Summary
Dette papiret foreslår en ny generasjon multiparametriske analytiske plattformer med økt gjennomstrømning for karakterisering av ekstracellulære vesikelundergrupper. Metoden er basert på en kombinasjon av multipleksede biosensingsmetoder med metrologiske og morfomekaniske analyser ved atomkraftmikroskopi, kombinert med Raman-spektroskopi, for å kvalifisere vesikulære mål fanget på en mikroarray-biochip.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) er membranavledede, små vesikler produsert av alle celler som varierer fra 50 til flere hundre nanometer i diameter og brukes som et middel til intercellulær kommunikasjon. De fremstår som lovende diagnostiske og terapeutiske verktøy for en rekke sykdommer. Det er to hovedbiogeneseprosesser som brukes av celler for å produsere elbiler med forskjeller i størrelse, sammensetning og innhold. På grunn av deres høye kompleksitet i størrelse, sammensetning og celleopprinnelse, krever karakteriseringen en kombinasjon av analytiske teknikker. Dette prosjektet innebærer utvikling av en ny generasjon multiparametriske analyseplattformer med økt gjennomstrømning for karakterisering av underpopulasjoner av elbiler. For å oppnå dette målet starter arbeidet fra nanobioanalytisk plattform (NBA) etablert av gruppen, som tillater en original undersøkelse av EV basert på en kombinasjon av multipleksede biosensingsmetoder med metrologiske og morfomekaniske analyser ved atomkraftmikroskopi (AFM) av vesikulære mål fanget på en microarray biochip. Målet var å fullføre denne EV-undersøkelsen med en fenotypisk og molekylær analyse ved Raman-spektroskopi. Disse utviklingene gjør det mulig å foreslå en multimodal og brukervennlig analytisk løsning for diskriminering av EV-undergrupper i biologiske væsker med klinisk potensial
Introduction
Den økende interessen for EV-forskning i diagnose og terapeutikk 1,2,3,4,5, kombinert med utfordringene dette feltet står overfor, har resultert i utvikling og implementering av et stort utvalg av tilnærminger og teknikker for å kvantifisere eller karakterisere disse vesiklene. De mest brukte metodene for EV-identifikasjon er proteinspesifikk immunoblotting og proteomikk for å bekrefte opprinnelsen til EV, transmisjonselektronmikroskopi (TEM) for å bekrefte strukturen og nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) for å kvantifisere antall og størrelsesfordeling i et prøvevolum.
Ingen av disse teknikkene alene gir imidlertid all den informasjonen som kreves for å karakterisere EV-delmengder. Den iboende heterogeniteten til elbiler på grunn av mangfoldet i deres biokjemiske og fysiske egenskaper hindrer globale analyser som er pålitelige og reproduserbare, spesielt for elbiler som finnes i en blanding (råprøve). Deteksjons- og karakteriseringsmetoder er derfor nødvendig for elbiler, både individuelt og generelt for å utfylle andre metoder som er raskere, men ikke selektive6.
Høyoppløselig avbildning av TEM (eller cryoTEM) eller AFM tillater bestemmelse av morfologi og metrologi av EV med en nanometrisk oppløsning 7,8,9,10,11,12. Imidlertid er hovedbegrensningen ved bruk av elektronmikroskopi for biologiske objekter, som EV, behovet for et vakuum for å utføre studien som krever fiksering og dehydrering av prøven. Et slikt preparat gjør det vanskelig å oversette fra strukturene observert til EV-morfologien i løsningen. For å unngå denne dehydreringen av prøven, er teknikken til cryoTEM den mest egnede for EV-karakterisering13. Det er mye brukt for å bestemme ultrastrukturen til elbiler. Immunmerkingen av vesikler ved biofunksjonaliserte gullnanopartikler gjør det også mulig å identifisere spesifikke underpopulasjoner av EV og skille dem fra andre partikler som er tilstede i en kompleks biologisk prøve. På grunn av det lave antallet elbiler som analyseres ved elektronisk mikroskopi, er det imidlertid ofte vanskelig å utføre en karakterisering som er representativ for en kompleks og heterogen prøve.
For å avsløre denne størrelsesheterogeniteten foreslår International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) å analysere et tilstrekkelig antall vidvinkelbilder, ledsaget av mindre bilder, for å avsløre individuelle elbiler med høy oppløsning14. AFM er et alternativ til optiske tilnærminger og elektroniske diffraksjonsteknikker for studier av elbiler. Denne teknikken bruker en skarp spiss som holdes av en fleksibel utkrager som skanner prøven som er avsatt på en støtte, linje for linje, og justerer avstanden mellom spissen og elementene som er tilstede gjennom en tilbakemeldingssløyfe. Dette gjør det mulig å karakterisere prøvens topografi og samle morfomekanisk informasjon15,16,17,18. EV-ene kan skannes av AFM enten etter å ha blitt avsatt på et atomisk flatt substrat eller etter å ha blitt fanget på et spesifikt substrat funksjonalisert av antistoffer, peptider eller aptamere for å karakterisere de forskjellige underpopulasjonene18,19. På grunn av sin evne til å kvantifisere og samtidig undersøke strukturen, biomekanikken og membranøs biomolekylalt innhold av EV i komplekse biologiske prøver uten behov for forbehandling, merking eller dehydrering, brukes AFM nå i økende grad til å karakterisere EV på en fin og multiparametrisk måte under fysiologiske forhold av temperatur og medium.
Dette papiret foreslår en metodikk ved hjelp av en kjerne gull biochip stand til å være (bio) kjemisk funksjonalisert i et multiplekset format. Dette substratet er hjørnesteinen i en kraftig analytisk plattform som kombinerer biodeteksjon av EV-undergrupper ved overflateplasmonresonans, og når elbilene er adsorbert/podet eller immunfanget på brikken, muliggjør AFM metrologisk og morfomekanisk karakterisering av elbilene. Sammen med Raman-signaturen til EV-undergruppene fanget på brikken, gjør denne analytiske plattformen det mulig å kvalifisere elbilene som er tilstede i biologiske prøver på en etikettfri måte og uten behov for preanalytiske trinn. Dette papiret viser at kombinasjonen av kraftige teknikker, assistert av en svært streng metodikk i substratforberedelse og datainnsamling, gjør EV-analysen dyp, definitiv og robust.
Prinsippet for den foreslåtte tilnærmingen er å forberede et gullsubstrat, å adsorbere / pode eller fange EV-undertypene, og å skanne dem med AFM for å estimere størrelsen og morfologien til hver EV-delmengde. I tillegg analyseres de adsorberte elbilene ved Raman-spektroskopi. Dette substratet kan faktisk presentere tre typer grensesnitt med økende kompleksitet: nakne, kjemisk funksjonaliserte eller ligandmikromatriser. Før de beskriver de forskjellige trinnene i protokollen, blir leserne henvist til den skjematiske presentasjonen av nanobioanalytisk plattform (NBA) tilnærming i figur 1, som kombinerer overflateplasmonresonansavbildning (SPRi), AFM og spektroskopi.
Figur 1: NanoBioAnalytisk plattform. Tilnærmingen kombinerer (A) overflateplasmonresonansavbildning, (B) atomkraftmikroskopi og infrarød / Raman (nano) spektroskopi, alle engasjert på samme substrat - en multiplekset gullbrikke. Forkortelser: NBA = NanoBioAnalytisk plattform; SPRi = overflateplasmon resonans imaging; AFM = atomkraftmikroskopi; EV = ekstracellulær vesikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kjernen gull biochip utgjør hjertet av plattformen siden alle etikettfrie karakteriseringsteknikker utføres på denne biochipen. I henhold til behovene til EV-karakteriseringen (enten globale / totale EV-er eller EV-undergrupper) og begrensningene / kravene til metodene som brukes, har tre typer gullbiochipoverflater blitt utviklet: enten "naken", kjemisk funksjonalisert "C11 / C16" eller ligandbiofunksjonalisert, kalt "ligand" gulloverflate.
Den nakne biochipen, kalt "naken", muliggjør enkel adsorpsjon av elbiler på gull. Det er mulig å velge bufferen som brukes og realisere denne adsorpsjonen enten på en passiv måte (inkubasjon og deretter skylletrinn) eller for å overvåke den under strømning (i SPRi). Videre kan denne passive adsorpsjonen realiseres enten på hele brikken (som en makromatrise) eller lokalisert i mikromatriser ved hjelp av en mikropipettespotter. "Under flow-prosedyren" gjør det mulig for etterforskere å følge kinetikken og nivået av EV-adsorpsjon. Denne tilnærmingen på det nakne gullsubstratet tas i bruk når det kjemiske laggrensesnittet kan forstyrre analysemetoden (f.eks. for Raman-spektroskopi).
Den kjemisk funksjonaliserte biochipen, kalt "C11 / C16", brukes til å skape et tett og robust "teppe" av EVer kovalent bundet på gulloverflaten ved å danne primære amidbindinger med tiolater når målet er å få et globalt syn på EV-prøven. Faktisk, i dette tilfellet funksjonaliseres gullet av en tiolat blanding av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: "C11") og merkapto-1-heksadekansyre (16-MHA: "C16"), og en brøkdel av tiolatene aktiveres kjemisk for å etablere kovalent binding med målene. Igjen kan denne strategien realiseres enten passivt (inkubasjon og deretter skylletrinn, enten i "makromatrise" eller i flere mikromatriser ved bruk av en mikropipettespotter) eller under strømningshastigheter (i SPRi) for å følge kinetikken og nivået av EV-poding på gulloverflaten.
Den ligand-biofunksjonaliserte biochip, kalt "ligander", aktiveres kjemisk for å kovalent pode forskjellige ligander (f.eks. antistoffer, reseptorer) for selektivt å fange (med affinitet) forskjellige EV-undergrupper som sameksisterer i den biologiske prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av gullsubstrat
MERK: Tre typer overflater er produsert på gullflis: 1) naken overflate, 2) kjemisk funksjonalisert og 3) biofunksjonalisert (ligander podet på C11C16 lag). De vil bli kalt henholdsvis "naken", "C11C16" og "ligander" fra dette tidspunktet og fremover.
- Forberedelse av gullsubstrat:
MERK: For denne protokollen ble gullbiochips produsert internt i renrommet. De hjemmelagde biochipene var sammensatt av glassglass (SF11) med et belegg av krom (2 nm Cr) og gull (48 nm Au). Lengden på biochipet var 28 mm, bredden var 12, 5 mm, og tykkelsen var 0, 5 mm20.- Bruk DC magnetron sputtering15 til å belegge lysbildene ved fysisk dampavsetning (PVD).
- Kjemisk funksjonalisering:
- Funksjonaliser de nakne sjetongene ved å inkubere dem over natten i en 90% / 10% av molblandingen av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: C11) og merkapto-1-heksadekansyre (16-MHA: C16) ved 1 mM i absolutt etanol, under omrøring og ved romtemperatur.
MERK: Dette trinnet vil danne et stabilt, selvmontert monolag (SAM), som er nyttig i podingen av ligandene. - Rengjør biochipen (vask forsiktig) med absolutt etanol og ultrarent vann, tørk den under nitrogen og oppbevar den under rene romforhold.
- Aktivering av den kjemisk funksjonaliserte biochipen:
MERK: Fra dette trinnet må eksperimentene utføres i et analytisk laboratorium.- Rengjør biochipet med ultrarent vann ved å vaske det forsiktig, og tørk deretter brikken under mild luftstrøm. For å aktivere C16-karboksylgruppene, inkuber biochipen i en blanding av 200 mM etyl (dimetylaminopropyl) karbodiimid/N-hydroksysuccinimid (EDC) og 50 mmol / L N-hydroksysuccinimid (Sulfo-NHS) i minst 30 minutter i mørket ved romtemperatur. Skyll deretter med vann før podeforsøkene.
- Funksjonaliser de nakne sjetongene ved å inkubere dem over natten i en 90% / 10% av molblandingen av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: C11) og merkapto-1-heksadekansyre (16-MHA: C16) ved 1 mM i absolutt etanol, under omrøring og ved romtemperatur.
- Podning av ligandene på den funksjonaliserte biochipen:
MERK: Immobiliseringen av ligandene (eller EVene for noen eksperimenter) på brikken kan enten gjøres passivt utenfor SPRi-instrumentet (inkubasjon av en dråpe på den aktiverte brikken) eller dynamisk under strømmen inn i SPRi-instrumentet. Dette utgjør EV- eller ligandmodifiserte brikker. Figur 2 viser gullbiochipen, mikropipettspotteren og biochipen etter spotting med 16 liganddråper på 300 nL hver.- For ligandtransplantasjon, bruk molekyler som antistoffer (f.eks. immunoglobuliner-antiCD41 [spesifikke for EV avledet fra innfødte blodplater, kalt N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 og antiOVA [kontrollantistoff mot ovalbumin]) og vedlegg V. Fortynn dem ved 200 μg / ml i en sur løsning (fra pH 4,5 til 6, avhengig av optimal pH for ligandaktivitet eller funksjon).
MERK: Den optimale pH for poding antistoffer ble bestemt tidligere ved prekonsentrasjonseksperimenter utført på et SPR-instrument for bestemmelse av optimal pH for ligandtransplantasjon (se figur 3). Ettersom podebetingelsene endres med klonene av antistoffer som brukes, anbefales det å bestemme disse forholdene før du fortsetter med SPRi-eksperimentene. - For podeprosedyren, tilsett 300 nL EV / ligandløsning ved å bruke spotteren.
MERK: Et stykke papir nedsenket i vann bør oppbevares i både venstre og høyre brønn for å unngå fordampning av dråper. Dette trinnet er viktig for å opprettholde elbilene/ligandene under optimale forhold for stabilitet og funksjonalitet. - Etter spotting, hold biochip under et sonisk bad (frekvens: 37 kHz, effekt: 30%) i en 30 min inkubasjon. Vask biochipen fra toppen med ultrarent vann, og legg den forsiktig på et prisme med samme brytningsindeks (RI) som biochipen. Mens du justerer biochipet på toppen av prismet, tilsett en dråpe (~ 2,3 μL) olje med samme RI som prismet for å skape et jevnt, tynt lag mellom biochipet og prismet.
MERK: Dette trinnet sikrer et kontinuerlig medium av samme RI i den optiske banen. Det er viktig å unngå å innlemme bobler i oljelaget på dette trinnet, da dette vil endre de optiske egenskapene i banen og hindre videre analyse.
- For ligandtransplantasjon, bruk molekyler som antistoffer (f.eks. immunoglobuliner-antiCD41 [spesifikke for EV avledet fra innfødte blodplater, kalt N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 og antiOVA [kontrollantistoff mot ovalbumin]) og vedlegg V. Fortynn dem ved 200 μg / ml i en sur løsning (fra pH 4,5 til 6, avhengig av optimal pH for ligandaktivitet eller funksjon).
Figur 2: Biochip og manuell spotter. Gullbiochip (venstre), mikropipettespotter (midten) og biochip etter spotting med liganddråper på 300 nL hver (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prekonsentrasjonstester for å bestemme optimal pH for ligandtransplantasjon. Sensorgrammet presenterer interaksjonsnivået som en funksjon av tid for en ligand injisert tilfeldig (ved forskjellige pH-verdier) i samme konsentrasjon over 2 minutter på overflaten. OG er vaskemiddelet, som gjør at baseline kan gjenopprettes mellom hver injeksjon. Her indikerer sensorgrammet at pH 6 tillot mest ligandtransplantasjon, med et SPRi-signal på 1091 RU. Forkortelser: OG = oktylglukosid; RU = responsenhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Overflateplasmon resonans avbildning
- Monter biochipen på SPRi-systemet. Hold strømningshastigheten til PBS-bufferen (løpende buffer) på 50 μL/min.
MERK: Hvis det er noen bobler, øk strømningshastigheten opp til 500-1000 μL / min, og injiser 40 mM oktyl glukosid (OG) ofte for å fjerne dem så snart som mulig. - Kondisjonering av gullbiochipen i SPRi-instrumentet: Valg av arbeidsvinkler
- Klikk på rullegardinmenyen på venstre side av programvaren, og klikk på arbeidskatalogen for å definere mappen der eksperimentelle data skal lagres. Etterpå, klikk på Plasmon | Anskaffelse av bilder.
- Finn bildet (som vist i figur 4A) der forskjellige flekker er synlige, og klikk for å velge dette bildet. For å definere interesseområdet (ROI), som representert i figur 4, klikker du enten på automatisk deteksjon eller manuell definisjon inne i flekkene (figur 4B) eller på brikken for å referere til et bestemt sted selv uten flekker (figur 4C).
- Når multipleksede biochips brukes, skriv navnet på ligandfamiliene, og klikk deretter på de tilsvarende stedene.
MERK: En ligandfamilie tilsvarer flere flekker funksjonalisert med samme ligand. Vanligvis presenterer brikken minst duplikater og til og med ofte triplikater av hver ligand. - Klikk på ferdig artsdefinisjon og vent på å bli dirigert til vinduet som inneholder de oppnådde plasmonkurvene.
- Velg en arbeidsvinkel. Dra den svarte linjen med markøren til den optimale arbeidsvinkelen, og klikk på Flytt speilet til arbeidsvinkel.
MERK: Plasmonkurven består av verdien av reflektiviteten (%) versus vinkelen, og programvaren gir en annen kurve med verdien av helningen (%) versus vinkelen. For å velge en god arbeidsvinkel, velg vinkelen med den høyeste verdien av skråningen.- I tilfelle av et passiverende trinn (på grunn av albumin) utført inne i apparatet, velg en arbeidsvinkel for å få optimal følsomhet mot overflaten, og dermed etablere en kvalitetskontroll av overflatereaktiviteten.
MERK: Dette passiveringstrinnet er viktig når brikken er klargjort for affinitets-/fangstbiodeteksjon for å redusere ikke-spesifikke interaksjoner mellom prøven og biochipoverflaten.
- I tilfelle av et passiverende trinn (på grunn av albumin) utført inne i apparatet, velg en arbeidsvinkel for å få optimal følsomhet mot overflaten, og dermed etablere en kvalitetskontroll av overflatereaktiviteten.
- Klikk på Kinetikk for å starte kinetisk overvåking i sanntid. Når programvaren ber brukeren om å definere den negative kontrollen, velger du ingen negativ kontroll på dette tidspunktet (da dette vil tillate observasjon av kinetikken på de negative kontrollpunktene).
- Injiser serumalbumin fra rotter (RSA, 200 μg/ml, fremstilt i acetatbuffer, pH 4,5) ved 50 μL/min i 4 minutter for å passivere overflaten rundt flekkene og eventuelt for å fylle tomme mellomrom inne i ligandflekkene.
MERK: RSA injiseres for å dekke biochip, som ikke er bundet til noen ligander. - Injiser etanolamin (1 M) ved 20 μL/min i 10 minutter for å deaktivere karboksylgruppene som fortsatt er tilstede og reaktive på overflaten.
- Vask biochipen ved å injisere 40 mM OG ved 50 μL/min i 4 minutter.
MERK: Etter passiveringstrinnet justeres arbeidsvinkelen (som en ny baselinebestemmelse før prøveinjeksjon) for å være på høyeste følsomhet på interessepunktene.
- Injiser serumalbumin fra rotter (RSA, 200 μg/ml, fremstilt i acetatbuffer, pH 4,5) ved 50 μL/min i 4 minutter for å passivere overflaten rundt flekkene og eventuelt for å fylle tomme mellomrom inne i ligandflekkene.
- Eksempel på injeksjon:
- Redefiner plasmonkurvene etter passivering, og velg arbeidsvinkelen i henhold til liganden denne gangen.
- Ved kinetisk overvåking, reduser strømningshastigheten til 20 μL/min, og vent til baselinjen er stabil.
- Injiser prøven med en valgfri konsentrasjon (fra 1 x 10 8 EV/ml til 1 x 10 10 EV/ml, avhengig av affiniteten mellom elbilene og de podede ligandene), og klikk på enten manuell injeksjon eller automatisk injeksjon. Ved manuell injeksjon, etter injeksjon av 200 μL av prøven, klikk på stopp injeksjonen. Siden injeksjonens varighet vanligvis er 10 minutter, må du begynne å følge kinetikken til interaksjonen og måle reflektivitetsvariasjonen ved å beregne forskjellen i reflektivitet mellom start og slutt av injeksjonen observert under kinetisk overvåking (figur 5).
MERK: De forskjellige prøvene som ble injisert, er beskrevet i avsnittet om representative resultater.
- Etter prøveinjeksjon, følg en av disse to tilnærmingene for å fullføre SPRi-eksperimentet:
- I ufiksert / væske-tilnærming , ta biochipet ut av SPRi-apparatet, tilsett en væskedråpe på den, og fortsett for ytterligere AFM-karakterisering av overflaten i væske.
- I den faste tilnærmingen, injiser glutaraldehyd (0,5%) fortynnet i vann ved 20 μL / min i 10 minutter for å fikse molekylene fanget på biochipen. Injiser vann for å skylle overflaten, ta biochipen ut, vask den veldig forsiktig med destillert vann og lufttørk den for å bli analysert videre under AFM.
Figur 4: SPRi CCD-bilde av biochipen. (A,B) Multiplekset biochip etter albuminpassivering. (A) En brikke uten standard; (B) noen defekter som dukket opp på brikken: fusjon av flekker (i), svak poding (ii), eller støv eller "forurensninger" (iii). ROIene, i farge i flekkene (en farge per ligandfamilie), ble valgt for å unngå disse "forurensningene". Når flekker ble slått sammen, ble de notert og enten ignorert eller navngitt som "blanding av ligander 1 og 2". (C) Naken gullbrikke uten mikromatriser for eksperimentet som undersøker adsorpsjonen av elbiler på gull. Den blå pilen indikerer strømningsretningen. Denne brikken presenterte ikke flekker, og avkastningen ble valgt for å registrere reflektivitetssignalet fra linje 1 (L1, røde sirkler) til linje 4 (L4, lilla sirkler) under prøveinjeksjonen. Skalalinje = 1 mm for alle tre bildene. Forkortelser: SPRi = overflateplasmon resonansavbildning; CCD = ladningskoblet enhet; ROI = regioner av interesse; EV = ekstracellulære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: SPRi-eksperimenter med EV-injeksjon på en biochip. (A) Fangsteksperiment på en multiplekset biochip som viser reflektivitetssignalene til forskjellige ligander. Her var signal-støy-forholdet for de forskjellige ligandene veldig bra (og spesielt på antiCD41-punktene) siden responsen til den negative kontrollen var ubetydelig. (B) Adsorpsjonseksperiment av elbiler på en naken biochip. Sensorgram som presenterer kondisjoneringen av brikken med to spylinger av buffer og OG-rengjøring (1), med EV-prøveinjeksjonen (2) og reflektivitetssignalet etter EV-interaksjon (3). På denne biochipen var det ingen negativ kontroll, men reflektivitetssignalet (kinetikken, stabiliteten etter injeksjon) var høyt, noe som betyr at disse elbilene var i stand til å adsorbere og forbli stabile på gullbrikken. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikkel; OG = oktyl glukosid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Atomkraftmikroskopi
- Bruk kontaktmodus for å skanne biochip i luft og kvantitativ bildebehandling modus for å skanne biochip i flytende forhold.
- Juster biochipen på toppen av masken på glassglasset (utviklet i laboratoriet) for å identifisere posisjonen til de respektive mikroflekkene på biochipen (figur 6A).
MERK: Masken inneholder markeringene av flekkene, som tilsvarer posisjonene til flekkene på ligandene i henhold til spotteren som brukes. Denne masken består av et glassglass hvor to vinkelrette kiler muliggjør plassering av brikken. Videre er glassglasset merket med 16 filtprikker som tilsvarer punktlokaliseringen på brikken, noe som tillater, ved transparens, å finne flekkene og skanne ønsket område. - Plassering av spissen:
- Bruk et CCD-kamera på toppen av AFM for å lokalisere utkrageren på riktig sted som må skannes. For å følge denne protokollen, bruk trekantede utkrager med 200 μm lengde, 28 μm bredde og en fjærkonstant på 0,08 N / m.
- Juster laseren på toppen av utkrageren i en posisjon som gir optimal respons i tilbakemeldingskontrollmekanismen.
- Skanning:
- Når den er engasjert og i kontakt med biochipoverflaten, starter AFM-oppkjøpet i kontaktmodus eller i kvantitativ avbildningsmodus fra tre til fem store områder (typisk 10 × 10 μm²) til små områder (1 x 1 μm²).
MERK: En fremstilling av de forskjellige områdene som kan skannes, er vist i figur 6D. Sørg for at AFM-karakteriseringen er representativ for hele mm²-punktet, og at nok elbiler visualiseres med god oppløsning for en robust analyse (minimum 300 EV-er telles og analyseres for hver tilstand), og utfør målinger av metrologi og morfologi.
- Når den er engasjert og i kontakt med biochipoverflaten, starter AFM-oppkjøpet i kontaktmodus eller i kvantitativ avbildningsmodus fra tre til fem store områder (typisk 10 × 10 μm²) til små områder (1 x 1 μm²).
- AFM bilde behandling:
- Behandle AFM-bildene med JPK-databehandlingsprogramvare ved først å velge høydekanal.
- Velg en polynomtilpasning som skal trekkes fra hver linje for å få rettede skannelinjer.
- Velg høydeterskelen på gullkorn for å eliminere ruheten på overflaten. I den refererte programvaren (se materialfortegnelsen), i kornutvinningsmodulen, merker du kornene med en høydeterskelverdi ved 8,5 nm. Når kornene er filtrert, vises antall korn .
MERK: Vanligvis krever det grove gullsubstratet (RMS på ~ 3 nm) og tilstedeværelsen av kjemikalie- og ligandlagene at terskelen settes til 8,5 nm. - For å trekke ut flere egenskaper til de merkede kornene, for eksempel høyde, volum og diameter, åpne bildet i den refererte programvaren og velg databehandling | Korn | Merk etter terskel.
- Velg filterkorn i egenskapenes funksjon. Når et nytt vindu vises, velger du følgende parametere: Verdi = maksimum z-maks, overflate = projisert overflate A0. Velg deretter kriteriene A OG B.
- Åpen kornfordeling; I vinduet som vises, velger du verdi (maksimum), volum (grunntall: null) og grense (lengde). Vær oppmerksom på tabellen (i .txt format) som vises, som viser tre kolonner med høyde-, volum- og diameterverdier for alle kornene som oppdages ved den innstilte terskelen per bilde.
- Fra høyden, h og diameter, D, beregne krumningsradiusen, Rc, for hver EV ved hjelp av ligning (1) 8, og beregn deretter volumet, V, ved hjelp av ligning (2):
(1)
(2) - Fra V, beregne den effektive diameteren, d eff, for hver EV (diameteren av en kule med samme volum) ved hjelp av ligning (3):
(3) - Plottdiagrammer som viser størrelsene (målt høyde, målt diameter og beregnet effektiv diameter) på elbilene, med hver partikkel telt representert med en prikk.
MERK: På slutten av karakteriseringen muliggjør NBA-plattformen korrelasjonen mellom biodeteksjonssignalet og deretter fenotypingen, med tallene og størrelsene til EV-delmengdene.
(1)
(2)
(3)
Figur 6: Biochip karakterisering av AFM. Etter SPRi-eksperimentet ble brikken enten festet og tørket eller vedlikeholdt i væske for AFM-karakterisering. (A) Det maskinerte glassglasset (med to vinkelrette posisjonerskiler, indikert med en "w" på bildet) som presenterer en maske som passer med lokaliseringen av de 16 biochipmikromatrisene. Ved lyseksponering og gjennomsiktighet, når det er installert for AFM-karakteriseringen, gjør glassglasset at AFM-spissen kan plasseres på ønsket sted for å karakterisere den. (B) Biochip installert på "maske" lysbildet og under en dråpe buffer for å skanne i flytende forhold. (C) SPRi-bilde av de 16 mikromatrisene. (D) En mikromatrise avbildet ved optisk mikroskopi etter immunfangst av biofunksjonaliserte kalibreringsnanopartikler på 920 nm i diameter. De hvite firkantene indikerer prøvetaking av de forskjellige områdene skannet av AFM på hvert sted av interesse for å gjøre AFM-karakteriseringen robust. Skalastenger = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; SPRi = overflateplasmon resonansavbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Raman spektroskopi
MERK: For Raman-spektroskopi, erstatt glassglasset som brukes som underlag med et lysbilde av CaF2, som har en ubetydelig Raman-signatur.
- Optiske betingelser for oppkjøpet:
- Sett følgende betingelser for Raman imaging mikroskopet: mikroskopmål: 50x; laser bølgelengde: 532 nm; lasereffekt: 10 mW; eksponeringstid: 500 ms; antall akkumulasjoner: 140; spektralområde: fra 450 cm-1 til 3,200 cm-1.
MERK: Bruk av for mye strøm og/eller for lang innsamlingstid kan føre til skade på prøven, dokumentert av ustabile spektra over tid. Start med en lav mengde energi og øk dette hvis signalet er for svakt. Høyere laserbølgelengder kan brukes (633 nm, 785 nm) for å redusere fluorescensen som er skadelig for Raman-målinger. Intensiteten avtar imidlertid med bølgelengdens fjerde potens, og kameraets spektrale følsomhet bør vurderes.
- Sett følgende betingelser for Raman imaging mikroskopet: mikroskopmål: 50x; laser bølgelengde: 532 nm; lasereffekt: 10 mW; eksponeringstid: 500 ms; antall akkumulasjoner: 140; spektralområde: fra 450 cm-1 til 3,200 cm-1.
- Raman bildebehandling:
- Først må du observere de levende spektrene med et redusert antall akkumulasjoner (10) for å finne området med det beste signal-støy-forholdet.
MERK: Et sterkt signal i høyfrekvensområdet (2,800-3,000 cm-1) kan lette deteksjonen av EV på overflaten med lave eksponeringstider, som tidligere vist10. - Når avkastningen er valgt, velger du den romlige oppløsningen i henhold til tiden som er tilgjengelig for anskaffelsen.
MERK: Den romlige oppløsningen er begrenset av diffraksjonsgrensen (~ 500 nm). - Start oppkjøpet av Raman-kartleggingen.
- Først må du observere de levende spektrene med et redusert antall akkumulasjoner (10) for å finne området med det beste signal-støy-forholdet.
- Forhåndsbehandling av data:
- Bruk et Python-integrert utviklingsmiljø (IDE) (f.eks. Spyder), åpne filen som inneholder spektrene.
- Trekk grunnlinjen av spektra for å korrigere for interferens fra mulig fluorescens. Bruk for eksempel "arpls" -funksjonen fra pakken "irfpy"23. Test forskjellige verdier av parameteren "lam" for å finne den som gir best grunnlinjekorreksjon (vanligvis mellom 10,3 og 10,7).
- Normaliser spektrene, for eksempel ved å dele alle intensitetene til et spektrum med intensiteten ved 2,900 cm-1 eller ved å trekke gjennomsnittet av spekteret og deretter dele det med standardavviket ("standard normal variat" normalisering).
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å sammenligne den relative molekylære sammensetningen av elbiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemmelse av optimale pH-forhold for ligandtransplantasjon
De forskjellige ligandene som brukes til å forberede biochipsene testes som en funksjon av pH og deres tilgjengelighet til å interagere med det tiolat kjemiske laget (figur 3). Ligandene fortynnes i acetatbuffer ved forskjellige pH-verdier og injiseres på biochipet kjemisk funksjonalisert med et C11C16-lag. Løsningene injiseres tilfeldig på overflaten, og et vaskemiddel (OG ved 40 mM) injiseres etter hver ligandinjeksjon for å gjenopprette grunnlinjen. Denne prekonsentrasjonstesten tillater bestemmelse av optimal pH for hver ligandtransplantasjon. I eksemplet presentert i figur 3 ble en pH på 6 valgt som den beste pH når det gjelder helning og nivå av ligandtransplantasjon.
SPRi CCD-bilder
SPRi CCD-bildene registrert på biochipen (nakne, kjemisk funksjonaliserte eller presenterende mikromatriser) etter innsetting i SPRi-maskinen er presentert i figur 4. Når det gjelder mikromatrise-presenterende biochip, ble bildet tatt etter albuminpassivering av overflaten. Duplikater eller triplikater av flekker ble systematisk realisert på brikken, og en negativ kontroll var automatisk også tilstede på brikken. Den negative kontrollen besto hovedsakelig av et irrelevant antistoff. I SPRi, når biochipen ble brukt uten å spotte adsorpsjon på nakent gull eller for direkte poding av elbiler på en kjemisk funksjonalisert biochip, ble avkastningen valgt vilkårlig i sensorområdet. Som et eksempel viser figur 4C avkastning valgt på en naken gullbrikke før injeksjon av elbiler.
Takket være dette SPRi CCD-bildet er det mulig å ignorere visse flekker hvis slike problemer oppstår under podningen. SPRi CCD-bildet tillater også estimering av homogeniteten til podingen inne i stedet, sikrer reproduserbarheten av podingen mellom forskjellige flekker av samme ligand, og til slutt sikrer at EV-biodeteksjonen fortsetter på arrays som er ekvivalente når det gjelder overflatetetthet.
SPRi resultater
Når ROIene er valgt, er basislinjen stabil, noe som betyr at prøven kan injiseres. Figur 5 viser forskjellige resultater oppnådd på en multiplekset biochip, og avslører et høyt signal-støyforhold for visse immunomatriser (reflektivitetssignalet er 1,4% på antiCD41 sammenlignet med responsen på den negative kontrollen på 0,02%). Figur 5B presenterer resultatene for EV-adsorpsjon oppnådd etter injeksjon av EV-prøven på en naken gullbrikke. N-PEVs prøven var fra blodplater. Oppløsningen ble sentrifugert ved 3000 × g i 15 minutter ved 22 °C. supernatanten ble deretter sentrifugert igjen ved 20 000 × g i 15 minutter ved 22 °C. Den resulterende pelleten ble resuspendert i bufferen. De SPRi-resultatene oppnådd på immunfangede N-PEVs ble sammenlignet med Western Blot (WB) -resultatene. WB viste et sterkt uttrykk for CD41, CD62P og CD9 i disse prøvene, noe som fremhever en god korrelasjon med SPRi-resultatene (tilleggsfigur S1).
Figur 5B presenterer resultatene for EV-adsorpsjon oppnådd etter injeksjon av EV-prøven fra humane primære brystepitelceller (HMECs) på en naken gullbrikke. HMEC-cellekulturen ble sentrifugert ved 3 650 × g i 10 minutter, og deretter ble supernatanten sentrifugert igjen ved 10 000 × g i 30 minutter ved 4 °C. Den resulterende pelleten ble resuspendert i 1x PBS-buffer for å vaske den, og sentrifugering ble utført igjen ved 10 000 × g i 30 minutter ved 4 °C. Til slutt ble pelleten suspendert i 1x PBS buffer.
AFM-karakterisering
Etter SPRi-eksperimentene og EV-belastningen på biochips (enten ved adsorpsjon, poding eller affinitetsfangst), ble AFM utført ved å følge metoden for å skanne store skanninger (10 x 10 μm²) og deretter (~ 10 minst) mindre (noen få μm²). Figur 7 viser eksempler på storskala og småskala AFM-bilder av elbiler på biochips.
Figur 7: AFM-karakterisering av elbiler på en biochip. Bilder oppnådd i kontaktmodus for en tørket prøve. (A) Et eksempel på et stort skanneområde for å gi en representativ oversikt over mm² ROI på brikken. Dette resultatet ble oppnådd etter kovalent poding av EV på en kjemisk modifisert overflate. (B) Et annet eksempel på et stort skanneområde oppnådd etter fangst av EV på immunoarrays. (C) En nærmere visning av objektene for å få høy oppløsning og aktivere metrologi (i høyde og diameter) av EV. (D) En nærmere visning av biochipen i bildet i (A) med et 3D-skråstilt bilde. (E) Et zoomet inn bilde av en stor EV adsorbert på en naken gullbiochip i et skråstilt 3D-bilde. Z-skalaen er (A, B) 30 nm og (C) 20 nm. Skalastenger = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Forkortelser: AFM = Atomic Force Microscopy; EV = ekstracellulære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Gwyddion analyse
Gwyddion-programvare ble brukt til å behandle dataene for hver vesikkel visualisert på hver batch av AFM-bilder. Først ble et stort område (i området 10 x 10 μm²) som viste en representativ visning av mm² ROI på brikken skannet. Bildet i figur 7A viser at overflaten var tett dekket med gjenstander. I dette tilfellet ble elbilene (fra storfemelk) injisert ved 2,5 × 1010/ml på en aktivert tiolfunksjonalisert brikke. Etter å ha eliminert kasein fra prøven, ble mysesupernatanter konsentrert ved sentrifugering ved 4000 × g og 20 °C ved bruk av Amicon 100 kDa sentrifugalfilterenheter, og elbilene ble isolert ved hjelp av ultrasentrifugeringsmetoden sukrosegradient. Dette resultatet tilsvarer kovalent podede elbiler på en kjemisk modifisert overflate. Figur 7B viser et annet eksempel på et stort skanneområde oppnådd etter fangst av EV på immunoarrays. Også her var objekter til stede på overflaten, men viste en mindre tett dekning enn når elbilene ble kovalent podet på brikken. En nærmere titt, i figur 7C, flere steder i avkastningen muliggjør høy oppløsning og metrologi (i høyde og diameter) av EVs. En annen nærmere visning (figur 7D) av biochipen vist i figur 7A, med et 3D-skråstilt bilde, avslører objekter som er vesikler, men også trådformede (øverst til venstre). Faktisk, mens immunchips muliggjør selektiv og differensiell fangst av EV-undergrupper, transplanterer kovalent poding alle objektene med frie amingrupper som er tilstede i prøven. I figur 7E avslører AFM en eneste stor EV fra HMEC-kulturen adsorbert på nakent gull. Dermed er AFM i stand til å avsløre små til store elbiler og måle dem og hjelper til med å telle antall objekter per mm² ved å tillate visualisering av hver EV.
Den målte høyden og diameteren til hver EV ble bestemt, hvorfra den effektive diameteren ble oppnådd. EV-høydene dekket et område fra 10 nm til 50 nm, med et gjennomsnitt på 15 nm; De målte EV-diametrene dekket et område fra 50 nm til 300 nm, med et gjennomsnitt på 100 nm. Vi observerte at den effektive diameteren på elbilene varierte fra 30 nm til 300 nm, med et stort flertall rundt 60 nm (figur 8A). Disse målingene ble utført i væske eller etter fiksering og tørking. Figur 8B viser at resultatene oppnådd i disse to forholdene var sammenlignbare.
Figur 8: Resultater generert av AFM-karakterisering av elbiler på en biochip. (A) Metrologi av EV på ett sted (antiCD41 immunoarray), bestemt med en terskel på 8,5 nm og etter injeksjon av en EV-prøve ved 2,5 × 1010 / ml. Den "effektive beregnede diameteren" presenteres, med hver prikk som tilsvarer en partikkel visualisert på AFM-bildene. (B) Histogram generert fra dataene i (A), som viser fordelingen av den effektive diameteren til EV-ene. Resultater oppnådd i luft (i rødt: prøve fast og tørket) og i væske (i blått: ufiksert). Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; EV = ekstracellulære vesikler . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
N-PEV-analysen ved AFM ble sammenlignet med NTA-resultatene. De siste "in-solution" -resultatene, av NTA, viste en fordeling av EV-diametre fra 32 nm til 650 nm, med et stort flertall mellom 90 nm og 250 nm i diameter. Således, med tanke på at NTA ikke er følsom for små størrelser (nær 50 nm), viser disse AFM-målingene god korrelasjon med disse resultatene (tilleggsfigur S2).
Raman-eksperimentene, som ble realisert på elbiler adsorbert på en naken chip, avslørte oppmuntrende resultater; Nærmere bestemt ble det oppnådd et klart spekter av elbilene (figur 9). Raman-spektra kan deles inn i tre forskjellige områder: "fingeravtrykk" -regionen (under 1,800 cm-1), som inneholder topper som danner molekylærspesifikke mønstre og er dermed den viktigste delen for identifikasjonsformål; den "bio-stille" regionen (1,800-2,800 cm-1), som vanligvis kasseres når man studerer biologiske prøver, da den ikke inneholder topper; og "høye frekvenser" -regionen, som hovedsakelig inneholder informasjon om lipider og ofte er den mest intense delen av spekteret, men er mindre spesifikk. Spekteret viser topper som hovedsakelig tilsvarerCH2-vibrasjoner (2,853 cm-1, 1,444 cm-1 og 130 cm-1), som er forbundet med lipidene i membranen til EV og en topp som tilsvarer fenylalaninaminosyren21. En Raman-toppoppgavetabell over vanlige molekyler som finnes i elbiler, finnes i papiret av Penders et al.22.
Figur 9: Raman-spektroskopikarakterisering av elbiler på en biochip. Her ble EV-prøven hentet fra en HMECkultur og gjenvunnet ved sentrifugering ved 20.000 × g. (A) Eksempel på et Raman-bilde av elbiler adsorbert på en naken biochip (gjennomsnittlig intensitet), lagt på et brightfield-bilde. (B) Eksempel på målt Raman-spektra av elbiler. De stiplede linjene tilsvarer identifiserte vibrasjoner. α, saks; τ, vridning; υ, strekking (s, symmetrisk; som, asymmetrisk). Skala bar = (A) 50 μm. Forkortelser: EV = ekstracellulære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) målinger av N-PEVs. Elbilene ble utvannet i PBS; forsøkene ble gjort i triplikat med et MALVERN-instrument NS300. Gjennomsnittlig diameter = 137,5 nm ± 1,3 nm; Modusdiameter = 104,9 nm ± 13,3 nm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Western blot-analyser av N-PEVs. N-PEV (1) og (2) tilsvarer to partier N-PEV fremstilt fra to blodplatekonsentratlommer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De siste metodene for EV-identifikasjon som er de mest brukte, er proteinspesifikk immunoblotting for å bekrefte opprinnelsen til EV, TEM for å bekrefte strukturen og NTA for å kvantifisere antall og størrelsesfordeling i et prøvevolum3. Likevel har den høye interessen for elbiler i (bio) medisinsk forskning og begrensningene i eksisterende analytiske verktøy bedt det vitenskapelige samfunnet om å utvikle nye metoder for EV-karakterisering, diskriminering og kvantifisering.
De fleste utviklinger fokuserer på å kombinere prinsippene for immunmerking eller immunfangst med avanserte fysiske metoder for EV-deteksjon. Noen av disse tilnærmingene fokuserer på identifisering av individuelle EVer for å oppnå maksimalt pålitelige data på nanoobjektskalaen. Andre er mer opptatt av å foreslå globale metoder som er rimelige og pålitelige for klinisk bruk.
NBA-plattformen, som kombinerer biodeteksjon av EV på et multiplekset gullsubstrat og AFM-karakterisering, muliggjør dyp kvalifisering av nanovesiklene som er tilstede i komplekse biologiske væsker. Faktisk, på grunn av biochipets selektivitet, kan råprøver injiseres, og vesikelbidraget kan fremheves.
Den foreslåtte tilnærmingen består av karakterisering av elbiler adsorbert / podet eller fanget av affinitet på et grovt gullsubstrat. AFM, som er konvensjonelt brukt på atomisk flate substrater, viser fortsatt optimal ytelse på den grove gullbrikken, og avslører forskjellige grensesnitt som er mikro / nanostrukturert.
Den multipleksede biochipen som presenterer flere flekker å skanne (opptil 16 til nå) og NBA-tilnærmingen for faste og tørkede prøver ble utviklet for å redusere tiden som trengs for en dyp og svært løst AFM-undersøkelse av hvert sted. Ulike tester utført i laboratoriet viste at denne prosedyren (fiksering, tørking og avbildning i luft) ikke påvirker metrologi av EV betydelig.
Det er to viktige kritiske trinn i tilnærmingen: å finne et kompromiss for å velge den beste chipfølsomheten for alle de forskjellige podede ligandene og EV-dissosiasjon fra substratet på slutten etter injeksjon. Her ble det brukt en SPRi-maskin som arbeider med en enkelt resonansvinkel, noe som indikerer at det beste kompromisset i plasmonrespons for alle ligandspunktene må velges. For noen ligander vil deteksjonen være svært følsom (nær den optimale vinkelen); For andre vil deteksjonen være mindre følsom hvis den faste vinkelverdien er forskjellig fra den optimale vinkelen. Dette kan løses ved å bruke den siste generasjonen av SPRi-instrumentering som gir opptil 10 forskjellige arbeidsvinkler.
Det andre kritiske trinnet er dissosiasjonen av elbilene fra substratet etter injeksjon. Hvis dissosiasjonen er for høy (fordi elbilene for eksempel bare presenterer noen få spesifikke proteiner på overflaten), vil det ikke være mulig å skanne med AFM etterpå. Disse situasjonene er svært sjeldne, men når de oppstår, må strømningshastigheten og injeksjonsvarigheten optimaliseres for å løse problemet.
En begrensning av den foreslåtte metoden kan være mangel på representativitet av korrelasjonen mellom AFM-observasjonene og mm²-området av EV-interaksjoner på biochipen. For det må forskjellige områder på stedet skannes, inkludert fra store områder til små områder og på forskjellige steder inne på stedet. Ideelt sett bør skanningen utføres i ROI-området for en god sammenheng mellom AFM-karakteriseringen og SPRi-responsen.
I andre arbeider brukte forfatterne av denne studien optisk deteksjon og digital telling av individuelle EVer, som er basert på interferometrisk avbildning av EVer fanget på et biofunksjonalisert silisiumsubstrat. Denne teknikken gjør det mulig å estimere størrelsen på elbilene på grunn av kontrasten som observeres. Denne plattformen gjorde det dermed mulig, ved hjelp av de rikelige markørene CD9, CD63 og CD81, å multiplekse analysen og oppdage tilstedeværelsen av EVer som uttrykker en nevronmarkør, CD171, i cerebrospinalvæske hos mennesker24.
Denne kombinerte og merkefrie tilnærmingen, assistert av streng metodikk i utarbeidelsen av biochip og i AFM-oppkjøpsmodus, utgjør en metode for valg for å karakterisere elbiler gjennom fangst i sanntid og under flyt i selv komplekse og grove prøver. Faktisk er det ikke nødvendig med noen preanalytiske trinn med prøven og ingen merkings- eller avmaskeringstrinn i den presenterte metoden. I litteraturen avslørte Ertsgaard et al. forskjellige rikelig EV-membranmarkører ved hjelp av en enkelt partikkel interferometrisk refleksjonsbildesensor (SP-IRIS), men i statisk modus (ingen strømning) uten kinetikkmålinger, og ga bare en estimering av EV-størrelsen25.
På grunn av denne optimaliserte prosedyren som muliggjør fremstilling av reaktive, kontrollerte biogrensesnitt og passiverte multipleksede biochips, kan EV-undergrupper karakteriseres dypt når de injiseres som råprøver. Disse forskjellige elementene gjør denne NBA-plattformen til en svært relevant metode for direkte, dyp og løst analyse av elbiler i råprøver.
Spektroskopi, og spesielt overflateforbedret Raman-spektroskopi (SERS), fremstår som en metode for valg for biokjemisk analyse av svakt uttrykte EV-biomarkører. Denne strategien har gjort det mulig å utvikle multipleksede analyser med følsomheter på noen få titalls EV per μL. SERS-avbildning kombinert med sorteringsmetoder (f.eks. Dielektroforese) gjør analysen av EV-sammensetning mulig med høy gjennomstrømning26.
I dette arbeidet var Raman-eksperimentene utført på gullbiochips også veldig oppmuntrende, siden et klart spekter av elbiler ble oppnådd, og dermed ga innsikt i deres molekylære sammensetning. Fremtidig utvikling kan også inkludere SERS for å øke signalet som kommer fra elbilene på overflaten av biochipet og spissforbedret Raman-spektroskopi (TERS) for å oppnå bilder med nanometrisk oppløsning, og dermed tillate enkelt-EV-karakterisering.
Nylige utviklinger i laboratoriet har blitt gjort for å forbedre følsomheten til biodeteksjon og diskrimineringen mellom EV-delmengder som sameksisterer i en prøve og potensielt samhandler på de samme arrayene. For å øke følsomheten byttes eksperimenter til SPRi-systemet, som gjør det mulig å velge flere vinkler for EV-deteksjon på forskjellige steder. For å forbedre diskrimineringen av EV-undergrupper, må ulike utfordringer møtes: i) å skaffe den spektroskopiske Raman-signaturen til hver EV-delmengde på biochipen, ii) øke antall flekker identifisert på biochipen (fra 16 til 100), og iii) øke gjennomstrømningen av analysen ved hjelp av høyhastighets AFM (HS AFM). Videre vil HS AFM også tillate karakterisering av EV-delmengder raskt og i flytende forhold.
Noen andre punkter å merke seg er at hvis hydrofiliteten til gullbiochipet er høy, er det fare for at flekkene på ligandene overlapper hverandre og blandes sammen (som vist i figur 4B). Det er nødvendig å unngå å injisere luftbobler under injeksjon av oppløsninger under SPRi, da dette vil føre til endringer i reflektiviteten og bidra til feil overvåking av SPRi-signalet.
Mens du skanner overflatene med AFM, er det nødvendig å observere bildene for å sjekke om det er drastiske endringer i sumverdien eller om det er gjenstander (f.eks. Repeterende utseende av objekter). Dette kan skyldes forurensning av AFM-spissen; I dette tilfellet må spissen byttes ut.
Det er noen begrensninger i teknikken vi har observert: den valgte chipfølsomheten for alle de forskjellige podede ligandene er ikke optimal for dem alle; dissosiasjonen av elbilene fra substratet på slutten av injeksjonen; og den lavere oppløsningen (enn AFM) til Raman-bildebehandling, som ikke tillater visualisering av individuelle EV-er.
Til tross for begrensningene har denne protokollen mange betydelige fordeler med hensyn til eksisterende metoder. Ved å kombinere de etikettfrie metodene (SPRi + AFM + Raman-spektroskopi) på samme substrat og deretter på samme biologiske prøve, unngår man skjevhet mellom analysene på grunn av substratet og gir høy originalitet og tillit til analysen av EV-undergrupper.
En slik konstruert analytisk plattform kan hjelpe til med EV-karakterisering i forskjellige sammenhenger, for eksempel innen diagnose og acellulær bioterapi og biofluider fra blod til cellesupernatanter. I tillegg til EV-kvalifisering kan andre nanoobjekter (f.eks. Molekylære komplekser, syntetiske nanopartikler, virus) karakteriseres av denne multimodale analytiske plattformen.
Til tross for det store utvalget av metoder utviklet og implementert i EV-samfunnet, har hver av disse teknikkene sitt eget potensial og forskjeller i ytelse når det gjelder dynamisk rekkevidde, nøyaktighet, gjennomstrømning og applikasjon for analyse av spesifikke EV-parametere26. Innovative, ultrasensitive og flertrinns tilnærminger (separasjon, utvalg, spektral signatur og analyse av vesikulært innhold), som denne multimodale analytiske plattformen, selv når den brukes på små volumer på chips (lab-on-a-chip), gir nye perspektiver innen flytende biopsier, biomonitorering og presisjonsmedisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Kelly Aubertin og Fabien Picot fra IVETh-kjernefasiliteten (Paris) er anerkjent for Raman-avbildningseksperimentene. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) og Zuzana Krupova (fra Helincourt, Frankrike) er anerkjent for å ha levert EV-prøvene avledet fra henholdsvis blodplate- og storfemelkprøver. Arbeidet ble støttet av regionen Bourgogne Franche-Comté og EUR EIPHI graduate school (NOVICE prosjekt, 2021-2024). En del av dette arbeidet ble gjort ved hjelp av CLIPP-plattformen og i RENATECHs renromsfasiliteter i FEMTO-ENGINEERING, som vi takker Rabah Zeggari for.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
- Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).
- Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).
- Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
- Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
- Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).
- Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
- Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).
- Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
- Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
- Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).
- Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).
- Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).
- Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
- Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
- Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
- Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
- Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246 (2016).
- Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
