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Biology

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

Abstract

선충류 Caenorhabditis elegans는 자연에서 다양한 미생물과 상호 작용합니다. 일반적으로 C. elegans 는 썩은 식물 물질, 특히 사과와 같은 썩은 과일이나 퇴비 더미에서 흔히 발견됩니다. 또한 민달팽이 및 나무 줄기와 같은 특정 무척추 동물 숙주와 관련이 있습니다. 이 서식지는 미생물이 풍부하여 C. elegans 의 먹이로 사용되며 선충류 장을 지속적으로 식민지화 할 수 있습니다. 현재까지 서식지와 지리적 위치에 걸친 토착 C. elegans 미생물총의 정확한 다양성과 일관성은 완전히 이해되지 않았습니다. 여기에서는 C. elegans를 자연에서 분리하고 웜의 미생물을 특성화하는 데 적합한 접근법을 설명합니다. 선충류는 퇴비 재료, 썩은 사과, 민달팽이에서 쉽게 분리하거나 퇴비 더미에 사과를 놓아 끌 수 있습니다. 북반구에서 C. elegans 를 찾는 가장 좋은시기는 9 월에서 11 월까지입니다. 웜은 기질을 완충 용액에 담그고 선충을 수집하고 후속 분석을 위해 선충 성장 배지 또는 PCR 완충액으로 옮겨 수집된 기질 물질에서 씻어낼 수 있습니다. 우리는 또한 샘플을 사용하여 벌레 관련 미생물을 분리 및 정제하고 미생물군 군집 구성의 16S 리보솜 RNA 분석을 위해 벌레를 처리하는 방법을 설명합니다. 전반적으로, 설명 된 방법은 서식지와 지리적 위치에 걸쳐 C. elegans 미생물 총의 특성화에 대한 새로운 연구를 자극 할 수 있으므로 향후 기능 연구의 기초로서 선충 미생물의 다양성과 안정성에 대한 포괄적 인 이해를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

자연에서 C. elegans는 일반적으로 썩은 식물 물질, 특히 사과와 같은 썩은 과일이나 퇴비 더미에서 발견됩니다1. 또한 민달팽이 및 나무 줄기 2,3과 같은 특정 무척추 동물 숙주와 관련이 있습니다. 이 서식지는 미생물이 풍부하여 벌레의 먹이 역할을 할뿐만 아니라 미생물과 안정적인 연관성을 형성 할 수 있습니다. 자연적으로 관련된 미생물의 다양성에 대한 정보는 2016 4,5,6 년에만 발표되었습니다. 그 이후로, 이것들과 최근의 몇 가지 연구에서만 C. elegans가 다양한 박테리아 및 곰팡이와 관련이 있음이 밝혀졌으며, 가장 일반적으로 슈도모나스, 엔테로박터, 오크로박트룸, 에르위니아, 코마모나스, 글루코노박터 및 기타 여러 박테리아를 포함합니다 6,7,8. 여러 관련 박테리아가 벌레 내장을 안정적으로 식민지화할 수 있지만 모두 6,9,10,11,12는 아닙니다. 그들은 영양을 제공하고 병원체 및 기타 스트레스 요인으로부터 보호하며 재생산 속도, 발달 또는 행동 반응과 같은 중심 생활사 특성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 C. elegans 생물학에 대한 우리의 이해에 매우 중요할 것입니다.

예를 들어, 슈도모나스, 오크로박트룸, 엔테로박터 또는 글루코노박터 속의 자연적으로 연관된 분리물은 별개의 방식으로 병원체 감염 및 사멸로부터 웜을 보호할 수 있습니다 5,6,11,13,14. Comamonas 속의 특정 분리물은 선충 식이 반응, 발달, 수명 및 생식력에 영향을 미칩니다15,16,17. 프로비덴시아 박테리아는 신경 조절제 티라민을 생성하여 숙주 신경계 활동과 그에 따른 행동 반응을 조절합니다18. 다양한 자연 관련 박테리아 세트가 인구 증가율, 출산율 및 행동 반응 5,6,9,11,19에 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다.

현재까지 서식지와 지리적 위치에 걸친 토착 C. elegans 미생물총의 정확한 다양성과 일관성은 완전히 이해되지 않았으며 환경에서 벌레와 미생물 사이의 추가 연관성은 아직 밝혀지지 않았습니다. 이전의 여러 연구에서는 일부 토양 환경, 자연 C. elegans 서식지 또는 메소 코즘 실험 (즉, 자연 서식지를 재현하는 실험실 기반 환경)에서 분리 된 박테리아 균주를 C. elegans 실험실 균주 4,5,20과 함께 사용했습니다. 이러한 연구가 특정 선충 형질(예: 선충 대사21)에 대한 미생물의 영향에 대한 새로운 통찰력을 얻었음에도 불구하고 자연에서 C. elegans 생물학에 대한 이러한 상호 작용의 관련성은 불분명합니다. 따라서이 원고는 C. elegans를 자연에서 직접 분리하고 단일 벌레와 벌레 그룹 모두에서 자연적으로 관련된 미생물을 분리하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 설명 된 방법은 천연 C. elegans 및 그 토착 미생물군 2,6,7의 분리 및 특성화를 위해 이전에 사용 된 절차의 업데이트 및 개선 된 버전입니다. C. elegans가 전 세계적으로 (특히 썩은 과일, 온대 지역 및 가을)의 분해 식물 물질에서 널리 발견된다는 점을 고려할 때,1,2,22,23,24,25,이 프로토콜은 C. elegans 관련에 관심이있을 때마다 모든 실험실에서 적용 할 수 있습니다. 자연적으로 관련된 미생물에 대한 특성과 따라서 더 자연스럽게 관련된 맥락. 후자는 다른 숙주 시스템의 다양성에서 관련 미생물이 다양한 생활사 특성에 영향을 미칠 수 있다는 것이 알려져 있기 때문에 선충의 생물학을 완전히 이해하는 데 중추적입니다.26, 현재 거의 모든 생명 과학 분야의 수많은 C. elegans 연구에서 크게 무시되는 측면입니다.

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Protocol

1. 완충액 및 배지의 제조

  1. 플라스크에 5.85 g의 NaCl, 1.123 g의 K2HPO4, 5.926 g의 KH2PO4, 및 1 L의 탈이온화된 H2O를 첨가하고, 121°C에서 20분 동안 오토클레이브함으로써 S-완충액을 제조한다.
  2. 1.2%(w/v) 하이드록시메틸셀룰로오스(배지의 점도를 유발하는 물질), 5mg/mL 콜레스테롤, 1mMMgSO4, 1mMCaCl2 및 0.1%(v/v) 아세톤을 포함하는 S-완충액을 첨가하여 점성 배지를 준비합니다. 점성 매체가 완전히 균질해질 때까지 오토 클레이브하고 저어줍니다.
    참고: 이 작업은 여러 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한, S-완충액은 사전 멸균 없이 직접 제조하여 점성 배지에 첨가할 수 있다.
  3. 1 L 플라스크에 3 g의 KH2PO4, 6 g의 NA2HPO4·2H2O, 5 g의 NaCl 및 1 L의 탈이온화된H2O를 첨가하여 M9-완충액을 준비한다. 용액을 오토클레이브하고, 냉각시킨 후, 1 mL의 1 MMgSO4 (500 mL의 탈이온화된 H2O, 필터 멸균된 MgSO4·7H2O123.24g)를 첨가한다.
  4. 5mL의 트리톤 X-100과 45mL의 M9 버퍼를 혼합하여 10%(v/v) 트리톤 X-100 원액을 준비합니다. 필터-0.2 μm 필터를 사용하여 용액을 멸균한다.
  5. 오토클레이빙 후 M9 버퍼 1L에 10%(v/v) 트리톤 X-100 원액 2.5mL를 추가하여 트리톤 X-100(M9-T)으로 M9-버퍼를 준비하면 0.025%(v/v) M9-T를 얻을 수 있습니다.
  6. 50mL 튜브에 멸균 100% 글리세롤 15mL와 멸균 S-버퍼 35mL를 혼합하여 S-버퍼에서 30%(v/v) 글리세롤을 준비합니다.

2. 환경 샘플 준비 (그림 1)

  1. 퇴비 또는 썩은 과일과 같은 환경 샘플을 수집하고 각 샘플을 개별 비닐 봉지, 튜브 또는 기타 깨끗한 용기에 넣습니다.
    알림: 선충류를 유인하기 위해 사과는 샘플링 몇 주 전에 퇴비에 놓을 수 있습니다.
  2. 환경 시료 조각을 비어 있는 멸균 9cm 페트리 접시에 고르게 펴 바릅니다.
    알림: 붕괴 수준이 높은 샘플은 C. elegans를 포함할 가능성이 더 큽니다. 선택적으로 펩톤이 없는 한천 배지(PFM)로 채워진 페트리 접시를 사용하여 대비를 높일 수 있습니다.
  3. 약 20mL의 멸균 점성 배지로 샘플을 조심스럽게 덮습니다.
    알림: 선충류는 1-2 시간 내에 표면으로 떠 있습니다. 점성 매체는 웜의 움직임을 늦추고 샘플링을 더 쉽게 만듭니다. 멸균 M9 버퍼를 대안으로 사용할 수 있지만 웜 이동이 더 빠릅니다.

Figure 1
그림 1: 기질에서 선충류의 분리. 기질 샘플을 빈 페트리 접시에 넣고 점성 배지로 덮어 선충류를 씻어냅니다. 선충류는 M9-T로 옮겨져 반복적으로 세척되어 외부에서 박테리아를 제거합니다. 개별 선충류는 DNA 분리, 관련 박테리아 분리에 사용하거나 한천 플레이트에 올려 벌레 개체군을 배양할 수 있습니다. BioRender.com 로 만든 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 선 충류의 분리 (그림 1)

  1. Barrière 및 Félix27의 C. elegans 및 관련 선충류의 분리에 대한 WormBook 장에 제시된 지침에 따라 해부 현미경을 사용하여 Caenorhabditis 선충을 검색합니다.
    알림: Caenorhabditis 자웅동체/암컷은 밝은 갈색의 내장을 가지고 있습니다(투과된 조명 아래). 또한 장 세포에는 흰색 점으로 보이는 큰 세포핵이 있습니다. 대조적으로, 다른 선충류 종은 종종 짙은 갈색의 내장을 가지고 있으며 색소 강도에서 전후 비대칭을 보일 수 있으며 일반적으로 눈에 보이는 핵이 없습니다. 성인 Caenorhabditis 자웅 동체 / 암컷의 외음부는 동물의 중간에서 발견됩니다. 이 외음부 국소화가 항상 다른 선충류 분류군에 의해 나타나는 것은 아닙니다. Caenorhabditis 선충류는 두 개의 인두 구근을 가지고 있으며, 둘 다 충분한 배율로 볼 수 있으며 다른 많은 선충 분류군과 조명 및 대비를 투과시킵니다. Caenorhabditis 선충류는 뾰족한 꼬리를 가지고있는 반면, 다른 선충류는 둥근 꼬리를 가지고 있습니다.
  2. Caenorhabditis 선충류를 20-100 μL 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 액체로 해부 현미경으로 수집합니다. 수집 된 선충류를 멸균 된 3cm 페트리 접시에 담긴 멸균 된 M9-T 1-3mL에 직접 옮겨 벌레를 세척하여 부착되지 않은 미생물을 제거하거나 (3.3 단계) 또는 개별 벌레를 선충 성장 배지 (NGM)가있는 플레이트로 옮겨 벌레 개체군을 설정합니다 (3.4 단계).
  3. 선충류를 씻어 선충류 외부에서 미생물을 제거하십시오.
    알림: 이 프로토콜은 장내 세균을 풍부하게 하지만 벌레 큐티클에 달라붙는 박테리아를 완전히 제거하지는 않습니다.
    1. 선충류를 M9-T에서 10-15 분 동안 배양하십시오.
    2. 가능한 한 적은 액체에 선충류를 피펫팅하여 새로운 멸균 3cm 페트리 접시에 1-3mL의 신선한 M9-T를 넣습니다.
    3. 배양을 반복하고 선충류를 신선한 M9-T로 두 번 더 옮깁니다.
      참고: 다음 단계는 개별 웜 또는 웜 모집단을 사용하여 수행할 수 있습니다. 벌레는 이제 C. elegans 및 관련 미생물의 특성화와 박테리아의 분리에 사용할 수 있습니다 (4 단계 및 5 단계). 또는 개별적으로 NGM 플레이트로 옮겨 웜 개체군을 설정할 수 있습니다 (3.4 단계).
  4. 벌레 개체군을 얻으려면 개별 선충을 NGM 플레이트에 피펫팅합니다.
    참고 : C. elegans 또는 C . briggsae 와 같은 자웅 동체 선충류 만이 단일 벌레에서 자손을 생산할 수 있습니다. 그러나 다른 종의 단일 벌레는 이미 짝짓기 된 경우 여전히 자손을 생산할 수 있습니다.
    1. 자연적으로 분리 된 선충류는 일반적으로 장에 박테리아를 포함하고 있으며,이 박테리아는 NGM 플레이트에 흘려 보내며,이 박테리아는 성장하고 C. elegans의 음식으로 사용할 수 있습니다. 표준 실험실 식품 유기체인 대장균 균 주 OP50과 같은 별도의 식품 유기체를 추가하지 마십시오.
      참고 : 판에 벌레를 사육하는 것은 관련 박테리아 군집의 구성에 영향을 미치지 만 구성은 여전히 천연 C. elegans 분리 6,7의 구성과 비슷합니다.
    2. 선충류가 적절한 온도(예: 온대 위치의 경우 15-20°C)에서 최대 10일 동안 증식하도록 합니다. 이 선충류를 동결 (3.5 단계)하거나 C. elegans 및 관련 미생물의 특성화 및 미생물 분리 (4 단계 및 5 단계)에 사용하십시오.
  5. 장기 보관을위한 냉동 선충류
    1. 음식 박테리아가 사라질 때까지 선충류를 접시에 남겨두고 접시에 주로 작은 애벌레 단계가 있습니다. 1.5mL의 S- 버퍼로 플레이트에서 벌레를 씻어냅니다.
    2. 멸균 2mL 튜브의 S-버퍼에 500μL의 웜 함유 S-버퍼와 500μL의 30%(v/v) 글리세롤을 완전히 혼합합니다. 장기 보관을 위해 -80 °C에서 튜브를 즉시 동결하십시오, 그렇지 않으면 글리세롤이 선충류에 해를 끼칠 수 있습니다.

4. C. elegans 및 미생물의 분자 식별을위한 웜의 준비

  1. 선충 관련 미생물의 편견 없는 식별을 위해 웰당 멸균 1mm 비드 3개, PCR 버퍼 19.5μL 및 프로테이나제 K (20mg/mL) 0.5μL가 포함된 96웰 플레이트를 준비합니다. 개별적으로 피펫팅하고 각 우물에 씻은 선충류를 가능한 한 적은 양의 액체로 옮깁니다.
  2. 웜 개체군도 사용할 수 있습니다. 이를 위해 플레이트에서 웜을 M9 버퍼로 씻고 ~300μL의 웜 함유 M9 버퍼를 10-15개의 비드가 있는 2mL 튜브로 옮깁니다.
  3. 비드 균질화기를 사용하여 선충류를 분해합니다(예를 들어, 30Hz에서 3분 동안 비드 박동). 플레이트 또는 튜브를 잠시 원심분리하여 액체를 바닥으로 가져옵니다(예: 실온[RT]에서 8000 x g 에서 10초 동안).
  4. C. 엘레 간스의 식별
    1. PCR 사이클러에서 샘플을 50°C에서 1시간, 95°C에서 15분 동안 가열하여 개별 선충의 DNA를 분리합니다. 선택한 분리 방법을 사용하여 웜 개체군의 DNA를 분리합니다(상용 키트 7,9를 사용하는 다양한 분리 방법의 프로토콜 예). 장기 보관을 위해 DNA를 -20 ° C에서 동결시킵니다.
    2. C. elegans의 식별을 위해 선택한 Taq 공급자의 지침에 따라 DNA와 프라이머 쌍 nlp30-F(표 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') 및 nlp30-R(표 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3')을 PCR에 사용합니다.
    3. 다음의 PCR 조건을 사용한다: 95°C에서 2분 동안 초기 변성 단계, 이어서 45초 동안 95°C, 30초 동안 55°C, 1분 동안 72°C의 35 사이클, 및 72°C에서 5분 동안 최종 신장 단계를 수행한다 .
  5. 분리된 DNA를 사용하여 V3-V4 영역의 16S 앰플리콘 시퀀싱을 통해 선충 관련 박테리아를 특성화합니다.
    1. 선택한 16S 프라이머로 16S 라이브러리를 준비하고 라이브러리 준비 키트 프로토콜을 따르십시오. 하나의 옵션은 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 커버하는 프라이머 341F (표 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') 및 806R (표 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')을 사용하는 것이며, 이는 양호한 해상도7을 갖는 표준 데이터베이스로 분류될 수 있는 서열을 초래한다.
      참고: 입력 DNA의 양은 이 단계에서 중요합니다. 단일 벌레에서 얻은 DNA는 벌레 개체군에서 얻은 것보다 훨씬 적을 것입니다. 단일 웜의 경우 입력 DNA의 양을 늘리거나 PCR 주기의 양을 늘려야 할 수도 있습니다7.
    2. 라이브러리는 적절한 시퀀싱 키트를 사용하여 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱할 수 있습니다.
      참고: 여기서 MiSeq 플랫폼은 적합한 MiSeq 시약 키트와 함께 사용됩니다. 시약은 지속적으로 개선되며 최신 표준으로 선택해야합니다.

5. 선충 관련 박테리아의 분리 및 배양(그림 2)

  1. 박테리아를 분리하려면 3개의 멸균 1mm 비드, 웰당 20μL의 M9 버퍼가 있는 96웰 플레이트를 준비하고 세척된 선충류를 각 웰에 피펫팅하여 가능한 한 적은 액체를 옮깁니다.
    알림: 또는 웜 개체군을 M9 버퍼로 플레이트에서 세척할 수 있으며 ~300μL의 웜 함유 M9 버퍼를 10-15개의 비드가 있는 2mL 튜브로 옮길 수 있습니다. 모든 경우에 웜은 4.1-4.4단계를 사용하여 C. elegans 로 확인된 배양에서 가져와야 합니다.
  2. 비드 균질화기를 사용하여 선충류를 분해합니다(예를 들어, 30Hz에서 3분 동안 비드 박동). 플레이트 또는 튜브를 잠시 원심분리하여 액체를 바닥으로 가져옵니다(예: RT에서 10 x g 에서 8000초 동안).
    참고: 이 방법의 사용은 16S rDNA 앰플리콘 시퀀싱7에 의해 밝혀진 것과 유사한 박테리아 분류군의 분리로 이어졌으며, 이는 설명된 비드 박동이 대부분의 박테리아 세포를 그대로 유지함을 시사합니다.
  3. 상청액을 수집하고, 1:10에 연속 희석하고, 9cm 한천 플레이트에 최대 100μL까지 도금합니다.
    1. 대부분의 박테리아를 배양할 수 있도록 희석된 트립티카제 대두 한천(TSA, 1:10 희석), 맥콩키 한천, 사부로 포도당 한천, 감자 포도당 한천 또는 효모 펩톤 덱스트로스 한천을 포함하여 다양한 영양 성분의 다양한 대체 배지를 사용하십시오.
  4. 샘플링 위치의 평균 온도 조건(예: 온대 위치의 경우 15-20°C 사이의 온도)에서 플레이트를 24-48시간 동안 배양합니다.
  5. 표준 3 연속 기술과 멸균 루프를 사용하여 순수한 박테리아 배양을 얻습니다(그림 2).
    1. 멸균 루프 또는 이쑤시개를 사용하여 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 정제에 사용된 것과 동일한 한천 배지가 포함된 새 한천 플레이트에 줄무늬를 그립니다. 접시의 약 1/3만 사용하십시오.
    2. 새 멸균 루프를 사용하거나 재사용 가능한 루프를 멸균하고 첫 번째 줄무늬를 통해 드래그하여 동일한 플레이트의 다른 1/3에 두 번째 줄무늬를 만듭니다.
    3. 두 번째 줄무늬를 통해 멸균 루프를 드래그하여 이 단계를 반복합니다.
    4. 플레이트를 단리에 사용된 것과 동일한 성장 조건에서 배양한다. 이 기술은 세 번째 줄무늬 영역에서 단일 식민지가 자라야합니다.
      참고: 천연 분리물은 생물막 및/또는 응집체를 형성하는 경향이 있으므로 정제 단계를 여러 번 반복해야 할 수도 있습니다.
  6. 위와 동일한 온도 및 성장 시간을 사용하여 액체 배지 (한천 배지와 동일한 유형)에서 순수한 콜로니를 성장시킵니다 (단계 5.4).
  7. 300μL의 박테리아 배양액을 200μL의 86%(v/v) 글리세롤(각각의 성장 배지, 예: TSB)에 첨가하고 피펫을 위아래로 올려 적절하게 혼합하여 박테리아 스톡을 준비합니다. 또는 50μL의 박테리아 배양과 50μL의 7%(v/v) DMSO를 혼합하여 DMSO 스톡을 준비합니다. 장기 보관을 위해 -80 °C에서 동결하십시오.
  8. 전체 16S 리보솜 RNA 유전자의 시퀀싱을 사용한 박테리아 특성 분석
    1. 적합한 기술을 사용하여 순수한 액체 배양물로부터 박테리아 DNA를 추출한다(예를 들어, DNA 추출 키트; 경험으로부터, CTAB-기반 추출 프로토콜은 매우 잘 작동한다(22).
    2. 프라이머 27F (표 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 1495R (표 1, 5'-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3')28을 사용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 하기 PCR 조건: 95°C, 2분, 22x (95°C, 30초; 55°C, 30초; 72°C, 100초), 및 72°C, 5분에서 최종 연장 기간을 가진다.
    3. 전체 서열을 획득하기 위해, 701F (표 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') 및 785R (표 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6과 같은 2개의 내부 시퀀싱 프라이머를 추가로 사용한다.

Figure 2
그림 2 : 개별 박테리아의 종 식별 및 분리. 개별 선충류는 비드 균질화를 사용하여 분해되고 DNA는 PCR 또는 시퀀싱을 통한 종 결정을 위해 분리됩니다. 대안적으로, 분해된 선충 물질을 연속적으로 희석하고 성장 배지 플레이트에 플레이팅한다. 플레이트는 박테리아 콜로니가 나타날 때까지 배양되고 단일 콜로니는 순수한 배양을 얻기 위해 새로운 플레이트에 줄무늬가 있습니다. 순수 배양물의 단일 콜로니는 -80°C에서 장기 보관을 위한 박테리아 스톡의 제조를 위한 액체 박테리아 배양물을 성장시키는데 사용된다. BioRender.com 로 만든 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Representative Results

선충류 C. elegans는 사과와 같은 분해 과일 및 퇴비 샘플에서 자주 발견됩니다. 북부 독일에서는 C. elegans와 동종 종 (특히 C. remanei뿐만 아니라 C. briggsae)이 주로 9 월부터11 월 2 일까지 발견됩니다. 선충류는 분해되는 식물 물질, 특히 사과 나 배와 같은 썩은 과일과 퇴비, 특히 높은 수준의 분해를 나타내는 물질에서 가장 흔하게 발견됩니다. 과일 및 퇴비 샘플은 실험실로 가져갈 수 있으며(그림 3A,B), 페트리 접시(그림 3C,D)에 배포한 다음 액체 또는 점성 매체에 담가 벌레가 기질 재료를 떠나 매체 표면으로 헤엄치도록 할 수 있습니다(그림 3E, F). 그 후, 웜을 수집하여 한천 플레이트 또는 미세 원심분리 튜브로 옮기고 진단 PCR 2,6,7,22를 사용하여 종 동일성을 결정할 수 있습니다.

Figure 3
그림 3 : 선충류 분리를위한 사과 준비. (A,B) 선충류는 퇴비 또는 썩은 과일과 같은 환경 샘플에서 분리 될 수 있으며 퇴비에 사과를 놓아 추가로 유인 될 수 있습니다. (씨,디) 샘플을 나누고 작은 조각을 페트리 접시에 넣습니다. (E, F) 점성 배지가 샘플에 첨가되어 일반적으로 선충류가 기질 재료를 떠나 배지 표면으로 헤엄칩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

C. elegans 특이적 프라이머 nlp30-F 및 nlp30-R을 사용한 PCR 결과 C. elegans에 대해서는 154bp 길이의 PCR 산물이 나오고 다른 선충류에 대해서는 생성물이 없습니다(그림 4). PCR의 성공적인 성능을 확인하려면 N2와 같은 실험실 균주의 DNA를 분리된 선충류의 DNA와 동시에 양성 대조군으로 실행해야 합니다. 작은 유충 단계와 같은 소량의 생물학적 물질은 약한 PCR 밴드를 초래할 수 있습니다(그림 4A). PCR 밴드의 가시성은 PCR에서 더 많은 DNA를 사용함으로써 개선될 수 있으며(이는 박테리아 16S rDNA 앰플리콘 시퀀싱을 위해 남겨진 DNA의 양을 최소화할 수 있음에 유의하고, 예를 들어, 1μL 대신 2μL의 DNA), 더 많은 양의 PCR 산물을 겔에 적용함으로써(예를 들어, 10-15μL), 또는 PCR 주기 수를 늘림으로써. 단일 벌레와 비교하여 최소 50 개의 벌레로 구성된 벌레 개체군은 일반적으로 더 많은 양의 DNA를 생성하며 전기 영동 겔의 밴드가 명확하게 보입니다 (그림 4B).

Figure 4
그림 4: C. 엘레간스 특이적 PCR의 PCR 산물. (ᄀ,ᄂ) C. 엘레간스 특이적 프라이머 nlp30-F 및 nlp30-R은 154bp 길이의 PCR 산물을 생성합니다. 예를 들어, PCR은 (A) 단일 웜 및 (B) 웜 개체군 (예 : 300-500 개체)에 대해 수행되었으며, 모두 독일 킬에있는 식물원의 퇴비에서 썩은 식물 물질로부터 설명 된 프로토콜로 분리되었습니다. (A) 단일 벌레, 특히 작은 유충 단계의 DNA는 종종 약한 PCR 밴드를 초래합니다. (B) 벌레 개체군(예: 300-500명)에서 분리된 DNA는 더 명확한 띠를 만듭니다. C. elegans N2의 DNA는 양성 대조군(+)으로 사용되었고, 주형은 음성 대조군(-)으로 사용되지 않았습니다. PCR 밴드 아래의 얼룩은 젤 인공물입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

C. elegans와 관련된 미생물은 웜 및 웜 함유 기질 샘플에서 분리 할 수 있습니다. 미생물 분리는 한천 플레이트에서 순수 배양물의 분리, 액체 배지에서의 성장 및 후속 특성 분석(예: 박테리아에 대한 16S 리보솜 RNA 유전자 서열 사용)을 포함한 일반적인 미생물학 표준을 따릅니다. 미생물은 표준 미생물학 절차를 사용하여 플레이트에서 순수한 단일 콜로니로 분리하는 것이 중요합니다(그림 5). 이것은 C. elegans 관련 박테리아 중 일부가 생물막을 형성하거나 쉽게 응집되어 다종 배양을 초래할 수 있기 때문에 중요합니다 (그림 5C, D). 단리된 박테리아 배양물의 순도는 이전에 단리된 C. elegans 관련 미생물 6,7에 대해 수행된 것처럼 16S rRNA 유전자의 서열을 통해 확인할 수 있습니다. 얻어진 미생물은 이후 C. elegans 실험에 사용될 수 있습니다.

Figure 5
그림 5: 한천 플레이트의 박테리아 분리 물. 개별 박테리아 분리 물은 한천 플레이트, 이 경우 트립신 대두 한천 (TSA) 플레이트에 줄무늬가 있으며, 예를 들어 (A) 슈도 모나스 루리다, (B) 슈도모나스 형광 및 여러 박테리아 종의 예, (C) 전체 플레이트의 개요 및 (D) 뚜렷한 콜로니 유형이 보이는 이 플레이트 섹션의 배율로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이 연구에 사용된 프라이머 목록 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

선충류 Caenorhabditis elegans는 생물학적 연구에서 가장 집중적으로 연구 된 모델 유기체 중 하나입니다. 그것은 원래 신경계의 발달과 기능을 이해하기 위해 1960 년대 시드니 브레너 (Sydney Brenner)에 의해 소개되었습니다29. 그 이후로 C. elegans는 행동 생물학, 신경 생물학, 노화, 진화 생물학, 세포 생물학, 발생 생물학 및 면역학을 포함한 모든 생물학적 분야에서 기본 과정을 연구하기위한 강력한 모델이되었습니다. 그 성공은 약 3일의 짧은 생성 시간, 재배 용이성, 투명한 몸체(효율적인 표현형 허용), 동결 생존, 효율적인 살균 및 발달 동기화, 돌연변이 유발, CRISPR-Cas, 또는 RNAi에 의한 효율적인 유전자 조작 방법을 포함한 유리한 특성의 고유한 조합을 기반으로 합니다. 오늘날 C. elegans는 전 세계적으로 약 1,500 개의 실험실에서 연구되고 있습니다. 시드니 브레너 (Sydney Brenner)가 실험실에서 C. elegans를 모델 시스템으로 처음 확립했을 때, 그는 그람 음성 박테리아 인 Escherichia coli OP50에서 박테리 보어 선충을 식품 공급원으로 재배했습니다. 그 이후로, C. elegans는 전 세계의 실험실에서 대장균 OP50 상의 단일성 배양으로 유지되어 왔다29. 또한, C. elegans 개체군은 멸균 된 알에 의해서만 생존하고 관련 미생물이없는 표백 절차에 의해 습관적으로 동기화되거나 오염을 제거합니다. 따라서 고도로 통제 된 조건에서 개별 박테리아에 노출 될 수있는 멸균 동물을 쉽게 생성 할 수 있습니다. 그러나 이러한 표준화 된 C. elegans 실험실 유지 관리 프로토콜의 결과로 C. elegans 생물학에 대한 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 박테리아가없는 상태에서 수행되었습니다. 사실, 자연적으로 관련된 미생물의 다양성에 대한 정보는 2016 4,5,6 년에만 발표되었으며 관련 미생물의 정확한 다양성은 아직 완전히 탐구되지 않았습니다.

설명 된 방법은 자연에서 C. elegans와 관련된 미생물의 다양성을 더욱 특성화하는 데 도움이됩니다. 이 미생물은 선충류의 생활사를 결정하는 중요한 요인 일 가능성이 높으므로이 벌레에 대한 향후 작업에 필수적인 자원이어야합니다. 설명 된 방법은 필드 6,7에서 직접 수집 한 천연 C. elegans 샘플에서 미생물을 분리하기 위해 이전에 발표 된 유일한 방법의 업데이트 된 버전입니다. 이 프로토콜은 C. elegans가 자연에서 분해되는 식물 물질에 서식한다는 사실을 이용합니다. 이러한 썩는 물질은 미생물이 풍부하여 C. elegans의 음식 역할을하며 면역 보호 (즉, 병원균에 대한 보호)와 같은 다른 기능을 수행 할 가능성이 있습니다 5,6,11,13,14. 따라서 첫 번째 핵심 단계는 웜 격리에 적합한 기판을 얻는 것입니다. 적합성은 연중 시간에 따라 달라질 수 있습니다. 북부 독일에서는 C. elegans가 주로 9 월부터11 월 2 일까지 발견됩니다. 사과 나 배와 같은 과일을 사용할 수있게되고 땅에서 썩기 시작하는시기입니다. 정확한 시간은 지리적 지역23,24,25,30에 따라 다를 수 있습니다. 모든 식물 재료는 C. elegans에 적합한 것으로 보이며, 높은 분해도를 나타내어 풍부한 미생물 군집을 보유하는 한 C. elegans에 적합한 것으로 보입니다 (종종 C. elegans1에 병원성이있는 곰팡이가 우세한 물질을 제외하고). 또한, C. elegans는 일반적으로 일반적인 습도가 너무 낮지 않을 때 특히 일반적입니다2. 현재까지 Caenorhabditis 선충류가 산업 대 유기 농업 또는 표면 대 더 깊은 찌꺼기 층 또는 비에 대한 의존도에서 식물 재료가 풍부하게 다른지에 대한 체계적인 정보가 부족합니다.

샘플이 수집되어 실험실로 옮겨지면 웜을 기질에서 "유인"해야합니다. 이것은 예를 들어 Baermann 깔때기 (31)를 통한 웜 추출 또는 중간(27)의 유인 물질로서 대장균 실험실 식품을 포함하는 한천 플레이트에 샘플을 배치하는 것과 같은 몇 가지 다른 접근법으로 달성되었습니다. 경험상 여기에 설명된 프로토콜은 일반적으로 더 빠르고 효율적입니다. 이는 기판 샘플이 액체 또는 점성 용액에 잠겨 웜을 기판에서 액체 표면까지 효율적으로 밀어내어 쉽게 수집 할 수 있다는 아이디어를 기반으로합니다. 배지의 점도가 절대적으로 필요한 것은 아니지만 웜의 움직임을 늦추므로 웜을 더 쉽게 수집 할 수 있습니다. 액체가 기질에 조심스럽게 첨가 될 때 벌레의 효율적인 수집이 촉진되어 액체를 어둡게하고 선충류를보기 어렵게 만들 수있는 humous 물질의 가용화를 피할 수 있습니다.

다음 과제는 C. elegans를 식별하는 것입니다. 일부 형태학적 특징은 Caneorhabditis 벌레를 다른 선충류(27)와 구별하는 데 도움이 될 수 있지만, 정확한 종 식별에는 불충분하다. 썩은 식물 물질에는 종종 C. briggsae 또는 C. remanei 2,6,23,25와 같은 동종 종을 포함하여 다른 유사하게 보이는 선충류가 포함되어 있으며 이는 첫눈에 구별하기가 불가능합니다. 따라서, C. elegans는 프로토콜에 설명 된대로 종 특이 적 프라이머 2,6,7을 사용하는 진단 PCR의 도움으로 가장 확실하게 식별 될 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 예를 들어 표준 NGM 플레이트에서 실험실에서 분리 된 천연 C. elegans의 증식하는 개체군을 확립하는 것이 유용 할 수 있습니다. 천연 C. elegans는 일반적으로 관련 박테리아를 가져 와서 NGM 플레이트에 흘려 박테리아가 일반적으로 자라서 벌레 6,7의 먹이로 사용됩니다. 플레이트에서 C. elegans가 증식하는 동안 관련 미생물의 정확한 구성이 변하지만, 이는 여전히 즉시 특성화 된 천연 선충 샘플 6,7의 구성과 유사하므로 C. elegans 및 관련 미생물 모두의 분리를 허용하는 유용한 절충안입니다.

C. elegans가 성공적으로 확인되면 선충류 또는 관련 기질 샘플을 관련 미생물의 분리 및 특성화에 사용할 수 있습니다. 미생물이 자연에서 C. elegans와 진정으로 연관되도록하려면 프로토콜의 모든 단계에서 오염을 피하는 것이 가장 중요합니다. 현장에서 퇴비와 과일 샘플을 수집하는 것은 멸균 된 재료를 사용하여 연구원이 특별한주의를 기울여 수행해야합니다. 실험실에서의 모든 재료 처리는 높은 수준의 위생과 멸균 된 플라스틱 제품 및 완충액을 보장해야합니다. 오염 위험을 줄이려면 모든 실험실 작업을 미생물 분리 전용으로 사용되는 별도의 실험실에서 수행하는 것이 이상적입니다. 대안으로, 열린 판, 튜브 또는 기타 용기를 사용한 모든 작업은 층류 캐비닛에서 수행해야 합니다. 오염 위험을 평가하려면 적절한 대조 샘플(예: 샘플 없음 또는 웜 없음)을 병렬로 처리해야 합니다. 또한 다양한 배지를 사용하여 성장 요구 사항이 다른 모든 유형의 박테리아를 배양하고 분리 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이전 연구에 따르면 천연 C. elegans 분리 물과 관련된 지금까지 분리 된 모든 박테리아는 NGM 및 TSA 플레이트에서 쉽게 자랍니다. 따라서 이러한 미디어에 집중하는 것으로 충분할 수 있습니다.

분리되고 특성화 된 미생물은 C. elegans의 자연사에 대한 이해를 향상시키는 데 기여할 것입니다. 더 중요한 것은 현재까지 C. elegans가 자연적으로 관련된 미생물에 어떻게 반응하는지, 어떤 분자 과정이 관련되어 있는지, 어떤 기능이 벌레와 미생물 동료의 상호 작용을 매개하는지 잘 이해되지 않았다는 것입니다. 주요 예외 중 하나는 C. elegans와 Comamonas DA 1877 간의 상호 작용에 대한 Walhout 그룹의 포괄적 인 작업입니다. 비타민 B12는 벌레 유전자 발현, 생식력, 수명 및 발달에 영향을 미치는 박테리아가 제공하는 중심 대사 산물임을 밝혔습니다15,16,17. Walhout 그룹은 생식력 및 발달에 대한 비타민 B12 효과가 메티오닌 / S- 아데노 실 메티오닌주기에 달려 있으며 핵 호르몬 수용체 NHR-23 15,16,17과 같은 여러 전사 인자의 영향을 받는다는 것을 입증했습니다. 또한, 박테리아 비타민 B12는 잠재적으로 독성이 있는 단쇄 지방산 프로피오네이트 산의 분해에 기여하며, 이는 비타민 B12가 없을 때 3-하이드록시프로피오네이트16,32의 생산을 통해 대사 네트워크 재배선을 통해 보상될 수 있습니다. 다른 예는 박테리아 티라민이 C. elegans 티라민 β- 하이드 록 실라 제에 의해 옥토 파민으로 전환되는 Sengupta 실험실에서 발견 된 Providencia의 신경 조절 효과로, 이후 특정 감각 뉴런18에서 OCTR-1 옥토 파민 수용체와의 상호 작용을 통해 웜 행동에 영향을 미칩니다. 또 다른 예는 다양한 박테리아, 특히 슈도모나스 속의 박테리아에 의해 제공되는 면역 보호입니다. 이것은 항균 화합물의 생산을 통해 또는 간접적 인 효과, 아마도 특정 숙주 반응 6,11,14의 활성화를 통해 발생합니다. 추가의 미생물 및 특히 자연적으로 연관된 미생물 군집의 사용은 이 모델 선충류의 생물학에 대한 보다 현실적인 이해를 얻는 데 도움이 될 것이다.

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Disclosures

우리는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 독일 과학 재단 (메타 유기체의 기원과 기능에 관한 공동 연구 센터 1182의 프로젝트 A1.1 및 A1.2)의 재정 지원을 인정합니다. Schulenburg 연구소의 조언과 지원에 감사드립니다.

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References

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생물학 문제 186 Caenorhabditis elegans 숙주-미생물 상호 작용 사과 퇴비 Ochrobactrum 슈도모나스 루리 다
모델 선충 <em>Caenorhabditis elegans</em>의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화
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