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Neuroscience

Vivo में एक बड़ी कपाल विंडो का उपयोग करके माउस से वाइड-फील्ड और टू-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64224
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2,3, 1
1Department of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Yamanashi, 2Department of Neuropharmacology, Faculty of Medicine, University of Yamanashi, 3Yamanashi GLIA center, Interdisciplinary Graduate School of Medicine, University of Yamanashi, 4Department of Neurochemistry, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल खाद्य लपेट, पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास का उपयोग करके एक बड़ी (6 x 3 मिमी2) कपाल खिड़की बनाने का वर्णन करता है। यह कपाल विंडो एक ही माउस में विवो वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों में अनुमति देती है।

Abstract

माउस के नियोकॉर्टेक्स से वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग विभिन्न मस्तिष्क कार्यों से संबंधित कॉर्टेक्स-वाइड तंत्रिका गतिविधि का निरीक्षण करने की अनुमति देता है। दूसरी ओर, दो-फोटॉन इमेजिंग एकल-कोशिका स्तर पर स्थानीय तंत्रिका सर्किट की गतिविधि को हल कर सकती है। एक ही माउस में दोनों इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके कई पैमाने पर विश्लेषण करने के लिए एक बड़ी कपाल खिड़की बनाना महत्वपूर्ण है। इसे प्राप्त करने के लिए, किसी को खोपड़ी के एक बड़े हिस्से को हटाना होगा और पारदर्शी सामग्री के साथ उजागर कॉर्टिकल सतह को कवर करना होगा। इससे पहले, इस उद्देश्य के लिए कांच की खोपड़ी और बहुलक-आधारित कपाल खिड़कियां विकसित की गई हैं, लेकिन ये सामग्री आसानी से निर्मित नहीं होती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीविनाइलिडेन क्लोराइड (पीवीडीसी) रैपिंग फिल्म, एक पारदर्शी सिलिकॉन प्लग और एक कवर ग्लास से युक्त एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है। पूरे गोलार्ध की पृष्ठीय सतह की इमेजिंग के लिए, खिड़की का आकार लगभग 6 x 3 मिमी2 था। इतनी बड़ी खिड़की की परवाह किए बिना गंभीर मस्तिष्क कंपन नहीं देखा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, मस्तिष्क की सतह की स्थिति एक महीने से अधिक समय तक खराब नहीं हुई। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई), जीसीएएमपी 6 एफ को व्यक्त करने वाले माउस की वाइड-फील्ड इमेजिंग, विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स में, कुछ मिलीमीटर में सिंक्रनाइज़ प्रतिक्रियाओं का पता चला। एक ही माउस के दो-फोटॉन इमेजिंग ने कई सेकंड में व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स में प्रमुख कैल्शियम प्रतिक्रियाएं दिखाईं। इसके अलावा, एक एडेनो से जुड़े वायरस की एक पतली परत पीवीडीसी फिल्म पर लागू की गई थी और कपाल खिड़की पर कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में जीईसीआई को सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया था। यह तकनीक एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने के लिए विश्वसनीय और लागत प्रभावी है और मैक्रोस्कोपिक और सूक्ष्म स्तरों पर व्यवहार के दौरान तंत्रिका और ग्लियल गतिशीलता और उनकी बातचीत की जांच की सुविधा प्रदान करती है।

Introduction

वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग प्रभावी रूप से पशु मस्तिष्क 1,2,3 के एक बड़े क्षेत्र में स्थानिक गतिविधि पैटर्न की जांच करता है। कृन्तकों की पूरी कॉर्टिकल सतह का निरीक्षण करने के लिए वाइड-फील्ड इमेजिंग का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है क्योंकि उनका कॉर्टेक्स अपेक्षाकृत सपाट 2,3,4,5,6,7,8,9,10 है। ट्रांसजेनिक चूहों या चूहों को एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) के साथ इंजेक्ट किया जाता है, जो विशेष रूप से न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं जैसे विभिन्न कोशिकाओं में जीईसीआई को व्यक्त करते हैं, का उपयोग वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग 11,12,13 के लिए किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक का स्थानिक संकल्प आमतौर पर विवो14 में व्यक्तिगत कोशिकाओं की गतिविधि को हल करने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह गहरी परतों में स्थित इमेजिंग कोशिकाओं के लिए भी उपयुक्त नहीं है।

दूसरी ओर, दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग उपकोशिकीय स्थानिक संकल्प के साथ एक साथ कई कोशिकाओं की गतिविधि का निरीक्षण कर सकती है, जिससे न्यूरोनल डेंड्राइट और ग्लियल प्रक्रियाओं 15,16,17,18,19,20,21,22 में भी व्यक्तिगत कोशिकाओं की गतिविधि का अवलोकन किया जा सकता है। यह सेरेब्रल कॉर्टेक्स23,24 की गहरी परतों में कोशिकाओं का भी निरीक्षण कर सकता है। यद्यपि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी में हालिया तकनीकी प्रगति मिलीमीटर-वाइड कॉर्टिकलक्षेत्रों 25,26,27,28,29 से इमेजिंग को सक्षम करती है, फिर भी दो-फोटॉन इमेजिंग द्वारा वाइड-फील्ड इमेजिंग के बराबर क्षेत्र का निरीक्षण करना मुश्किल है।

एकल-कोशिका से पूरे मस्तिष्क तक मस्तिष्क गतिविधि की शारीरिक प्रासंगिकता को समझने के लिए, पूरे कॉर्टेक्स पर कॉर्टिकल क्षेत्रों की गतिविधि और स्थानीय तंत्रिका सर्किट में एकल-कोशिका संकल्प के बीच की खाई को पाटना महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक ही माउस में किए गए वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग का संयोजन विशेष रूप से प्रभावी है। इसे महसूस करने के लिए, एक विस्तृत और स्थिर कपाल खिड़की बनाई जानी चाहिए, आदर्श रूप से लंबी अवधि में।

इससे पहले, कपाल खिड़कियां बनाने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है ताकि वाइड-फील्ड और टू-फोटॉन इमेजिंग को एक ही माउस30,31 में किया जा सके। ट्रेपोज़ॉइडल के आकार की कवर ग्लास खिड़कियां (क्रिस्टल खोपड़ी), जिन्हें हटाई गई हड्डी को बदलने के लिए कॉर्टिकल सतह के आकार में ढाला जाता है, पूरे कॉर्टेक्स32 पर ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट (पीईटी) 33 या पॉलीथीन-ऑक्साइड-लेपित अनाकार फ्लोरोपॉलिमर नैनोशीट34 के साथ बहुलक आधारित कपाल खिड़कियां बनाई जा सकती हैं। प्रत्येक विधि को 1 महीने से अधिक समय तक एक स्थिर खिड़की बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इन खिड़कियों का उत्पादन करना आसान नहीं है, और उपयोग की जाने वाली सामग्री और उपकरण अक्सर महंगे होते हैं।

वर्तमान अध्ययन पीवीडीसी फिल्म (प्लास्टिक फूड रैप) (चित्रा 1) का उपयोग करके एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने के लिए एक नई विधि का वर्णन करता है। इस विंडो का उपयोग करके, विवो वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन इमेजिंग प्रयोगों को एक ही चूहों में किया जा सकता है। यह भी दिखाया गया है कि जीईसीआई को चूहों के कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जा सकता है, जिससे रैप पर एएवी कणों वाली फिल्म की एक पतली परत बन जाती है।

Protocol

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को यामानाशी विश्वविद्यालय की पशु प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। जंगली प्रकार (C57BL / 6J, जापान SLC) और ट्रांसजेनिक चूहों एस्ट्रोसाइट्स में झिल्ली-लंगर वाले GECI (Lck-GCaMP6f) को व्यक्त करने वाले इस अध्ययन में उपयोग किया गया था। ट्रांसजेनिक चूहों को AldH1l1-CreERT2 चूहों [B6N] को पार करके प्राप्त किया गया था। FVB-Tg (Aldh1l1-cre/ERT2)1Kh/J, व्यावसायिक रूप से प्राप्त, सामग्री की तालिका देखें] और Flx-Lck-GCaMP6f चूहे [C57BL/6N-Gt (ROSA)26Sor/J, व्यावसायिक रूप से प्राप्त] चूहे। ट्रांसजेनिक चूहों को जीसीएएमपी 6 एफ को व्यक्त करने के लिए 5 दिनों (0.05 एमएल / 10 ग्राम बीडब्ल्यू, यानी) के लिए टैमोक्सीफेन (20 मिलीग्राम / एमएल) के साथ इलाज किया गया था। इस्तेमाल किए गए सभी चूहे कम से कम 4 सप्ताह के नर और मादा थे। विंडो की योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, और सर्जिकल प्रक्रिया को चित्रा 1 बी में संक्षेपित किया गया है।

1. कपाल खिड़की सर्जरी की तैयारी

  1. आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें (प्रेरण: 3%, सर्जरी: 1% -1.5%, प्रवाह दर: 0.2-0.3 एल / पूंछ या पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स के नुकसान से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। हीटिंग पैड (36-38 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके शरीर के तापमान को बनाए रखें। एनेस्थीसिया के तहत चूहों की आंखों को सूखने से रोकने के लिए कपास के फाहे के साथ आंखों का मलहम लगाएं।
  2. 15% मैनिटोल समाधान इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें) इंट्रापरिटोनियल (3 एमएल / 100 ग्राम शरीर का वजन)। माउस के सिर को कान की सलाखों के साथ स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर ठीक करें। शेवर और हेयर रिमूवल क्रीम का उपयोग करके माउस के सिर से बालों को हटा दें।
  3. पोविडोन-आयोडीन और अल्कोहल के साथ त्वचा की सतह को तीन बार कीटाणुरहित करें। प्रीमेप्टिव एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए लिडोकेन को शीर्ष पर लागू करें। सर्जिकल कैंची के साथ रुचि के क्षेत्र पर त्वचा को हटा दें और खोपड़ी (आकार: 15 x 15 मिमी) को उजागर करें। यदि रक्तस्राव मौजूद है, तो रक्तस्राव को रोकने के लिए कपास के फाहे का उपयोग करें।
    नोट: इस अध्ययन में, दृश्य प्रांतस्था के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स का निरीक्षण करने के लिए त्वचा को हटा दिया गया था।
  4. एक माइक्रो क्योरेट का उपयोग करके उजागर खोपड़ी पर पेरीओस्टेम को हटा दें और खोपड़ी की सतह को सुखाएं ताकि सिर की प्लेट को दंत सीमेंट के साथ खोपड़ी से मजबूती से जोड़ा जा सके ( सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 2 बी)।
    नोट: कस्टम-निर्मित हेड प्लेट एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर बनाया गया है। डिजाइन फ़ाइल गिटहब रिपॉजिटरी (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates) में जमा की जाती है।
  5. दंत सीमेंट का उपयोग करके हेड प्लेट संलग्न करें (चित्रा 2 सी)। सीमेंट के सख्त होने के लिए कम से कम 20 मिनट प्रतीक्षा करें। हेड प्लेट धारक35 के साथ हेड प्लेट को सुरक्षित करें।

2. कपाल खिड़की बनाना

  1. दंत ड्रिल के साथ खोपड़ी पर अतिरिक्त सीमेंट निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)। सावधान रहें कि हड्डी के माध्यम से ड्रिल न करें और ड्रिलिंग द्वारा मस्तिष्क को नुकसान न पहुंचाएं।
  2. पेन से काटे जाने वाले क्षेत्र को चिह्नित करें और स्केलपेल से हड्डी में काट लें। यह सुनिश्चित करने के लिए स्केलपेल की नोक को कुंद करें कि नोक खोपड़ी में प्रवेश नहीं करती है (पूरक चित्र 1)। खिड़की कहां बनानी है यह निर्धारित करने के लिए मस्तिष्क एटलस का संदर्भ लें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, एंटेरोपोस्टेरियर अक्ष में ब्रेग्मा से -2 मिमी और +4 मिमी के बीच एक खिड़की बनाई गई थी और मोटर, सोमाटोसेंसरी और दृश्य कॉर्टिकस सहित मेडियोलेटरल अक्ष में +3 मिमी तक।
  3. नाली को गहरा करने के लिए स्केलपेल के साथ हड्डी को बार-बार खुरचें जब तक कि हल्के से छूने पर उस क्षेत्र में हड्डी अच्छी तरह से न चले।
  4. बारीक चिमटी के साथ संक्रमित हड्डी को हटा दें। हड्डी फ्लैप को मस्तिष्क में धक्का न दें, जो मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है (चित्रा 1 बी ए)।
    नोट: यदि हड्डी को हटाने के बाद रक्तस्राव देखा जाता है, तो तुरंत कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ, सामग्री की तालिका देखें) को लागू करें और इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक रक्तस्राव बंद न हो जाए। वैकल्पिक रूप से, रक्तस्राव बिंदु पर एसीएसएफ में भिगोए गए हेमोस्टैटिक जिलेटिन स्पंज (लगभग 3 मिमी वर्ग क्यूब्स) रखें।
  5. यदि ड्यूरा हटाया नहीं जाता है, तो चरण 2.7 पर आगे बढ़ें।
  6. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए ड्यूरा मेटर को हटा दें।
    1. उदाहरण के लिए, निम्न स्थितियों में ड्यूरा को हटा दें; फाइब्रोइन-एएवी फिल्म विधि36 का उपयोग करके अभिकर्मक और डेंड्राइटिक स्पाइन जैसी छोटी संरचनाओं का अवलोकन करना।
    2. लगभग 10 μm की पतली नोक के साथ खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करके ड्यूरा को काटें। पूरी खिड़की पर इस कट का विस्तार करने के लिए, यू-आकार की सुई का उपयोग करें।
    3. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप ज़ूम को 60-100x पर सेट करें और अल्ट्राफाइन ट्वीज़र्स के साथ कटे हुए ड्यूरा मैटर को हटा दें। यदि ड्यूरा मेटर को हटाने से रक्तस्राव होता है, तो एसीएसएफ से कुल्ला करें या रक्तस्राव को रोकने के लिए जिलेटिन स्पंज का उपयोग करें।
  7. पीवीडीसी रैप को काट लें।
    1. पीवीडीसी रैप के एक बड़े (उदाहरण के लिए, 10 x 15 मिमी) टुकड़े को निष्फल करें (लगभग 11 μm, सामग्री की तालिका देखें, चित्रा 2 ए ए) ऑटोक्लेविंग द्वारा और 70% इथेनॉल के साथ।
    2. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, आवश्यक आकार की एक लपेट को काटने के लिए चिमटी और एक स्केलपेल का उपयोग करें।
      नोट: रैप का आकार कपाल खिड़की के आकार से लगभग 10 मिमी बड़ा होना चाहिए लेकिन सिर प्लेट के उद्घाटन से छोटा होना चाहिए। 6 x 3 मिमी2 कपाल खिड़की के लिए, 15 x 10 मिमी2 रैप तैयार करें।
  8. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए रैप को सटीक रूप से रखें।
    1. सतह पर एसीएसएफ छोड़ते हुए, मस्तिष्क की सतह पर लपेटें। रैप के किनारे से एसीएसएफ को चूसें, जिससे रैप मस्तिष्क की सतह पर मजबूती से चिपक जाए (चित्रा 1 बीबी, सी)।
      नोट: इस्तेमाल किया गया रैप झुर्री प्रतिरोधी है, इसलिए इसे मस्तिष्क की सतह पर रखने से लगभग कोई झुर्रियां पैदा नहीं होती हैं।
    2. एक स्केलपेल और चिमटी के साथ लपेट को ट्रिम करें ताकि कपाल खिड़की के किनारे और लपेट के बीच लगभग 1 मिमी मार्जिन हो (चित्रा 1 बीडी)।
    3. एक बार जब लपेट पूरी हो जाती है, तो लपेट के किनारे को जैविक चिपकने वाले के साथ खोपड़ी पर गोंद करें ( सामग्री की तालिका, चित्रा 2 डी देखें)। चिपकने वाले को लगभग 30 मिनट तक सूखने दें।
  9. पारदर्शी सिलिकॉन इलास्टोमर लागू करें।
    1. मिक्सिंग टिप (चित्रा 1 बीई, 2 ए बी-डी) के साथ डिस्पेंसर का उपयोग करके रैप के शीर्ष पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पारदर्शी सिलिकॉन इलास्टोमर (सामग्री की तालिका देखें) लागू करें और कवर ग्लास (0.12-0.17 मिमी मोटाई) को शीर्ष पर रखें (चित्रा 2 ई)।
    2. कवर ग्लास की परिधि को वाटरप्रूफ फिल्म, सुपरग्लू या डेंटल सीमेंट के साथ सील करें (चित्रा 1 बीएफ)।
  10. सर्जरी के बाद, माउस की निगरानी करें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए होश में न आ जाए। उसके बाद, चूहों को व्यक्तिगत रूप से रखें, और उन्हें कम से कम 7 दिनों के लिए अपने घर के पिंजरे में ठीक होने की अनुमति दें।
    1. तनाव और दर्द को कम करने के लिए, विरोधी भड़काऊ और एनाल्जेसिक एजेंटों (जैसे, डेक्सामेथासोन और केटोप्रोफेन, प्रत्येक 5 मिलीग्राम /
  11. संक्रमण के लिए नियमित रूप से चूहों की निगरानी करें। यदि संक्रमण की पुष्टि हो जाती है, तो पीने के पानी में एक रोगाणुरोधी दवा (जैसे, 10% एनरोफ्लोक्सासिन, 1.7 μL / mL) का प्रशासन करें जब तक कि संक्रमण समाप्त न हो जाए (आमतौर पर 4 सप्ताह से कम)।

3. फाइब्रोइन समाधान का उपयोग करके प्लास्टिक रैप पर एएवी फिल्म बनाना

नोट: चरण 3 वैकल्पिक है।

  1. पहले प्रकाशित विधि37 का पालन करते हुए रेशम कीट कोकून से फाइब्रोइन समाधान तैयार करें।
    1. संक्षेप में, सोडियम कार्बोनेट समाधान (0.02 एम, 2 एल) में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामान्य रेशम कीट कोकून (5 ग्राम, सामग्री की तालिका देखें) उबालें। कोकून को अल्ट्राप्योर पानी में धो लें और रात भर सुखाएं।
    2. सूखे कोकून को लिथियम ब्रोमाइड समाधान (9.3 एम, 20% डब्ल्यू / वी फाइब्रोइन) में घोलें, जबकि 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में गर्म करें। विघटित कोकून समाधान, सेंट्रीफ्यूज (12,700 x g पर दो बार, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर) 37 को डायलाइज करें, और सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए फाइब्रोइन-एएवी फिल्म तैयार करें।
    1. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एक छोटे से नमूना ट्यूब में 1: 4 अनुपात में फाइब्रोइन और एएवी समाधान20 मिलाएं। कपाल खिड़की के लिए प्लास्टिक रैप पर मिश्रित फाइब्रोइन-एएवी समाधान का एक एलिकोट गिराएं, और इसे कम से कम 3 घंटे तक सुखाएं।
      नोट: व्यास में 3 मिमी के क्षेत्र में अभिव्यक्ति के लिए, फाइब्रोइन-एएवी समाधान की 5 μL बूंद लागू करें। यह अनुपात किसी दिए गए क्षेत्र के लिए समाधान की मात्रा निर्धारित करता है।
    2. सूखने के बाद, प्लास्टिक की चादर को खिड़की के लिए आवश्यक आकार में काटें (उदाहरण के लिए, 10 x 15 मिमी) और इसे मस्तिष्क की सतह पर रखें। फिर, चरण 2.8.1 से उपर्युक्त विधि का पालन करें।
      नोट: मस्तिष्क की सतह पर लपेटने से पहले, मस्तिष्क की सतह पर एसीएसएफ को जितना संभव हो उतना हटा दें। ऐसा इसलिए है क्योंकि एसीएसएफ से फाइब्रोइन-एएवी फिल्म को भंग करने और एएवी कणों की एकाग्रता को कम करने की उम्मीद है।
    3. एएवी-उपचारित विंडो बनाने के बाद लगभग 2-4 सप्ताह प्रतीक्षा करें जब तक कि जीईसीआई पर्याप्त रूप से व्यक्त न हों। इस प्रक्रिया के दौरान, नियमित रूप से चूहों और खिड़कियों की स्थिति की जांच करें।

4. कैल्शियम इमेजिंग और विश्लेषण

नोट: इमेजिंग और विश्लेषण पर विवरण के लिए, कृपया पहले प्रकाशित रिपोर्ट 1,2,38 देखें।

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए वाइड-फील्ड इमेजिंग करें।
    1. अग्रानुक्रम लेंस फ्लोरेसेंस मैक्रोस्कोप के तहत एक सिर निर्धारण डिवाइस का उपयोग करके माउस को स्थिर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एक उत्तेजना फिल्टर, डाइक्रोइक दर्पण और उद्देश्य लेंस के माध्यम से 465 एनएम एलईडी प्रकाश स्रोत से उत्तेजना प्रकाश के साथ चूहों के सेरेब्रल कॉर्टेक्स को रोशन करें।
    3. एक उद्देश्य लेंस (1.0x), डाइक्रोइक दर्पण, उत्सर्जन फ़िल्टर और इमेजिंग लेंस (2.0x) के माध्यम से सीसीडी कैमरे द्वारा सेरेब्रल कॉर्टेक्स की प्रतिदीप्ति छवियों को एकत्र करें। इन लेंसों का संयोजन लगभग 0.5x का कुल आवर्धन देता है।
    4. 50 हर्ट्ज की नमूना आवृत्ति पर छवियां प्राप्त करें। डेटा अधिग्रहण के बाद, ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण करें। मैन्युअल रूप से रुचि क्षेत्र (ROI) का चयन करें। प्रत्येक ROI में प्रतिदीप्ति परिवर्तन की गणना ΔF/F = (Ft - F0) / F0 के रूप में करें, जहां Ft प्रत्येक फ्रेम का कच्चा प्रतिदीप्ति मान है और F0 सभी फ्रेम की औसत छवि से प्राप्त औसत प्रतिदीप्ति मान है।
      नोट: ImageJ के लिए एक मैक्रो प्रोग्राम GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro) में जमा किया जाता है, जो कैल्शियम इमेजिंग डेटा से ΔF / F छवियों की गणना करता है।
  2. नीचे दिए गए चरणों के बाद दो-फोटॉन इमेजिंग करें।
    1. सिर निर्धारण उपकरण का उपयोग करके दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत माउस को स्थिर करें। कम आवर्धन (5x) उद्देश्य लेंस के साथ उज्ज्वल-क्षेत्र मोड में माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किए जाने वाले क्षेत्र की पहचान करें।
    2. दो-फोटॉन इमेजिंग पर स्विच करें। एक उच्च आवर्धन उद्देश्य लेंस (16x या 25x) का उपयोग करें और दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए लेजर को रोशन करें।
      नोट: ग्रीन एलसीके-जीसीएएमपी 6 एफ22 और लाल एक्ससीएएमपी-आर36 क्रमशः 920 एनएम और 1070 एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर अल्ट्राफास्ट लेजर द्वारा उत्तेजित थे।
    3. 30 हर्ट्ज पर प्रतिदीप्ति छवियां प्राप्त करें। डेटा अधिग्रहण के बाद, सूट 2 पी सॉफ्टवेयर39 के पंजीकरण फ़ंक्शन द्वारा सही गति कलाकृतियां। वाइड-फील्ड इमेजिंग के लिए एक ही विधि का उपयोग करके छवियों से ROI और F / F प्राप्त करें।
  3. निम्नलिखित पुस्तकालयों के साथ पायथन का उपयोग करके डेटा को प्लॉट करें: NumPy, Matplotlib, और पांडा ( सामग्री की तालिका देखें)।

Representative Results

पीवीडीसी रैप विधियों का उपयोग करके बनाई गई एक बड़ी कपाल खिड़की का मूल्यांकन
सर्जरी के तुरंत बाद, सफलता या विफलता को कॉर्टिकल सतह की स्थिति से एक नज़र में जांचा जा सकता है, जैसे कि क्षति या इस्किमिया के कारण रक्तस्राव और रंग परिवर्तन। सर्जरी के लंबे समय बाद, कॉर्टिकल सतह संक्रमण के कारण एक अपारदर्शी सफेद झिल्ली से ढकी हो सकती है, या रक्तस्राव के कारण रक्त खिड़की को कवर कर सकता है (चित्रा 2 जी)। इन मामलों में, कॉर्टेक्स स्वस्थ स्थिति में नहीं हो सकता है, और इमेजिंग संभव नहीं हो सकती है। ये आंशिक रूप से कटे हुए लपेटों या चिपकने वाले द्वारा लपेट के अपर्याप्त निर्धारण के कारण हो सकते हैं। यदि संक्रमण बार-बार देखा जाता है, तो एंटीबायोटिक दवाओं को लागू करना प्रभावी हो सकता है, उदाहरण के लिए, खिड़की प्लेसमेंट पर मस्तिष्क की सतह पर जेंटामाइसिन सल्फेट (10 μL, 50 mg / mL)। मासिक धर्म या हड्डियों का पुनर्जनन भी देखा जाता है जब कॉर्टिकल सतह और लपेट के बीच ऊर्ध्वाधर अंतर बड़ा होता है। इसे रोकने के लिए, खिड़की की तैयारी के दौरान मस्तिष्क की सतह पर रैप को यथासंभव कसकर लागू करना महत्वपूर्ण है। यह मस्तिष्क की सतह पर प्लास्टिक की चादर रखकर और जितना संभव हो उतना एसीएसएफ चूसकर प्राप्त किया जा सकता है। एसीएसएफ की अनुपस्थिति में, यह केवल मस्तिष्क की सतह पर प्लास्टिक की चादर रखकर किया जा सकता है। मस्तिष्क और रक्त वाहिकाओं को इस तथ्य से बिना नुकसान के निर्धारित किया जाता है कि मस्तिष्क का रंग बदरंग नहीं होता है और रक्त वाहिकाएं अलग नहीं होती हैं।

खिड़की की दीर्घायु काफी हद तक सर्जरी की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। जब स्थिति अच्छी होती है, तो सर्जरी के 1 महीने से अधिक समय बाद संक्रमण, रक्तस्राव या पुनर्जनन का कोई संकेत नहीं होता है (चित्रा 2 एफ और चित्रा 3 बी)। 10 चूहों में से 8 में, खिड़की को 10 सप्ताह या उससे अधिक समय तक साफ रखा जा सकता है। संक्रमण या रक्तस्राव के कारण दो चूहों में खिड़कियों को ठीक से बनाए नहीं रखा जा सका। यद्यपि बड़ी खिड़की यांत्रिक तनाव या प्रभाव से ग्रस्त हो सकती है, टूटी हुई या टूटी खिड़कियां नहीं देखी गईं।

रैप, सिलिकॉन और ग्लास के साथ नई कपाल खिड़की की इमेजिंग गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन की तुलना नई विंडो के तहत पारंपरिक ग्लास विंडो के तहत आगर में 0.1 μm फ्लोरोसेंट मोतियों की इमेजिंग करके की गई थी (पूरक फ़ाइल 1 देखें)। परिणामों ने दोनों स्थितियों के लिए आधे अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) पर पूर्ण चौड़ाई में कोई अंतर नहीं दिखाया। [x-अक्ष (μm): ग्लास, 1.99 ± 0.07, रैप, 1.76 ± 0.13, Y-अक्ष (μm): ग्लास केवल 2.11 ± 0.27, रैप, 1.90 ± 0.15, Z-अक्ष (μm): ग्लास केवल, 25.29 ± 0.71, लपेटना, 26.64 ± 1.02, N = 7 मोती, p > 0.02, N = 7

श्वसन, दिल की धड़कन और शरीर की गति के कारण कंपन कलाकृतियां वाइड-फील्ड और टू-फोटॉन इमेजिंग में मौजूद हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि नई कपाल खिड़की कितनी कंपन करती है, विवो टू-फोटॉन इमेजिंग डेटा से एक छोटे फ्लोरोसेंट कण का चयन किया गया था और जांच की गई थी कि 60 के दशक के दौरान इसकी छवि कितनी चली गई। यह पाया गया कि उस फ्लोरोसेंट कण के केन्द्रक का मानक विचलन लगभग 0.3 μm था, जो एक पारंपरिक ग्लास विंडो (पूरक चित्रा 2 सी) के तहत तुलनीय है। यह इंगित करता है कि क्योंकि मस्तिष्क को एक पारदर्शी सिलिकॉन प्लग और कवर ग्लास द्वारा रखा गया था, कंपन पारंपरिक छोटी खिड़कियों में देखे गए कंपन के बराबर थे, और कंपन कलाकृतियों को खत्म करने के लिए ऑफ़लाइन छवि पंजीकरण पर्याप्त था।

वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग में, कॉर्टिकल गतिविधि को संवेदी उत्तेजना (चित्रा 3 ए-डी, के-एन) द्वारा प्रेरित कॉर्टेक्स में फैलते हुए देखा जा सकता है। दो-फोटॉन इमेजिंग ने न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं (चित्रा 3 ई, ओ) के लिए विशिष्ट एकल-कोशिका प्रतिदीप्ति छवियों के अवलोकन की अनुमति दी। संवेदी उत्तेजना से प्रेरित प्रतिदीप्ति परिवर्तन व्यक्तिगत कोशिकाओं में देखे जा सकते हैं (चित्रा 3 ई-जे, ओ-टी)।

पीवीडीसी रैप और एएवी का उपयोग करके सेरेब्रल कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) की अभिव्यक्ति
खिड़की के लिए पीवीडीसी रैप को कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में कार्यात्मक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह एएवी और फाइब्रोइन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो रेशम कीट कोकून का एक घटक प्रोटीन है जिसे व्यापक रूप से बायोमैटेरियल्स37 के रूप में लागू किया गया है। एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि फाइब्रोइन को एएवी के साथ मिलाया जा सकता है, जिससे फोटोएक्टिवेबल ऑप्सिन या जीईसीआई36 जैसे कार्यात्मक प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए मस्तिष्क में प्रत्यारोपित फिल्में बनाई जा सकती हैं। वर्तमान अध्ययन में, जीईसीआई और फाइब्रोइन को व्यक्त करने वाले एएवी को लपेट पर मिलाया और सुखाया गया था, और कपाल खिड़की के लिए एएवी-लेपित रैप का उपयोग किया गया था। इसके परिणामस्वरूप सर्जरी के 2-4 सप्ताह बाद कॉर्टेक्स के व्यापक क्षेत्र में जीईसीआई की अभिव्यक्ति हुई (चित्रा 3के-एम)। चूंकि खिड़की बड़ी थी, इसलिए एक ही माउस के विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों को चित्रित किया जा सकता है (चित्रा 3 एम-टी)।

इस विधि की अभिव्यक्ति दक्षता की पुष्टि करने के लिए, जीईसीआई को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की संख्या को निश्चित मस्तिष्क (पूरक चित्रा 2 डी) में गिना गया था। यह पाया गया कि फाइब्रोइन-एएवी के साथ रैप का उपयोग करने वाली वर्तमान रणनीति के परिणामस्वरूप सतही और गहरी परतों (एल 2/3: 20.78%, एक्ससीएएमपी-आर व्यक्त सेल: 32 कोशिकाएं, डीएपीआई: 154 स्थान, एल 5: 20.08%, एक्ससीएएमपी-आर व्यक्त सेल: 51 कोशिकाएं, डीएपीआई: 254 स्थान) में लगभग 20% की दक्षता के साथ जीईसीआई की अभिव्यक्ति हुई। इस प्रकार, इस विधि ने न केवल सतह परतों में बल्कि गहरी परतों में भी कोशिकाओं में जीईसीआई व्यक्त किया।

Figure 1
चित्र 1: बड़ी कपाल खिड़की का वैचारिक आरेख। (A) नई कपाल खिड़की का बाएं, योजनाबद्ध चित्रण। यह पारंपरिक खिड़की (3 मिमी व्यास) से बड़ा है। दाएं, क्रॉस-अनुभागीय दृश्य। एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने की विधि खाद्य लपेट, पारदर्शी सिलिकॉन इलास्टोमर और कवर ग्लास का उपयोग करती है, जिससे एक ही माउस से वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन इमेजिंग की अनुमति मिलती है। (बी) कपाल खिड़की निर्माण प्रक्रिया: (ए) हड्डी हटाने। (ख) एसीएसएफ को हटाने की प्रक्रिया। (ग) एसीएसएफ को हटाकर मस्तिष्क की सतह पर लपेट का पालन। (घ) अतिरिक्त लपेट को काटना। (ङ) पारदर्शी सिलिकॉन लगाना। (च) कवर ग्लास चिपकाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कपाल खिड़की सर्जरी का अवलोकन। (ए) कपाल खिड़की के लिए आवश्यक सामग्री और उपकरण। (क) पॉलीविनाइलडिडेन क्लोराइड (पीवीडीसी) रैपिंग फिल्म। (बी) मिश्रण टिप के साथ पारदर्शी सिलिकॉन इलास्टोमेर का एक डिस्पेंसर। (ग) कवर ग्लास। (घ) कवर ग्लास के दो टुकड़ों के बीच रखा पारदर्शी सिलिकॉन। (बी) खोपड़ी को उजागर करने के लिए माउस सिर की त्वचा की तस्वीर। माउस को एनेस्थेटाइज्ड किया गया था, और माउस के सिर को कान की सलाखों का उपयोग करके स्थिर किया गया था। फिर सिर को हटा दिया गया, स्थानीय एनाल्जेसिया के साथ इलाज किया गया, और त्वचा को इंजेक्शन दिया गया। (सी) हेड प्लेट की स्थापना के बाद फोटो। एक हेड प्लेट (3 डी प्रिंटर से राल से बना) दंत सीमेंट के साथ माउस के सिर से जुड़ी हुई थी। (डी) कपाल खिड़की की तस्वीर। कपाल खिड़की माउस मस्तिष्क के दाहिने गोलार्ध के कॉर्टेक्स में बनाई गई थी। ड्यूरा मेटर को हटा दिया गया था, और लपेट को जगह-जगह चिपका दिया गया था। (ई) शीर्ष पर पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास के साथ लपेट से बनी खिड़की की एक तस्वीर। (एफ) एक सफल खिड़की का एक विशिष्ट उदाहरण (दाहिना गोलार्ध, सर्जरी के 7 सप्ताह बाद)। (जी) असफल खिड़की का उदाहरण (दोनों गोलार्ध, सर्जरी के 5 सप्ताह बाद)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: बड़ी खिड़की एक ही माउस से वाइड-फील्ड और दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग की अनुमति देती है। (A) कैल्शियम इमेजिंग एस्ट्रोसाइट्स40 में झिल्ली-लंगर वाले GECI (Lck-GCaMP6f) को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक माउस में की गई थी। (बी) बाईं ओर, प्लास्टिक रैप, पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास के साथ एक बड़ी खिड़की बनाई गई थी। इस विंडो के माध्यम से वाइड-फील्ड इमेजिंग की गई थी। दाएं, कपाल खिड़की की स्थापना के 79 दिन बाद एक तस्वीर कैप्चर की गई थी। (सी) जब विपरीत मूंछों पर एयर-पफ उत्तेजना लागू की गई थी, तो प्रतिदीप्ति परिवर्तन देखे गए थे। (डी) सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स (सी में लाल वर्ग) में प्रतिदीप्ति परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम प्लॉट किया गया था। लाल और नीली सलाखों क्रमशः (सी) में एयर पफ टाइमिंग और "पहले", "दौरान", और "बाद में" समय को इंगित करते हैं। (ई) दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग का क्षेत्र (एफओवी 1 सी में)। चूंकि GCaMP6f को झिल्ली के स्थानीयकरण के लिए व्यक्त किया गया था, इसलिए एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं में स्थानीय प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए रुचि के क्षेत्रों (सफेद वर्ग) को मैन्युअल रूप से रखा गया था। (एफ) (ई) में रंगीन वर्गों में प्रतिदीप्ति परिवर्तन प्लॉट किए गए हैं। (G) (E) के सभी वर्गों में प्रतिदीप्ति परिवर्तन प्लॉट किए गए हैं। क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर अक्ष क्रमशः समय और सेल संख्या को इंगित करते हैं। (एच-जे) (सी) में एफओवी 2 (दृश्य प्रांतस्था में) के लिए डेटा दिखाया गया है। एफओवी 1 में इमेजिंग के बाद एफओवी 2 को चित्रित किया गया था। (के) रेड जीईसीआई, एक्ससीएएमपी-आर, जंगली प्रकार के माउस में फाइब्रोइन-एएवी विधि द्वारा न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था। (एल) सर्जरी के दो सप्ताह बाद कैप्चर की गई तस्वीर जिसमें फाइब्रोइन फिल्म का उपयोग करके खिड़की बनाई गई थी। (एम) इस माउस पर वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था। (एन) मूंछ उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रतिदीप्ति परिवर्तन को सबसे प्रमुख साइट (सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स, लाल वर्ग (एम)) से प्लॉट किया गया था। लाल और नीली रेखाएं क्रमशः (एम) में एयर पफ टाइमिंग और "पहले" और "दौरान" समय को इंगित करती हैं। (ओ) 300 μm गहराई पर दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग के दृश्य क्षेत्र (सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स, FOV 1 in (M))। आरओआई को मैन्युअल रूप से न्यूरोनल सोमाटा में रखा गया था। (पी) (ओ) में रंगीन वर्गों में प्रतिदीप्ति परिवर्तन प्लॉट किए गए हैं। (Q) (O) के सभी वर्गों में प्रतिदीप्ति परिवर्तन रंग में प्लॉट किए गए हैं। (आर-टी) पार्श्विका प्रांतस्था में स्थित एफओवी 2 इन (एम) के लिए डेटा दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: स्केलपेल्स के लिए युक्तियाँ। खोपड़ी की तुलना में नए स्केलपेल (शीर्ष) की नोक एक कुंद नोक (नीचे) के साथ खोपड़ी को काटने के लिए उपयोग की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: नई कपाल खिड़की और फाइब्रोइन-एएवी अभिव्यक्ति विधि का सत्यापन। (ए) एगर में 0.1 μm फ्लोरोसेंट मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल। शीर्ष पंक्ति एक ऐसी स्थिति से डेटा दिखाती है जिसमें एगर में मिश्रित फ्लोरोसेंट मोतियों पर केवल कवर ग्लास रखा गया था, और नीचे की पंक्ति एक ऐसी स्थिति से डेटा दिखाती है जिसमें रैप, पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास रखे गए थे। ग्रे निशान गॉसियन को प्रत्येक मोती के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल में फिट दिखाते हैं, और लाल निशान अपने औसत मान (एन = 7) दिखाते हैं। (बी) (ए) में डेटा का सारांश। प्रत्येक ग्राफ XYZ अक्ष पर बिंदु प्रसार फ़ंक्शन के आधे अधिकतम (FWHM) पर पूर्ण चौड़ाई दिखाता है। ग्रे प्लॉट प्रत्येक मोती के लिए डेटा दिखाता है, और लाल उनकी माध्य और मानक त्रुटि दिखाता है। (सी) विवो इमेजिंग डेटा के 2,000 फ्रेम (60 एस रिकॉर्डिंग) से, एक छोटे फ्लोरोसेंट कण का चयन किया गया था और जांच की गई थी कि 60 के दशक के दौरान छवि कितनी स्थानांतरित हुई। केंद्र में फ्लोरोसेंट छवि 2,000 फ्रेम के औसत का प्रतिनिधित्व करती है। छवियों को एक्स- और वाई-अक्ष दिशाओं में औसत द्वारा प्रक्षेपित किया गया था। हिस्टोग्राम प्रत्येक फ्रेम में केन्द्रक के वितरण को दर्शाते हैं। केन्द्रक के मानक विचलन X: 0.36 और Y: 0.315 μm थे। (D) फाइब्रोइन-एएवी विधि द्वारा GECI अभिव्यक्ति का उदाहरण। बाएं: सेरेब्रल कॉर्टेक्स का एक टुकड़ा फाइब्रोइन-एएवी अभिव्यक्ति विधि को लागू करता है। लाल और नीला क्रमशः एक्ससीएएमपी-आर और डीएपीआई से प्रतिदीप्ति का संकेत देते हैं; एक्ससीएएमपी-आर न केवल परत 2/3 कोशिकाओं में बल्कि परत 5 कोशिकाओं में भी व्यक्त किया गया था। केंद्र और दाएं। बाएं आकृति (सियान वर्ग) में क्रमशः 2/3, और 5 परतों के आवर्धित दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: (ए) फाइब्रोइन-एएवी फिल्म विधि के साथ रैप की अभिव्यक्ति दक्षता और (बी) दो-फोटॉन इमेजिंग के दौरान बिंदु प्रसार समारोह का मूल्यांकन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह लेख पीवीडीसी प्लास्टिक रैप, पारदर्शी सिलिकॉन और कवर ग्लास का उपयोग करके एक बड़ी कपाल खिड़की बनाने की एक सस्ती विधि प्रस्तुत करता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि सेरेब्रल कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग की जा सकती है। दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग एक ही माउस में कई अलग-अलग कॉर्टिकल क्षेत्रों से किया जा सकता है जो वाइड-फील्ड इमेजिंग से गुजरा है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि खिड़की के लिए उपयोग की जाने वाली प्लास्टिक की चादर पर एक फाइब्रोइन-एएवी फिल्म कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र पर जीईसीआई को व्यक्त कर सकती है।

महत्वपूर्ण कदम
प्लास्टिक रैप का उपयोग करके कपाल खिड़कियां बनाते समय संक्रमण और मस्तिष्क को नुकसान से बचना महत्वपूर्ण है। इन स्थितियों में, तंत्रिका और ग्लियल गतिविधि नहीं देखी जा सकती है, और गहरे क्षेत्रों की इमेजिंग असंभव है। रक्त वाहिकाओं को चोट लगने से रक्तस्राव भी होता है, जिससे रक्त के कारण इमेजिंग असंभव हो जाती है। संक्रमण से बचने के लिए, मस्तिष्क की सतह और लपेट को यथासंभव कसकर संलग्न करना एसीएसएफ को चूसकर महत्वपूर्ण है। सर्जरी के दौरान मस्तिष्क के दबाव को रोककर मस्तिष्क और रक्त वाहिका क्षति से बचने के लिए मैनिटोल प्रशासन महत्वपूर्ण है। यह मस्तिष्क की सतह और ड्यूरा मेटर के बीच की जगह को बनाए रखता है और खोपड़ी और ड्यूरा मैटर को हटाने के दौरान मस्तिष्क और रक्त वाहिकाओं को छूने से रोकता है। उच्च आवर्धन के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और तेज युक्तियों के साथ चिमटी भी सटीक सर्जरी के लिए प्रभावी हैं।

फाइब्रोइन-एएवी विधि में, मांस रेशम कीट कोकून का उपयोग करना आवश्यक है, फाइब्रोइन समाधान को फ्रीज करने के लिए नहीं, फाइब्रोइन-एएवी समाधान को पर्याप्त रूप से सुखाने के लिए, और समाधान की पर्याप्त मात्रा (5 μL प्रति 3 मिमी व्यास) लागू करने के लिए। जब पुराने कोकून का उपयोग किया गया था, तो अभिव्यक्ति दक्षता कम थी। ऐसा इसलिए है क्योंकि पुराने कोकून से फाइब्रोइन आसानी से विकृत हो सकता है। जब फाइब्रोइन समाधान -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे और उपयोग के समय पिघल गए थे, तो अभिव्यक्ति दक्षता खराब थी। यह ठंड और पिघलने के कारण प्रोटीन के विकृतीकरण के कारण हो सकता है। चूंकि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत फाइब्रोइन समाधानों को गेलेशन तक प्रभावी ढंग से उपयोग किया जा सकता है, इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि फाइब्रोइन समाधानों को प्रशीतित रखा जाए और गेलेशन के बाद फिर से कोकून से शुद्ध किया जाए। फाइब्रोइन-एएवी समाधान को कम से कम 3 घंटे के लिए सुखाया जाना चाहिए, क्योंकि अभिव्यक्ति 3 घंटे से कम समय के बाद खराब है। अंत में, अभिव्यक्ति का क्षेत्र उपयोग किए गए फाइब्रोइन-एएवी समाधान की मात्रा पर निर्भर करता है। चित्रा 3 एम में उदाहरण में, राशि छोटी थी (5 μL); इस प्रकार, फाइब्रोइन-एएवी फिल्म ने केवल खिड़की के ऊपरी आधे हिस्से को कवर किया, जिसके परिणामस्वरूप खिड़की पर गैर-समान अभिव्यक्ति हुई। यदि पर्याप्त मात्रा में फाइब्रोइन-एएवी का उपयोग किया जाता है, तो अभिव्यक्ति पूरी खिड़की पर समान होगी।

तकनीक के संशोधन
उपन्यास कपाल खिड़की तकनीक कॉर्टिकल सर्किट की मैक्रोस्कोपिक गतिविधि और एक ही माउस में उनकी अंतर्निहित एकल-कोशिका-स्तर की गतिविधि की जांच करने की अनुमति देती है। इस प्रकार, विधि को विभिन्न प्रकार के तंत्रिका विज्ञान अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग निर्णय लेने के कार्यों, मोटर सीखने और मस्तिष्क की चोट और बीमारी के माउस मॉडल के दौरान कॉर्टिकल गतिविधि का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हम यह भी मानते हैं कि विधि को न केवल कृन्तकों पर बल्कि गैर-मानव प्राइमेट्स पर भी लागू किया जा सकता है।

यह पेपर दर्शाता है कि बड़ी कपाल खिड़की ट्रांसजेनिक चूहों और चूहों को कार्यात्मक प्रोटीन व्यक्त करने वाले एएवी के साथ इंजेक्ट किए गए इमेजिंग के लिए प्रभावी है। विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि रैप पर फाइब्रोइन-एएवी फिल्म कॉर्टेक्स के विस्तृत क्षेत्र में जीईसीआई को व्यक्त करने के लिए पारंपरिक एएवी इंजेक्शन विधि की तुलना में बहुत आसान है। विभिन्न रंगों41 के जीईसीआई को एन्कोडिंग करने वाले दो एएवी के मिश्रण का उपयोग करके, न्यूरॉन और ग्लियल सेल गतिविधि के बीच सहसंबंध को कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र में एक साथ चित्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, फाइब्रोइन-एएवी फिल्म विधि को अन्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर42,43,44,45,46,47 पर भी लागू किया जा सकता है।

बड़ी कपाल खिड़की, जो दोनों गोलार्धों की छवि बना सकती है, भी संभव है। दृश्य के बहुत व्यापक क्षेत्र (~ 25मिमी 2) के साथ दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप हाल ही में 25,26,27,28,29 विकसित किए गए हैं। यहां वर्णित विस्तृत कपाल विंडो का उपयोग करके एक-फोटॉन वाइड-फील्ड इमेजिंग के साथ इस दो-फोटॉन इमेजिंग तकनीक को संयोजित करने से हमें अभूतपूर्व पैमाने से जनसंख्या गतिविधि और एकल-कोशिका गतिविधि के बीच संबंधों की जांच करने की अनुमति मिलेगी।

सीमाओं
खाद्य लपेटने से किसी भी पदार्थ को गुजरने की अनुमति नहीं मिलती है। इससे औषधीय प्रयोगों के लिए विधि का उपयोग करना मुश्किल हो जाता है। रैप को हटाना भी मुश्किल है, जिससे ग्लास पिपेट या इलेक्ट्रोड डालना असंभव हो जाता है। इसलिए, अन्य तरीकों जैसे एक साथ कैल्शियम इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, और ग्लास पिपेट का उपयोग करके दवाओं के स्थानीय प्रशासन के साथ संयुक्त प्रयोगों को लागू करना कठिन है। इन सीमाओं के लिए एक संभावित समाधान एक छेद के साथ रैप और ग्लास विंडो का उपयोग करना है। यह कपाल खिड़की को लंबे समय तक बाँझ रखते हुए ग्लास पिपेट या रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के माध्यम से मस्तिष्क तक पहुंच की अनुमतिदेता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को परिवर्तनकारी अनुसंधान क्षेत्रों (ए) 'ग्लियल डिकोडिंग' (जेपी 21एच05621 से एसएम), जेएसपीएस केकेन्ही (जेपी19के06883 से एसएम, 15के0340 से ईएस, जेपी22एच00432, जेपी22एच05160, जेपी17एच06312 से एचबी तक) और जेपी17एच06312 द्वारा सहायता अनुदान (जेपी17एच06313) द्वारा समर्थित किया गया था। यामानाशी प्रान्त (एसएम के लिए), और टाकेडा साइंस फाउंडेशन (एसएम के लिए) से युवा शोधकर्ता के लिए अनुदान और आंशिक रूप से यूनिवर्सिटी यामानाशी से फ्रंटियर ब्रेन रिसर्च ग्रांट द्वारा समर्थित।

यागुची और के ओकाजाकी को पशु देखभाल और तकनीकी सहायता के लिए और उपयोगी चर्चाओं के लिए कितामुरा प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan TritonX Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
50 mL beaker
Acquisition software Brain vision BV_Ana For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Acquisition software Hamamatsu photonics High speed recording software: HSR For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Acquisition software Vibrio Technologies scanImage For two-photon calcium imaging
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH
ACSF aspiration needle
Adeno-associated virus VectorBuilder custom-made AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R
Adhesives for biological use Daiichi Sankyo Aron Alpha-A
Anesthesia machine Shinano seisakusho SN-487
Anesthetic Kyoritsu Seiyaku Corporation pentobarbital Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Auxiliary ear bar Narishige EB-5N
CCD camera Brain vision MiCAM02-HR For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Clear vinyl polysiloxane GC Exaclear
CMOS camera Hamamatsu photonics ORCA-spark For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Cotton swab
Cover glass Matsunami 18 x 18 NO.1 Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass
DAPI Thermo Fisher D1306 Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Ddialysis cassette 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer ThermoFisher
Dental adhesive resin cement SUN MEDICAL Super-Bond
Dental drill Nakanishi VOLVERE Vmax
Digital scale Dretec KS-243
Filters Brain vision EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50
Filters Olympus U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ
Fluorescence microscope Keyence BZ-X810 Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Fluorescent beads Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres 0.1 µm Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging
Forceps FST No. 11252-20 thin-tipped, for removal of dura mater
Forceps KFI K-7, No.J 18-8 for general use
Gelatin for hemostasis Johnson & Johnson Spongostan
Gentamicin sulfate Iwaki seiyaku
Glass pipette custom-made
Hair remover Reckitt Japan Veet
Head fixing device custom-made Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.
Head plate custom-made aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)
Heating pad
Image processing software (for calcium imaging data analysis) ImageJ https://imagej.net
Isoflurane Pfizer
Light source Hayashi-repic LA-HDF108AA
Light source Brain vision LEX2-LZ4-B For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Light source Olympus U-HGLGPS For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Mannitol solution (15% with saline) Sigma-Aldrich (Merck) M4125
Micro curette FST No. 10080-05
Microscope Brain vision For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Microscope Olympus MVX10 For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Microscope Sutter Instruments MOM For two-photon calcium imaging
Microslicer Dosaka EM DTK-1000N Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Mixing tip GC
Needle (30 G)
Polyethylens spoids AS ONE 1-4656-01
Polyvinylidene chloride (PVDC) film Asahi Kasei Asahi Wrap (or Saran Wrap)
Povidone-iodine Mundipharma Isodine
Python libralies NumPy package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#
Matplotlib library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#
pandas data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org
Scalpel Kai No. 11
Shaver for animal
Silicone dispensers GC
Silkworm cocoon Satoyama Craft News https://sato-yama.jp/
Stereomicroscope LEICA MZ6 objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x
Surfactant NACALAI TESQUE TritonX Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Surgical Scissors FST No. 91460-11
Syringe for mannitol injection Terumo 1mL
Transdermal anesthetic AstraZeneca Lidocaine
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes The mice were obtained by the following method.
AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008)
Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes
Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626)
Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f.
A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.
Tunable ultrafast lasers Spectra-Physics InSight X3 For two-photon calcium imaging
Waterproof film Nichiban BFR5
Wild-type mice Japan SLC C57BL/6J Male and femalek, >4 weeks old

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References

  1. Ren, C., Komiyama, T. Wide-field calcium imaging of cortex-wide activity in awake, head-fixed mice. STAR Protocols. 2 (4), 100973 (2021).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 186
<em>Vivo में</em> एक बड़ी कपाल विंडो का उपयोग करके माउस से वाइड-फील्ड और टू-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग
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Manita, S., Shigetomi, E., Bito, H., … More

Manita, S., Shigetomi, E., Bito, H., Koizumi, S., Kitamura, K. In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window. J. Vis. Exp. (186), e64224, doi:10.3791/64224 (2022).

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