Summary
本文提出了新一代多参数分析平台，具有更高的通量，用于表征细胞外囊泡亚群。该方法基于多重生物传感方法与原子力显微镜的计量和形态力学分析相结合，结合拉曼光谱，以鉴定捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标。
Abstract
细胞外囊泡（EV）是由所有细胞产生的膜衍生的微小囊泡，直径范围为50至数百纳米，用作细胞间通讯的手段。它们正在成为各种疾病的有前途的诊断和治疗工具。细胞使用两种主要的生物发生过程来生产大小、组成和含量不同的 EV。由于它们的大小、组成和细胞来源高度复杂，它们的表征需要结合分析技术。该项目涉及开发新一代多参数分析平台，具有更高的吞吐量，用于表征电动汽车的亚群。为了实现这一目标，这项工作从该小组建立的纳米生物分析平台（NBA）开始，该平台允许基于多重生物传感方法与原子力显微镜（AFM）的计量和形态力学分析相结合的EV进行原始研究微阵列生物芯片上捕获的囊泡靶标。目的是通过拉曼光谱的表型和分子分析来完成这项 EV 研究。这些发展使得能够提出一种多模态且易于使用的分析解决方案，用于区分具有临床潜力的生物体液中的EV亚群
Introduction
对诊断和治疗学1，2，3，4，5中的EV研究的兴趣日益浓厚，加上该领域面临的挑战，导致开发和实施各种方法来量化或表征这些囊泡的方法和技术。最广泛使用的EV鉴定方法是蛋白质特异性免疫印迹和蛋白质组学，以确认EV的来源，透射电子显微镜（TEM）以确认其结构，以及纳米颗粒跟踪分析（NTA）以量化其在样品体积中的数量和尺寸分布。
然而，这些技术本身都不能提供表征EV子集所需的所有信息。由于电动汽车生化和物理特性的多样性，其固有的异质性阻碍了可靠和可重复的全球分析，特别是对于混合物（粗样品）中所含的电动汽车。因此，电动汽车需要检测和表征方法，无论是单独还是一般，以补充其他更快但非选择性的方法6。
通过TEM（或cryoTEM）或AFM进行高分辨率成像，可以确定纳米分辨率为7，8，9，10，11，12的EV的形态和计量。然而，将电子显微镜用于生物物体（例如EV）的主要限制是需要真空来进行研究，这需要对样品进行固定和脱水。这种制备使得很难从观察到的结构转化为溶液内的EV形态。为了避免样品脱水，cryoTEM技术最适合EV表征13。它广泛用于确定电动汽车的超微结构。通过生物功能化的金纳米颗粒对囊泡进行免疫标记，还可以识别EV的特定亚群，并将其与复杂生物样品中存在的其他颗粒区分开来。然而，由于通过电子显微镜分析的EV数量很少，因此通常难以进行代表复杂和异质样品的表征。
为了揭示这种大小异质性，国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议分析足够数量的宽场图像，并伴有较小的图像，以揭示具有高分辨率14的单个EV。AFM是用于研究电动汽车的光学方法和电子衍射技术的替代方案。该技术使用由柔性悬臂固定的锋利尖端，该悬臂逐行扫描沉积在一个支架上的样品，并通过反馈回路调整尖端与存在的元件之间的距离。这使得表征样品的形貌并收集形态力学信息成为可能15，16，17，18。EV可以在沉积在原子平坦的基板上后，或者在由抗体，肽或适配体功能化的特定底物上捕获以表征各种亚群后通过AFM进行扫描18，19。由于AFM能够在复杂的生物样品中定量并同时探测EV的结构、生物力学和膜生物分子含量，而无需预处理、标记或脱水，因此现在越来越多地用于在温度和介质的生理条件下以精细和多参数的方式表征EV。
本文提出了一种使用核心金生物芯片的方法，该方法能够以多重形式进行（生物）化学功能化。该基板是强大的分析平台的基石，该平台结合了通过表面等离子体共振对EV亚群进行生物检测，一旦EV被吸附/接枝或免疫捕获到芯片上，AFM就可以对EV进行计量和形态力学表征。结合芯片上捕获的EV子集的拉曼特征，该分析平台能够以无标记的方式鉴定生物样品中存在的EV，而无需任何分析前步骤。本文表明，强大的技术与高度严格的底物制备和数据采集方法相结合，使EV分析具有深入性、确定性和稳健性。
该方法的原理是制备金基底，吸附/嫁接或捕获EV亚型，并通过AFM扫描它们以估计每个EV亚群的大小和形态。此外，这些吸附的电动汽车通过拉曼光谱进行分析。事实上，这种底物可以呈现三种日益复杂的界面：裸界面、化学功能化界面或配体微阵列。在描述协议的不同步骤之前，读者参考 图1中纳米生物分析平台（NBA）方法的示意图，该方法结合了表面等离子体共振成像（SPRi），AFM和光谱学。
图1：纳米生物分析平台。该方法结合了（A）表面等离子体共振成像，（B）原子力显微镜和红外/拉曼（纳米）光谱，所有这些都在同一基板上 - 多路复用金芯片。缩写：NBA = 纳米生物分析平台;SPRi = 表面等离子体共振成像;AFM = 原子力显微镜;EV = 细胞外囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
核心金生物芯片构成了该平台的核心，因为所有无标记表征技术都是在该生物芯片上进行的。根据 EV 表征的需求（全球/总 EV 或 EV 子集）和所用方法的局限性/要求，已经开发了三种类型的金生物芯片表面：“裸”，化学功能化的“C11/C16”或配体生物功能化的，称为“配体”金表面。
这种被称为“裸体”的裸生物芯片能够简单地将电动汽车吸附在黄金上。可以选择使用的缓冲液，并以被动方式（孵育然后冲洗步骤）或在流动下（在SPRi中）监测其实现这种吸附。此外，这种被动吸附既可以在整个芯片上（作为宏阵列）实现，也可以使用微量移液器点样器定位在微阵列中。“流动下程序”允许研究人员跟踪动力学和EV吸附水平。当化学层界面可能干扰分析方法（例如，用于拉曼光谱）时，在裸金衬底上采用这种方法。
化学功能化的生物芯片称为“C11/C16”，用于通过与硫醇酸盐形成伯酰胺键，在金表面上共价结合的EV的致密而坚固的“地毯”，目的是获得EV样品的全局视图。事实上，在这种情况下，金被巯基-1-十一醇（11-MUOH：“C11”）和巯基-1-十六烷酸（16-MHA：“C16”）的硫代酸盐混合物官能化，并且一小部分硫醇酸盐被化学活化以建立与靶标的共价结合。同样，这种策略可以被动地（孵育然后冲洗步骤，无论是在“宏阵列”中还是在多个微阵列中使用微量移液器点样器）或在流速下（在SPRi中）实现，以跟踪EV接枝在金表面上的动力学和水平。
配体 生物功能化的生物芯片，称为 “配体”，被化学激活以共价移植不同的配体（例如，抗体，受体），以选择性地捕获（亲和力）在生物样品中共存的不同EV亚群。
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Protocol
1. 金基板制备
注意：在金芯片上产生三种类型的表面：1）裸露表面，2）化学功能化和3）生物功能化（配体嫁接在C11C16层上）。从这一点开始，它们将分别被称为“裸”，“C11C16”和“配体”。
- 金基板制备：
注意：对于此协议，金生物芯片是在洁净室内部制造的。自制生物芯片由玻璃载玻片（SF11）组成，上面涂有铬（2纳米Cr）和金（48纳米金）。生物芯片的长度为28毫米，宽度为12.5毫米，厚度为0.5毫米20。- 使用直流磁控溅射15 通过物理气相沉积 （PVD） 涂覆载玻片。
- 化学功能化：
- 通过将巯基-1-十一烷醇（11-MUOH：C11）和巯基-1-十六烷酸（16-MHA：C16）的摩尔混合物在90%/10%的摩尔混合物中孵育过夜，在搅拌下，并在室温下，使裸芯片功能化。
注意：此步骤将形成稳定的自组装单层（SAM），这对于配体的接枝很有用。 - 用无水乙醇和超纯水清洁生物芯片（轻轻清洗），在氮气下干燥，并在洁净室条件下储存。
- 化学功能化生物芯片的活化：
注意：从此步骤开始，实验必须在分析实验室中进行。- 用超纯水轻轻清洗生物芯片，然后在温和的气流下干燥芯片。为了激活C16羧基，将生物芯片在200mM乙基（二甲氨基丙基）碳二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺（EDC）和50mmol/ L N-羟基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）的混合物中孵育至少30分钟在室温下黑暗中。然后在嫁接实验前用水冲洗。
- 通过将巯基-1-十一烷醇（11-MUOH：C11）和巯基-1-十六烷酸（16-MHA：C16）的摩尔混合物在90%/10%的摩尔混合物中孵育过夜，在搅拌下，并在室温下，使裸芯片功能化。
- 在功能化生物芯片上移植配体：
注意：配体（或某些实验的EV）在芯片上的固定可以在SPRi仪器外被动完成（在激活的芯片上孵育一滴液），也可以在SPRi仪器中动态完成。这构成了 EV或 配体修饰的芯片。 图2 显示了金生物芯片、微量移液器点样器和生物芯片，每个配体液滴300 nL点样后。- 对于配体移植，使用抗体（例如，免疫球蛋白-抗CD41[特异性于源自天然血小板的EV，称为 N-PEV]，抗CD61，抗CD62P，抗CD9和抗OVA[针对卵清蛋白的对照抗体]）和膜联蛋白V等分子。
注意：移植抗体的最佳pH值先前是通过在SPR仪器上进行的预浓缩实验确定的，用于确定配体移植的最佳pH值（见 图3）。由于移植条件随着所用抗体克隆的变化而变化，建议在进行SPRi实验之前确定这些条件。 - 对于移植程序，使用点状物添加 300 nL 的 EV/配体溶液。
注意：浸没在水中的纸应保存在左右孔中，以避免液滴蒸发。此步骤对于将EV/配体保持在稳定性和功能的最佳条件下非常重要。 - 点样后，将生物芯片保持在声浴（频率：37 kHz，功率：30%）下孵育30分钟。用超纯水从顶部清洗生物芯片，并将其轻轻地放在与生物芯片折射率（RI）相同的棱镜上。在调整棱镜顶部的生物芯片时，加入一滴（~2.3μL）与棱镜具有相同RI的油，以在生物芯片和棱镜之间形成均匀的薄层。
注意：此步骤可确保光路中具有相同RI的连续介质。在这一步中，避免将任何气泡掺入油层中非常重要，因为这会改变路径中的光学特性并阻碍进一步的分析。
- 对于配体移植，使用抗体（例如，免疫球蛋白-抗CD41[特异性于源自天然血小板的EV，称为 N-PEV]，抗CD61，抗CD62P，抗CD9和抗OVA[针对卵清蛋白的对照抗体]）和膜联蛋白V等分子。
图 2：生物芯片和手动观察器。 金生物芯片（左）、微量移液器点样器（中）和用 300 nL 配体液滴点样后的生物芯片（右）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：用于确定配体接枝的最佳 pH 值的预浓缩测试。 传感器图将相互作用水平表示为在表面上以相同浓度随机注射（在不同的pH值下）的一个配体的时间函数。OG是洗涤剂，允许在每次注射之间回收基线。在这里，传感器图表明pH 6允许最多的配体移植，SPRi信号为1091RU。缩写：OG = 辛基葡糖苷;RU = 响应单位。 请点击此处查看此图的大图。
2. 表面等离子体共振成像
- 将生物芯片安装在 SPRi 系统上。将PBS缓冲液（电泳缓冲液）的 流速 保持在 50μL/min。
注意：如果有任何气泡，请将流速增加到 500-1，000 μL/min，并经常注射 40 mM 辛基葡糖苷 （OG） 以尽快去除它们。 - SPRi 仪器中金生物芯片的调节：工作角度的选择
- 单击软件左侧的下拉菜单，然后单击 工作目录 以定义保存实验数据的文件夹。之后，点击等 离激元 |图像采集。
- 找到可见不同斑点的图像（如图4A所示），然后单击以选择此图像。要定义感兴趣区域（ROI），如图4所示，请单击光斑内的自动检测或手动定义（图4B），或者在芯片上指代特定位置，即使没有光斑（图4C）。
- 当使用多重生物芯片时，写下配体家族的名称，然后单击相应的点。
注意：配体家族对应于用相同配体官能化的几个斑点。通常，芯片至少呈现每个配体的重复，甚至经常一式三份。 - 单击 完成物种定义 并等待定向到包含获得的等离激元曲线的窗口。
- 选择 工作角度。用光标将黑线拖动到最佳工作角度，然后单击将 镜像移动到工作角度。
注意：等离激元曲线由反射率 （%） 值与角度组成，软件给出了另一条曲线，其中包含斜率 （%） 与角度的值。要选择良好的工作角度，请选择斜率值最高的角度。- 在设备内部进行钝化步骤（由于白蛋白）的情况下，选择一个 工作角度 以获得对表面的最佳灵敏度，从而建立表面反应性的质量控制。
注意：当芯片准备用于亲和/捕获生物检测以减少样品与生物芯片表面之间的非特异性相互作用时，此钝化步骤非常重要。
- 在设备内部进行钝化步骤（由于白蛋白）的情况下，选择一个 工作角度 以获得对表面的最佳灵敏度，从而建立表面反应性的质量控制。
- 单击动力学以开始实时 动力学 监测。一旦软件提示用户定义阴性对照，此时选择无阴性对照（因为这将允许观察 阴性对照 点上的动力学）。
- 以50μL/min的速度注射大鼠血清白蛋白（RSA，200μg/ mL，在乙酸盐缓冲液中制备，pH 4.5）4分钟，以使斑点周围的表面钝化并可能填充配体斑点内的空白空间。
注意：注射RSA以覆盖生物芯片，生物芯片不与任何配体结合。 - 以20μL / min的速度注入乙醇胺（1M）10分钟，以使仍然存在并在表面上反应的羧基失活。
- 通过以 50 μL/min 的速度注入 40 mM OG 洗涤生物芯片 4 分钟。
注意：在钝化步骤之后，调整工作角度（作为样品进样前的新基线测定），以在感兴趣的点上处于最高灵敏度。
- 以50μL/min的速度注射大鼠血清白蛋白（RSA，200μg/ mL，在乙酸盐缓冲液中制备，pH 4.5）4分钟，以使斑点周围的表面钝化并可能填充配体斑点内的空白空间。
- 样品进样：
- 钝化后重新定义等离激元曲线，本次根据配体选择工作角度。
- 在动力学监测中，将流速降低至 20 μL/min，并等待 基线稳定。
- 以所选浓度（根据 EV 和接枝配体之间的亲和力，从 1 x 108 EV/ mL 到 1 x 1010 EV/mL ）进样，然后单击 手动进样 或 自动进样。在手动进样的情况下，进样200μL样品后，点击 停止进样。由于注射的持续时间通常为 10分钟，因此开始跟踪 相互作用的动力学，并通过计算动力学监测期间观察到的注射开始和结束之间的反射率差异来测量 反射率变化 （图5）。
注意：进样的不同样品在代表性结果部分进行了描述。
- 进样后，按照以下两种方法之一完成SPRi实验：
- 在 非固定/液体方法 中，将生物芯片从SPRi设备中取出，在其上添加液滴，然后继续对液体中的表面进行进一步的AFM表征。
- 在固定方法中，注入以20μL / min的速度稀释在水中的戊二醛（0.5%）10分钟，以固定生物芯片上捕获的分子。注入水冲洗表面，取出生物芯片，用蒸馏水非常温和地清洗，然后风干，在AFM下进一步分析。
图4：生物芯片的SPRi CCD图像 。 （A，B）白蛋白钝化后的多路复用生物芯片。（一）无违约芯片;（B）芯片上出现的一些缺陷：斑点融合（i），接枝弱（ii），或灰尘或“污染物”（iii）。选择ROI，在斑点中的颜色（每个配体家族一种颜色），以避免这些“污染物”。当斑点合并时，它们被注意到并被忽略或命名为“配体1和2的混合物”。（C）没有微阵列的裸金芯片，用于检查EV在黄金上的吸附实验。蓝色箭头表示流向。该芯片没有斑点，选择ROI以在进样过程中记录从线1（L1，红色圆圈）到线4（L4，紫色圆圈）的反射率信号。所有三个图像的比例尺 = 1 mm。缩写：SPRi = 表面等离子体共振成像;CCD = 电荷耦合器件;投资回报率 = 感兴趣的区域;EVs = 细胞外囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：将 EV 注射到生物芯片上的 SPRi 实验。 （A）在多路复用生物芯片上捕获实验，显示不同配体的反射率信号。在这里，不同配体的信噪比非常好（特别是在抗CD41斑点上），因为阴性对照的反应可以忽略不计。（B）电动汽车在裸生物芯片上的吸附实验。传感器图显示芯片的调节，包括两次缓冲液冲洗和OG清洁（1），EV样品注入（2）和EV相互作用后的反射率信号（3）。在这个生物芯片上，没有阴性对照，但反射率信号（其动力学，注射后的稳定性）很高，这意味着这些电动汽车能够在金芯片上吸附并保持稳定。缩写：EV = 细胞外囊泡;OG = 辛基葡糖苷。 请点击此处查看此图的大图。
3. 原子力显微镜
- 使用 接触 模式扫描空气中的生物芯片，使用 定量成像模式 扫描液体条件下的生物芯片。
- 将载玻片（在实验室中开发）上面罩顶部的生物芯片对齐，以识别生物芯片上各个微点的位置（图6A）。
注意：掩模包含斑点的标记，根据所使用的斑点对应于配体斑点的位置。该掩模由一个载玻片组成，上面有两个垂直的楔子可以放置芯片。此外，载玻片上标有16个毛毡点，对应于芯片上的斑点定位，这允许通过透明性定位斑点并扫描所需区域。 - 尖端的定位：
- 使用AFM顶部的CCD相机将悬臂定位在必须扫描的正确位置。要遵循此协议，请使用长度为200μm，宽度为28μm的三角形悬臂，弹簧常数为0.08 N / m。
- 将悬臂顶部的激光对准在反馈控制机构中提供最佳响应的位置。
- 扫描：
- 一旦接合并与生物芯片表面接触，以 接触 模式或 定量成像模式 开始AFM采集，从三个到五个大区域（通常为10×10μm²）到小区域（1 x 1μm²）。
注意：可以扫描的不同区域的表示如图 6D所示。确保AFM表征代表整个mm²点，并以良好的分辨率可视化足够的EV以进行稳健的分析（每种条件下至少计数和分析300个EV），并执行计量和形态测量。
- 一旦接合并与生物芯片表面接触，以 接触 模式或 定量成像模式 开始AFM采集，从三个到五个大区域（通常为10×10μm²）到小区域（1 x 1μm²）。
- 原子力显微镜图像处理：
- 首先选择 高度通道，使用JPK数据处理软件处理AFM图像。
- 选择要从每条线中减去的 多项式拟合 以获得拉直的扫描线。
- 选择金晶粒上的高度阈值以消除表面的粗糙度。在参考软件（参见材料表）中，在晶粒提取模块内，使用 8.5 nm 处的高度阈值标记晶粒。过滤谷物后，将显示谷物数量。
注意：通常，粗糙的金基底（RMS 为~3 nm）以及化学和配体层的存在要求将 阈值 设置为 8.5 nm。 - 要提取标记颗粒的多个属性，例如 高度、体积和 直径，请在参考的软件中打开图像，然后选择 数据处理 |谷物 |按阈值标记。
- 在属性函数中选择过滤器颗粒。出现新窗口时，选择以下参数：值 = 最大 z-max，表面 = 投影表面 A0。 然后，选择条件 A 和 B。
- 开放式 谷物分配;在出现的窗口中，选取“ 值 （最大值）、 体积 （基数：零）”和 “边界 （长度）”。观察出现的表格（.txt格式），该表格显示三列，其中包含在每个图像的设定阈值下检测到的所有颗粒的高度 、体积和 直径 值。
- 从高度 h 和直径 D 开始，使用公式 （1）8 计算每个 EV 的曲率半径 Rc，然后使用公式 （2） 计算体积 V：
（1）
（二） - 从 V 开始，使用公式 （3） 计算每个 EV（具有相同体积的球体的直径）的有效直径 d eff：
（三） - 显示EV的大小（测量高度，测量直径和计算有效直径）的绘图图，每个粒子计数用一个点表示。
注意：因此，在表征结束时，NBA平台能够将生物检测信号和表型与EV子集的数量和大小相关联。
（1）
（二）
（三）
图 6：通过 AFM 进行生物芯片表征。 在SPRi实验之后，将芯片固定并干燥或保持在液体中以进行AFM表征。（A）机加工的载玻片（带有两个垂直定位楔形，在图片上用“w”表示）呈现一个掩模配件，用于定位16个生物芯片微阵列。通过光照和透明度，一旦安装用于AFM表征，载玻片就可以将AFM尖端放置在所需的位置以进行表征。（B）将生物芯片安装在“面罩”载玻片上并在一滴缓冲液下在液体条件下进行扫描。（C）16个微阵列的SPRi图像。（D）在免疫捕获直径为920nm的生物功能化校准纳米颗粒后，通过光学显微镜成像的一个微阵列。白色方块表示AFM在每个感兴趣点扫描的不同区域的采样，以使AFM表征具有鲁棒性。比例尺 = （C） 1 毫米，（D） 500 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;SPRi = 表面等离子体共振成像。 请点击此处查看此图的大图。
4. 拉曼光谱
注意：对于拉曼光谱，用CaF2载玻片替换用作基板的载玻片，其拉曼特征可以忽略不计。
- 采集的光学条件：
- 为拉曼成像显微镜设置以下条件：显微镜物镜：50倍;激光波长：532纳米;激光功率：10毫瓦;曝光时间：500毫秒;累积次数：140;光谱范围：从450 cm−1到3，200 cm−1。
注意：使用过多的功率和/或过长的采集时间会导致样品损坏，随着时间的推移，光谱不稳定就是证明。从少量能量开始，如果信号太弱，则增加能量。可以使用更高的激光波长（633 nm、785 nm）来减少对拉曼测量有害的荧光。但是，强度随着波长的第四次方而降低，应考虑相机的光谱灵敏度。
- 为拉曼成像显微镜设置以下条件：显微镜物镜：50倍;激光波长：532纳米;激光功率：10毫瓦;曝光时间：500毫秒;累积次数：140;光谱范围：从450 cm−1到3，200 cm−1。
- 拉曼成像：
- 首先，观察累积次数减少的活光谱（10），以找到信噪比最佳的区域。
注意：高频区域（2，800-3，000 cm−1）的强信号可以简化对低曝光时间表面EV的检测，如前所示10。 - 选择ROI后，根据可用于采集的时间选择空间分辨率。
注意：空间分辨率受衍射极限（~500 nm）的限制。 - 开始拉曼成像采集。
- 首先，观察累积次数减少的活光谱（10），以找到信噪比最佳的区域。
- 数据预处理：
- 使用Python集成开发环境（IDE）（例如Spyder），打开包含光谱的文件。
- 减去光谱的基线以校正可能的荧光干扰。例如，使用包“irfpy”23中的“arpls”函数。测试参数“lam”的不同值，以找到给出最佳基线校正的值（通常在103 和107之间）。
- 归一化光谱，例如，通过将光谱的所有强度除以其在 2，900 cm−1 处的强度，或者减去光谱的平均值，然后将其除以其标准偏差（“标准正态变量”归一化）。
注意：此步骤对于比较EV的相对分子组成是必要的。
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Representative Results
确定配体接枝的最佳pH条件
用于制备生物芯片的不同配体根据pH值及其与硫代酸盐化学层相互作用的可用性进行测试（图3）。将配体稀释在不同的pH值的乙酸盐缓冲液中，并注入用C11C16层化学官能化的生物芯片上。将溶液随机注入表面上，并在每次配体注射后注射去垢剂（40mM的OG）以恢复基线。该 预浓缩 测试可以确定每个配体移植的最佳pH值。在 图3所示的示例中，就斜率和配体移植水平而言，pH值为6作为最佳pH值。
SPRi CCD 图像
插入SPRi机器后在生物芯片上记录的SPRi CCD图像（裸露，化学功能化或呈递微阵列）如图 4所示。在微阵列呈递生物芯片的情况下，图像是在表面白蛋白钝化后拍摄的。在芯片上系统地实现了斑点的重复或一式三份，并且芯片上也自动存在阴性对照。阴性对照主要由一种无关的抗体组成。在SPRi中，当生物芯片在没有点样的情况下使用时 - 用于在裸金上吸附或直接将EV嫁接到化学功能化的生物芯片上 - ROI在传感区域中任意选择。例如， 图4C 显示了在注入电动汽车之前在裸金芯片上选择的ROI。
多亏了这张SPRi CCD图像，如果在移植过程中出现此类问题，则可以忽略某些斑点。SPRi CCD图像还可以估计斑点内接枝的均匀性，确保同一配体的不同点之间接枝的可重复性，最后确保EV生物检测在表面密度方面等效的阵列上进行。
SPRi 结果
选择ROI时，基线是稳定的，这意味着可以进样。 图5 显示了在多路复用生物芯片上获得的不同结果，揭示了某些免疫阵列的高信噪比（抗CD41的反射率信号为1.4%，而阴性对照的响应为0.02%）。 图5B 显示了将EV样品注入裸金芯片后获得的EV吸附结果。N-PEVs样品来自血小板。将溶液在22°C下以3，000× g 离心15分钟;然后将上清液在22°C下再次以20，000× g 离心15分钟。 将所得沉淀重悬于缓冲液中。将免疫捕获的N-PEV获得的SPRi结果与蛋白质印迹（WB）结果进行比较。WB显示这些样品中CD41，CD62P和CD9的强烈表达，突出了与SPRi结果的良好相关性（补充图S1）。
图5B 显示了将人原代乳腺上皮细胞（HMEC）的EV样品注射到裸金芯片上后获得的EV吸附结果。将HMEC细胞培养物以3，650× g 离心10分钟，然后将上清液在4°C下以10，000× g 再次离心30分钟。 将所得沉淀重悬于1x PBS缓冲液中以洗涤，并在4°C下以10，000× g 再次离心30分钟。 最后，将沉淀悬浮在1x PBS缓冲液中。
原子力显微镜表征
在SPRi实验和EV加载到生物芯片上（通过吸附，接枝或亲和捕获）之后，按照扫描大扫描（10 x 10μm²）然后（~至少~10）较小的扫描（几μm²）的方法进行AFM。 图7 显示了生物芯片上电动汽车的大规模和小规模AFM图像示例。
图 7：生物芯片上电动汽车的 AFM 表征。 在接触模式下获得的干燥样品的图像。（A） 一个大扫描区域的示例，用于提供芯片上mm² ROI的代表性视图。该结果是在化学改性表面上共价接枝EV后获得的。（B）在免疫阵列上捕获EV后获得的大扫描区域的另一个示例。（C）近距离观察物体以获得高分辨率，并实现电动汽车的计量（高度和直径）。（D）用3D倾斜图像近距离观察（A）中图像中的生物芯片。（E）倾斜3D图像中吸附在裸金生物芯片上的大型EV的放大视图。Z 标度为 （A， B） 30 nm 和 （C） 20 nm。比例尺 = （A， B） 2 μm， （C） 500 nm。缩写：AFM = 原子力显微镜;EVs = 细胞外囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
格温迪翁分析
Gwyddion软件用于处理每批AFM图像上可视化的每个囊泡的数据。首先，扫描一个大面积（在10 x 10 μm²范围内），显示芯片上mm²ROI的代表性视图。图7A中的图像显示表面被物体密集覆盖。在这种情况下，将EV（来自牛奶）以2.5×1010 / mL注入活化的硫醇功能化芯片上。从样品中去除酪蛋白后，使用Amicon 100 kDa离心过滤装置在4，000 × g和20 °C下离心浓缩乳清上清液，并使用蔗糖梯度超速离心法分离EV。该结果对应于化学改性表面上的共价接枝EV。图7B显示了在免疫阵列上捕获EV后获得的大扫描区域的另一个示例。在这里，物体也存在于表面上，但与将电动汽车共价嫁接到芯片上时相比，其覆盖密度较低。在图7C中，在ROI的多个位置仔细观察，可以实现电动汽车的高分辨率和计量（高度和直径）。图7A所示生物芯片的另一个近距离视图（图7D）具有3D倾斜图像，揭示了囊泡但也是丝状物体（左上角）。事实上，虽然免疫芯片能够选择性和差异捕获EV亚群，但共价接枝移植了样品中存在游离胺基团的所有对象。在图7E中，AFM揭示了来自HMEC培养物的一个吸附在裸金上的单个大型EV。因此，AFM能够显示小型到大型EV并对其进行测量，并通过允许每个EV的可视化来帮助计算每mm²的物体数量。
确定每个EV的测量高度和直径，并从中获得有效直径。EV 高度覆盖范围从 10 nm 到 50 nm，平均为 15 nm;测得的EV直径范围为50 nm至300 nm，平均值为100 nm。我们观察到电动汽车的有效直径范围为30纳米至300纳米，其中绝大多数在60纳米左右（图8A）。这些测量是在液体中或在固定和干燥后进行的。 图8B 显示，在这两种条件下获得的结果具有可比性。
图 8：在生物芯片上对 EV 进行 AFM 表征产生的结果。 （A） EV 在一个点上的计量（抗 CD41 免疫阵列），以 8.5 nm 的阈值测定，并在 2.5 × 1010/mL 下注射 EV 样品后测定。给出了“有效计算直径”，每个点对应于AFM图像上可视化的颗粒。（B）根据（A）中的数据生成的直方图，显示EV有效直径的分布。在空气（红色：样品固定和干燥）和液体（蓝色：未固定）中获得的结果。缩写：AFM = 原子力显微镜;EVs = 细胞外囊泡 。请点击此处查看此图的大图。
将AFM的N-PEV分析与NTA结果进行比较。NTA最后的“溶液内”结果显示，EV直径的分布从32 nm到650 nm，其中绝大多数直径在90 nm到250 nm之间。因此，考虑到NTA对小尺寸（接近50nm）不敏感，这些AFM测量与这些结果显示出良好的相关性（补充图S2）。
在裸芯片上吸附的电动汽车上实现的拉曼实验显示出令人鼓舞的结果;具体而言，获得了清晰的EV光谱（图9）。拉曼光谱可分为三个不同的范围：“指纹”区域（低于1，800 cm−1），其中包含形成分子特异性图案的峰，因此是识别目的的最重要部分;“生物沉默”区域（1，800-2，800 cm−1），通常在研究生物样品时被丢弃，因为它不包含峰;和“高频”区域，主要包含有关脂质的信息，通常是频谱中最强烈的部分，但特异性较低。光谱显示主要对应于CH 2振动（2，853 cm−1，1，444 cm−1和130 cm−1）的峰，这些峰与EV膜的脂质和对应于苯丙氨酸氨基酸21的峰有关。EV中存在的常见分子的拉曼峰分配表可以在Penders等人的论文中找到22。
图 9：生物芯片上电动汽车的拉曼光谱表征。 在这里，EV样品来自HMEC培养物，并通过以20，000 × g离心回收。（A）吸附在裸生物芯片上的EV的拉曼图像示例（平均强度），叠加在明场图像上。（B） 电动汽车的拉曼光谱测量示例。虚线对应于已识别的振动。α，剪刀;τ，扭曲;υ，拉伸（s，对称;as，不对称）。比例尺 = （A） 50 μm。缩写：EVs = 细胞外囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：N-PEV的纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量。 电动汽车在PBS中稀释;实验使用墨尔文仪器NS300一式三份进行。平均直径 = 137.5 nm ± 1.3 nm;模径 = 104.9 nm ± 13.3 nm。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：N-PEV的蛋白质印迹测定。 N-PEV （1） 和 （2） 对应于从两个浓缩血小板口袋制备的两批 N-PEV。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
最近使用最广泛的 EV 鉴定方法是蛋白质特异性免疫印迹法，用于确认 EV 的来源，TEM 以确认其结构，以及 NTA 以量化其在样品体积中的数量和大小分布3。然而，（生物）医学研究中对电动汽车的高度兴趣以及现有分析工具的局限性促使科学界开发用于电动汽车表征、区分和量化的新方法。
大多数开发侧重于将免疫标记或免疫捕获原理与用于EV检测的先进物理方法相结合。其中一些方法侧重于识别单个电动汽车，以获得纳米物体尺度的最大可靠性数据。其他人更关心的是提出负担得起且可靠的临床使用的全球方法。
NBA平台结合了多重金基板上电动汽车的生物检测和AFM表征，能够对复杂生物流体中存在的纳米囊泡进行深度鉴定。事实上，由于生物芯片的选择性，可以注入粗样品，并且可以突出显示囊泡贡献。
所提出的方法包括在粗糙的金基板上通过亲和力吸附/接枝或捕获的EV进行表征。AFM通常用于原子平坦的基板，在粗糙的金芯片上仍然显示出最佳性能，揭示了微/纳米结构的不同界面。
开发了多路复用生物芯片，提供了多个要扫描的点（到目前为止多达 16 个）和用于固定和干燥样品的 NBA 方法，以减少对每个点进行深入且高度解析的 AFM 研究所需的时间。在实验室进行的不同测试表明，该过程（固定，干燥和空气中成像）不会显着影响电动汽车的计量。
该方法有两个主要的关键步骤：找到折衷方案，为所有不同的接枝配体选择最佳的芯片灵敏度，以及在注射后结束时EV与底物解离。在这里，使用了一台单共振角度的SPRi机器，这表明必须选择所有配体点的等离激元响应的最佳折衷方案。对于某些配体，检测将非常灵敏（接近最佳角度）;对于其他人，如果固定角度值与最佳角度不同，则检测的灵敏度会降低。这可以通过使用提供多达 10 种不同工作角度的上一代 SPRi 仪器来克服。
第二个关键步骤是注射后EV与基板分离。如果解离度太高（例如，因为EV在其表面仅存在很少的特定蛋白质），则以后将无法使用AFM进行扫描。这些情况非常罕见，但是当它们发生时，必须优化流速和注射持续时间才能解决问题。
所提出的方法的局限性可能是AFM观测值与生物芯片上EV相互作用的mm²面积之间的相关性缺乏代表性。为此，必须扫描现场的不同区域，包括从大区域到小区域以及现场内的不同位置。理想情况下，扫描应在ROI区域进行，以使AFM表征与SPRi响应之间具有良好的相关性。
在其他工作中，本研究的作者使用了单个电动汽车的光学检测和数字计数，这是基于在生物功能化硅衬底上捕获的电动汽车的干涉成像。该技术允许根据观察到的对比度估计EV的大小。因此，该平台使得使用丰富的标记物CD9，CD63和CD81进行多重分析并检测人类脑脊液中表达神经元标志物CD171的EV的存在24成为可能。
这种组合和无标记的方法，辅以生物芯片制备和AFM采集模式的严格方法，构成了通过实时捕获EV和在复杂和粗糙样品中的流动来表征EV的首选方法。实际上，在所提出的方法中，不需要对样品进行分析前步骤，也不需要标记或揭开步骤。在文献中，Ertsgaard等人使用单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）揭示了不同丰度的EV膜标记物，但在静态模式（无流动）下没有动力学测量，并且仅给出了EV尺寸的估计25。
由于这种优化的程序能够制备反应性、受控的生物界面和钝化多重生物芯片，因此当EV亚群作为粗样品进样时，可以对其进行深入表征。这些不同的元素使该NBA平台成为直接，深入和解析原油样品中EV分析的高度相关方法。
光谱学，特别是表面增强拉曼光谱（SERS），正在成为弱表达EV生物标志物生化分析的首选方法。该策略允许开发灵敏度为每μL几十个EV的多重测定。 SERS成像与分选方法（例如，介电泳）相结合，使EV组成的高通量分析成为可能26。
在这项工作中，在金生物芯片上进行的拉曼实验也非常令人鼓舞，因为获得了清晰的电动汽车光谱，从而深入了解了它们的分子组成。未来的发展还可能包括SERS，以增加来自生物芯片表面的EV信号，以及尖端增强拉曼光谱（TERS）以获得具有纳米分辨率的图像，从而允许单EV表征。
该实验室的最新进展已经提高了生物检测的灵敏度，并区分了样品中共存并可能在同一阵列上相互作用的EV子集。为了提高灵敏度，实验正在切换到SPRi系统，该系统可以选择多个角度进行EV检测。为了提高对EV子集的区分，必须应对不同的挑战：i）在生物芯片上获得每个EV子集的光谱拉曼特征，ii）增加生物芯片上识别的斑点数量（从16个增加到100个），以及iii）使用高速AFM（HS AFM）提高分析的通量。此外，HS AFM还将允许在液体条件下快速表征EV子集。
其他需要注意的一点是，如果金生物芯片的亲水性很高，则存在配体的斑点重叠并混合在一起的风险（如图 4B所示）。在SPRi下注入溶液时，必须避免注入气泡，因为这会导致反射率发生变化，并导致对SPRi信号的错误监测。
在使用AFM扫描表面时，有必要观察图像以检查总值是否有剧烈变化或是否存在伪影（例如，物体的重复外观）。这可能是由于AFM尖端污染;在这种情况下，需要更换吸头。
我们观察到该技术存在一些局限性：为所有不同的接枝配体选择的芯片灵敏度并非对所有配体都是最佳的;注射结束时EV与底物的解离;以及拉曼成像的分辨率（低于AFM），这不允许单个EV的可视化。
尽管存在局限性，但与现有方法相比，该协议具有许多显着优势。在同一基底上和同一生物样品上结合无标记方法（SPRi + AFM + 拉曼光谱），避免了由于底物而导致的分析之间的偏差，并为EV子集的分析提供了高原创性和可信度。
这种工程分析平台可以帮助在不同情况下进行电动汽车表征，例如在诊断和无细胞生物疗法以及从血液到细胞上清液的生物流体领域。除了EV鉴定外，其他纳米物体（例如，分子复合物，合成纳米颗粒，病毒）也可以通过这种多模态分析平台进行表征。
尽管电动汽车社区开发和实施的方法种类繁多，但这些技术中的每一种在动态范围、精度、吞吐量和用于分析特定电动汽车参数的应用方面都有其自身的潜力和性能差异26.创新、超灵敏和多步骤的方法（分离、选择、光谱特征和囊泡内容物分析），例如这种多模态分析平台，即使应用于芯片上的小体积（芯片实验室），也为液体活检、生物监测和精准医学领域提供了新的视角。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
来自IVETh核心设施（巴黎）的Kelly Aubertin和Fabien Picot因拉曼成像实验而获得认可。Thierry Burnouf（台湾台北医科大学）和Zuzana Krupova（来自法国Helincourt）分别提供来自血小板和牛奶样本的EV样本。这项工作得到了勃艮第地区弗朗什-孔泰地区和欧洲 EIPHI 研究生院的支持（新手项目，2021-2024 年）。这项工作的一部分是使用CLIPP平台和FEMTO-ENGINEERING的RENATECH洁净室设施完成的，为此我们感谢Rabah Zeggari。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
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