Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Påvisning av homologe rekombinasjonsmellomprodukter via nærhetsligering og kvantitativ PCR i Saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

D-loop capture (DLC) og D-loop extension (DLE) analysene benytter prinsippet om nærhetsligering sammen med kvantitativ PCR for å kvantifisere D-loop-formasjon, D-loop-utvidelse og produktdannelse på stedet for et induserbart dobbeltstrenget brudd i Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

DNA-skade, inkludert DNA-dobbeltstrengede brudd og kryssbindinger mellom tråder, pådratt under S- og G2-fasene av cellesyklusen, kan repareres ved homolog rekombinasjon (HR). I tillegg representerer HR en viktig mekanisme for replikasjonsgaffelredning etter stalling eller kollaps. Reguleringen av de mange reversible og irreversible trinnene i denne komplekse veien fremmer dens troskap. Den fysiske analysen av rekombinasjonsmellomproduktene dannet under HR muliggjør karakterisering av disse kontrollene av forskjellige nukleoproteinfaktorer og deres interaksjoner. Selv om det er veletablerte metoder for å analysere spesifikke hendelser og mellomprodukter i rekombinasjonsbanen, har deteksjonen av D-loop-dannelse og forlengelse, to kritiske trinn i denne banen, vist seg utfordrende inntil nylig. Her beskrives effektive metoder for å oppdage nøkkelhendelser i HR-banen, nemlig DNA-dobbeltstrenget brudddannelse, D-sløyfedannelse, D-sløyfeforlengelse og dannelse av produkter via bruddindusert replikasjon (BIR) i Saccharomyces cerevisiae . Disse analysene oppdager deres relevante rekombinasjonsforbindelser og produkter med høy følsomhet og er uavhengige av cellulær levedyktighet. Påvisning av D-sløyfer, D-sløyfeforlengelse og BIR-produktet er basert på nærhetsligering. Sammen gjør disse analysene det mulig å studere kinetikken til HR på befolkningsnivå for å finadressere funksjonene til HR-proteiner og regulatorer på betydelige trinn i banen.

Introduction

Homolog rekombinasjon (HR) er en hi-fi-mekanisme for reparasjon av DNA-dobbeltstrengede brudd (DSB), tverrbindinger mellom tråder og ssDNA-hull, samt en vei for DNA-skadetoleranse. HR skiller seg fra feilutsatte veier for reparasjon/toleranse av DNA-skader, slik som ikke-homolog endesammenføyning (NHEJ) og translesjonssyntese, ved at den benytter et intakt, homologt dupleks DNA som donor for å mal reparasjonshendelsen. Videre er mange av de viktigste mellomleddene i HR-banen reversible, noe som muliggjør utsøkt regulering av de enkelte veitrinnene. Under S-, G2- og M-fasene i cellesyklusen konkurrerer HR med NHEJ om reparasjon av de to-endede DSB-ene1. I tillegg er HR avgjørende for DNA-replikasjon for reparasjon av replikasjonsassosiert DNA-skade, inkludert ssDNA-hull og ensidige DSB-er, og som en mekanisme for DNA-lesjon bypass2.

Et kritisk mellomprodukt i HR-banen er forskyvningssløyfen, eller D-sløyfen (figur 1). Etter endereseksjon laster den sentrale rekombinasen i reaksjonen, Rad51, på det nylig resekterte ssDNA av det ødelagte molekylet, og danner et spiralformet filament2. Rad51 utfører deretter et homologisøk for å identifisere en egnet homolog donor, typisk søsterkromatiden i somatiske celler. D-sløyfen dannes når Rad51-ssDNA-filamentet invaderer et homologt dupleks DNA, noe som fører til Watson-Crick-baseparingen av den ødelagte strengen med donorens komplementære streng, og fortrenger den motsatte donorstrengen. Forlengelse av 3'-enden av den ødelagte strengen av en DNA-polymerase erstatter basene som gikk tapt under DNA-skadehendelsen og fremmer oppløsning av det utvidede D-loop-mellomproduktet til et dsDNA-produkt gjennom synteseavhengig strandglødning (SDSA), dobbelt-Holliday-krysset (dHJ) eller break-induced replication (BIR) HR-underveier.

Analyser som fysisk overvåker mellomproduktene i HR-banen, tillater analyse av de genetiske kravene for hvert trinn (dvs. veianalyse). DSB-dannelse, endereseksjon, dHJ-er, BIR-replikasjonsbobler og HR-produkter observeres lett av Southern blotting 3,4,5,6,7. Likevel unnlater Southern blotting å rapportere om begynnende og utvidede D-løkker, og dermed er det nødvendig med en alternativ metode for pålitelig måling av disse leddmolekylene 4,8,9. En mye brukt strategi for å analysere begynnende D-sløyfedannelse er kromatin-immunoprecipitation (ChIP) av Rad51 kombinert med kvantitativ PCR (qPCR) 10,11. Rad51-assosiasjonen med dsDNA målt ved ChIP-qPCR er imidlertid uavhengig av sekvenshomologi og Rad51-tilbehørsfaktoren Rad5410,11. I motsetning til dette avhenger et betydelig signal ved hjelp av metoden for D-loop-analyse som presenteres her, kalt D-loop capture (DLC) -analysen, av DSB-formasjon, sekvens homologi, Rad51 og Rad51-tilbehørsproteinene Rad52 og Rad548. Funnet om at Saccharomyces cerevisiae Rad51-fremmet D-sløyfedannelse avhenger av Rad54 in vivo er i samsvar med mange in vitro rekonstitueringseksperimenter som indikerer at Rad54 er nødvendig for homologisøk og D-sløyfedannelse ved spirende gjær Rad51 8,12,13,14,15.

Nåværende tilnærminger til måling av D-loop-forlengelse, først og fremst gjennom semi-kvantitativ PCR, er tilsvarende problematiske. En typisk PCR-basert analyse for å oppdage D-loop-utvidelse forsterker en unik sekvens, som følge av rekombinasjon mellom et pausested og en ektopisk donor og den påfølgende rekombinasjonsassosierte DNA-syntesen, via en primer oppstrøms homologiområdet på den ødelagte strengen og en annen primer nedstrøms for homologiområdet på donorstrengen. Ved hjelp av denne metoden krever deteksjon av rekombinasjonsassosiert DNA-syntese den ikke-essensielle Pol δ prosessivitetsfaktoren Pol3216. Dette funnet er i konflikt med observasjonen om at POL32-delesjon bare har en mild effekt på genkonvertering in vivo17. Videre klarer ikke disse PCR-baserte analysene å midlertidig løse D-loop-utvidelse og BIR-produktdannelse, noe som tyder på at signalresultatene fra dsDNA-produkter i stedet for ssDNA mellomprodukter17,18,19. D-loop extension (DLE) -analysen ble nylig utviklet for å løse disse avvikene. DLE-analysen kvantifiserer rekombinasjonsassosiert DNA-syntese på et sted ~ 400 basepar (bp) nedstrøms for den første 3 'invaderende enden9. Ved denne metoden er D-loop-forlengelse uavhengig av Pol32 og kan påvises innen 4 timer etter DSB-induksjon, mens BIR-produkter først observeres ved 6 timer. Faktisk bemerket en nylig publikasjon fra Haber- og Malkova-laboratoriene at bruk av denne metoden for fremstilling av genomisk DNA enkeltvis resulterer i ssDNA-bevaring 9,20.

Her er DLC- og DLE-analysene beskrevet i detalj. Disse analysene er avhengige av nærhetsligering for å oppdage begynnende og utvidede D-løkker i S. cerevisiae (figur 2)8,9. BIR-produkter kan kvantifiseres ved hjelp av det samme analysesystemet. For begge analysene er DSB-dannelse på et HO-endonuklease-kuttsted lokalisert ved URA3-lokuset på kromosom (Chr.) V indusert av ekspresjonen av HO-endonukleasen under kontroll av en galaktoseinduserbar promotor. Rad51-mediert DNA-strenginvasjon fører til begynnende D-sløyfedannelse på stedet for en ektopisk donor lokalisert ved LYS2-lokuset på Chr. II. Siden høyre side av DSB mangler homologi til giveren, er reparasjon via SDSA- og dHJ-dannelse ikke mulig. Første reparasjon av DSB av BIR er mulig, men dannelsen av levedyktige produkter hemmes av tilstedeværelsen av sentromere21. Denne bevisste utformingen forhindrer produktiv DSB-reparasjon, og unngår dermed gjenopptakelse av vekst av celler med reparerte DBS-er, som ellers kan overta kulturen i løpet av tidsforløpsanalysen.

I DLC-analysen bevarer psoralen tverrbinding av de to strengene av heteroduplex DNA i D-sløyfen rekombinasjonsmiddelet. Etter restaurering av restriksjonsenzymstedet på den ødelagte (resekterte) strengen og fordøyelsen, tillater tverrbindingen ligering av de unike sekvensene oppstrøms for homologe ødelagte og donor-DNAer. Ved hjelp av qPCR kvantifiseres nivået av kimært DNA-molekyl tilstede i hver prøve. I DLE-analysen er det ikke nødvendig med tverrbinding, og restaurering og fordøyelse av restriksjonsenzymstedet etterfulgt av intramolekylær ligering knytter i stedet 5'-enden av det ødelagte molekylet til den nylig utvidede 3'-enden. Igjen brukes qPCR til å kvantifisere de relative mengdene av dette kimære produktet i hver prøve. I fravær av restaurering av restriksjonsenzymstedet, rapporterer DLE-analysen om de relative nivåene av BIR (dsDNA)-produktet som dannes etter D-loop-utvidelsen.

Representative resultater for hver analyse ved bruk av en villtypestamme vises, og leserne henvises til Piazza et al.8 og Piazza et al.9 for bruk av disse analysene for analyse av rekombinasjonsmutanter 8,9. Hensikten med dette bidraget er å gjøre det mulig for andre laboratorier å ta i bruk DLC- og DLE-analysene, og støtte for dem er tilgjengelig på forespørsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Pre-vekst, DSB-induksjon og prøveinnsamling

MERK: Tilskudd av alle medier med 0,01% adenin anbefales for Ade-stammer.

  1. Strek ut passende haploide stammer (se tabell 1) på gjær pepton dextrose adenin (YPDA) ( 1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose, 2% agar, 0,001% adenin) og vokse i 2 dager ved 30 ° C.
  2. Bruk en enkelt koloni til å inokulere 5 ml YPDA i et 15 ml glasskulturrør. Dyrk kulturer til metning ved 30 °C med risting eller rotasjon for lufting.
  3. DLC-analyse: Klargjør 5x psoralen stamløsning (0,5 mg / ml trioxsalen i 200-bevis etanol) i en avtrekkshette ved å oppløse psoralen i et 50 ml konisk rør innpakket i aluminiumsfolie over natten ved romtemperatur med kontinuerlig risting eller inversjon. Tetning skrue toppen med en gjennomsiktig film for å hindre fordampning. Ikke tilbered mer enn 7 ml 5x psoralen stamløsning per 50 ml konisk rør for å sikre riktig oppløsning av psoralene.
  4. Neste dag, bruk 5 ml av YPDA dyrket over natten kultur for å inokulere 50-100 ml YEP-laktat (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% w / w laktat, 0,001% adenin) i en passende størrelse kolbe (spirende gjær vokser optimalt i en kolbe som er minst 5x volumet av kulturen) til en OD600 på ~ 0,03.
  5. Dyrk kulturen i ~ 16 timer ved 30 ° C med risting ved 220 o / min. Etter ~ 16 timer, måle OD600 av kulturen, og det skal være ~ 0,5-0,8. Ikke bruk under- eller gjengrodde kulturer.
  6. For hvert tidspunkt, samle riktig volum av celler i et konisk rør og legg på is. Vanligvis er dette 1 x 108 celler (ca. 7,5 ml kultur ved OD 600 1,0 for en haploid villtypestamme) for DLC-analysen og 5 x 107 celler (ca. 2,5 ml kultur ved OD600 1,0) for DLE-analysen.
  7. For å sikre nøyaktigheten av OD 600-verdiene, lag 1:5 fortynninger for kulturer med OD600≥0,2 for å holde OD-avlesningen på 0,2 eller lavere. For villtypestammer er optimale tidspunkter for DLC-analyse mellom 2 og 6 timer, og optimale tidspunkter for DLE-analyse er mellom 4 timer og 8 timer (se figur 3 og figur 4).
  8. DLC-analyse
    1. Før hvert tidspunkt, tilbered nok 1x psoral oppløsning (0,1 mg / ml trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% etanol) i en avtrekkshette for alle prøvene i et 50 ml konisk rør innpakket i folie. La på RT.
    2. Sentrifuger prøvene ved 2 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend pelleten i 2,5 ml 1x psoral oppløsning i en avtrekksvifte og overfør til en 60 mm x 15 mm petriskål. Alternativt kan du resuspendere pelleten i 2,5 ml TE1-løsning (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) for en ikke-tverrbindingskontroll.
    3. Krysskoble prøvene. For en UV-tverrbindingspasning med langbølgede (365 nm) pærer, plasser petriskålene 1-2 cm under UV-lyskilden med lokket fjernet på toppen av en plast- eller pleksiglassplate som er forkjølt ved -20 ° C. For en UV-lysboks, plasser petriskålene direkte på toppen av UV-lyskilden. Utsett prøvene i 10 minutter med forsiktig risting.
      MERK: Det anbefales å stille UV-lyskilden på toppen av en orbital shaker satt til ~ 50 o / min.
    4. I en avtrekkshette overfører du prøven til et nytt 15 ml rør. Skyll petriskålen med 2,5 ml TE1-løsning og tilsett denne i røret. Sentrifuger prøvene ved 2,500 x g i 5 minutter ved 4 ° C, kast supernatanten på riktig måte, og oppbevar pelleten ved -20 ° C. Prøver kan lagres i opptil 1 uke før du går videre til neste trinn.
  9. DLE-analyse
    1. Sentrifuger prøvene ved 2 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Vask cellepelleten i 2,5 ml kald TE1-løsning før du gjentar spinnet og oppbevarer pellets ved -20 °C. Prøver kan lagres i opptil 1 uke før du går videre til neste trinn.
  10. For prøveinnsamling ved 0 timer, samle prøvene før tilsetning av 20% galaktose. For påfølgende tidspunkter, indusere DSB-dannelse ved å tilsette 20% galaktose til kulturer til en endelig konsentrasjon på 2%. Samle de resterende prøvene som beskrevet ovenfor, pellet og frysing i forhold til tiden etter DSB-induksjon (dvs. 4 timers prøven samles 4 timer etter tilsetning av 20% galaktose).

2. Cell sfæroplasting, lysis, og begrensning sted restaurering

  1. Tine prøvene på is. Forvarm et tørt bad til 30 °C.
  2. Resuspend prøvene i 1 ml sfæroplasting buffer (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM natriumfosfatbuffer pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) og overfør til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  3. Tilsett 3,5 μL zymolyaseoppløsning (2 % glukose, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml zymolyase 100T; 17,5 μg/ml zymolyase endelig konsentrasjon). Bland forsiktig ved å trykke eller inversjonere. Inkuber ved 30 °C i 15 minutter, og legg deretter på is. I løpet av 15 minutters inkubasjon, oppnå flytende nitrogen eller tørris.
  4. Sentrifuge i 3 minutter ved 2 500 x g ved 4 °C og legg prøvene på is. Vask prøvene 3x i 1 ml sfæroplastbuffer. Sentrifuger prøvene i 3 minutter ved 2 500 x g ved 4 °C.
  5. Resuspend prøvene i 1 ml kald 1x restriksjonsenzymbuffer (50 mM kaliumacetat, 20 mM Tris-acetat, 10 mM magnesiumacetat, 100 μg / ml BSA pH ~ 8,0 ved RT) og sentrifuge i 3 minutter ved 16 000 x g ved 4 ° C. Legg prøvene på is. Gjenta vasken 1x.
  6. Resuspend prøvene i 1 ml kald 1x restriksjonsenzymbuffer. Del prøven (0,5 ml hver) i to mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Sentrifuger prøvene i 3 minutter ved 16 000 x g ved 4 °C.
  7. Resuspend ett rør fra hver prøve i 180 μL av 1,4x restriksjonsenzymbuffer med hybridiserende oligoer (se tabell 2) og ett rør i 180 μL av 1,4x restriksjonsenzymbuffer uten hybridisering av oligoer. Hver hybridiserende oligo resuspenderes i 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) og brukes ved en endelig konsentrasjon på 7 nM. 1x TE erstatter hybridiserende oligoer i 1,4x restriksjonsenzymbufferen uten hybridisering av oligoer.
    MERK: De hybridiserende oligoene må oppbevares ved -20 °C i små aliquots ved arbeidsfortynningen. Konsentrasjonen av hybridiserende oligoer kan kreve optimalisering; se Diskusjon.
  8. Knips ned prøvene i flytende nitrogen eller tørris/etanol og oppbevar ved −80 °C. Prøver kan lagres på dette stadiet i flere måneder.

3. Restriksjonsenzymfordøyelse og intramolekylær ligering

  1. Tine prøvene på is. Forvarm ett tørt bad til 65 °C og et annet til 37 °C.
  2. Pipet 36 μL av prøven til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør på is. Returner straks den gjenværende prøven til −80 °C for oppbevaring.
  3. Tilsett 4 μL 1% SDS (0,1% sluttkonsentrasjon) og bland ved å banke forsiktig på siden av røret. Inkuber ved 65 °C i 15 minutter med forsiktig banking hvert 5. minutt. Legg prøver på is umiddelbart etter inkubasjonen.
    MERK: Denne SDS-behandlingen fremmer denatureringen av DNA-assosierte proteiner, oppløseliggjøring av nukleær konvolutt og kromatintilgjengelighet i forkant av restriksjonsenzymfordøyelses- og intramolekylære ligeringstrinnene.
  4. Tilsett 4,5 μL 10% Triton X-100 (1% endelig konsentrasjon) og bland ved pipettering. Tilsett 20-50 U restriksjonsenzym (EcoRI-HF eller HindIII-HF) til hver prøve og inkubert ved 37 °C i 1 time med skånsom omrøring hvert 20.-30. minutt. I løpet av denne tiden forvarmer du et tørt bad til 55 °C og forhåndsinnstiller et vannbad til 16 °C.
  5. Tilsett 8,6 μL 10 % SDS (1,5 % sluttkonsentrasjon) i hver prøve og bland ved pipettering og tapping. Inkuber ved 55 °C i 10 minutter. Tilsett 80 μL 10 % Triton X-100 (6 % sluttkonsentrasjon) til hver prøve og bland ved pipettering.
  6. Tilsett 660 μL 1x ligeringsbuffer uten ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/ml BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA-ligase (8 U/prøve) til hver prøve og bland ved mild inversjon. Inkuber ved 16 °C i 1,5 time med inversjon hvert 30. minutt. Legg prøvene på is umiddelbart etter inkubasjonen.

4. DNA-rensing

  1. Forvarm ett tørt bad til 65 °C og et annet til 37 °C. Tilsett 1 μL 10 mg/ml proteinase K (fremstilt i 1x TE pH 8,0) til hver prøve (12,5 μg/ml sluttkonsentrasjon). Inkuber ved 65 °C i 30 minutter og legg prøvene på is umiddelbart etter inkubasjonen til de er avkjølt.
  2. Overfør prøvene til 2 ml rør. Når du arbeider i en avtrekksvifte, tilsett et likt volum (~ 800 μL) fenol / kloroform / isoamylalkohol (P / C / IA; pH 8,0) til hver prøve. Vortex prøvene for ~ 30 s og sentrifuger prøvene i 5-10 minutter ved 16.000 x g i en mikrocentrifuge.
  3. Fjern forsiktig 600 μL av den øvre fasen av hver prøve i et nytt 1,5 ml rør. Kast forsiktig den nedre fasen og 2 ml rørene.
  4. Utfelling av DNA ved å tilsette et 1/10 volum på 3 M natriumacetat pH 5,2 (~ 60 μL) til hver prøve, etterfulgt av 1 volum isopropanol (~ 660 μL). Inverter prøvene 5x-10x og inkuber ved RT i 30 min.
  5. Legg prøvene på is i 2 minutter, og sentrifuger deretter prøvene ved 16 500 x g i 15 minutter ved 4 °C i en mikrosentrifuge. Sett prøvene tilbake til is, hell av supernatanten og tøm røret på et papirhåndkle.
  6. Vask DNA-pelleten med 200 μL 70% etanol. Sentrifuge ved 16 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, legg prøvene tilbake på is, hell av supernatanten og fjern restalkoholen med en pipette. Tørk prøvene med hettene på rørene åpne ved 37 °C i 15-20 min.
  7. Resuspend DNA-pellets i 50 μL av 1x TE ved vortexing. Inkuber ved RT i 30 min, virvel, og inkuber deretter ved 37 °C i et tørt bad i 30 minutter. Vortex prøvene igjen, og legg dem deretter på is. Prøver kan lagres på dette stadiet ved -20 ° C i flere måneder, men det anbefales å fortsette umiddelbart for decrosslinking (kun DLC) og qPCR-trinnene.

5. Psoralen tverrlink reversering (kun for DLC-analyse)

  1. Pipet 9 μL renset DNA til et PCR-rør på is. Tilsett 1 μL av 1 M KOH (0,1 M endelig konsentrasjon). Inkuber prøvene ved 90 °C i 30 minutter i en termocycler.
  2. Tilsett 19,73 μL natriumacetatoppløsning (0,1 M natriumacetat, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Prøver kan lagres på dette stadiet ved -20 ° C i flere måneder, men det anbefales å fortsette umiddelbart til qPCR-trinnet.

6. Kvantitativ PCR, kontroller og analyse

  1. Ved å bruke 2 μL renset DNA, med eller uten tverrbinding, sett opp en 20 μL qPCR-reaksjon i henhold til produsentens instruksjoner. Sett opp hver reaksjon i duplikat. For både DLC- og DLE-analysene er det fem kontrollreaksjoner og en DLC / DLE-kvantifiseringsreaksjon, eller totalt seks reaksjoner per prøve, kjørt i duplikat. Tilleggstabell S1 og tilleggstabell S2 gir en mal for å sette opp disse reaksjonene og analysene, og sekvensene til qPCR-primerne er oppført i tabell 3.
  2. qPCR-sykkelforhold må optimaliseres for hvert qPCR-sett.
    1. Bruk følgende DLC qPCR-forhold, avhengig av qPCR-settene som brukes: innledende denaturering (95 °C i 3 minutter); 50 runder med forsterkning (95 °C for 15 s, 61 °C for 25 s, 72 °C for 15 s med en enkelt anskaffelse); smeltekurveanalyse (95 °C i 5 s, 65 °C i 1 min, 97 °C med kontinuerlig innsamling); og kjøling (37 °C i 30 s).
    2. Bruk følgende qPCR-betingelser for DLE-analysen: innledende denaturering (95 °C i 5 minutter); 50 runder med forsterkning (95 °C for 15 s, 60 °C i 30 s, 72 °C i 15 s med et enkelt oppkjøp); smeltekurveanalyse (95 °C i 5 s, 65 °C i 1 min, 97 °C med kontinuerlig innsamling); og kjøling (37 °C i 30 s). Vær oppmerksom på at optimalisering for forskjellige qPCR-maskiner/-sett kan være nødvendig.
  3. DLC-analyse
    1. Kontroller: Se listen over qPCR-primere i tabell 3. Et kart over primerbindingsstedene er vist i figur S1. For supplerende sekvensfiler for de relevante genomiske funksjonene og amplikonene, sjekk A plasmid Editor (ApE)-filene; Supplerende sekvensfiler 1-5.
      1. Genomisk DNA ved ARG4: Bruk olWDH1760/olWDH1761 for å forsterke dsDNA lokalisert ved ARG4. Bruk denne reaksjonen som en belastningskontroll og normaliser alle andre reaksjoner unntatt DLC-signalreaksjonen på denne kontrollen.
      2. Intramolekylær ligeringseffektivitet ved DAP2: Bruk 1,904 bp-fragmentet opprettet av EcoRI-fordøyelsen for intramolekylær ligering parallelt med DLC-ligeringen. Forsterkning over dette ligeringskrysset rapporterer om den intramolekylære ligeringseffektiviteten og fungerer som en kontroll som DLC-signalet normaliseres til.
      3. DSB-induksjon: Bruk olWDH1766/olWDH1767 til å forsterke et område som spenner over den induserte DSB-en.
      4. Psoralen tverrbinding og reseksjon: Bruk olWDH2019/olWDH2020 for å forsterke den unike PhiX-regionen nedstrøms EcoRI-gjenkjenningssiden. Uten tverrbindingsreversering, bruk forholdet mellom ssDNA (ingen tverrbinding) over ARG4 (tverrbundet dsDNA) for å bestemme tverrbindingseffektiviteten. Med tverrbindingsreversering vil reseksjon føre til en progressiv reduksjon fra 1 til 0,5 av signalet i forhold til ARG4.
      5. Økor Jeg gjenkjenner restaurering og kutting av nettstedet: Bruk olWDH1768/olWDH1764 for å forsterke en region som spenner over det restaurerte EcoRI-gjenkjenningsstedet oppstrøms DSB på den resekterte strengen. olWDH1769/olWDH1763 forsterker en region som spenner over EcoRI-restriksjonsenzymområdet ved DAP2. Utfør EcoRI-spaltning på dette stedet for å bruke som intramolekylær ligeringskontroll.
    2. DLC-signal: Bruk olWDH1764 / olWDH1765 for å forsterke det kimære DNA-molekylet opprettet ved intramolekylær ligering av den resekterte (invaderende) strengen og giveren.
    3. Analyse: Beregn gjennomsnittet og standardavviket til CP-verdiene for hver av duplikatreaksjonene. Bruk ARG4 genomiske DNA qPCR Cp-verdier som referanse for å normalisere alle de andre kontroll-qPCR-ene. Normaliser DLC-signalet til den intramolekylære ligeringskontrollen ved DAP2. Se figur 3 for typiske DLC-signalverdier ved 2 timer.
  4. DLE-analyse
    1. Kontroller: Se listen over qPCR-primere i tabell 3. Et kart over primerbindingsstedene er vist i figur S1. For supplerende sekvensfiler for de relevante genomiske egenskapene og amplikonene, sjekk A plasmid Editor (ApE)-filene (Supplementary Sequence Files 1-5).
      1. Genomisk DNA ved ARG4: Se pkt. 6.3.1.1.
      2. Intramolekylær ligeringseffektivitet ved YLR050C: Bruk HindIII-fordøyelsen til å lage et 765 bp-fragment som vil gjennomgå intramolekylær ligering parallelt med DLE-ligeringen. Forsterkning over dette ligeringskrysset rapporterer om den intramolekylære ligeringseffektiviteten og fungerer som en kontroll som DLE-signalet normaliseres til.
      3. DSB-induksjon: Se pkt. 6.3.1.3.
      4. Hind III gjenkjenningssted restaurering og kutting: Bruk olWDH2010 / olWDH2012 og olWDH2009/2011 for å forsterke en region som spenner over HindIII-restriksjonsenzymstedene på den ødelagte strengen der den har blitt resektert og utvidet, henholdsvis.
    2. DLE-signal: Bruk olWDH2009/olWDH2010 til å forsterke det kimære DNA-molekylet skapt ved intramolekylær ligering av den resekterte enden av den invaderende strengen oppstrøms for DSB til den nylig utvidede enden nedstrøms for DSB.
    3. Analyse: Beregn gjennomsnittet og standardavviket til CP-verdiene for hver av duplikatreaksjonene. Bruk ARG4 genomiske DNA qPCR Cp-verdier som referanse for å normalisere alle de andre kontroll-qPCR-ene. Normaliser DLE-signalet til den intramolekylære ligeringskontrollen ved YLR050C. Typiske DLE-signalverdier ved 6 timer er rapportert i figur 4 og tidligere publikasjoner9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DLC-analyse
DLC-analysen oppdager både begynnende og utvidede D-sløyfer dannet av invasjonen av en stedsspesifikk DSB i en enkelt donor (figur 2). Psoralen tverrbinding knytter fysisk den ødelagte strengen og donoren via heteroduplex DNA i D-sløyfen. Restaurering av restriksjonsenzymstedet med en lang, hybridiserende oligo på den resekterte strengen av bruddet tillater begrensningsenzymspaltning, etterfulgt av ligering av den ødelagte strengen til den proksimale donoren for å danne et kimært produkt som kvantifiseres av qPCR. Spesielt avhenger DLC-signalet av psoral tverrbinding, hybridiserende oligo, den sentrale rekombinase, Rad51 og Rad51-tilbehørsfaktorene Rad52 og Rad548. Delesjon av DNA-helikasene/topoisomerasene Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 og Srs2 fører til økt DLC-signal.

Figur 3 viser de representative resultatene for standard villtypestamme ved 2 timer etter DSB-induksjon i tre eksemplarer med og uten hybridisering av oligo. Et utvalg som mangler i et nøkkeltrinn, psoralen tverrbinding, vises også i duplikat.

Som vist i figur 3, er psoralen tverrbinding et kritisk skritt. Det er praktisk talt ikke noe detekterbart signal uten det8. Tverrbindingseffektivitet måles basert på forholdet mellom ssDNA og dsDNA-amplifisering. I motsetning til dsDNA opplever ssDNA minimal psoralen tverrbinding, og dermed indikerer et høyt signal vellykket tverrbinding. Tverrbindingseffektiviteten varierer avhengig av tiden mellom prøvetaking og klargjøring for qPCR (figur 3, nederst til venstre). Jo mer tid mellom prøveinnsamling og klargjøring, jo mindre signal vil bli observert for tverrbindingseffektiviteten qPCR-kontroll. Signifikant intersample variasjon i signalet observert for tverrbindingseffektiviteten qPCR-kontroll er en grunn til bekymring, og tidsforløpet bør kastes.

ARG4 Cp-verdiene er like mellom med- og uten-hybridiserende oligoprøver (figur 3, panelet øverst til venstre). En lav CP-verdi indikerer at mer forsterkbart DNA er tilstede. Dette forklarer hvorfor ARG4 CP-verdiene for prøvene uten tverrbinding er betydelig lavere: tverrbinding forstyrrer qPCR-forsterkning. Denne forskjellen mellom med- og uten-tverrbindingsprøvene gjelder for alle qPCR-ene bortsett fra EcoRI-spaltnings-qPCR-kontrollen, som vil forsterke ssDNA/ikke-kryssbundet dsDNA. Alle qPCR-kontrollene, men ikke DLC-signalet, normaliseres til ARG4 qPCR-signalet.

For alle prøvene er den intramolekylære ligerings qPCR-kontrollen innenfor riktig område (figur 3, øverste midtpanel), og det er robust DSB-induksjon, som det fremgår av det lave signalet for qPCR-kontrollen som forsterkes over HO-endonukleasegjenkjenningsstedet (figur 3, øverst til høyre panel). I de medhybridiserende oligoprøvene observeres effektiv EcoRI-skjæring, og denne qPCR-kontrollen gir et lavt signal (figur 3, nederste midtpanel). Omvendt gir de uten-hybridiserende oligo-kryssbindingsprøvene et høyt signal, som ligner på det som vises for tverrbindingseffektiviteten qPCR-kontroll, siden i dette tilfellet blir uklippet ssDNA forsterket og normalisert til ARG4 qPCR-signalet (dsDNA).

I motsetning til de andre qPCR-ene normaliseres qPCR-signalet for DLC-analysen til den intramolekylære ligerings-qPCR-kontrollen, siden det kimære molekylet kvantifisert av DLC qPCR avhenger av ligering. Median DLC-signal ved 2 timer med hybridisering av oligo er 0,030 ± 0,0055 (figur 3, nederst til høyre), i tråd med tidligere publiserte resultater for denne analysen8. Som forventet avhenger dette signalet av både hybridiserende oligo og psoralen tverrbinding.

DLE-analyse
DLE-analysen muliggjør nøyaktig overvåking av D-loop-utvidelse som svar på en stedsspesifikk DSB (figur 2). Det ble tidligere demonstrert at DLE-signalet avhenger av Rad51, den sentrale rekombinasen i reaksjonen, som formidler strandinvasjon og dermed er nødvendig for rekombinasjonsassosiert DNA-syntese9. I tillegg avhenger DLE-signalet av den katalytiske underenheten til Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, upubliserte data), men ikke den ikke-essensielle prosesseringsfaktoren Pol32. I motsetning til DLC-signalet, som først blir detekterbart ved 2 timer etter DSB-induksjon, øker DLE-signalet først merkbart ved 4 timer etter DSB-induksjon, stiger dramatisk mellom 4 timer og 6 timer, og begynner å platå deretter, med mye av økningen i signal mellom 6 timer og 8 timer som kan tilskrives BIR-produktdannelse8, 9.

Siden det kimære ligeringsproduktet kvantifisert i DLE-analysen er enkeltstrenget, er cellesfæropplasterings- og lysistrinnet kritisk. Redusert DLE-signal kan skyldes problemer med dette trinnet, noe som kan frigjøre nukleaser og føre til nedbrytning av målet ssDNA.

Figur 4 viser representative resultater for standard villtypestamme ved 6 timer etter DSB-induksjon i tre eksemplarer med og uten hybridisering av oligoer. Den ville typeprøven uten hybridisering av oligoer representerer dsDNA BIR-produktet alene, mens med-oligo-signalet er avledet fra både ssDNA av den utvidede D-sløyfen og dsDNA BIR-produktet. En tredje prøve er inkludert som et eksempel på et mislykket eksperiment.

ARG4 Cp-verdiene var like mellom med- og uten-hybridiserende oligosprøver (figur 4, panelet øverst til venstre). ARG4 Cp-verdiene var merkbart lavere for den mislykkede prøven, noe som indikerer at denne prøven har mer genomisk DNA enn de vellykkede prøvene. qPCR-signalene for qPCR-kontrollene, men ikke DLE-signalet, ble normalisert til ARG4 qPCR-signalet. Den intramolekylære ligerings-qPCR-kontrollen viste et akseptabelt signal for med- og uten-hybridiserende oligosprøver (mellom ~0,15-0,35), men et vesentlig lavere signal for den mislykkede prøven (figur 4, øverste midtpanel). I denne mislykkede prøven forårsaket den høye mengden genomisk DNA indikert av ARG4 qPCR-kontrollen sannsynligvis den intramolekylære ligasjonen til å mislykkes, siden en høy konsentrasjon av genomisk DNA vil føre til intermolekylær ligering.

I alle tre prøvene var det robust DSB-induksjon (figur 4, øverst til høyre). Hind III spaltning på både resekterte og utvidede tråder avhenger av tilstedeværelsen av hybridiserende oligoer. På den utvidede strengen avhenger det i tillegg av D-loop-forlengelse. Dermed var det en signifikant forskjell i forsterkning over Hind III-spaltningsstedet på den resekterte strengen mellom med- og uten-oligo-prøvene (figur 4, nederst til venstre) og en mindre forskjell i forsterkning over HindIII-gjenkjenningsstedet på den utvidede strengen mellom disse prøvene (figur 4, nederst-midtpanel).

Siden DLE-signalet avhenger av intramolekylær ligering, normaliseres det til den intramolekylære ligasjonen qPCR-kontroll. Median DLE-signal ved 6 timer med hybridiserende oligoer var 0,53 ± 0,17 (figur 4, nederst til høyre), i samsvar med tidligere publiserte resultater for denne analysen9. DLE-signalet for den ville typeprøven uten hybridisering av oligoer var tilsvarende kompatibelt med denne tidligere publikasjonen. DLE-signalet var lavere enn forventet for den mislykkede prøven, noe som sannsynligvis gjenspeiler problemene med den prøven som er nevnt ovenfor.

Reversering av krysskoblinger
Psoralen interkalert mellom ApT / TpA basepar i dsDNA kan bli kovalent forbundet gjennom furan- og pyronringene til en eller begge motsatte tyminbaser ved UV-bestråling, noe som resulterer i (overveiende furan) mono-addukter eller inter-strand di-addukter (dvs. tverrbindinger), henholdsvis22. Disse modifikasjonene forventes å blokkere DNA-polymerasens progresjon, og dermed hemme DNA-syntesereaksjonen integrert i kvantitativ PCR. De fleste dsDNA-maler kan derfor ikke forsterkes (figur 5A,B). I motsetning til dette gjør fraværet av basepar i ssDNA det mindre utsatt for psoralen tverrbinding. Det forsterkes dermed lettere enn dsDNA, noe som forvrenger den relative kvantifiseringen av ssDNA versus dsDNA og av dsDNA-amplikoner av forskjellige lengder og ApT / TpA-innhold (figur 5A, B). For å overvinne disse begrensningene ble en base- og varmekatalysert reversering av psoralens tverrbindingsreverseringstrinn23 anvendt før den kvantitative PCR. Denne metoden etterlater bare de mindre artene av pyron-side mono-addukter23,24. Det førte til en 80 ganger utvinning av genomiske dsDNA og intramolekylære ligasjonskontrollamplikoner, noe som indikerer at det store flertallet av malmolekyler hadde minst en furan-side monoaddukt eller inter-streng tverrbinding (figur 5B, C). Sammenligningen av CP-verdiene for dsDNA-genomisk DNA-kontroll før og etter tverrbindingsreversering gir et estimat av tverrbindingseffektiviteten, som bør være i området vist her. Utover korte amplikoner kan denne prosedyren gjenopprette maler som er opptil 3 kb lange (figur S2). Ingen endring ble observert for ssDNA-amplikonet, forenlig med mangel på psoral tverrbinding til ssDNA (figur 5B-D). Det viser også at tverrbindingsreverseringsprosedyren ikke påviselig skader DNA23. Gjenvinningen av DLC chimera amplicon, som inneholder et tverrbundet dsDNA-segment ligert til et ikke-tverrbundet ds-ssDNA-segment (50 bp og 118 bp / nt; Figur 5A) var middels til dsDNA- og ssDNA-amplikoner, med en 8 ganger forbedring i utvinning (figur 5B, C). Tverrbindingsreversering påvirket ikke de relative nivåene av de to dsDNA-amplikonene, med den intramolekylære ligeringskontrollen igjen i området 0,2-0,25 i forhold til genomisk DNA-kontroll (figur 5E). Det endret imidlertid den relative mengden av ssDNA-amplikonen i forhold til dsDNA-genomisk DNA-kontroll fra et 40 ganger overskudd til 0,5 ganger forventet for et ssDNA i forhold til en dsDNA-mal (figur 5D). På samme måte ble det delvis ssDNA DLC-signalet redusert fra 6,6 x 10−2 til 6,6 x 10−3 i forhold til dsDNA intramolekylære ligeringskontroller (figur 5F). Dette fører oss til å estimere antall D-loop leddmolekyler ved en interkromosomal donor oppdaget ved denne tilnærmingen 4 timer etter DSB-induksjon til å være et gjennomsnitt på 1,3% av de totale ødelagte molekylene i cellepopulasjonen. Slike absolutte estimater kunne ikke gjøres med psoralenbasert forvrengning av dsDNA og ssDNA-amplifisering, noe som fremhever verdien av dette ekstra kryssbindingsreverseringstrinnet.

Figure 1
Figur 1: Homologe rekombinasjons- og oppløsningsunderveier. Etter DNA-skade som resulterer i en en- eller to-endet DSB (vist) eller et ssDNA-gap, avslører 5 'til 3' reseksjon av DNA-endene 3' ssDNA-overheng som Rad51-filamentet dannes på, hjulpet av tilbehørsfaktorene. Rad51 søker deretter i genomet etter et intakt dupleks DNA (dvs. donoren) som reparasjonshendelsen skal males på. Denne prosessen kulminerer i DNA-strenginvasjon, der den ødelagte strengen Watson-Crick-basen parrer seg med den komplementære strengen til den dobbeltstrengede DNA-giveren, forskyver den motsatte strengen og danner den begynnende D-sløyfen. Denne D-sløyfen kan enten reverseres for å tillate Rad51 homologisøk for å velge en annen donor eller utvides med en DNA-polymerase for å erstatte basene som går tapt under DNA-skadehendelsen. Tre HR-underveier er tilgjengelige for å løse dette utvidede D-loop-mellomproduktet i et produkt. For det første kan den utvidede D-sløyfen forstyrres av en helikase, slik at den nylig utvidede enden av bruddet blir anneal til den andre enden i en prosess som kalles synteseavhengig strandglødning (SDSA). Fill-in DNA-syntese og ligering fører deretter til produktdannelse. Alternativt kan den andre enden av pausen anneal til den fordrevne donorstrengen, og danner et dobbelt-Holliday-kryss (dHJ). Nukleolytisk oppløsning av dHJ resulterer i enten en crossover (CO) eller ikke-crossover (NCO), mens dHJ-oppløsning (ikke vist) resulterer i bare NCO-produkter. Til slutt resulterer unnlatelse av å engasjere den andre enden av DSB i break-induced replication (BIR), en mutagen prosess der tusenvis av basepar kopieres fra giveren til den ødelagte strengen. Denne prosessen kan strekke seg så langt som den konvergerende replikasjonsgaffelen eller enden av kromosomet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Premisset for D-loop capture (DLC), D-loop extension (DLE) og break-induced replication (BIR) produktdannelsesanalyser. DSB-dannelse drives av en stedsspesifikk endonuklease under kontroll av GAL1-promotoren . DSB-induksjon fører til dannelsen av en begynnende D-sløyfe. I DLC-analysen bevarer kryssbinding mellom tråder av DNA denne strukturen, som deretter ekstraheres. Restaurering av restriksjonsenzymsted oppnås via hybridisering med et langt oligonukleotid, og deretter blir DNA fordøyd og ligert for å danne et produkt som kan kvantifiseres ved kvantitativ PCR (qPCR). DLE-analysen er forskjellig ved at DNA ikke er tverrbundet, og i stedet dannes det intramolekylære ligeringsproduktet mellom de to endene av ssDNA på den ene siden av bruddet, 3'-enden har blitt utvidet med en DNA-polymerase. qPCR brukes igjen til å kvantifisere dannelsen av det kimære ligeringsproduktet. Påvisning av D-sløyfeforlengelse via DLE-analysen krever også restaurering av restriksjonsenzymstedet. I motsetning til dette oppdages det dobbeltstrengede BIR-produktet ved hjelp av DLE-analyseprimerne uten hybridiserende oligonukleotider. R indikerer at et restriksjonsenzymsted er kompetent for enzymspaltning; (R) indikerer et restriksjonsenzymsted som ikke kan kuttes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater fra DLC-analyseanalyse av D-sløyfer 2 timer etter DSB-induksjon. Prøver ble samlet inn, forberedt og analysert av qPCR som beskrevet i denne protokollen. Blå symboler representerer resultater for standard villtypestamme med hybridiserende oligoer for n = 3. Grønne symboler representerer resultater for villtypestammen uten hybridisering av oligoer for n = 3. Den tykke røde linjen viser medianen. De lilla symbolene representerer prøver uten psoralen tverrbinding, men med hybridiserende oligoer for n = 2. Symboler indikerer at prøvene er avledet fra samme kultur. Intereksperimentelle forskjeller i kryssbindingseffektivitet kan introdusere variabilitet i visse qPCR-kontroller, men er ikke problematiske så lenge det ikke er noen inter-utvalgsvariabilitet i disse qPCR-kontrollene i et eksperiment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater fra DLE-analyseanalyse 6 timer etter DSB-induksjon. Prøver ble samlet inn, forberedt og analysert av qPCR som beskrevet i denne protokollen. Blå symboler representerer resultater for standard villtypestamme med hybridiserende oligoer for n = 3. Grønne symboler representerer resultater for villtypestammen uten hybridisering av oligoer for n = 3. Den tykke røde linjen viser medianen. Legg merke til at med- og uten-hybridiserende oligosprøver er avledet fra de samme kulturene. Den lilla diamanten representerer en mislykket prøve uten hybridisering av oligoer for n = 1. Symboler indikerer at prøvene er avledet fra samme kultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater fra psoralen tverrlink reversering . (A) Psoralen-DNA mono-addukter (*) og inter-streng tverrbindinger (X) forekommer spesifikt på dsDNA og forhindrer amplifisering av DNA-polymeraser, i motsetning til ssDNA-maler. Denne forskjellen introduserer en skjevhet i kvantifiseringen av dsDNA- og ssDNA-holdige maler av qPCR. Denne skjevheten kan overvinnes ved reversering av psoralen tverrbinding. (B) Representative CP-verdier av dsDNA (genomisk, ligering), ssDNA og blandede ds-ssDNA (DLC) amplikoner oppnådd 4 timer etter DSB-induksjon. Data representerer individuelle verdier og medianen av fire biologiske replikasjoner. (C) Forsterkningsgjenoppretting ved tverrbindingsreversering, beregnet ut fra Cp-verdiene i (B). (D) ssDNA-amplifikasjonen i forhold til genomisk dsDNA-kontroll med og uten psoralen tverrbindingsreversering. Ved reversering forsterker ssDNA-amplikonen ved forventet 0,5 av genomisk dsDNA-kontroll. (E) dsDNA intramolekylær ligeringskontroll i forhold til genomisk dsDNA-kontroll med og uten psoralen tverrbindingsreversering. (F) DLC-signalet i forhold til dsDNA-ligeringskontrollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Gjeldende DLC/DLE-analysesystem og de foreslåtte endringene. Over: Gjeldende DLC / DLE analyse pause nettsted og donor vises. Nedenfor: Planlagte endringer i DLC / DLE-analysebruddstedet og giveren. (I) 117 bp HO endonuklease kuttet sted er indikert i gult. For å forhindre forvirrende effekter mens du overvåker D-loop-forstyrrelse, vil venstre side av HOcs (74 bp) bli introdusert i giveren, slik at rekombinasjon mellom de to skaper en perfekt tilpasset D-sløyfe som mangler en 3 'klaff. (II) For å gjøre systemet reparerbart og dermed mer fysiologisk, vil DNA homologt til giveren (angitt i blågrønn og lilla) bli satt inn i høyre side av HOcs. (III) Invasjon og forlengelse av strengen til høyre for HOcs vil bli overvåket ved hjelp av sekvenser som er unike for den siden av pausen (angitt i oransje). (IV) Ytterligere jevnt fordelte restriksjonsenzymsteder og sekvenser som er unike for giveren, vil tillate D-loop-utvidelse (via invasjon fra venstre side av HOcs) som skal overvåkes på fjernere steder. I dette modifiserte systemet kan synteseavhengig strandglødning (SDSA) eller dobbelt-Holliday-kryssdannelse (dHJ) forekomme på stedene vist i blågrønn eller lilla. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Kart over qPCR-primerne som brukes i DLC- og DLE-analysene. Kart over de genomiske lociene som brukes til analyse i DLC- og DLE-analysene, deres relevante funksjoner og de omtrentlige primerbindingsstedene (se tabell 3 for en liste over qPCR-primere). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Kvalitativ vurdering av tverrbindingsreversering på store amplikoner. Genomisk DNA ble fremstilt fra tverrbundne eller ikke-tverrbundne prøver, der det som beskrevet i protokollen angis §§ 1-5. Ikke-kvantitativ PCR ble brukt til å forsterke 3 kbp-segmentet som spenner over homologiområdet som deles mellom pausestedet og donoren. Merk at på grunn av forskjellene i forsterkningseffektivitet mellom tverrbundet og ikke-tverrbundet DNA og den begrensede mengden prøve, var det ikke mulig å standardisere inngangs-DNA. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 1: S. cerevisiae-stamme brukt til DLC- og DLE-analyse. Genotype av den haploide spirende gjærstammen som ble brukt i denne studien. Stammen er tilgjengelig på forespørsel. Ytterligere stammer tilgjengelig for DLC/DLE-analyseanalyse finnes på Piazza et al.8 og Piazza et al.9. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Hybridisering av oligonukleotider brukt til DLC- og DLE-analyse. Sekvensene av de lange, hybridiserende oligonukleotidene som brukes i DLC- og DLE-analysene. Ytterligere SDS-PAGE-rensing av hybridiserende oligonukleotider av leverandøren av det tilpassede oligonukleotidet anbefales. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: qPCR-primere brukt til DLC- og DLE-analyse. QPCR-primerparene for DLC- og DLE-analysene og beskrivelsene av deres formål. Merk at olWDH1764, olWDH2009 og olWDH2010 brukes i to qPCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggstabell S1: Mal for oppsett og analyse av DLC-analyse qPCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggstabell S2: Mal for oppsett og analyse av DLE-analyse qPCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende sekvensfiler 1-5. Supplerende sekvensfiler for relevante genomiske egenskaper og amplikoner. Sekvensfilene er i ApE-filformatet; ApE er en fritt tilgjengelig programvare for visning og redigering av DNA-sekvenser. ApE-filer er også kompatible med all større sekvensredigeringsprogramvare. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analysene som presenteres tillater deteksjon av begynnende og utvidede D-sløyfer (DLC-analyse), D-loop-utvidelse (DLE-analyse) og BIR-produktdannelse (DLE-analyse uten hybridisering av oligonukleotider) ved bruk av nærhetsligering og qPCR. ChIP-qPCR av Rad51 til steder fjernt fra DSB har tidligere blitt brukt som en proxy for Rad51-mediert homologisøk og D-loop-formasjon. Imidlertid er dette ChIP-qPCR-signalet uavhengig av sekvenshomologien mellom pausestedet og en potensiell donor, så vel som den Rad51-assosierte faktoren Rad54, og er dermed mer sannsynlig å representere en forbigående sammenheng mellom Rad51-ssDNA-filamentet og dsDNA i stedet for et D-loop-mellomprodukt10,11. I motsetning til dette avhenger DLC-signalet av DSB-dannelse, Rad51, Rad52, Rad54 og delt sekvens homologi mellom DSB og donorstedet analysert8. Videre observeres økte DLC-signaler i fravær av Mph1- og Srs2-helikasene, og Sgs1-Top3-Rmi1 helicase-topoisomerase-komplekset, i samsvar med tidligere rapporter om at disse tre faktorene kan demontere Rad51/Rad54-laget begynnende D-sløyfer in vitro 8,25,26,27. DLE-analysen representerer på samme måte en forbedring i forhold til tidligere metoder for å følge rekombinasjonsassosiert DNA-syntese, da den kan skille mellom D-loop-utvidelse og BIR-produktdannelse19.

Som diskutert ovenfor er qPCR-kontrollene, inkludert de for genomisk DNA, DSB-induksjon, psoral tverrbinding, intramolekylær ligering og oligonukleotidhybridisering, kritiske for suksessen og reproduserbarheten av disse analysene. Rå genomiske DNA qPCR-verdier bør være omtrent ekvivalente på tvers av prøver. Lave CP-verdier for ARG4 genomisk DNA-kontroll indikerer overflødig DNA, og antall celler samlet bør justeres. Høye CP-verdier for denne kontrollen indikerer utilstrekkelig DNA-gjenvinning eller forurensning med reagenser som forstyrrer qPCR. Etter sfæroplastering kan cellelyse observeres ved hjelp av et standard lysmikroskop og like store mengder prøve og sterilt vann. Hvis det ikke observeres tilstrekkelig lyse ved tilsetning av vann, må zymolyaseoppløsningen gjenskapes, eller inkubasjonen ved 30 °C skal forlenges. Prøven kan også gå tapt eller forurensninger introdusert under DNA-rensing ved P / C / IA-ekstraksjon. For effektiv gjenvinning av DNA bør man sørge for at pH i P/C/IA er justert til ~8,0 og at bunnfasen ikke forstyrres under fjerning av den øvre fasen. Til slutt kan ineffektiv resuspendering av DNA-pelleten i 1x TE resultere i lave CP-verdier. En lengre inkubasjon ved 37 °C og vortexing vil forbedre resuspenderingen av DNA-pelleten.

I tillegg til genomisk DNA-genomisk DNA-kontroll, bør DSB-induksjons- og restriksjonsenzymspaltningskontrollreaksjonene også være like på tvers av prøver. HO endonuklease eller restriksjonsenzymskjæring på stedet for DSB eller restriksjonsenzymgjenkjenningsstedet forhindrer forsterkning over hele denne regionen; Derfor er typiske normaliserte qPCR-verdier for disse kontrollene nær null, og en høy qPCR-verdi indikerer utilstrekkelig spaltning. Hvis et høyt signal på DSB-stedet observeres, bør galaktoseoppløsningen gjenskapes. For mutanter med kjent cellesyklusdefekt bør DSB-induksjon kvantifiseres ved plettering av like mengder kultur dyrket i henhold til protokollen (se avsnitt 1) på YPDA- og YPA-medier supplert med galaktose. Kolonier som vokser på medier som inneholder galaktose representerer gjær der slutt-sammenføyning skapte en uncleavable HOcs. Hvis det er betydelig flere slutthendelser i en mutant av interesse i forhold til villtypen, må det brukes en korreksjon for å kompensere for denne forskjellen i DSB-induksjon, noe som vil påvirke DLC / DLE-signalet.

Tre primerpar (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 og olWDH2009/olWDH2011) vurderer restaurering av restriksjonsenzymstedet ved hybridisering av oligoer og skjæring av EcoRI-HF og HindIII-HF restriksjonsenzymer. Videre er de intramolekylære ligeringskontrollene også avhengige av tilstrekkelig restriksjonsenzymfordøyelse. Dermed har en prøve med lav intramolekylær ligeringseffektivitet og et høyt signal for et av disse tre primerparene utilstrekkelig restriksjonsenzymskjæring. Ytterligere restriksjonsenzym bør gis i påfølgende preparater, og effekten av restriksjonsenzymet bør vurderes på genomisk DNA. OlWDH1769/olWDH1763 primerparet representerer en ekstra kontroll for DLC-analysen, som måler EcoRI-spaltning ved DAP2, hvor intramolekylær ligeringseffektivitet også måles. En prøve med et tilstrekkelig intramolekylært ligeringssignal, men et høyt signal for et av disse tre primerparene, har utilstrekkelig restaurering av restriksjonsenzymstedet ved hybridiserende oligoer. For å løse dette problemet, bør dupliserte prøver samles inn og konsentrasjonen av de berørte hybridiserende oligoene bør varieres. Typiske qPCR-verdier oppnådd for disse reaksjonene med og uten hybridiserende oligoer finnes i figur 3 og figur 4 og på Piazza et al.8 og Piazza et al.9.

For både DLC- og DLE-analysen anses en intramolekylær ligeringseffektivitet på 0,15-0,35 som normalisert til genomisk DNA-kontroll som normalisert. Siden deteksjon av begynnende og utvidede D-sløyfer og BIR-produktet er avhengig av effektiv ligering, må prøver med lave ligeringssignaler kastes. 10x ligeringsbufferen som mangler ATP bør lagres ved 4 °C i ikke mer enn 6 måneder. Å samle for mange celler kan føre til intermolekylær ligering, noe som vil resultere i lav intramolekylær ligeringseffektivitet og DLC / DLE-signal.

Selv om disse kontrollene for DLC- og DLE-analysene rapporterer om nesten alle de sensitive trinnene, er det fortsatt mulig å oppnå ikke-fysiologiske verdier for DLC- eller DLE-signalet når disse kontrollene er innenfor riktig område. Et lavt DLC- eller DLE-signal kan skyldes feil i cellesfærosetrinnet, noe som er ekstremt følsomt. Man bør bare behandle noen få prøver parallelt og holde dem på 4 °C til enhver tid. Et høyt / lavt DLC / DLE-signal kan også skyldes å samle for mange / få celler på hvert tidspunkt. Dette problemet kan løses ved å samle flere OD600s celler på hvert tidspunkt for hver prøve.

Det er flere tekniske og konseptuelle begrensninger i DLC- og DLE-analysene i sin nåværende form. For det første er psoralen-mediert inter-strand tverrbindingstetthet ~ 1 i 500 bp8. Derfor kan et økt DLC-signal enten indikere at det er flere D-sløyfer i populasjonen, at gjennomsnittslengden på D-løkkene i populasjonen har økt (forutsatt at D-sløyfer kan være mindre enn 500 bp), eller begge deler. Videre reduseres sannsynligheten for at en D-sløyfe fanges opp av DLC-analysen med synkende D-sløyfelengde. Gitt at svært korte D-sløyfer kan utgjøre en betydelig del av den totale D-sløyfepopulasjonen i visse mutante bakgrunner, må denne begrensningen av analysen tas i betraktning ved tolkning av resultater. For det andre krever DLC-analysen DNA-tverrbinding, mens DLE-analysen ikke gjør det. Tidligere, for et gitt eksperiment, betydde dette at DLC- og DLE-prøver måtte samles inn og analyseres separat. Metoden vist i figur 5 oppnår robust tverrbindingsreversering, noe som lindrer behovet for å samle flere prøver fra samme kultur. Innføringen av et andre EcoRI-restriksjonsenzymsted på den ødelagte strengen, nedstrøms for HindIII-gjenkjenningsstedet, vil muliggjøre sekvensiell DLC- og DLE-analyse.

I tillegg til disse tekniske begrensningene tillater DLC- og DLE-analysesystemet for øyeblikket ikke gjenoppretting av levedyktige HR-produkter fordi høyre side av den induserbare DSB mangler homologi til giveren. For bedre å forstå kinetikken og mekanismen for andre endeengasjement og syntese, kan systemet modifiseres slik at reparasjon ved hjelp av en proksimal eller distal region av homologi delt mellom den andre enden av pausen og giveren er mulig (figur 6). Når vi ser fremover, kan det vise seg å være innsiktsfullt å kombinere DLC- og DLE-analysene med andre teknologier, for eksempel ChIP-qPCR, høykapasitets kromosomkonformasjonsfangst (Hi-C) og in vivo D-loop-kartlegging, for å oppnå en omfattende analyse av kinetikken og reguleringen av trinnene i HR-banen, inkludert brudddannelse, endereseksjon, Rad51-filamentdannelse, begynnende D-sløyfeformasjon, D-loop-utvidelse, D-loop-reversering, andre endeengasjement, andre endesyntese og oppløsning28.

Oppsummert tillater DLC- og DLE-analysene kvantifisering av begynnende og utvidede D-sløyfer, D-loop-utvidelse og BIR-produktdannelse ved bruk av prinsippet om nærhetsligering. Disse analysene representerer store fremskritt i feltet, da de er de første som tillater semi-kvantitativ måling av D-loop-dannelse og forlengelse uavhengig av cellulær levedyktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet i Heyer-laboratoriet støttes av bevilgningene GM58015 og GM137751 til W.-D.H. Forskning på Piazza-laboratoriet er støttet av Det europeiske forskningsrådet (ERC-StG 3D-loop, stor avtale 851006). D.R. støttes av T32CA108459 og A.P. Giannini Foundation. Vi takker Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) for å dele sine DLC / DLE-analyseresultater og for i tillegg å validere endringene i analysene som er beskrevet i denne protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Tags

Genetikk D-loop genomstabilitet leddmolekyl Rad51 break-indusert replikasjon
Påvisning av homologe rekombinasjonsmellomprodukter <em>via</em> nærhetsligering og kvantitativ PCR i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A.,… More

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter