Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering og karakterisering av den naturlige mikrobiotaen til modellen Nematode Caenorhabditis elegans

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans er en av de viktigste modellartene i biologi, men nesten all forskning utføres i fravær av dens naturlig assosierte mikrober. Metodene beskrevet her vil bidra til å forbedre vår forståelse av mangfoldet av tilknyttede mikrober som grunnlag for fremtidig funksjonell C. elegans forskning.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans samhandler med et stort mangfold av mikroorganismer i naturen. Generelt er C. elegans ofte funnet i råttent plantemateriale, spesielt råtne frukter som epler eller på komposthauger. Det er også forbundet med visse hvirvelløse verter som snegler og woodlice. Disse habitatene er rike på mikrober, som tjener som mat for C. elegans , og som også vedvarende kan kolonisere nematodetarmen. Til dags dato er det nøyaktige mangfoldet og konsistensen til den innfødte C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder ikke fullt ut forstått. Her beskriver vi en passende tilnærming for å isolere C. elegans fra naturen og karakterisere mikrobiota av ormer. Nematoder kan lett isoleres fra kompostmateriale, råtnende epler, snegler eller tiltrekkes ved å plassere epler på komposthauger. Den beste tiden for å finne C. elegans på den nordlige halvkule er fra september til november. Ormer kan vaskes ut av oppsamlet substratmateriale ved å nedsenke substratet i bufferløsning, etterfulgt av innsamling av nematoder og overføring til nematodevekstmedium eller PCR-buffer for etterfølgende analyse. Vi illustrerer videre hvordan prøvene kan brukes til å isolere og rense ormassosierte mikroorganismer og til å behandle ormer for 16S ribosomal RNA-analyse av mikrobiotasamfunnssammensetning. Samlet sett kan de beskrevne metodene stimulere til ny forskning på karakterisering av C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder, og dermed bidra til å oppnå en omfattende forståelse av mangfoldet og stabiliteten til nematodens mikrobiota som grunnlag for fremtidig funksjonell forskning.

Introduction

I naturen finnes C. elegans ofte i råttent plantemateriale, spesielt råtne frukter som epler eller på komposthauger1. Det er også forbundet med visse virvelløse verter som snegler og woodlice 2,3. Disse habitatene er rike på mikrober, som ikke bare tjener som mat til ormen, men kan også danne stabile foreninger med den. Informasjon om mangfoldet av naturlig assosierte mikroorganismer ble først publisert i 2016 4,5,6. Siden da har disse og bare noen få nyere studier vist at C. elegans er assosiert med en rekke bakterier og sopp, oftest inkludert bakterier av slekten Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter og flere andre 6,7,8. Flere tilknyttede bakterier kan stabilt kolonisere ormtarmen, men ikke alle 6,9,10,11,12. De vil sannsynligvis være av sentral betydning for vår forståelse av C. elegans biologi fordi de kan gi ernæring, beskytte mot patogener og muligens andre stressorer, og påvirke sentrale livshistorieegenskaper som reproduktiv hastighet, utvikling eller atferdsrespons.

Som et eksempel kan naturlig assosierte isolater av slektene Pseudomonas, Ochrobactrum, og også Enterobacter eller Gluconobacter beskytte ormen mot patogeninfeksjon og drepe på forskjellige måter 5,6,11,13,14. Et spesifikt isolat av slekten Comamonas påvirker nematode kostholdsrespons, utvikling, levetid og fruktbarhet15,16,17. Providencia-bakterier produserer nevromodulatoren tyramin og derved modulerer vertsnervesystemets aktivitet og resulterende atferdsresponser18. Et sett med forskjellige naturlig assosierte bakterier ble vist å påvirke befolkningsvekst, fruktbarhet og atferdsrespons 5,6,9,11,19.

Til dags dato er det nøyaktige mangfoldet og konsistensen til den innfødte C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder ikke fullt ut forstått, og ytterligere foreninger mellom ormen og mikrober fra miljøet gjenstår å bli avdekket. Flere tidligere studier brukte bakteriestammer isolert fra noe jordmiljø, naturlige C. elegans habitater, eller fra mesokosmeksperimenter (dvs. laboratoriebaserte miljøer som gjenskaper naturlige habitater) med C. elegans laboratoriestammer 4,5,20. Selv om disse studiene fikk ny innsikt i påvirkning av mikrober på spesifikke nematodeegenskaper (f.eks. Nematodemetabolisme21), er relevansen av disse interaksjonene for C. elegans biologi i naturen uklar. Derfor beskriver dette manuskriptet metodene for å direkte isolere C. elegans fra naturen og å isolere og deretter karakterisere de naturlig assosierte mikrober fra både enkeltormer og grupper av ormer. De beskrevne metodene er en oppdatert og forbedret versjon av prosedyrene som tidligere ble brukt for isolering og karakterisering av naturlige C. elegans og dens opprinnelige mikrobiota 2,6,7. Tatt i betraktning at C. elegans er utbredt i nedbrytende plantemateriale over hele verden (spesielt i råtnende frukt, tempererte områder og om høsten)1,2,22,23,24,25, kan denne protokollen brukes av ethvert laboratorium når det er interesse for å relatere C. elegans egenskaper til naturlig assosierte mikrober og dermed en mer naturlig relevant kontekst. Sistnevnte er avgjørende for en full forståelse av nematodens biologi fordi det er kjent fra et mangfold av andre vertssystemer at den tilhørende mikrobiotaen kan påvirke ulike livshistorieegenskaper26, et aspekt som for tiden i stor grad er neglisjert i mangfoldet av C. elegans-studier på tvers av nesten alle livsvitenskapsdisipliner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av buffere og medier

  1. Forbered S-buffer ved å tilsette 5,85 g NaCl, 1,123 g K 2 HPO4, 5,926 g KH2PO4 og 1 L avionisertH2O til en kolbe og autoklav i 20 minutter ved 121 °C.
  2. Forbered et viskøst medium ved å tilsette S-buffer som inneholder 1,2% (w / v) hydroksymetylcellulose (stoffet som forårsaker viskositet i mediet), 5 mg / ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 og 0,1% (v / v) aceton. Autoklav og rør det viskøse mediet til det er helt homogent.
    MERK: Dette kan ta flere timer. S-buffer kan også fremstilles direkte og tilsettes det viskøse mediet uten forutgående sterilisering.
  3. Forbered M9-buffer ved å tilsette 3 g KH 2 PO 4, 6 g NA 2 HPO4 ·2 H2O, 5 g NaCl og1 L avionisertH2O til en 1 L kolbe. Autoklav løsningen, og etter avkjøling, tilsett 1 ml 1 M MgSO 4 (123,24 g MgSO4 · 7H 2 O i 500 ml avionisert H2O,filter sterilisert).
  4. Forbered 10 % (v/v) Triton X-100 stamløsning ved å blande 5 ml Triton X-100 med 45 ml M9-buffer. Filtersteriliser løsningen ved hjelp av et 0,2 μm filter.
  5. Forbered M9-buffer med Triton X-100 (M9-T) ved å legge til 2,5 ml av 10% (v / v) Triton X-100 lagerløsning til 1 L M9-buffer etter autoklavering for å oppnå 0,025% (v / v) M9-T.
  6. Forbered 30% (v / v) glyserol i S-buffer ved å blande 15 ml steril 100% glyserol og 35 ml steril S-buffer i et 50 ml rør.

2. Klargjøring av miljøprøver (figur 1)

  1. Samle miljøprøver som kompost eller råtne frukter og plasser hver prøve i en individuell plastpose, rør eller annen ren beholder.
    MERK: For å tiltrekke seg nematoder, kan epler plasseres på kompost flere uker før prøvetakingen.
  2. Fordel deler av miljøprøven jevnt i en tom, steril 9 cm petriskål.
    MERK: Prøver med høyere nivåer av forfall er mer sannsynlig å inneholde C. elegans. Eventuelt kan en petriskål fylt med peptonfritt agarmedium (PFM) brukes til å øke kontrasten.
  3. Dekk prøven forsiktig med ca. 20 ml sterilt tyktflytende medium.
    MERK: Nematoder flyter til overflaten innen 1-2 timer. Det viskøse mediet bremser ormens bevegelse og gjør det lettere å prøve dem. Steril M9-buffer kan brukes som et alternativ, men ormbevegelsen vil være raskere.

Figure 1
Figur 1: Isolering av nematoder fra substrater. Substratprøver plasseres i tomme petriskåler og dekkes med tyktflytende medium for å skylle ut nematoder. Nematoder overføres til M9-T og vaskes gjentatte ganger for å fjerne bakterier fra utsiden. Individuelle nematoder kan brukes til DNA-isolasjon, isolering av tilknyttede bakterier, eller plasseres på agarplater til kulturormpopulasjoner. Figur opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Isolering av Caenorhabditis nematoder (figur 1)

  1. Søk etter Caenorhabditis nematoder ved hjelp av et dissekeringsmikroskop, etter retningslinjene presentert i WormBook-kapittelet om isolering av C. elegans og relaterte nematoder av Barrière og Félix27.
    MERK: Caenorhabditis hermafroditter / kvinner har en tarm av lysebrun farge (under overført belysning). Dessuten har tarmcellene store cellekjerner, som er synlige som hvite prikker. I motsetning til dette har andre nematodearter ofte en mørk brun tarm og kan vise anteroposterior asymmetri i pigmentintensitet og vanligvis ingen synlige kjerner. Vulva hos voksne Caenorhabditis hermafroditter/hunner finnes midt i dyret. Denne vulvalokaliseringen vises ikke alltid av andre nematode taxa. Caenorhabditis nematoder har to pharyngeal pærer, som begge er synlige med tilstrekkelig forstørrelse og overført belysning og kontrast med mange andre nematode taxa. Caenorhabditis nematoder har en spiss hale, mens noen andre nematoder har en rund hale.
  2. Samle Caenorhabditis nematoder under et dissekeringsmikroskop i så lite væske som mulig ved hjelp av en 20-100 μL pipette. Overfør de oppsamlede nematodene direkte til 1-3 ml steril M9-T i en steril 3 cm petriskål for å vaske ormene for å fjerne ikke-festede mikrober (trinn 3.3) eller alternativt overføre individuelle ormer på en tallerken med nematodevekstmedium (NGM) for å etablere en ormpopulasjon (trinn 3.4).
  3. Vask nematodene for å fjerne mikrober fra utsiden av nematoden.
    MERK: Denne protokollen beriker for tarmbakterier, men eliminerer ikke bakterier som stikker til ormekutikulaen.
    1. Inkuber nematodene i 10-15 minutter i M9-T.
    2. Pipetter nematodene i så lite væske som mulig til 1-3 ml fersk M9-T i en ny steril 3 cm petriskål.
    3. Gjenta inkubasjonen og overfør nematodene til fersk M9-T to ganger til.
      MERK: Følgende trinn kan gjøres enten med individuelle ormer eller med ormpopulasjoner. Ormene kan nå brukes til karakterisering av C. elegans og tilhørende mikrober, samt isolering av bakterier (trinn 4 og 5). Alternativt kan de overføres individuelt til NGM-plater for å etablere en ormpopulasjon (trinn 3.4).
  4. For å oppnå en ormpopulasjon, pipetter en individuell nematode til en NGM-plate.
    MERK: Bare hermafrodittiske nematoder som C. elegans eller C . briggsae er i stand til å produsere avkom fra enkeltormer. Imidlertid kan enkelte ormer av andre arter fortsatt produsere avkom hvis de allerede var parret.
    1. Naturlig isolerte nematoder inneholder vanligvis bakterier i tarmen, som de kaster på NGM-platene, hvor disse bakteriene vokser og er tilgjengelige som mat for C. elegans. Ikke legg til separate matorganismer som standard laboratoriematorganisme, E. coli-stamme OP50.
      MERK: Oppdrett av ormer på plater påvirker sammensetningen av det tilknyttede bakterielle samfunnet, men sammensetningen er fortsatt sammenlignbar med den naturlige C. elegans isolerer 6,7.
    2. La nematodene spre seg i opptil 10 dager ved riktig temperatur (f.eks. 15-20 ° C for tempererte steder). Frys disse nematodene (trinn 3.5) eller bruk dem til karakterisering av C. elegans og tilhørende mikrober samt isolering av mikrober (trinn 4 og 5).
  5. Frysing av nematoder for langvarig lagring
    1. La nematodene ligge på tallerkener til matbakteriene har forsvunnet, og det er hovedsakelig små larvestadier på platene. Vask ormene av platene i 1,5 ml S-buffer.
    2. Bland 500 μL ormholdig S-buffer grundig med 500 μL 30% (v / v) glyserol i S-buffer i et sterilt 2 ml rør. Frys rørene omgående ved -80 °C for langtidsoppbevaring, ellers kan glyserol skade nematodene.

4. Forberedelse av ormene for molekylær identifisering av C. elegans og mikrober

  1. For objektiv identifisering av nematodeassosierte mikrober, lag en 96-brønnplate med tre sterile 1 mm perler, 19,5 μL PCR-buffer og 0,5 μL proteinase K (20 mg / ml) per brønn. Pipette en person, vasket nematode til hver brønn, og overfør så lite væske som mulig.
  2. Ormepopulasjoner kan også brukes. For dette, vask ormene fra platene med M9-buffer og overfør ~ 300 μL ormholdig M9-buffer til 2 ml rør med 10-15 perler.
  3. Bryt opp nematodene ved hjelp av en perlehomogenisator (f.eks. Perleslag i 3 minutter ved 30 Hz). Sentrifuge platen eller rørene kort for å få væsken til bunnen (f.eks. i 10 s ved 8000 x g ved romtemperatur [RT]).
  4. Identifisering av C. elegans
    1. Isoler DNA fra individuelle nematoder ved å varme opp prøvene i en PCR-syklus i 1 time ved 50 ° C og 15 minutter ved 95 ° C. Isoler DNA fra ormpopulasjoner ved hjelp av en hvilken som helst isolasjonsmetode du velger (eksempelprotokoller for forskjellige isolasjonsmetoder ved bruk av kommersielle sett 7,9). Frys ned DNA-et ved -20 °C for langtidslagring.
    2. For identifisering av C. elegans, bruk DNA og primerparet nlp30-F (tabell 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') og nlp30-R (tabell 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') i en PCR, etter instruksjonene fra en Taq-leverandør.
    3. Bruk følgende PCR-betingelser: innledende denatureringstrinn ved 95 °C i 2 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på 95 °C i 45 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 1 min, og et siste forlengelsestrinn ved 72 °C i 5 min. C. elegans produserer et 154 bp PCR-produkt.
  5. Karakteriser de nematodassosierte bakteriene via 16S amplikonsekvensering av V3-V4-regionen, ved hjelp av det isolerte DNA.
    1. Forbered et 16S-bibliotek med de 16S-primerne du velger, og følg bibliotekets forberedelsessettprotokoll. Et alternativ er å bruke primerne 341F (tabell 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') og 806R (tabell 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') som dekker V3-V4-regionen i 16S rRNA-genet, noe som resulterer i sekvenser som kan klassifiseres med standarddatabaser med god oppløsning7.
      MERK: Mengden inndata-DNA er kritisk i dette trinnet. DNA ervervet fra enkle ormer kommer til å være mye mindre enn det som er oppnådd fra ormpopulasjoner. For enkeltormer kan det være nødvendig å øke mengden inndata-DNA eller å øke mengden PCR-sykluser7.
    2. Biblioteker kan sekvenseres på en sekvenseringsplattform ved hjelp av et passende sekvenseringssett.
      MERK: Her brukes MiSeq-plattformen med et passende MiSeq Reagent Kit. Reagensene forbedres kontinuerlig og bør velges til de nyeste standardene.

5. Isolering og dyrking av nematodeassosierte bakterier (figur 2)

  1. For å isolere bakterier, lag en 96-brønnplate med tre sterile 1 mm perler, 20 μL M9-buffer per brønn, og pipetter en person, vasket nematode til hver brønn, og overfør så lite væske som mulig.
    MERK: Alternativt kan ormpopulasjoner vaskes fra platene med M9-buffer og ~ 300 μL ormholdig M9-buffer kan overføres til 2 ml rør med 10-15 perler. I alle tilfeller bør ormene komme fra en kultur som ble identifisert til å være C. elegans ved hjelp av trinn 4.1-4.4.
  2. Bryt opp nematodene ved hjelp av en perlehomogenisator (f.eks. Perleslag i 3 minutter ved 30 Hz). Sentrifuge platen eller rørene kort for å få væsken til bunnen (f.eks. i 10 s ved 8000 x g ved RT).
    MERK: Bruken av denne metoden førte til isolering av bakteriell taxa som ligner de som ble avslørt av 16S rDNA amplicon-sekvensering7, noe som tyder på at de beskrevne perle-slo etterlater de fleste bakterieceller intakte.
  3. Samle supernatanten, fortynn den serielt ved 1:10, og plate opp til 100 μL på 9 cm agarplater.
    1. For å sikre at de fleste bakterier kan dyrkes, bruk en rekke alternative medier med forskjellige næringssammensetninger, inkludert fortynnet trypticase soya agar (TSA, 1:10 fortynning), MacConkey agar, Sabouraud glukose agar, potet dextrose agar, eller gjær pepton dextrose agar.
  4. Inkuber platene ved gjennomsnittstemperaturforholdene på prøvetakingsstedet (f.eks. temperaturer mellom 15-20 °C for tempererte steder) i 24-48 timer.
  5. Bruk standard trestreksteknikk og en steril løkke for å oppnå rene bakteriekulturer (figur 2).
    1. Plukk en enkelt koloni fra en tallerken ved hjelp av en steril løkke eller tannpirker og strek den ut på en ny agarplate som inneholder samme agarmedium som brukes til rensing. Pass på at du bare bruker omtrent 1/3 av platen.
    2. Bruk enten en ny steril løkke eller steriliser en gjenbrukbar løkke og dra den gjennom den første stripen for å lage en andre strek på en annen 1/3 av samme plate.
    3. Gjenta dette trinnet ved å dra en steril løkke gjennom den andre streken.
    4. Inkuber platen ved de samme vekstforholdene som brukes til isolasjon. Denne teknikken må resultere i at enkeltkolonier vokser i området med den tredje streken.
      MERK: Det kan være nødvendig å gjenta rensetrinnet flere ganger, da naturlige isolater har en tendens til å danne biofilmer og / eller aggregater.
  6. Dyrk de rene koloniene i et flytende medium (av samme type som agarmediet) ved å bruke samme temperatur og veksttid som ovenfor (trinn 5.4)
  7. Forbered bakterielagre ved å tilsette 300 μL av bakteriekulturen til 200 μL 86% (v / v) glyserol (i det respektive vekstmediet, f.eks. TSB) og pipette opp og ned for å blande riktig. Alternativt kan du forberede DMSO-lagre ved å blande 50 μL bakteriekultur med 50 μL 7% (v / v) DMSO. Frys ved -80 °C for langtidslagring.
  8. Karakterisering av bakterier ved hjelp av sekvensering av hele 16S ribosomale RNA-genet
    1. Trekk ut bakterie-DNA fra rene flytende kulturer ved hjelp av en egnet teknikk (f.eks. Et DNA-ekstraksjonssett; av erfaring fungerer en CTAB-basert ekstraksjonsprotokoll veldig bra22).
    2. Forsterk 16S rRNA-genet ved hjelp av primerne 27F (tabell 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') og 1495R (tabell 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 og følgende PCR-tilstander: 95 °C, 2 min, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s), og en siste forlengelsesperiode ved 72 °C, 5 min.
    3. For å oppnå de fullstendige sekvensene, bruk i tillegg to interne sekvenseringsprimere, for eksempel 701F (tabell 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') og 785R (tabell 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.

Figure 2
Figur 2: Artsidentifisering og isolering av enkeltbakterier. Individuelle nematoder brytes opp ved hjelp av en perlehomogenisator, og DNA isoleres for artsbestemmelse via PCR eller sekvensering. Alternativt blir det oppbrutte nematodematerialet serielt fortynnet og belagt på vekstmediumplater. Plater inkuberes til bakteriekolonier vises, og enkeltkolonier er stripet til nye plater for å oppnå rene kulturer. Enkeltkolonier av de rene kulturene brukes til å dyrke flytende bakteriekulturer for fremstilling av bakterielagre for langtidslagring ved -80 °C. Figur opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nematoden C. elegans finnes ofte i nedbrytende frukt, som epler, og også kompostprøver. I Nord-Tyskland finnes C. elegans samt congeneric arter (spesielt C. remanei, men også C. briggsae) hovedsakelig fra september til2. november. Nematoder er oftest funnet i nedbrytende plantemateriale, spesielt råtnende frukter som epler eller pærer, og også kompost, spesielt materiale som viser en høy grad av nedbrytning. Frukt- og kompostprøvene kan tas inn i laboratoriet (figur 3A, B), distribueres i petriskåler (figur 3C, D), og deretter nedsenkes i et flytende eller tyktflytende medium for å tvinge ormene til å forlate substratmaterialet og svømme til mediets overflate (figur 3E, F). Deretter kan ormene samles, overføres til agarplater eller mikrosentrifugerør, og artsidentiteten bestemmes ved hjelp av diagnostiske PCR 2,6,7,22.

Figure 3
Figur 3: Tilberedning av epler for isolering av nematoder. (A,B) Nematoder kan isoleres fra miljøprøver som kompost eller råtne frukter og i tillegg tiltrekkes ved å plassere epler på kompost. (C,D) Prøvene er delt, og små biter er plassert i en petriskål. (E,F) Viskøs medium tilsettes prøvene, noe som vanligvis fører til at nematoder forlater substratmaterialet og svømmer til overflaten av mediet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

PCR ved bruk av C. elegans-spesifikke primere nlp30-F og nlp30-R resulterer i et PCR-produkt på 154 bp lengde for C. elegans og ikke noe produkt for andre nematoder (figur 4). For å bekrefte den vellykkede ytelsen til PCR, bør DNA fra en laboratoriestamme som N2 kjøres som positiv kontroll samtidig med DNA fra de isolerte nematodene. Små mengder biologisk materiale, som små larvestadier, kan gi svake PCR-bånd (figur 4A). Synligheten av PCR-båndene kan forbedres ved å bruke mer DNA i PCR (merk at dette vil minimere mengden DNA som er igjen for bakteriell 16S rDNA amplikonsekvensering, f.eks. 2 μL DNA i stedet for 1 μL), ved å påføre en større mengde PCR-produkt på gelen (f.eks. 10-15 μL), eller ved å øke antall PCR-sykluser. I forhold til enkeltormer gir ormpopulasjoner bestående av minst 50 ormer vanligvis en større mengde DNA, og båndene i elektroforesegelen er tydelig synlige (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: PCR-produkt av C. elegans-spesifikk PCR. (A,B) De C. elegans-spesifikke primerne nlp30-F og nlp30-R produserer et PCR-produkt med en lengde på 154 bp. Som et eksempel ble PCR utført på (A) enkeltormer og (B) ormpopulasjoner (f.eks. 300-500 individer), alle isolert med den beskrevne protokollen fra råtnende plantemateriale fra komposten til Botanisk hage i Kiel, Tyskland. (A) DNA fra enkeltormer og spesielt av små larvestadier resulterer ofte i svake PCR-bånd. (B) DNA isolert fra ormpopulasjoner (f.eks. 300-500 individer) resulterer i klarere bånd. DNA fra C. elegans N2 ble brukt som positiv kontroll (+), ingen mal ble brukt som negativ kontroll (-). Smørene under PCR-båndene er gelartefakter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mikrobene, som er assosiert med C. elegans, kan isoleres fra ormer og også de ormholdige substratprøvene. Mikrobeisolasjon følger generelle mikrobiologistandarder, inkludert isolering av rene kulturer fra agarplater, deres vekst i flytende medier og deres påfølgende karakterisering (f.eks. Ved bruk av sekvensene av 16S ribosomalt RNA-gen for bakterier). Det er kritisk at mikrobene isoleres som rene enkeltkolonier fra plater, ved hjelp av standard mikrobiologiske prosedyrer (figur 5). Dette er viktig fordi noen av de C. elegans-assosierte bakteriene kan danne biofilmer og / eller lett aggregere, noe som resulterer i flerartskulturer (figur 5C, D). Renheten til de isolerte bakteriekulturene kan bekreftes gjennom sekvensene av 16S rRNA-genet, som gjort for tidligere isolerte C. elegans-assosierte mikrober 6,7. De oppnådde mikrober kan senere brukes i eksperimenter med C. elegans.

Figure 5
Figur 5: Bakterieisolat på agarplater. Individuelle bakterieisolater stripes ut på agarplater, i dette tilfellet tryptiske soyaagar (TSA) plater, og viser som eksempler et isolat av (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens, og et eksempel med flere bakteriearter, vist som en (C) oversikt over hele platen og (D) forstørrelse av en del av denne platen, der forskjellige kolonityper er synlige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Liste over primere brukt i denne studien Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nematoden Caenorhabditis elegans er en av de mest intensivt studerte modellorganismene i biologisk forskning. Det ble introdusert av Sydney Brenner på 1960-tallet, opprinnelig for å forstå utviklingen og funksjonen til nervesystemet29. Siden da har C. elegans blitt en kraftig modell for å studere grunnleggende prosesser på tvers av alle biologiske disipliner, inkludert atferdsbiologi, nevrobiologi, aldring, evolusjonær biologi, cellebiologi, utviklingsbiologi og immunologi. Suksessen er basert på en unik kombinasjon av fordelaktige egenskaper, inkludert en kort generasjonstid på ca. 3 dager, enkel dyrking, gjennomsiktig kropp (tillater effektiv fenotyping), overlevelse av frysing, effektiv sterilisering og utviklingssynkronisering, og også effektive metoder for genetisk manipulasjon ved mutagenese, CRISPR-Cas eller RNAi. I dag studeres C. elegans i omtrent 1,500 laboratorier over hele verden. Da Sydney Brenner først etablerte C. elegans som et modellsystem i laboratoriet, dyrket han bakterivorenatoden på den gramnegative bakterien Escherichia coli OP50 som matkilde. Helt siden den gang har C. elegans blitt opprettholdt i monoxenisk kultur på E. coli OP50 i laboratorier over hele verden29. Videre er C. elegans-populasjoner vanligvis synkronisert eller de-forurenset av en blekeprosedyre som bare overlates av sterile egg og ingen tilhørende mikrobe. Det er dermed lett å generere sterile dyr som deretter kan bli utsatt for individuelle bakterier under svært kontrollerte forhold. Imidlertid, som et resultat av disse standardiserte C. elegans laboratorievedlikeholdsprotokollene, ble nesten alle studier på C. elegans biologi gjort i fravær av dets naturlig assosierte bakterier. Faktisk ble informasjon om mangfoldet av naturlig assosierte mikroorganismer først publisert i 2016 4,5,6, og det eksakte mangfoldet av tilknyttede mikrober er fortsatt ikke fullt utforsket.

De beskrevne metodene vil bidra til å ytterligere karakterisere mangfoldet av mikrober som er forbundet med C. elegans i naturen. Disse mikrobene er sannsynligvis viktige determinanter for nematodens livshistorie og bør derfor være en viktig ressurs for fremtidig arbeid med denne ormen. De beskrevne metodene er en oppdatert versjon av de eneste tidligere publiserte metodene for å isolere mikrober fra naturlige C. elegans-prøver samlet direkte fra feltet 6,7. Protokollen utnytter det faktum at C. elegans bor i nedbrytende plantemateriale i naturen. Slike råtnende materialer er rike på mikrober, som tjener som mat for C. elegans og vil sannsynligvis oppfylle andre funksjoner, for eksempel immunforsvar (dvs. beskyttelse mot patogener)5,6,11,13,14. Det første viktige trinnet er dermed å skaffe egnede substrater for ormeisolering. Egnethet kan avhenge av tidspunktet på året; i Nord-Tyskland finnes C. elegans hovedsakelig fra september til2. november. Dette er tiden da frukt som epler eller pærer blir tilgjengelige og begynner å råtne på bakken. Den nøyaktige tiden vil sannsynligvis variere mellom geografiske regioner23,24,25,30. Ethvert plantemateriale ser ut til å være egnet for C. elegans, så lenge det viser en høy grad av nedbrytning og dermed bærer et rikt mikrobielt samfunn - bortsett fra materiale dominert av sopp, som ofte er patogene for C. elegans1. Videre er C. elegans vanligvis spesielt vanlig når generell fuktighet ikke er for lav2. Til dags dato mangler systematisk informasjon om Caenorhabditis nematoder varierer i overflod i plantemateriale fra industrielt versus økologisk landbruk eller overflate versus dypere lag av detritus eller avhengighet av regn eller ikke.

Når prøvene er samlet inn og overført til laboratoriet, må ormer "lokkes" ut av underlagene. Dette har blitt oppnådd med et par forskjellige tilnærminger, for eksempel ved ormekstraksjon gjennom Baermann-trakter31 eller plassering av prøver på en agarplate som inneholder E. coli-laboratoriematen som et attraktivt middel i midten27. Etter vår erfaring er protokollen beskrevet her generelt raskere og mer effektiv. Det er basert på ideen om at substratprøvene er nedsenket i en flytende eller viskøs løsning, som effektivt tvinger ormene ut av underlaget og opp til overflaten av væsken, hvorfra de lett kan samles opp. Viskositeten til mediet er ikke absolutt nødvendig, men det bremser ormens bevegelse og kan dermed gjøre det lettere å samle dem. Den effektive samlingen av ormer blir lettere når væsken tilsettes forsiktig til substratet, og unngår dermed oppløseliggjøring av eventuelle humøse stoffer, noe som kan mørke væsken og kan gjøre det vanskelig å se nematodene.

Den neste utfordringen er å identifisere C. elegans. Noen morfologiske trekk kan bidra til å skille Caneorhabditis ormer fra andre nematoder27, men er utilstrekkelige for presis artsidentifikasjon. Råtnende plantemateriale inneholder ofte andre lignende utseende nematoder, inkludert congeneric arter, som C. briggsae eller C. remanei 2,6,23,25, som er umulige å skille ved første øyekast. Derfor kan C. elegans best og mest pålitelig identifiseres ved hjelp av diagnostisk PCR ved hjelp av artsspesifikke primere 2,6,7, som beskrevet i protokollen. I denne sammenheng kan det være nyttig å etablere en voksende populasjon av de isolerte naturlige C. elegans i laboratoriet, for eksempel på standard NGM-plater. De naturlige C. elegans bringer vanligvis med seg tilknyttede bakterier, som kastes på NGM-platene, hvor bakteriene vanligvis vokser, og tjener deretter som mat til ormene 6,7. Selv om den nøyaktige sammensetningen av de tilknyttede mikrober endres under C. elegans spredning på plater, er den fortsatt sammenlignbar med den for umiddelbart karakteriserte naturlige nematodeprøver6,7, og er dermed et nyttig kompromiss som tillater isolering av både C. elegans og tilhørende mikrober.

Når C. elegans er vellykket identifisert, kan nematodene eller de tilhørende substratprøvene brukes til isolering og karakterisering av de tilknyttede mikrober. For å sikre at mikrobene virkelig er forbundet med C. elegans i naturen, er det av største betydning å unngå forurensninger på tvers av alle trinnene i protokollene. Innsamling av kompost- og fruktprøver i felt bør gjøres med særlig forsiktighet av forskeren, ved bruk av sterilisert materiale. All behandling av materiale i laboratoriet må sikre et høyt hygienenivå og igjen sterilisert plastvare og buffere. For å redusere forurensningsrisikoen bør alt laboratoriearbeid ideelt sett utføres i et eget laboratorierom, som utelukkende er dedikert til isolering av mikrober. Som et alternativ bør alt arbeid med åpne plater, rør eller andre beholdere gjøres i et laminært strømningsskap. For å vurdere forurensningsrisikoen bør egnede kontrollprøver (f.eks. uten prøver eller uten ormer) behandles parallelt. Videre kan en rekke forskjellige medier brukes for å sikre at alle forskjellige typer bakterier med deres forskjellige vekstbehov kan dyrkes og isoleres. Likevel indikerte tidligere arbeid at alle hittil isolerte bakterier, som er forbundet med naturlige C. elegans-isolater , lett vokser på NGM- og TSA-plater. Dermed kan det være tilstrekkelig å fokusere på disse mediene.

De isolerte og karakteriserte mikrobene vil bidra til en bedre forståelse av naturhistorien til C. elegans. Enda viktigere, til dags dato, er det ikke godt forstått hvordan C. elegans reagerer på sine naturlig assosierte mikrober, hvilke molekylære prosesser som er involvert, og hvilke funksjoner som formidler ormens interaksjon med dens mikrobielle medarbeidere. Et av de viktigste unntakene er Walhout-gruppens omfattende arbeid om samspillet mellom C. elegans og Comamonas DA 1877. Det avslørte vitamin B12 som en sentral metabolitt levert av bakterien, som påvirker ormgenuttrykk, fruktbarhet, levetid og utvikling15,16,17. Walhout-gruppen viste videre at vitamin B12-effekten på fruktbarhet og utvikling avhenger av metionin / S-adenosylmetioninsyklusen og påvirkes av flere transkripsjonsfaktorer, for eksempel nukleærhormonreseptoren NHR-2315,16,17. Videre bidrar bakteriell vitamin B12 til nedbrytningen av den potensielt giftige kortkjedede fettsyrepropionatsyren, som i fravær av vitamin B12 kan kompenseres gjennom metabolsk nettverkstilkobling, tilsynelatende gjennom produksjon av 3-hydroksypropionat16,32. Et annet eksempel er den nevromodulerende effekten av Providencia, oppdaget av Sengupta-laboratoriet, hvor bakteriell tyramin omdannes av C. elegans tyramin β-hydroksylase til oktopamin, som senere påvirker ormadferd gjennom samspillet med OCTR-1 oktopaminreseptoren i spesifikke sensoriske nevroner18. Enda et eksempel er immunforsvar, som er gitt av ulike bakterier, spesielt de av slekten Pseudomonas. Dette skjer enten ved produksjon av antimikrobielle forbindelser eller gjennom en indirekte effekt, muligens via aktivering av spesifikke vertsresponser 6,11,14. Ytterligere mikrober og spesielt bruk av naturlig assosierte mikrobielle samfunn vil bidra til å oppnå en mer realistisk forståelse av biologien til denne modellnematoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi erklærer at vi ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi anerkjenner økonomisk støtte fra German Science Foundation (prosjekter A1.1 og A1.2 fra Collaborative Research Center 1182 om metaorganismers opprinnelse og funksjon). Vi takker medlemmene av Schulenburg-laboratoriet for deres råd og støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schulenburg, H., Félix, M. -A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  2. Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
  3. Petersen, C., et al. Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
  4. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  5. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  6. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  7. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  8. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  9. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  10. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
  11. Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
  12. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  13. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  14. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  15. Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
  16. Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
  17. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  18. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  19. Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
  20. Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
  21. Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
  22. Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
  23. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
  24. Barrière, A., Félix, M. -A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
  25. Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
  26. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
  27. Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).
  28. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  29. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  30. Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
  31. Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
  32. Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).

Tags

Biologi utgave 186 Caenorhabditis elegans vert-mikrobiota interaksjoner eple kompost Ochrobactrum Pseudomonas lurida
Isolering og karakterisering av den naturlige mikrobiotaen til modellen Nematode <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, C., Dierking, K., Johnke,… More

Petersen, C., Dierking, K., Johnke, J., Schulenburg, H. Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (186), e64249, doi:10.3791/64249 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter