоресценции EGFP (mG) в специфических клетках и клональных производных27. (2) Мышиная линия Cdh5CreERT2/+ экспрессирует тамоксифен-индуцируемую CRE-рекомбиназу (CreERT2) при регуляции промотора кадгерина эндотелия сосудов (Cdh5), который экспрессируется в эндотелии сосудов и эндокарде на эмбриональных стадиях28. Мы скрестили самца и самку каждого генотипа, чтобы получить эмбрионы, несущие два трансгена, чтобы активировать экспрессию GFP в отдельных клетках эндокарда. Чтобы достичь этого, мы инокулировали низкие дозы тамоксифена для активации экспрессии CRE в уменьшенном количестве клеток. В результате одиночные клетки, или клоны нескольких клеток, экспрессировали GFP в эндокарде (рисунок 1A). Экспрессия GFP (Рисунок 1A,B) в сочетании с субклеточной локализацией VE-Cadherin (Рисунок 1C) является эффективным подходом к изучению взаимосвязи между динамикой AJ и образованием филоподий в клетках до EMT, поскольку у этих клеток развиваются мембранные протрузии по мере растворения AJs 29. Сигналы PCP могут придавать анизотропную сократимость AJs, производя клеточные силы, которые способствуют поляризованному морфогенезу в эпителии30. Мы обнаружили различия в интенсивности окрашивания VE-кадгерина в эндокарде (рисунок 2), что указывает на то, что мы не можем отбросить анизотропную сократимость в эмбриональном эндокарде АВК на предклапанных стадиях.

Второй задачей был анализ планарной топологии эндокарда при развитии клапана (рисунок 2). Чтобы определить количество клеток, сходящихся в одной вершине, мы окрашивали все сердце антителами VE-Cadherin в E8.5 и E9.5 (Рисунок 2A,B). Другие молекулы, локализованные в клеточно-клеточных контактах эндокардиальной клетки, также были бы полезны для этой цели (например, β-Катенин). При E8.5 эндокард AVC имеет тенденцию иметь стабильную эпителиальную организацию, и мы не смогли обнаружить вершины, образованные более чем четырьмя клетками (рисунок 2A,C). Позже на E9.5 мы обнаружили вершины, состоящие из шести клеток, образующих розеткоподобные структуры (рисунок 2B, D), похожие на клеточную организацию, ранее описанную в эпителии, претерпевающую активные клеточные перестройки31, предполагая, что эндокард AVC подвергается активной клеточной перестройке во время развития клапана.

Figure 1
Рисунок 1: Анализ формы одной клетки в преклапанкулярном эндокарде. (A) AVC из эмбриона мыши E9.5 вскрыт продольно, показывая рассеянные GFP-положительные клетки. (B) Экспрессия GFP в отдельных клетках определяет форму клеток при клеточном разрешении. (C) Окрашивание VE-Cadherin цельным креплением подчеркивает AJs. Филоподии генерируются в доменах клетки, которые не локализуют VE-Cadherin (фиолетовые стрелки), и наоборот, VE-Cadherin локализуется в доменах ячейки, которые гладкие и не образуют филоподии (синие наконечники стрелок). v, вентральный; г, дорсальный. Шкала шкалы в А составляет 100 мкм; в B и C составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Планарная топология и анизотропия планарно локализованных белков могут быть определены на изображениях эндокарда в AV-канале. VE-кадгерин локализуется в клеточно-клеточных контактах эндокарда. (A) E8.5 и (B) E9.5 AVC из эмбрионов были вскрыты продольно. Увеличения в (C) и (D) позволили нам наблюдать количество ячеек, которые сходятся в вершине. Кроме того, мы можем различить различные интенсивности в окрашивании VE-Cadherin, что указывает на то, что его расположение в AVC является анизотропным. Шкала в А и В составляет 100 мкм; в C и D составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эндокард представляет собой эпителиальный монослой, который покрывает всю внутреннюю поверхность эмбриональной сердечной трубки. Во время развития клапана клетки эндокарда в перспективных клапанных областях подвергаются ЭМТ, таким образом, клетки эндокарда трансформируются и перестраивают свой цитоскелет, чтобы расслоиться от эндокарда к сердечному желе. Мы и другие получили соответствующие данные о развитии клапанов у эмбрионов мышей путем анализа поперечных срезов эмбриональных сердец E8.5 и E9.5, где эндокард показан в виде ряда клеток 6,8,24,32. Такой подход позволил проанализировать экспрессию сигнальных путей и других молекул, участвующих в развитии клапанов, но проанализировать пространственные аспекты предклапанного эндокарда не удалось.

Экспланты AVC или OFT в основном использовались для изучения трансформации EC на 3D-коллагеновом геле. Экспланты полезны для количественной оценки ЭМТ, анализа трансформационной способности или тестирования лекарств через несколько дней в культуре 6,7,11,33. Эти эксперименты ex vivo также позволяют расширить эндокард поверх коллагенового геля в качестве монослоя, но условия окружающей среды, в которых выращиваются сердечные экспланты ex vivo, отличаются от внутриутробных условий. Например, однонаправленный кровоток необходим для правильного развития клапана34,35 и достигается только внутриутробно, а не in vivo, эксплантами.

Этот новый подход позволяет нам наблюдать неповрежденный клапан эндокарда на лице во время начала развития клапана без каких-либо манипуляций с окружающей средой. Он позволяет анализировать клеточное распределение клапанного эндокарда, а также анализ формы одной клетки до и во время ЭМТ в внутриутробных условиях. Мы также можем наблюдать и анализировать интенсивность и организацию клеточных контактов и субклеточное распределение соответствующих молекул во время ЭМТ. Этот метод также предлагает возможность анализа субклеточных структур эндокарда, активации сигнальных путей с использованием репортерных генов, влияния, которое инактивация генов может оказывать на клеточное поведение, и того, как она может влиять на соседние клетки дикого типа.

Чтобы получить высококачественные образцы, важно быть очень осторожным при обращении с ними, так как примеси (например, микроволокна), которые прилипают к ткани, могут привести к артефактам во время захвата изображений. Кроме того, поскольку это очень маленькие образцы, риск поломки высок, поэтому необходимо промывать ткань (шаг 1. и шаг 2.) в медленных шейкерах. Во время смены среды пипетками мы рекомендуем отрезать наконечник, чтобы ткань не разрушалась при прохождении через наконечник в случае, если она случайно всасывается. Чтобы стать экспертом в этой технике, необходима кривая обучения, которая будет длиннее или короче в зависимости от предыдущего опыта исследователя в микроманипуляции.

Выбор правильного фиксатора и времени фиксации может быть важен в случае использования трансгенов, экспрессирующих флуоресцентные белки. На анатомическую структуру не влияют различные фиксаторы, такие как этанол 70%, метанол, PFA 4% или формалин 10%.

Для противодействия окрашиванию ядер мы рекомендуем инкубацию образцов с помощью DAPI, поскольку проникновение намного эффективнее, чем использование монтажных носителей с DAPI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами PID2019-104776RB-I00 и CB16/11/00399 (CIBER CV) от MCIN/AEI/10.13039/501100011033 J.L.P.J.G.-B. финансировался Программой развития талантов из Мадридской коммуны (2020-5ª/BMD-19729). Т.Г.-К. финансировался организацией «Аюдас за формирование университетских профессоров» (FPU18/01054). Мы благодарим Отдел микроскопии и динамической визуализации CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, совместно финансируемый MCIN/AEI /10.13039/501100011033 и FEDER «Способ сделать Европу» (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Мы также благодарим А. Галисию и Л. Мендеса за разведение мышей. Стоимость этой публикации была частично поддержана за счет средств Европейского фонда регионального развития. CNIC поддерживается ISCIII, MCIN и Pro CNIC Foundation и является Центром передового опыта Северо Очоа (грант CEX2020-001041-S), финансируемым MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
  4. Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
  5. Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
  6. Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
  7. Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
  8. Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
  9. MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
  10. de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
  11. Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
  12. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
  13. Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
  14. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
  15. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
  16. Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
  17. Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
  18. Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
  19. Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
  20. Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
  21. Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
  22. Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
  23. Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
  24. Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
  25. Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
  26. Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
  27. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  28. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  29. Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
  30. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  31. Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
  32. Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
  33. Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
  34. Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
  35. Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).

Tags

Биология развития выпуск 185
<em>En Лицо</em> Подготовка эндокардиальной подушки к анализу планарного морфогенеза у эмбрионов мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J.… More

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter