Summary
Le présent protocole décrit la fabrication d’une grande fenêtre crânienne (6 x 3 mm2) à l’aide d’une pellicule alimentaire, de silicone transparent et de verre de couverture. Cette fenêtre crânienne permet des expériences in vivo d’imagerie calcique à grand champ et à deux photons chez la même souris.
Abstract
L’imagerie calcique à grand champ du néocortex de la souris permet d’observer l’activité neuronale à l’échelle du cortex liée à diverses fonctions cérébrales. D’autre part, l’imagerie à deux photons peut résoudre l’activité des circuits neuronaux locaux au niveau de la cellule unique. Il est essentiel de créer une grande fenêtre crânienne pour effectuer une analyse à plusieurs échelles en utilisant les deux techniques d’imagerie dans la même souris. Pour ce faire, il faut enlever une grande partie du crâne et recouvrir la surface corticale exposée de matériaux transparents. Auparavant, des crânes en verre et des fenêtres crâniennes à base de polymère ont été développés à cette fin, mais ces matériaux ne sont pas faciles à fabriquer. Le présent protocole décrit une méthode simple pour fabriquer une grande fenêtre crânienne composée d’un film d’emballage en polychlorure de vinylidène (PVDC) disponible dans le commerce, d’un bouchon en silicone transparent et d’un verre de couverture. Pour l’imagerie de la surface dorsale d’un hémisphère entier, la taille de la fenêtre était d’environ 6 x 3 mm2. De fortes vibrations cérébrales n’ont pas été observées indépendamment d’une si grande fenêtre. Il est important de noter que l’état de la surface du cerveau ne s’est pas détérioré pendant plus d’un mois. L’imagerie à grand champ d’une souris exprimant un indicateur de calcium codé génétiquement (GECI), GCaMP6f, en particulier dans les astrocytes, a révélé des réponses synchronisées en quelques millimètres. L’imagerie à deux photons de la même souris a montré des réponses proéminentes en calcium dans les astrocytes individuels pendant plusieurs secondes. De plus, une fine couche d’un virus adéno-associé a été appliquée sur le film PVDC et a exprimé avec succès la GECI dans les neurones corticaux au-dessus de la fenêtre crânienne. Cette technique est fiable et rentable pour faire une grande fenêtre crânienne et facilite l’étude de la dynamique neuronale et gliale et de leurs interactions lors du comportement aux niveaux macroscopique et microscopique.
Introduction
L’imagerie calcique à grand champ étudie efficacement le schéma d’activité spatio-temporelle sur une grande surface du cerveau animal 1,2,3. L’imagerie à grand champ a été largement utilisée pour observer toute la surface corticale des rongeurs puisque leur cortex est relativement plat 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Les souris transgéniques ou les souris injectées avec le virus adéno-associé (AAV), qui expriment spécifiquement les GECI dans diverses cellules telles que les neurones et les cellules gliales, peuvent être utilisées pour l’imagerie calcique à grand champ11,12,13. Cependant, la résolution spatiale de cette technique n’est généralement pas suffisante pour résoudre l’activité de cellules individuelles in vivo14. Il ne convient pas non plus aux cellules d’imagerie situées dans les couches plus profondes.
D’autre part, l’imagerie calcique à deux photons peut observer l’activité de plusieurs cellules simultanément avec une résolution spatiale subcellulaire, permettant l’observation de l’activité des cellules individuelles même dans les dendrites neuronales et les processus gliaux 15,16,17,18,19,20,21,22. Il peut également observer des cellules dans les couches plus profondes du cortex cérébral23,24. Bien que les progrès technologiques récents en microscopie à deux photons permettent d’imager à partir de régions corticales millimétriques 25,26,27,28,29, il est encore difficile d’observer une zone comparable à l’imagerie à grand champ par imagerie à deux photons.
Pour comprendre la pertinence physiologique de l’activité cérébrale d’une cellule à l’ensemble du cerveau, il est essentiel de combler l’écart entre l’activité des régions corticales sur l’ensemble du cortex et celle à la résolution d’une seule cellule dans les circuits neuronaux locaux. Par conséquent, une combinaison d’imagerie calcique à grand champ et à deux photons réalisée chez la même souris est particulièrement efficace. Pour réaliser cela, une fenêtre crânienne large et stable doit être créée, idéalement sur une longue période.
Auparavant, plusieurs techniques de fabrication de fenêtres crâniennes ont été développées pour permettre la réalisation d’une imagerie à grand champ et à deux photons chez la même souris30,31. Les fenêtres en verre de couverture de forme trapézoïdale (crâne de cristal), qui sont moulées dans la forme de la surface corticale pour remplacer l’os retiré, permettent un accès optique sur l’ensemble du cortex32. Alternativement, les fenêtres crâniennes à base de polymère peuvent être fabriquées avec du polyéthylène téréphtalate (PET)33 ou des fluoropolymères amorphes enrobés d’oxyde de polyéthylènenanofeuille 34. Il a été démontré que chaque méthode maintient une fenêtre stable pendant plus de 1 mois. Cependant, la production de ces fenêtres n’est pas facile, et les matériaux et équipements utilisés sont souvent coûteux.
La présente étude décrit une nouvelle méthode de fabrication d’une grande fenêtre crânienne à l’aide du film PVDC (emballage alimentaire en plastique) (Figure 1). En utilisant cette fenêtre, des expériences d’imagerie in vivo à grand champ et à deux photons peuvent être réalisées sur les mêmes souris. Il a également été démontré que les GECI pouvaient être exprimés dans les neurones sur une large zone du cortex des souris en formant une fine couche de film contenant des particules AAV sur l’enveloppe.
Protocol
Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de l’expérimentation animale de l’Université de Yamanashi. Des souris de type sauvage (C57BL/6J, Japan SLC) et transgéniques exprimant des GECI ancrées dans la membrane (Lck-GCaMP6f) dans des astrocytes ont été utilisées dans cette étude. Les souris transgéniques ont été obtenues en croisant des souris AldH1l1-CreERT2 [B6N. Souris FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, obtenues commercialement, voir le tableau des matières] et souris Flx-Lck-GCaMP6f [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor
1. Préparation à la chirurgie de la fenêtre crânienne
- Anesthésier les souris avec de l’isoflurane (induction : 3 %, chirurgie : 1 % à 1,5 %, débit : 0,2-0,3 L/min). Confirmer la profondeur de l’anesthésie par la perte du réflexe de pincement de la queue ou des orteils. Maintenez la température corporelle à l’aide d’un coussin chauffant (36-38 °C). Appliquez une pommade pour les yeux avec un coton-tige pour empêcher les yeux des souris de se dessécher sous anesthésie.
- Injecter une solution de mannitol à 15 % (voir le tableau des matières) par voie intrapéritonéale (3 mL/100 g de poids corporel). Fixez la tête de la souris sur un cadre stéréotaxique avec des barres d’oreille. Enlevez les poils de la tête de la souris à l’aide d’un rasoir et d’une crème dépilatoire.
- Désinfectez la surface de la peau avec de la povidone iodée et de l’alcool trois fois. Appliquer la lidocaïne par voie topique pour fournir une analgésie préventive. Enlevez la peau sur la zone d’intérêt avec des ciseaux chirurgicaux et exposez le crâne (taille: 15 x 15 mm). En cas de saignement, utilisez un coton-tige pour arrêter le saignement.
NOTE: Dans cette étude, la peau a été enlevée pour observer le cortex préfrontal au cortex visuel. - Retirez le périoste sur le crâne exposé à l’aide d’une micro-curette et séchez la surface du crâne pour attacher fermement la plaque de tête au crâne avec du ciment dentaire (voir le tableau des matériaux) (figure 2B).
REMARQUE: La plaque de tête sur mesure est créée à l’aide d’une imprimante 3D. Le fichier de conception est déposé dans le dépôt Github (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates). - Fixez la plaque de tête à l’aide de ciment dentaire (figure 2C). Attendez au moins 20 minutes que le ciment durcisse. Fixez la plaque de tête avec le support de plaque de tête35.
2. Faire la fenêtre crânienne
- Enlevez le ciment supplémentaire sur le crâne à l’aide d’une perceuse dentaire (voir le tableau des matériaux). Veillez à ne pas percer l’os et endommager le cerveau en forant.
- Marquez la zone à couper avec un stylo et coupez dans l’os avec un scalpel. Émoussez la pointe du scalpel pour vous assurer qu’elle ne pénètre pas dans le crâne (figure supplémentaire 1). Référez-vous à l’atlas cérébral pour déterminer où faire la fenêtre.
NOTE: Pour la présente étude, une fenêtre a été créée entre -2 mm et +4 mm à partir du bregma dans l’axe antéropostérieur et de la suture sagittale à +3 mm dans l’axe médiolatéral, y compris les cortex moteur, somatosensoriel et visuel. - Grattez l’os à plusieurs reprises avec un scalpel pour approfondir la rainure jusqu’à ce que l’os dans la zone à couper bouge bien lorsqu’il est légèrement touché.
- Retirer l’os incisé à l’aide d’une fine pince à épiler. Ne poussez pas le lambeau osseux dans le cerveau, ce qui pourrait endommager le cerveau (Figure 1Ba).
REMARQUE : Si un saignement est observé après l’ablation de l’os, appliquer et aspirer immédiatement le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF, voir le tableau des matériaux) et répéter ce processus jusqu’à ce que le saignement cesse. Alternativement, placez une éponge hématostatique de gélatine (cubes carrés d’environ 3 mm) trempée dans l’ACSF sur le point de saignement. - Si la dure-mère n’est pas enlevée, passez à l’étape 2.7.
- Retirez la dure-mère en suivant les étapes ci-dessous.
- Enlevez la dure-mère, par exemple, dans les situations suivantes; transfection en utilisant la méthode du film fibroïne-AAV36 et en observant de petites structures telles que des épines dendritiques.
- Couper la dure-mère à l’aide d’une pipette en verre tiré avec une pointe effilée d’environ 10 μm. Pour étendre cette coupe sur toute la fenêtre, utilisez une aiguille en forme de U.
- Réglez le zoom du stéréomicroscope sur 60-100x et retirez la dure-mère sectionnée avec une pince à épiler ultrafine. Si l’ablation de la dure-mère provoque des saignements, rincer avec ACSF ou utiliser une éponge de gélatine pour arrêter le saignement.
- Découpez l’enveloppe en PVDC.
- Stériliser un gros morceau (par exemple, 10 x 15 mm) d’enveloppe PVDC (environ 11 μm, voir le tableau des matières, figure 2Aa) à l’autoclave et avec de l’éthanol à 70 %.
- Sous un stéréomicroscope, utilisez une pince à épiler et un scalpel pour découper une enveloppe de la taille requise.
REMARQUE: La taille de l’enveloppe doit être d’environ 10 mm plus grande que la taille de la fenêtre crânienne, mais plus petite que l’ouverture de la plaque de tête. Pour une fenêtre crânienne de 6 x 3 mm 2, préparez une enveloppe de 15 x 10 mm2.
- Placez l’emballage avec précision en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez l’enveloppe sur la surface du cerveau, en laissant l’ACSF à la surface. Aspirez l’ACSF du bord de l’enveloppe, ce qui permet à l’enveloppe de coller fermement à la surface du cerveau (Figure 1Bb,c).
REMARQUE: L’enveloppement utilisé est résistant aux rides, donc le simple fait de le placer sur la surface du cerveau ne produit presque pas de rides. - Couper l’écharpe à l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler de manière à ce qu’il y ait une marge d’environ 1 mm entre le bord de la fenêtre crânienne et l’enveloppe (figure 1Bd).
- Une fois l’enveloppe en place, collez le bord de l’enveloppe au crâne à l’aide d’un adhésif biologique (voir le tableau des matériaux, figure 2D). Laissez l’adhésif sécher pendant environ 30 minutes.
- Placez l’enveloppe sur la surface du cerveau, en laissant l’ACSF à la surface. Aspirez l’ACSF du bord de l’enveloppe, ce qui permet à l’enveloppe de coller fermement à la surface du cerveau (Figure 1Bb,c).
- Appliquez l’élastomère de silicone transparent.
- Appliquer l’élastomère de silicone transparent disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) sur l’enveloppe à l’aide d’un distributeur muni d’un embout de mélange (figure 1B e, 2A b-d) et placer le verre de couverture (épaisseur 0,12-0,17 mm) sur le dessus (figure 2E).
- Scellez le périmètre du verre de couverture avec un film imperméable, de la superglue ou du ciment dentaire (figure 1Bf).
- Après la chirurgie, surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience pour maintenir la position couchée sternale. Après cela, gardez les souris individuellement et laissez-les récupérer dans leur cage à la maison pendant au moins 7 jours.
- Pour réduire le stress et la douleur, administrer des agents anti-inflammatoires et analgésiques (par ex. dexaméthasone et kétoprofène, 5 mg/kg chacun, p.i.).
- Surveillez régulièrement les souris pour détecter toute infection. Si une infection est confirmée, administrer un médicament antimicrobien (p. ex. 10 % d’enrofloxacine, 1,7 μL/mL) dans l’eau potable jusqu’à ce que l’infection soit éliminée (habituellement moins de 4 semaines).
3. Fabrication d’un film AAV sur pellicule plastique à l’aide d’une solution de fibroïne
REMARQUE : L’étape 3 est facultative.
- Préparer une solution de fibroïne à partir de cocons de vers à soie selon une méthode37 publiée précédemment.
- En bref, faire bouillir des cocons de vers à soie normaux disponibles dans le commerce (5 g, voir le tableau des matières) dans une solution de carbonate de sodium (0,02 M, 2 L). Lavez les cocons à l’eau ultrapure et séchez-les pendant la nuit.
- Dissoudre les cocons séchés dans une solution de bromure de lithium (9,3 M, 20 % p/v de fibroïne) tout en chauffant dans une étuve à 60 °C pendant 4 h. Dialyser la solution de cocon dissous, centrifuger (deux fois à 12 700 x g, à 4 °C pendant 20 min)37, et recueillir le surnageant.
- Préparez le film fibroïne-AAV en suivant les étapes ci-dessous.
- Mélanger les solutions de fibroïne et d’AAV20 dans un rapport de 1:4 dans un petit tube à échantillon à l’aide d’une micropipette. Déposez une partie aliquote de la solution mixte fibroïne-AAV sur la pellicule plastique de la fenêtre crânienne et séchez-la pendant au moins 3 heures.
REMARQUE: Pour l’expression dans une zone de 3 mm de diamètre, appliquer une goutte de 5 μL de solution de fibroïne-AAV. Ce rapport détermine la quantité de solution pour une zone donnée. - Après séchage, coupez la pellicule de plastique dans la taille requise pour la fenêtre (par exemple, 10 x 15 mm) et placez-la sur la surface du cerveau. Ensuite, suivez la méthode mentionnée ci-dessus à partir de l’étape 2.8.1.
REMARQUE: Avant de placer l’enveloppe sur la surface du cerveau, retirez l’ACSF sur la surface du cerveau autant que possible. En effet, on s’attend à ce que l’ACSF dissout le film fibroïne-AAV et réduise la concentration de particules AAV. - Attendez environ 2 à 4 semaines après la création de la fenêtre traitée par AAV jusqu’à ce que les GECI soient suffisamment exprimées. Au cours de ce processus, vérifiez régulièrement l’état des souris et des fenêtres.
- Mélanger les solutions de fibroïne et d’AAV20 dans un rapport de 1:4 dans un petit tube à échantillon à l’aide d’une micropipette. Déposez une partie aliquote de la solution mixte fibroïne-AAV sur la pellicule plastique de la fenêtre crânienne et séchez-la pendant au moins 3 heures.
4. Imagerie et analyse du calcium
REMARQUE : Pour plus de détails sur l’imagerie et l’analyse, veuillez consulter les rapports 1,2,38 publiés précédemment.
- Effectuez une imagerie grand champ en suivant les étapes ci-dessous.
- Immobiliser la souris à l’aide d’un dispositif de fixation de la tête sous un macroscope à fluorescence à lentille tandem (voir le tableau des matériaux).
- Illuminez le cortex cérébral des souris avec la lumière d’excitation d’une source lumineuse LED de 465 nm à travers un filtre d’excitation, un miroir dichroïque et une lentille d’objectif.
- Collectez les images de fluorescence du cortex cérébral par une caméra CCD à travers une lentille d’objectif (1,0x), un miroir dichroïque, un filtre d’émission et une lentille d’imagerie (2,0x). La combinaison de ces lentilles donne un grossissement total d’environ 0,5x.
- Acquérir des images à une fréquence d’échantillonnage de 50 Hz. Après l’acquisition des données, analysez les images à l’aide du logiciel ImageJ. Sélectionnez manuellement la région d’intérêt (ROI). Calculez le changement de fluorescence dans chaque ROI comme ΔF / F = (Ft - F0) / F0, où Ft est la valeur de fluorescence brute de chaque image et F0 est la valeur de fluorescence moyenne obtenue à partir d’une image moyenne de toutes les images.
Remarque : Un programme de macro pour ImageJ est déposé dans GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), qui calcule les images ΔF / F à partir des données d’imagerie calcique.
- Effectuez une imagerie à deux photons en suivant les étapes ci-dessous.
- Immobiliser la souris sous un microscope à deux photons à l’aide d’un dispositif de fixation de la tête. Identifiez la zone à imager à l’aide du microscope en mode champ clair avec un objectif à faible grossissement (5x).
- Passez à l’imagerie à deux photons. Utilisez un objectif à fort grossissement (16x ou 25x) et illuminez le laser pour une excitation à deux photons.
REMARQUE: Le Lck-GCaMP6f22 vert et le XCaMP-R36 rouge ont été excités par un laser ultrarapide à des longueurs d’onde d’excitation de 920 nm et 1070 nm, respectivement. - Acquérir des images de fluorescence à 30 Hz. Après l’acquisition des données, corrigez les artefacts de mouvement par la fonction d’enregistrement du logiciel suite2p39. Obtenez le retour sur investissement et le ΔF/F à partir d’images à l’aide de la même méthode pour l’imagerie à grand champ.
- Tracez les données à l’aide de python avec les bibliothèques suivantes : NumPy, Matplotlib et Pandas (voir Table des matériaux).
Representative Results
Evaluation d’une grande fenêtre crânienne réalisée à l’aide des méthodes d’enveloppement PVDC
Immédiatement après la chirurgie, le succès ou l’échec peut être vérifié en un coup d’œil par l’état de la surface corticale, comme le saignement et le changement de couleur dû à des dommages ou à une ischémie. Longtemps après la chirurgie, la surface corticale peut être recouverte d’une membrane blanche opaque en raison d’une infection, ou du sang peut recouvrir la fenêtre en raison d’un saignement (Figure 2G). Dans ces cas, le cortex peut ne pas être en bon état et l’imagerie peut ne pas être possible. Ceux-ci pourraient être causés par des enveloppes partiellement sectionnées ou une fixation insuffisante de l’enveloppe par l’adhésif. Si l’infection est observée à plusieurs reprises, il peut être efficace d’appliquer des antibiotiques, par exemple du sulfate de gentamicine (10 μL, 50 mg / mL), sur la surface du cerveau lors de la mise en place de la fenêtre. La régénération des méninges ou des os est également observée lorsque l’espace vertical entre la surface corticale et l’enveloppe est important. Pour éviter cela, il est crucial d’appliquer l’enveloppe aussi étroitement que possible sur la surface du cerveau pendant la préparation de la fenêtre. Cela peut être réalisé en plaçant une pellicule plastique sur la surface du cerveau et en aspirant autant d’ACSF que possible. En l’absence d’ACSF, cela peut être fait en plaçant simplement la pellicule de plastique sur la surface du cerveau. Le cerveau et les vaisseaux sanguins sont déterminés à ne pas être endommagés par le fait que la couleur du cerveau n’est pas décolorée et que les vaisseaux sanguins ne sont pas sectionnés.
La longévité de la fenêtre dépend en grande partie de la qualité de la chirurgie. Lorsque l’état est bon, il n’y a aucun signe d’infection, de saignement ou de régénération plus de 1 mois après la chirurgie (Figure 2F et Figure 3B). Chez 8 souris sur 10, la fenêtre pourrait être maintenue dégagée jusqu’à 10 semaines ou plus. Les fenêtres de deux des souris n’ont pas pu être correctement entretenues en raison d’une infection ou d’un saignement. Bien que la grande fenêtre puisse être sujette à des contraintes mécaniques ou à des chocs, on n’a pas observé de fenêtres brisées ou fissurées.
Pour évaluer la qualité d’imagerie de la nouvelle fenêtre crânienne avec l’enveloppe, le silicone et le verre, la fonction d’étalement de points a été comparée sous la nouvelle fenêtre avec celle sous la fenêtre de verre conventionnelle en imageant des billes fluorescentes de 0,1 μm dans de la gélose (voir le dossier supplémentaire 1). Les résultats n’ont montré aucune différence de pleine largeur à la moitié du maximum (FWHM) pour les deux conditions. [Axe X (μm) : verre seul, 1,99 ± 0,07, enveloppement, 1,76 ± 0,13, axe Y (μm) : verre seulement, 2,11 ± 0,27, enveloppe, 1,90 ± 0,15, axe Z (μm) : verre seulement, 25,29 ± 0,71, enveloppement, 26,64 ± 1,02, N = 7 billes, p > 0,05, test U de Mann-Whitney, figure supplémentaire 2A,B]. Par conséquent, les nouveaux éléments ajoutés (enveloppe et silicone) n’ont pas détérioré la qualité de l’imagerie.
Les artefacts de vibration causés par la respiration, le rythme cardiaque et le mouvement du corps sont présents dans l’imagerie à grand champ et à deux photons. Pour déterminer combien vibre la nouvelle fenêtre crânienne, une petite particule fluorescente a été sélectionnée à partir des données d’imagerie in vivo à deux photons et a examiné combien son image a bougé pendant 60 s. Il a été constaté que l’écart-type du centroïde de cette particule fluorescente était d’environ 0,3 μm, ce qui est comparable à celui sous une fenêtre en verre conventionnelle (figure supplémentaire 2C). Cela indique que parce que le cerveau était maintenu par un bouchon en silicone transparent et un verre de recouvrement, les vibrations étaient comparables à celles observées dans les petites fenêtres conventionnelles, et l’enregistrement d’images hors ligne était suffisant pour éliminer les artefacts de vibration.
Dans l’imagerie calcique à grand champ, l’activité corticale a pu être observée se propageant à travers le cortex induite par la stimulation sensorielle (Figure 3A-D,K-N). L’imagerie biphotonique a permis d’observer des images de fluorescence unicellulaire spécifiques aux neurones et aux cellules gliales (Figure 3E,O). Des changements de fluorescence induits par la stimulation sensorielle ont pu être observés dans des cellules individuelles (Figure 3E-J,O-T).
Expression d’indicateurs calciques codés génétiquement (GECI) dans une large zone du cortex cérébral à l’aide de l’enveloppe PVDC et de l’AAV
L’enveloppe en PVDC pour la fenêtre pourrait être appliquée pour exprimer des protéines fonctionnelles dans une large zone du cortex. Ceci est réalisé en utilisant AAV et la fibroïne, une protéine composant des cocons de vers à soie qui ont été largement utilisés comme biomatériaux37. Une étude antérieure a montré que la fibroïne pouvait être mélangée avec des AAV, formant des films implantés dans le cerveau pour exprimer des protéines fonctionnelles telles que les opsines photoactivables ou les GECI36. Dans la présente étude, l’AAV exprimant la GECI et la fibroïne ont été mélangées et séchées sur l’enveloppe, et une enveloppe recouverte d’AAV a été utilisée pour la fenêtre crânienne. Cela a entraîné l’expression de GECI sur la vaste zone du cortex 2 à 4 semaines après la chirurgie (Figure 3K-M). Comme la fenêtre était grande, différentes zones corticales d’une même souris peuvent être imagées (Figure 3M-T).
Pour confirmer l’efficacité d’expression de cette méthode, le nombre de cellules exprimant GECI a été compté dans le cerveau fixe (Figure supplémentaire 2D). Il a été constaté que la stratégie actuelle utilisant l’enveloppement avec fibroïne-AAV a abouti à l’expression de GECI avec une efficacité d’environ 20% dans les couches superficielles et profondes (L2/3: 20,78%, cellule exprimant XCaMP-R: 32 cellules, DAPI: 154 emplacements, L5: 20,08%, cellule exprimant XCaMP-R: 51 cellules, DAPI: 254 emplacements). Ainsi, cette méthode exprimait les GECI dans les cellules non seulement dans les couches superficielles, mais aussi dans les couches plus profondes.
Figure 1 : Schéma conceptuel de la grande fenêtre crânienne. (A) A gauche, dessin schématique de la nouvelle fenêtre crânienne. Elle est plus grande que la fenêtre conventionnelle (3 mm de diamètre). À droite, vue en coupe. La méthode de fabrication d’une grande fenêtre crânienne utilise un emballage alimentaire, un élastomère de silicone transparent et du verre de couverture, permettant une imagerie à grand champ et à deux photons à partir de la même souris. (B) Procédure de fabrication de la fenêtre crânienne : (a) Enlèvement des os. b) Retrait de l’ACSF sous l’enveloppe. c) Adhérence de l’enveloppe à la surface du cerveau par élimination de l’ACSF. d) Couper l’excès d’emballage. e) Application de silicone transparent. f) Verre de couverture apposé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Vue d’ensemble de la chirurgie de la fenêtre crânienne. (A) Matériel et équipement requis pour la fenêtre crânienne. a) Film d’emballage en polychlorure de vinylidène (PVDC). b) Un distributeur d’élastomère de silicone transparent muni d’un embout de mélange. c) Verre de couverture. d) Silicone transparent placé entre deux morceaux du verre de couverture. (B) Photographie de la peau de la tête de souris incisée pour exposer le crâne. La souris a été anesthésiée et la tête de la souris a été immobilisée à l’aide de barres d’oreille. La tête a ensuite été dépoilée, traitée avec une analgésie locale, et la peau a été incisée. (C) Photographie après installation d’une plaque frontale. Une plaque de tête (en résine provenant d’une imprimante 3D) a été fixée à la tête de la souris avec du ciment dentaire. D) Photographie d’une fenêtre crânienne. La fenêtre crânienne a été créée dans le cortex de l’hémisphère droit du cerveau de la souris. La dure-mère a été enlevée et l’enveloppe a été collée en place. (E) Une photo de la fenêtre faite de l’enveloppe avec le silicone transparent et le verre de couverture sur le dessus. (F) Un exemple typique de fenêtre réussie (hémisphère droit, 7 semaines après la chirurgie). (G) Exemple de fenêtre défaillante (les deux hémisphères, 5 semaines après la chirurgie). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La grande fenêtre permet l’imagerie calcique à grand champ et à deux photons à partir de la même souris. (A) L’imagerie calcique a été réalisée chez une souris transgénique exprimant une GECI à ancrage membranaire (Lck-GCaMP6f) dans les astrocytes40. (B) À gauche, une grande fenêtre a été créée avec une pellicule de plastique, du silicone transparent et du verre de couverture. L’imagerie grand champ a été réalisée à travers cette fenêtre. À droite, une photo a été prise 79 jours après l’installation de la fenêtre crânienne. (C) Lorsque la stimulation par bouffées d’air a été appliquée aux moustaches controlatérales, des changements de fluorescence ont été observés. (D) L’évolution temporelle du changement de fluorescence dans le cortex somatosensoriel (carré rouge en C) a été tracée. Les barres rouges et bleues indiquent le moment de la bouffée d’air et le moment « avant », « pendant » et « après » en (C), respectivement. (E) Le champ de vision (champ de vision 1 en C) de l’imagerie calcique à deux photons. Parce que GCaMP6f a été exprimé pour se localiser à la membrane, les régions d’intérêt (carrés blancs) ont été placées manuellement pour détecter la réponse locale dans les processus astrocytaires. (F) Les changements de fluorescence dans les carrés colorés en (E) sont tracés. (G) Les changements de fluorescence dans tous les carrés de (E) sont tracés. Les axes horizontaux et verticaux indiquent respectivement le temps et le numéro de cellule. (H-J) Les données pour FOV 2 (dans le cortex visuel) en (C) sont présentées. Le champ de vision 2 a été imagé après l’imagerie dans le champ de vision 1. (K) Le GECI rouge, XCaMP-R, a été exprimé dans les neurones par la méthode fibroïne-AAV chez la souris de type sauvage. (L) Photographie prise deux semaines après la chirurgie dans laquelle la fenêtre a été créée à l’aide du film de fibroïne. (M) Une imagerie calcique à grand champ a été réalisée sur cette souris. (N) Le changement de fluorescence évoqué par la stimulation des moustaches a été tracé à partir du site le plus important (cortex somatosensoriel, carré rouge en (M)). Les lignes rouges et bleues indiquent le timing de la bouffée d’air et le timing « avant » et « pendant » en (M), respectivement. (O) Champ de vision (cortex somatosensoriel, champ de vision 1 po (M)) de l’imagerie calcique à deux photons à 300 μm de profondeur. Les ROI ont été placés manuellement au somata neuronal. (P) Les changements de fluorescence dans les carrés colorés dans (O) sont tracés. (Q) Les changements de fluorescence dans tous les carrés de (O) sont tracés en couleur. (R-T) Les données pour le champ de vision 2 in (M) situé dans le cortex pariétal sont présentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Conseils pour les scalpels. La pointe du nouveau scalpel (en haut) comparée au scalpel utilisé pour couper le crâne avec une pointe émoussée (en bas). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Validation de la nouvelle fenêtre crânienne et de la méthode d’expression de la fibroïne-AAV. (A) Profil d’intensité de fluorescence des billes fluorescentes de 0,1 μm dans l’agar-agar. La rangée du haut montre les données d’une condition dans laquelle seul le verre de couverture a été placé sur des perles fluorescentes mélangées à de l’agar-agar, et la rangée inférieure montre les données d’une condition dans laquelle l’enveloppe, le silicone transparent et le verre de couverture ont été placés. Les traces grises montrent l’ajustement gaussien au profil d’intensité de fluorescence pour chaque bille, et les traces rouges montrent leurs valeurs moyennes (n = 7). B) Résumé des données figurant au point A). Chaque graphique montre la pleine largeur à la moitié maximum (FWHM) de la fonction d’étalement de points sur l’axe XYZ. Le graphique gris montre les données pour chaque perle, et le rouge indique leur moyenne et leur erreur-type. (C) À partir des 2 000 images (enregistrement de 60 s) de données d’imagerie in vivo , une petite particule fluorescente a été sélectionnée et a examiné l’ampleur du déplacement de l’image au cours des années 60. L’image fluorescente au centre représente la moyenne de 2 000 images. Les images ont été projetées en faisant la moyenne dans les directions des axes X et Y. Les histogrammes montrent la distribution du centroïde dans chaque image. Les écarts-types du centroïde étaient X: 0,36 et Y: 0,315 μm. (D) Exemple d’expression GECI par la méthode fibroïne-AAV. À gauche : Une tranche de cortex cérébral a appliqué la méthode d’expression de la fibroïne-AAV. Le rouge et le bleu indiquent la fluorescence de XCaMP-R et DAPI, respectivement; XCaMP-R a été exprimé non seulement dans les cellules de couche 2/3, mais aussi dans les cellules de couche 5. Centre et droite. Vues agrandies des couches 2/3 et 5 dans la figure de gauche (carrés cyan), respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 1 : (A) Efficacité d’expression de l’enveloppe avec la méthode du film fibroïne-AAV et (B) Évaluation de la fonction d’étalement ponctuel pendant l’imagerie à deux photons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Cet article présente une méthode peu coûteuse de création d’une grande fenêtre crânienne à l’aide d’une pellicule plastique PVDC, de silicone transparent et de verre de couverture. En utilisant cette méthode, nous avons montré que l’imagerie calcique à grand champ pouvait être réalisée sur une large zone du cortex cérébral. L’imagerie calcique à deux photons peut être réalisée à partir de plusieurs régions corticales différentes chez la même souris qui a subi une imagerie à grand champ. De plus, il a été démontré qu’un film de fibroïne-AAV sur la pellicule plastique utilisée pour la fenêtre pouvait exprimer GECI sur une large zone du cortex.
Étapes critiques
Il est important d’éviter les infections et les dommages au cerveau lors de la fabrication de fenêtres crâniennes à l’aide d’une pellicule de plastique. Dans ces conditions, l’activité neuronale et gliale ne peut pas être observée et l’imagerie des zones plus profondes est impossible. Les lésions des vaisseaux sanguins entraînent également des saignements, ce qui rend l’imagerie impossible en raison du sang. Pour éviter l’infection, il est essentiel de faire en sorte que la surface du cerveau et l’enveloppe soient attachées aussi étroitement que possible en aspirant l’ACSF. L’administration de mannitol est importante pour éviter les dommages au cerveau et aux vaisseaux sanguins en prévenant l’augmentation de la pression cérébrale pendant la chirurgie. Cela maintient l’espace entre la surface du cerveau et la dure-mère et empêche le cerveau et les vaisseaux sanguins d’être touchés lors de l’ablation du crâne et de la dure-mère. Un stéréomicroscope avec un grossissement élevé et une pince à épiler avec des pointes pointues sont également efficaces pour une chirurgie précise.
Dans la méthode fibroïne-AAV, il est essentiel d’utiliser des cocons de vers à soie de chair, de ne pas congeler la solution de fibroïne, de sécher suffisamment la solution de fibroïne-AAV et d’appliquer un volume suffisant de solution (5 μL pour 3 mm de diamètre). Lorsque des cocons plus anciens étaient utilisés, l’efficacité de l’expression était plus faible. C’est parce que la fibroïne des vieux cocons peut être dénaturée facilement. Lorsque la solution de fibroïne a été congelée à -80 °C et décongelée au moment de l’utilisation, l’efficacité de l’expression était faible. Cela peut être dû à la dénaturation de la protéine due à la congélation et à la décongélation. Étant donné que les solutions de fibroïne conservées à 4 °C peuvent être utilisées efficacement jusqu’à la gélification, il est recommandé de conserver les solutions de fibroïne au réfrigérateur et de les purifier à nouveau des cocons après la gélification. La solution de fibroïne-AAV doit être séchée pendant au moins 3 heures, car l’expression est faible après moins de 3 heures. Enfin, la zone d’expression dépend de la quantité de solution de fibroïne-AAV utilisée. Dans l’exemple de la figure 3M, la quantité était faible (5 μL); ainsi, le film fibroïne-AAV ne couvrait que la moitié supérieure de la fenêtre, ce qui entraînait une expression non uniforme au-dessus de la fenêtre. Si une quantité suffisante de fibroïne-AAV est utilisée, l’expression sera uniforme sur toute la fenêtre.
Modifications de la technique
La nouvelle technique de fenêtre crânienne permet d’examiner l’activité macroscopique des circuits corticaux et leur activité sous-jacente au niveau de la cellule unique chez la même souris. Ainsi, la méthode peut être appliquée à une variété d’études en neurosciences. Par exemple, il peut être utilisé pour observer l’activité corticale pendant les tâches de prise de décision, l’apprentissage moteur et dans des modèles murins de lésions cérébrales et de maladies. Nous pensons également que la méthode peut être appliquée non seulement aux rongeurs, mais aussi aux primates non humains.
Cet article démontre que la grande fenêtre crânienne est efficace pour l’imagerie des souris transgéniques et des souris injectées avec des protéines fonctionnelles exprimant l’AAV. En particulier, il est démontré que le film fibroïne-AAV sur l’enveloppe est beaucoup plus facile qu’une méthode d’injection AAV conventionnelle pour exprimer les GECI sur une large zone du cortex. En utilisant un mélange de deux AAV codant des GECI de couleurs différentes41, la corrélation entre l’activité des neurones et des cellules gliales peut être imagée simultanément sur une large zone du cortex. En outre, la méthode du film fibroïne-AAV peut également être appliquée à d’autres biocapteurs codés génétiquement 42,43,44,45,46,47.
La plus grande fenêtre crânienne, qui peut imager les deux hémisphères, est également possible. Des microscopes à deux photons avec un champ de vision beaucoup plus large (~25 mm2) ont récemment été développés 25,26,27,28,29. La combinaison de cette technique d’imagerie à deux photons avec l’imagerie à grand champ d’un photon à l’aide de la fenêtre crânienne large décrite ici nous permettra d’examiner la relation entre l’activité de la population et l’activité unicellulaire à des échelles sans précédent.
Limitations
L’emballage alimentaire ne laisse passer aucune substance. Cela rend la méthode difficile à utiliser pour des expériences pharmacologiques. Il est également difficile de retirer l’enveloppe, ce qui rend impossible l’insertion d’une pipette ou d’une électrode en verre. Par conséquent, il est difficile de mettre en œuvre des expériences combinées à d’autres méthodes telles que l’imagerie calcique simultanée et les enregistrements électrophysiologiques, et l’administration locale de médicaments à l’aide d’une pipette en verre. Une solution possible à ces limitations est d’utiliser l’emballage et la fenêtre en verre avec un trou. Cela permet d’accéder au cerveau via une pipette en verre ou une électrode d’enregistrement tout en maintenant la fenêtre crânienne stérile pendant une longue période48.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) 'Glial Decoding' (JP21H05621 to SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 to SM, 15KK0340 to ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 to HB, and JP17H06313 to KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 to SM, JP19dm0207079 to HB, and JP19dm0207080 to KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (to SM), Subvention pour jeune chercheur de la préfecture de Yamanashi (à SM) et de la Takeda Science Foundation (à SM) et partiellement soutenue par The Frontier Brain Research Grant de l’Université Yamanashi.
Nous remercions N. Yaguchi et K. Okazaki pour les soins aux animaux et l’assistance technique et les membres du laboratoire de Kitamura pour leurs discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| 50 mL beaker | |||
| Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
| Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
| ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
| ACSF aspiration needle | |||
| Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
| Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
| Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
| Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
| CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
| Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
| CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Cotton swab | |||
| Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
| Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
| Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
| Digital scale | Dretec | KS-243 | |
| Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
| Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
| Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
| Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
| Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
| Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
| Glass pipette | custom-made | ||
| Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
| Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
| Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
| Heating pad | |||
| Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
| Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
| Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
| Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
| Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
| Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
| Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Mixing tip | GC | ||
| Needle (30 G) | |||
| Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
| Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
| Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
| Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
| pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
| Scalpel | Kai | No. 11 | |
| Shaver for animal | |||
| Silicone dispensers | GC | ||
| Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
| Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
| Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
| Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
| Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
||
| Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
| Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
| Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |
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