Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans , biyolojideki ana model türlerden biridir, ancak neredeyse tüm araştırmalar doğal olarak ilişkili mikroplarının yokluğunda gerçekleştirilir. Burada açıklanan yöntemler, gelecekteki fonksiyonel C. elegans araştırmalarının temeli olarak ilişkili mikropların çeşitliliği hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Abstract

Nematod Caenorhabditis elegans, doğada çok çeşitli mikroorganizmalarla etkileşime girer. Genel olarak, C. elegans genellikle çürümüş bitki maddesinde, özellikle elma gibi çürümüş meyvelerde veya kompost yığınlarında bulunur. Ayrıca sümüklü böcek ve woodlice gibi bazı omurgasız konakçılarla da ilişkilidir. Bu habitatlar, C. elegans için yiyecek görevi gören ve aynı zamanda nematod bağırsağını ısrarla kolonize edebilen mikroplar bakımından zengindir. Bugüne kadar, yerli C. elegans mikrobiyotasının habitatlar ve coğrafi konumlar arasındaki tam çeşitliliği ve tutarlılığı tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, C. elegans'ı doğadan izole etmek ve solucanların mikrobiyotasını karakterize etmek için uygun bir yaklaşım açıklıyoruz. Nematodlar kompost malzemesinden, çürüyen elmalardan, sümüklü böceklerden kolayca izole edilebilir veya elmaları kompost yığınlarına yerleştirerek çekilebilir. Kuzey Yarımküre'de C. elegans'ı bulmak için en uygun zaman eylül ayından kasım ayına kadardır. Solucanlar, substratı tampon çözeltisine batırarak toplanan substrat malzemesinden yıkanabilir, ardından nematodların toplanması ve sonraki analizler için nematod büyüme ortamına veya PCR tamponuna aktarılması ile takip edilebilir. Ayrıca, örneklerin solucanla ilişkili mikroorganizmaları izole etmek ve saflaştırmak ve mikrobiyota topluluğu kompozisyonunun 16S ribozomal RNA analizi için solucanları işlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Genel olarak, açıklanan yöntemler, C. elegans mikrobiyotasının habitatlar ve coğrafi konumlar arasında karakterizasyonu üzerine yeni araştırmaları teşvik edebilir, böylece gelecekteki fonksiyonel araştırmalar için bir temel olarak nematodun mikrobiyotasının çeşitliliği ve stabilitesi hakkında kapsamlı bir anlayış elde edilmesine yardımcı olabilir.

Introduction

Doğada, C. elegans genellikle çürümüş bitki maddesinde, özellikle elma gibi çürümüş meyvelerde veya kompost yığınlarındabulunur 1. Ayrıca sümüklü böcek ve woodlice 2,3 gibi bazı omurgasız konakçılarla da ilişkilidir. Bu habitatlar, sadece solucan için yiyecek olarak hizmet etmekle kalmayıp, aynı zamanda onunla istikrarlı ilişkiler kurabilen mikroplar bakımından zengindir. Doğal olarak ilişkili mikroorganizmaların çeşitliliği ile ilgili bilgiler sadece 2016 yılında yayınlanmıştır 4,5,6. O zamandan beri, bu ve sadece birkaç yeni çalışma, C. elegans'ın, en yaygın olarak Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter ve diğerleri 6,7,8 cinsinin bakterilerini içeren çeşitli bakteri ve mantarlarla ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Birkaç ilişkili bakteri,solucan bağırsağını istikrarlı bir şekilde kolonize edebilir, ancak hepsi 6,9,10,11,12 değildir. C. elegans biyolojisini anlamamız için kilit öneme sahip olmaları muhtemeldir, çünkü beslenme sağlayabilir, patojenlere ve muhtemelen diğer stresörlere karşı koruyabilir ve üreme hızı, gelişim veya davranışsal tepkiler gibi merkezi yaşam öyküsü özelliklerini etkileyebilirler.

Örnek olarak, Pseudomonas, Ochrobactrum ve ayrıca Enterobacter veya Gluconobacter cinslerinin doğal olarak ilişkili izolatları, solucanı patojen enfeksiyonundan koruyabilir ve 5,6,11,13,14 farklı şekillerde öldürebilir. Comamonas cinsinin spesifik bir izolatı nematod diyet tepkisini, gelişimini, ömrünü ve doğurganlığı etkiler15,16,17. Providencia bakterileri nöromodülatör tiramin üretir ve böylece konakçı sinir sistemi aktivitesini ve bunun sonucunda ortaya çıkan davranışsal tepkileri modüle eder18. Doğal olarak ilişkili bir dizi farklı bakterinin nüfus artış hızını, doğurganlığı ve davranışsal tepkileri etkilediği gösterilmiştir 5,6,9,11,19.

Bugüne kadar, yerli C. elegans mikrobiyotasının habitatlar ve coğrafi konumlar arasındaki tam çeşitliliği ve tutarlılığı tam olarak anlaşılamamıştır ve solucan ile çevresinden mikroplar arasındaki diğer ilişkiler ortaya çıkarılmaya devam etmektedir. Önceki birkaç çalışmada, bazı toprak ortamlarından, doğal C. elegans habitatlarından veya mezokozmos deneylerinden (yani, doğal yaşam alanlarını yeniden yaratan laboratuvar tabanlı ortamlar) izole edilen bakteri suşları C. elegans laboratuvar suşları 4,5,20 ile kullanılmıştır. Bu çalışmalar, mikropların spesifik nematod özellikleri (örneğin, nematod metabolizması21) üzerindeki etkisine dair yeni bilgiler edinmiş olsa da, bu etkileşimlerin C. elegans biyolojisi ile doğadaki ilgisi belirsizdir. Bu nedenle, bu el yazması C. elegans'ı doğadan doğrudan izole etme ve doğal olarak ilişkili mikropları hem tek solucanlardan hem de solucan gruplarından izole etme ve daha sonra karakterize etme yöntemlerini açıklamaktadır. Açıklanan yöntemler, daha önce doğal C. elegans ve doğal mikrobiyotası 2,6,7'nin izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılan prosedürlerin güncellenmiş ve geliştirilmiş bir versiyonudur. C. elegans'ın dünya çapında bitki maddesinin ayrışmasında yaygın olarak bulunduğu göz önüne alındığında (özellikle çürüyen meyvelerde, ılıman bölgelerde ve sonbaharda)1,2,22,23,24,25, bu protokol, C. elegans ile ilgili ilgiye ilgi duyulduğunda herhangi bir laboratuvar tarafından uygulanabilir. doğal olarak ilişkili mikroplara ve dolayısıyla daha doğal olarak alakalı bir bağlama sahip olma özellikleri. İkincisi, nematodun biyolojisinin tam olarak anlaşılması için çok önemlidir, çünkü diğer konakçı sistemlerin çeşitliliğinden, ilişkili mikrobiyotanın çeşitli yaşam tarihi özelliklerini etkileyebileceği bilinmektedir26, şu anda neredeyse tüm yaşam bilimleri disiplinlerinde çok sayıda C. elegans çalışmasında büyük ölçüde ihmal edilen bir yön.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tamponların ve ortamların hazırlanması

  1. 121 ° C'de 20 dakika boyunca bir şişeye ve otoklavlara 5,85 g NaCl, 1,123g K2HPO 4, 5,926 g KH 2 PO4 ve 1 L deiyonize H2O ekleyerek S-tamponunu hazırlayın.
  2. % 1.2 (w / v) hidroksimetilselüloz (ortamın viskozitesine neden olan madde), 5 mg / mL kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 ve% 0.1 (v / v) aseton içeren S-tamponu ekleyerek viskoz bir ortam hazırlayın. Otoklav yapın ve viskoz ortamı tamamen homojen olana kadar karıştırın.
    NOT: Bu işlem birkaç saat sürebilir. Ayrıca, S-tamponu önceden sterilizasyon yapılmadan doğrudan hazırlanabilir ve viskoz ortama eklenebilir.
  3. 1 L şişeye 3 g KH 2 PO 4, 6 g NA 2 HPO4 · 2 H2O, 5 g NaCl ve 1 L deiyonize H2O ekleyerek M9 tamponunu hazırlayın. Çözeltiyi otoklav edin ve soğuduktan sonra, 1 mL'lik 1 M MgSO 4 ekleyin (500 mL deiyonize H2 O'da123.24g MgSO4 · 7H2O, filtre sterilize).
  4. 5 mL Triton X-100'ü 45 mL M9 tamponuyla karıştırarak %10 (v/v) Triton X-100 stok çözeltisi hazırlayın. 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak çözeltiyi filtreleyerek sterilize edin.
  5. %0,025 (v/v) M9-T elde etmek için otoklavlamadan sonra 1 L M9 tamponuna %10 (v/v) Triton X-100 stok çözeltisinin 2,5 mL'sini ekleyerek Triton X-100 (M9-T) ile M9 tamponunu hazırlayın.
  6. 50 mL'lik bir tüpte 15 mL steril% 100 gliserol ve 35 mL steril S-tamponu karıştırarak S-tamponunda% 30 (v / v) gliserol hazırlayın.

2. Çevre örneklerinin hazırlanması (Şekil 1)

  1. Kompost veya çürük meyveler gibi çevresel örnekleri toplayın ve her numuneyi ayrı bir plastik torbaya, tüpe veya başka bir temiz kaba yerleştirin.
    NOT: Nematodları çekmek için, elmalar örneklemeden birkaç hafta önce kompost üzerine yerleştirilebilir.
  2. Çevresel numunenin parçalarını boş, steril, 9 cm'lik bir Petri kabına eşit şekilde yayın.
    NOT: Daha yüksek bozunma seviyelerine sahip numunelerin C. elegans içerme olasılığı daha yüksektir. İsteğe bağlı olarak, kontrastı artırmak için pepton içermeyen agar ortamı (PFM) ile doldurulmuş bir Petri kabı kullanılabilir.
  3. Numuneyi yaklaşık 20 mL steril viskoz ortam ile dikkatlice örtün.
    NOT: Nematodlar 1-2 saat içinde yüzeye çıkar. Viskoz ortam, solucanların hareketini yavaşlatır ve örneklemeyi kolaylaştırır. Alternatif olarak steril M9-tampon kullanılabilir, ancak solucan hareketi daha hızlı olacaktır.

Figure 1
Şekil 1: Nematodların substratlardan izolasyonu. Substrat numuneleri boş Petri kaplarına yerleştirilir ve nematodları temizlemek için viskoz ortamla kaplanır. Nematodlar M9-T'ye aktarılır ve bakterileri dışarıdan uzaklaştırmak için tekrar tekrar yıkanır. Bireysel nematodlar DNA izolasyonu, ilişkili bakterilerin izolasyonu için kullanılabilir veya kültür solucanı popülasyonlarına agar plakalarına yerleştirilebilir. BioRender.com ile oluşturulan figür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Caenorhabditis nematodlarının izolasyonu (Şekil 1)

  1. Barrière ve Félix27 tarafından C. elegans ve ilgili nematodların izolasyonu ile ilgili WormBook bölümünde sunulan yönergeleri izleyerek, diseksiyon mikroskobu kullanarak Caenorhabditis nematodlarını araştırın.
    NOT: Caenorhabditis hermafroditleri / dişileri açık kahverengi renkte bir bağırsağa sahiptir (iletilen aydınlatma altında). Dahası, bağırsak hücreleri, beyaz noktalar olarak görülebilen büyük hücre çekirdeklerine sahiptir. Buna karşılık, diğer nematod türleri genellikle koyu kahverengi bir bağırsağa sahiptir ve pigment yoğunluğunda anteroposterior asimetri gösterebilir ve genellikle görünür çekirdekler göstermeyebilir. Yetişkin Caenorhabditis hermafroditlerinin / dişilerinin vulvası hayvanın ortasında bulunur. Bu vulva lokalizasyonu her zaman diğer nematod taksonları tarafından gösterilmez. Caenorhabditis nematodları, hem yeterli büyütme hem de iletilen aydınlatma ve diğer birçok nematod taksonu ile kontrast ile görülebilen iki faringeal ampule sahiptir. Caenorhabditis nematodları sivri bir kuyruğa sahipken, diğer bazı nematodların yuvarlak bir kuyruğu vardır.
  2. Caenorhabditis nematodlarını diseksiyon mikroskobu altında 20-100 μL'lik bir pipet kullanarak mümkün olduğunca az sıvı içinde toplayın. Toplanan nematodları, bağlanmamış mikropları çıkarmak için solucanları yıkamak için steril bir 3 cm Petri kabında doğrudan 1-3 mL steril M9-T'ye aktarın (adım 3.3) veya alternatif olarak, bir solucan popülasyonu oluşturmak için bireysel solucanları nematod büyüme ortamı (NGM) içeren bir tabağa aktarın (adım 3.4).
  3. Nematodun dışından mikropları çıkarmak için nematodları yıkayın.
    NOT: Bu protokol bağırsak bakterilerini zenginleştirir, ancak solucan kütikülüne yapışan bakterileri tamamen ortadan kaldırmaz.
    1. Nematodları M9-T'de 10-15 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Nematodları mümkün olduğunca az sıvı içinde pipetle 1-3 mL taze M9-T içine yeni steril 3 cm'lik Petri kabında yerleştirin.
    3. Kuluçkayı tekrarlayın ve nematodları iki kez daha taze M9-T'ye aktarın.
      NOT: Aşağıdaki adımlar tek tek solucanlarla veya solucan popülasyonlarıyla yapılabilir. Solucanlar artık C. elegans ve ilişkili mikropların karakterizasyonu ve bakterilerin izolasyonu için kullanılabilir (adım 4 ve 5). Alternatif olarak, bir solucan popülasyonu oluşturmak için ayrı ayrı NGM plakalarına aktarılabilirler (adım 3.4).
  4. Bir solucan popülasyonu elde etmek için, bireysel bir nematodu bir NGM plakasına pipetleyin.
    NOT: Sadece C. elegans veya C. briggsae gibi hermafroditik nematodlar tek solucanlardan yavru üretebilir. Bununla birlikte, diğer türlerin tek solucanları, zaten çiftleşmiş olsalar bile hala yavru üretebilirler.
    1. Doğal olarak izole edilmiş nematodlar genellikle bağırsaklarında bakteri içerir ve bu bakterilerin büyüdüğü ve C. elegans için yiyecek olarak bulunduğu NGM plakalarına dökülürler. Standart laboratuvar gıda organizması E. coli suşu OP50 gibi ayrı gıda organizmaları eklemeyin.
      NOT: Solucanların plakalar üzerinde yetiştirilmesi, ilişkili bakteri topluluğunun bileşimini etkiler, ancak bileşim hala doğal C. elegans izolatları 6,7 ile karşılaştırılabilir.
    2. Nematodların uygun sıcaklıkta 10 güne kadar çoğalmasına izin verin (örneğin, ılıman yerler için 15-20 ° C). Bu nematodları dondurun (adım 3.5) veya C. elegans ve ilişkili mikropların karakterizasyonu ve mikropların izolasyonu için kullanın (adım 4 ve 5).
  5. Uzun süreli depolama için dondurucu nematodlar
    1. Gıda bakterileri kaybolana kadar nematodları tabaklarda bırakın ve plakalarda çoğunlukla küçük larva aşamaları vardır. Solucanları plakalardan 1,5 mL S-tamponunda yıkayın.
    2. 500 μL solucan içeren S-tamponunu, steril 2 mL'lik bir tüp içinde S-tamponunda 500 μL% 30 (v / v) gliserol ile iyice karıştırın. Uzun süreli depolama için tüpleri derhal -80 ° C'de dondurun, aksi takdirde gliserol nematodlara zarar verebilir.

4. C. elegans ve mikropların moleküler tanımlanması için solucanların hazırlanması

  1. Nematodla ilişkili mikropların tarafsız bir şekilde tanımlanması için, üç steril 1 mm boncuk, 19.5 μL PCR tamponu ve kuyucuk başına 0.5 μL Proteinaz K (20 mg / mL) içeren 96 delikli bir plaka hazırlayın. Pipet bir birey, yıkanmış nematodun her bir oyuğa mümkün olduğunca az sıvı aktarmasıdır.
  2. Solucan popülasyonları da kullanılabilir. Bunun için, solucanları plakalardan M9 tamponu ile yıkayın ve ~ 300 μL solucan içeren M9 tamponunu 10-15 boncuklu 2 mL tüplere aktarın.
  3. Bir boncuk homojenizatörü kullanarak nematodları parçalayın (örneğin, 30 Hz'de 3 dakika boyunca boncuk çırpma). Sıvıyı tabana ulaştırmak için plakayı veya tüpleri kısaca santrifüj edin (örneğin, oda sıcaklığında [RT] 8000 x g'de 10 s için).
  4. C. elegans'ın tanımlanması
    1. Numuneleri bir PCR siklerindeki 50 ° C'de 1 saat ve 95 ° C'de 15 dakika ısıtarak bireysel nematodların DNA'sını izole edin. Solucan popülasyonlarının DNA'sını, tercih edilen herhangi bir izolasyon yöntemini kullanarak izole edin (ticari kitleri kullanan farklı izolasyon yöntemlerinin örnek protokolleri 7,9). Uzun süreli depolama için DNA'yı -20 ° C'de dondurun.
    2. C. elegans'ın tanımlanması için, DNA'yı ve nlp30-F primer çiftini (Tablo 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') ve nlp30-R (Tablo 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') bir PCR'de, tercih edilen bir Taq tedarikçisinin talimatlarını izleyerek kullanın.
    3. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 2 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon adımı, ardından 45 s için 95 ° C'lik 35 döngü, 30 s için 55 ° C, 1 dakika için 72 ° C ve 5 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzama adımı.
  5. İzole DNA'yı kullanarak V3-V4 bölgesinin 16S amplikon dizilimi yoluyla nematod ile ilişkili bakterileri karakterize edin.
    1. Tercih edilen 16S astarlarla bir 16S kütüphanesi hazırlayın ve kütüphane hazırlama kiti protokolünü takip edin. Bir seçenek, 16S rRNA geninin V3-V4 bölgesini kapsayan 341F (Tablo 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') ve 806R (Tablo 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') primerlerini kullanmaktır, bu da iyi çözünürlük7 olan standart veritabanlarıyla sınıflandırılabilen dizilerle sonuçlanır.
      NOT: Bu adımda girdi DNA'sının miktarı kritik öneme sahiptir. Tek solucanlardan elde edilen DNA, solucan popülasyonlarından elde edilenden çok daha az olacaktır. Tek solucanlar için, girdi DNA miktarını artırmak veya PCR döngülerinin miktarını artırmakgerekebilir 7.
    2. Kütüphaneler, uygun bir sıralama kiti kullanılarak bir sıralama platformunda sıralanabilir.
      NOT: Burada, MiSeq platformu uygun bir MiSeq Reaktif Kiti ile birlikte kullanılır. Reaktifler sürekli olarak geliştirilir ve en yeni standartlara göre seçilmelidir.

5. Nematodla ilişkili bakterilerin izolasyonu ve yetiştirilmesi (Şekil 2)

  1. Bakterileri izole etmek için, üç steril 1 mm boncuk, kuyu başına 20 μL M9 tamponu içeren 96 delikli bir plaka hazırlayın ve her bir kuyucuğa ayrı bir yıkanmış nematod pipetin, mümkün olduğunca az sıvı aktarın.
    NOT: Alternatif olarak, solucan popülasyonları plakalardan M9 tamponu ile yıkanabilir ve ~ 300 μL solucan içeren M9 tamponu, 10-15 boncuklu 2 mL tüplere aktarılabilir. Her durumda, solucanlar 4.1-4.4 adımları kullanılarak C. elegans olarak tanımlanan bir kültürden gelmelidir.
  2. Bir boncuk homojenizatörü kullanarak nematodları parçalayın (örneğin, 30 Hz'de 3 dakika boyunca boncuk çırpma). Sıvıyı tabana almak için plakayı veya tüpleri kısaca santrifüj edin (örneğin, RT'de 8000 x g'de 10 s için).
    NOT: Bu yöntemin kullanımı, 16S rDNA amplikon dizilimi7 tarafından ortaya çıkarılanlara benzer bakteri taksonlarının izolasyonuna yol açmıştır, bu da tarif edilen boncuk çırpmanın çoğu bakteri hücresini sağlam bıraktığını düşündürmektedir.
  3. Süper natantı toplayın, 1:10'da seri olarak seyreltin ve 9 cm agar plakalarına 100 μL'ye kadar tabaklayın.
    1. Çoğu bakterinin yetiştirilebilmesini sağlamak için, seyreltilmiş triptikaz soya agar (TSA, 1:10 seyreltme), MacConkey agar, Sabouraud glikoz agar, patates dekstroz agar veya maya pepton dekstroz agar dahil olmak üzere farklı besin bileşimlerine sahip çeşitli alternatif ortamlar kullanın.
  4. Plakaları, numune alma yerinin ortalama sıcaklık koşullarında (örneğin, ılıman yerler için 15-20 °C arasındaki sıcaklıklar) 24-48 saat boyunca inkübe edin.
  5. Saf bakteri kültürleri elde etmek için standart üç çizgili tekniği ve steril bir döngüyü kullanın (Şekil 2).
    1. Steril bir halka veya kürdan kullanarak bir plakadan tek bir koloni seçin ve saflaştırma için kullanılanla aynı agar ortamını içeren yeni bir agar plakasına çizin. Plakanın sadece kabaca 1 / 3'ünü kullandığınızdan emin olun.
    2. Ya yeni bir steril döngü kullanın ya da yeniden kullanılabilir bir döngüyü sterilize edin ve aynı plakanın başka bir 1 / 3'ünde ikinci bir çizgi oluşturmak için ilk çizgi boyunca sürükleyin.
    3. Steril bir döngüyü ikinci çizgi boyunca sürükleyerek bu adımı tekrarlayın.
    4. Plakayı izolasyon için kullanılan aynı büyüme koşullarında inkübe edin. Bu teknik, üçüncü çizgi alanında büyüyen tek kolonilerle sonuçlanmalıdır.
      NOT: Doğal izolatlar biyofilmler ve / veya agregalar oluşturma eğiliminde olduğundan saflaştırma adımını birkaç kez tekrarlamak gerekebilir.
  6. Saf kolonileri, yukarıdakiyle aynı sıcaklığı ve büyüme süresini kullanarak sıvı bir ortamda (agar ortamı ile aynı tipte) büyütün (adım 5.4)
  7. Bakteri kültürünün 300 μL'sini 200 μL% 86 (v / v) gliserol (ilgili büyüme ortamında, örneğin TSB) ve pipete ekleyerek bakteri stoklarını hazırlayın. Alternatif olarak, 50 μL bakteri kültürünü 50 μL% 7 (v / v) DMSO ile karıştırarak DMSO stoklarını hazırlayın. Uzun süreli depolama için -80 °C'de dondurun.
  8. Tam 16S ribozomal RNA geninin dizilimini kullanarak bakterileri karakterize etme
    1. Bakteriyel DNA'yı uygun bir teknik kullanarak saf sıvı kültürlerden çıkarın (örneğin, bir DNA ekstraksiyon kiti; deneyimlere göre, CTAB tabanlı bir ekstraksiyon protokolü çok iyi çalışır22).
    2. 27F (Tablo 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') ve 1495R (Tablo 1, 5'-CTACGGCTCTTTGTTACGA -3')28 primerlerini ve aşağıdaki PCR koşullarını kullanarak 16S rRNA genini yükseltin: 95 °C, 2 dakika, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) ve 72 °C, 5 dk'da son uzatma periyodu.
    3. Tam dizileri elde etmek için, ayrıca 701F (Tablo 1, 5'-GTGTAGCGTGAAATGCG-3') ve 785R (Tablo 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6 gibi iki dahili sıralama astarı kullanın.

Figure 2
Şekil 2: Türlerin tanımlanması ve bireysel bakterilerin izolasyonu. Bireysel nematodlar bir boncuk homojenizatörü kullanılarak parçalanır ve DNA, PCR veya dizileme yoluyla tür tayini için izole edilir. Alternatif olarak, parçalanmış nematod malzemesi seri olarak seyreltilir ve büyüme ortamı plakaları üzerine kaplanır. Bakteri kolonileri ortaya çıkana kadar plakalar inkübe edilir ve saf kültürler elde etmek için tek koloniler yeni plakalara dizilir. Saf kültürlerin tek kolonileri, -80 ° C'de uzun süreli depolama için bakteri stoklarının hazırlanması için sıvı bakteri kültürlerinin yetiştirilmesinde kullanılır. BioRender.com ile oluşturulan figür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nematod C. elegans sıklıkla elma gibi meyvelerin ayrışmasında ve ayrıca kompost örneklerinde bulunur. Kuzey Almanya'da, C. elegans ve konjenerik türler (özellikle C. remanei ve aynı zamanda C. briggsae) çoğunlukla Eylülayından 2 Kasım'a kadar bulunur. Nematodlar en yaygın olarak bitki maddesinin, özellikle elma veya armut gibi çürüyen meyvelerin ayrışmasında ve ayrıca kompostta, özellikle de yüksek derecede ayrışma gösteren malzemelerde bulunur. Meyve ve kompost örnekleri laboratuvara alınabilir (Şekil 3A,B), Petri kaplarına dağıtılabilir (Şekil 3C,D) ve daha sonra solucanları substrat malzemesini terk etmeye ve ortamın yüzeyine yüzmeye zorlamak için sıvı veya viskoz bir ortama batırılabilir (Şekil 3E,F). Bundan sonra, solucanlar toplanabilir, agar plakalarına veya mikrosantrifüj tüplerine aktarılabilir ve tür kimliği teşhis PCR'leri 2,6,7,22 kullanılarak belirlenebilir.

Figure 3
Şekil 3: Nematodların izolasyonu için elmaların hazırlanması. (A,B) Nematodlar, kompost veya çürük meyveler gibi çevresel örneklerden izole edilebilir ve ayrıca elmaların kompost üzerine yerleştirilmesiyle çekilebilir. (C,D) Örnekler bölünür ve küçük parçalar bir Petri kabına yerleştirilir. (E,F) Numunelere viskoz ortam eklenir, bu da genellikle nematodların substrat malzemesini terk etmesine ve ortamın yüzeyine yüzmesine neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

C. elegans'a özgü primerler nlp30-F ve nlp30-R'yi kullanan PCR, C . elegans için 154 bp uzunluğunda bir PCR ürünü ile sonuçlanır ve diğer nematodlar için ürün yoktur (Şekil 4). PCR'nin başarılı performansını doğrulamak için, N2 gibi bir laboratuvar suşunun DNA'sı, izole nematodların DNA'sı ile eşzamanlı olarak pozitif kontrol olarak çalıştırılmalıdır. Küçük larva evreleri gibi az miktarda biyolojik materyal, zayıf PCR bantlarına neden olabilir (Şekil 4A). PCR bantlarının görünürlüğü, PCR'de daha fazla DNA kullanılarak (bunun, bakteriyel 16S rDNA amplikon dizilimi için kalan DNA miktarını, örneğin 1 μL yerine 2 μL DNA'nın) en aza indireceğini unutmayın), jele daha büyük miktarda PCR ürünü uygulanarak (örneğin, 10-15 μL), veya PCR döngülerinin sayısını artırarak. Tek solucanlara kıyasla, en az 50 solucandan oluşan solucan popülasyonları genellikle daha fazla miktarda DNA verir ve elektroforez jelindeki bantlar açıkça görülebilir (Şekil 4B).

Figure 4
Resim 4: C. elegans'a özgü PCR'nin PCR ürünü. (A,B) C. elegans'a özgü primerler nlp30-F ve nlp30-R, 154 bp uzunluğunda bir PCR ürünü üretir. Örnek olarak, PCR'ler (A) tek solucanlar ve (B) solucan popülasyonları (örneğin, 300-500 birey) üzerinde gerçekleştirildi, hepsi Kiel, Almanya'daki Botanik Bahçesi'nin kompostundan çürüyen bitki maddesinden tarif edilen protokolle izole edildi. (A) Tek solucanların ve özellikle küçük larva evrelerinin DNA'sı genellikle zayıf PCR bantlarına neden olur. (B) Solucan popülasyonlarından izole edilen DNA (örneğin, 300-500 kişi) daha net bantlarla sonuçlanır. C. elegans N2'nin DNA'sı pozitif kontrol (+), hiçbir şablon negatif kontrol (-) olarak kullanılmadı. PCR bantlarının altındaki yaymalar jel artefaktlardır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

C. elegans ile ilişkili mikroplar, solucanlardan ve ayrıca solucan içeren substrat örneklerinden izole edilebilir. Mikrop izolasyonu, saf kültürlerin agar plakalarından izolasyonu, sıvı ortamdaki büyümeleri ve sonraki karakterizasyonları (örneğin, bakteriler için 16S ribozomal RNA geninin dizilerini kullanarak) dahil olmak üzere genel mikrobiyoloji standartlarını izler. Mikropların, standart mikrobiyoloji prosedürleri kullanılarak plakalardan saf tek koloniler olarak izole edilmesi kritik öneme sahiptir (Şekil 5). Bu önemlidir, çünkü C. elegans ile ilişkili bakterilerin bazıları biyofilmler oluşturabilir ve / veya kolayca toplanabilir, bu da çok türlü kültürlerle sonuçlanır (Şekil 5C, D). İzole bakteri kültürlerinin saflığı, daha önce izole edilmiş C. elegans ile ilişkili mikroplar 6,7 için yapıldığı gibi, 16S rRNA geninin dizileri ile doğrulanabilir. Elde edilen mikroplar daha sonra C. elegans ile yapılan deneylerde kullanılabilir.

Figure 5
Şekil 5: Agar plakaları üzerindeki bakteri izolatları. Bireysel bakteriyel izolatlar agar plakalarına dizilir, bu durumda, örnek olarak (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens'in bir izolatını gösteren triptik soya agar (TSA) plakaları ve (C) tüm plakaya genel bir bakış ve (D) bu plakanın bir bölümünün büyütülmesi olarak gösterilen birkaç bakteri türüne sahip bir örnek, farklı koloni tiplerinin görülebildiği bir örnek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan astarların listesi Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nematod Caenorhabditis elegans, biyolojik araştırmalarda en yoğun çalışılan model organizmalardan biridir. Sydney Brenner tarafından 1960'larda, başlangıçta sinir sisteminin gelişimini ve işlevini anlamak için tanıtıldı29. O zamandan beri, C. elegans davranışsal biyoloji, nörobiyoloji, yaşlanma, evrimsel biyoloji, hücre biyolojisi, gelişim biyolojisi ve immünoloji dahil olmak üzere tüm biyolojik disiplinlerdeki temel süreçleri incelemek için güçlü bir model haline gelmiştir. Başarısı, yaklaşık 3 günlük kısa bir üretim süresi, ekim kolaylığı, şeffaf gövde (verimli fenotiplemeye izin veren), donmanın hayatta kalması, verimli sterilizasyon ve gelişimsel senkronizasyon ve ayrıca mutagenez, CRISPR-Cas veya RNAi ile genetik manipülasyon için etkili yöntemler dahil olmak üzere avantajlı özelliklerin benzersiz bir kombinasyonuna dayanmaktadır. Bugün, C. elegans dünya çapında yaklaşık 1.500 laboratuvarda incelenmektedir. Sydney Brenner, C. elegans'ı laboratuvarda model bir sistem olarak ilk kez kurduğunda, Gram-negatif bakteri Escherichia coli OP50 üzerindeki bakteri nematodunu bir gıda kaynağı olarak yetiştirdi. O zamandan beri, C. elegans tüm dünyadaki laboratuvarlarda E. coli OP50 üzerinde monoksenik kültürde sürdürülmüştür29. Dahası, C. elegans popülasyonları, sadece steril yumurtalar tarafından hayatta kalan ve ilişkili mikrop olmayan bir ağartma prosedürü ile alışkanlıkla senkronize edilir veya dekontamine edilir. Bu nedenle, daha sonra yüksek kontrollü koşullar altında bireysel bakterilere maruz kalabilen steril hayvanlar üretmek kolaydır. Bununla birlikte, bu standartlaştırılmış C. elegans laboratuvar bakım protokollerinin bir sonucu olarak, C. elegans biyolojisi ile ilgili hemen hemen tüm çalışmalar, doğal olarak ilişkili bakterilerin yokluğunda yapılmıştır. Aslında, doğal olarak ilişkili mikroorganizmaların çeşitliliği hakkındaki bilgiler sadece 2016 yılındayayınlanmıştır 4,5,6 ve ilişkili mikropların tam çeşitliliği hala tam olarak araştırılmamıştır.

Açıklanan yöntemler, doğada C. elegans ile ilişkili mikropların çeşitliliğini daha da karakterize etmeye yardımcı olacaktır. Bu mikroplar muhtemelen nematodun yaşam öyküsünün önemli belirleyicileridir ve bu nedenle bu solucanla gelecekteki çalışmalar için gerekli bir kaynak olmalıdır. Açıklanan yöntemler, doğrudan 6,7 alanından toplanan doğal C. elegans örneklerinden mikropları izole etmek için daha önce yayınlanmış tek yöntemlerin güncellenmiş bir versiyonudur. Protokol, C. elegans'ın doğada ayrışan bitki maddesinde yaşadığı gerçeğinden yararlanır. Bu çürüyen materyal, C. elegans için gıda görevi gören mikroplar bakımından zengindir ve bağışıklık koruması (yani patojenlere karşı koruma) gibi diğer işlevleri yerine getirmesi muhtemeldir5,6,11,13,14. İlk önemli adım, solucan izolasyonu için uygun substratlar elde etmektir. Uygunluk, yılın zamanına bağlı olabilir; Kuzey Almanya'da, C. elegans öncelikle Eylül ayından2 Kasım'a kadar bulunur. Bu, elma veya armut gibi meyvelerin kullanılabilir hale geldiği ve yerde çürümeye başladığı zamandır. Tam sürenin coğrafi bölgeler arasında değişmesi muhtemeldir23,24,25,30. Herhangi bir bitki materyali, yüksek derecede ayrışma gösterdiği ve bu nedenle zengin bir mikrobiyal topluluk taşıdığı sürece C. elegans için uygun görünmektedir - genellikle C. elegans 1'e patojenik olan mantarların hakim olduğu materyal hariç. Dahası, C. elegans genellikle genel nem çok düşük olmadığında özellikle yaygındır2. Bugüne kadar, Caenorhabditis nematodlarının bitki materyalinde endüstriyelden organik tarıma veya yüzeyden daha derin detritus tabakasına veya yağmura bağımlılıktan bolca değişip değişmediği konusunda sistematik bilgi eksiktir.

Örnekler toplandıktan ve laboratuvara aktarıldıktan sonra, solucanların substratlarından "cezbedilmesi" gerekir. Bu, birkaç farklı yaklaşımla, örneğin, Baermann hunileri31 aracılığıyla solucan ekstraksiyonu veya örneklerin orta27'de bir cezbedici olarak E. coli laboratuvar gıdasını içeren bir agar plakasına yerleştirilmesiyle elde edilmiştir. Deneyimlerimize göre, burada açıklanan protokol genellikle daha hızlı ve daha verimlidir. Substrat numunelerinin, solucanları substrattan ve sıvının yüzeyine kadar verimli bir şekilde zorlayan sıvı veya viskoz bir çözeltiye batırıldığı fikrine dayanır. Ortamın viskozitesine kesinlikle ihtiyaç duyulmaz, ancak solucanların hareketini yavaşlatır ve böylece onları toplamayı kolaylaştırabilir. Solucanların verimli bir şekilde toplanması, sıvı substrata dikkatlice eklendiğinde kolaylaştırılır, böylece sıvıyı koyulaştırabilecek ve nematodları görmeyi zorlaştırabilecek herhangi bir humöz maddenin çözünmesinden kaçınılır.

Bir sonraki zorluk, C. elegans'ı tanımlamaktır. Bazı morfolojik özellikler, Caneorhabditis solucanlarını diğer nematodlardan27 ayırt etmeye yardımcı olabilir, ancak kesin tür tanımlaması için yetersizdir. Çürüyen bitki maddesi genellikle, ilk bakışta ayırt edilmesi imkansız olan C. briggsae veya C. remanei2,6,23,25 gibi konjenerik türler de dahil olmak üzere diğer benzer görünümlü nematodları içerir. Bu nedenle, C. elegans, protokolde açıklandığı gibi, türe özgü primerler 2,6,7 kullanılarak tanısal PCR yardımı ile en iyi ve en güvenilir şekilde tanımlanabilir. Bu bağlamda, izole edilmiş doğal C. elegans'ın çoğalan bir popülasyonunu, örneğin standart NGM plakaları üzerinde, laboratuarda oluşturmak yararlı olabilir. Doğal C. elegans genellikle bakterilerin genellikle büyüdüğü NGM plakalarına dökülen ve daha sonra solucanlar için yiyecek görevi gören ilişkili bakterileri beraberinde getirir 6,7. İlişkili mikropların tam bileşimi, plakalar üzerindeki C. elegans proliferasyonu sırasında değişmekle birlikte, hemen karakterize edilen doğal nematod örnekleri 6,7 ile hala karşılaştırılabilir ve bu nedenle hem C. elegans'ın hem de ilişkili mikropların izolasyonuna izin veren yararlı bir uzlaşmadır.

C. elegans başarılı bir şekilde tanımlandıktan sonra, nematodlar veya ilişkili substrat örnekleri, ilişkili mikropların izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılabilir. Mikropların doğada C. elegans ile gerçekten ilişkili olmasını sağlamak için, protokollerin tüm adımlarında kontaminasyonlardan kaçınmak çok önemlidir. Sahada kompost ve meyve örneklerinin toplanması, sterilize edilmiş malzeme kullanılarak araştırmacı tarafından özel bir dikkatle yapılmalıdır. Laboratuvardaki tüm malzeme işlemeleri, yüksek düzeyde hijyen ve yine sterilize edilmiş plastik eşya ve tamponlar sağlamalıdır. Kontaminasyon riskini azaltmak için, tüm laboratuvar çalışmaları ideal olarak yalnızca mikropların izolasyonuna adanmış ayrı bir laboratuvar odasında yapılmalıdır. Alternatif olarak, açık plakalar, tüpler veya diğer kaplar ile yapılan tüm çalışmalar laminer bir akış kabininde yapılmalıdır. Kontaminasyon riskini değerlendirmek için, uygun kontrol numuneleri (örneğin, numunesiz veya solucansız) paralel olarak işlenmelidir. Ayrıca, farklı büyüme gereksinimlerine sahip tüm farklı bakteri türlerinin yetiştirilebilmesini ve izole edilebilmesini sağlamak için çeşitli farklı ortamlar kullanılabilir. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, doğal C. elegans izolatları ile ilişkili olan şimdiye kadar izole edilmiş tüm bakterilerin NGM ve TSA plakalarında kolayca büyüdüğünü göstermiştir. Bu nedenle, bu medyaya odaklanmak yeterli olabilir.

İzole edilmiş ve karakterize edilmiş mikroplar, C. elegans'ın doğal tarihinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacaktır. Daha da önemlisi, bugüne kadar, C. elegans'ın doğal olarak ilişkili mikroplarına nasıl tepki verdiği, hangi moleküler süreçlerin dahil olduğu ve hangi işlevlerin solucanın mikrobiyal ortaklarıyla etkileşimine aracılık ettiği iyi anlaşılmamıştır. Ana istisnalardan biri, Walhout grubunun C. elegans ve Comamonas DA 1877 arasındaki etkileşim üzerine yaptığı kapsamlı çalışmadır. B12 vitaminini, solucan gen ekspresyonunu, doğurganlığı, ömrü ve gelişimi etkileyen bakteri tarafından sağlanan merkezi bir metabolit olarak ortaya çıkardı15,16,17. Walhout grubu ayrıca, B12 vitamininin doğurganlık ve gelişim üzerindeki etkisinin metiyonin / S-Adenosilmetionin döngüsüne bağlı olduğunu ve nükleer hormon reseptörü NHR-2315,16,17 gibi çeşitli transkripsiyon faktörlerinden etkilendiğini göstermiştir. Dahası, bakteriyel B12 vitamini, potansiyel olarak toksik kısa zincirli yağ asidi propiyonat asidinin parçalanmasına katkıda bulunur; bu, B12 vitamininin yokluğunda, görünüşe göre 3-hidroksipropiyonat16,32 üretimi yoluyla metabolik ağ yeniden kablolaması yoluyla telafi edilebilir. Farklı bir örnek, bakteriyel tiraminin C. elegans tiramin β-hidroksilaz tarafından ahtapota dönüştürüldüğü Providencia'nın nöro-modülatör etkisidir ve daha sonra spesifik duyusal nöronlarda OCTR-1 ahtapotamin reseptörü ile etkileşimi yoluyla solucan davranışını etkiler18. Yine başka bir örnek, çeşitli bakteriler, özellikle de Pseudomonas cinsininkiler tarafından sağlanan bağışıklık korumasıdır. Bu, antimikrobiyal bileşiklerin üretimi yoluyla veya dolaylı bir etki yoluyla, muhtemelen spesifik konakçı yanıtlarının aktivasyonu yoluyla gerçekleşir 6,11,14. Ek mikroplar ve özellikle doğal olarak ilişkili mikrobiyal toplulukların kullanımı, bu model nematodun biyolojisinin daha gerçekçi bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışmamız olmadığını beyan ederiz.

Acknowledgments

Alman Bilim Vakfı'nın mali desteğini kabul ediyoruz (Metaorganizmaların Kökeni ve İşlevi üzerine İşbirlikçi Araştırma Merkezi 1182'nin A1.1 ve A1.2 projeleri). Schulenburg laboratuvarı üyelerine tavsiye ve destekleri için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schulenburg, H., Félix, M. -A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  2. Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
  3. Petersen, C., et al. Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
  4. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  5. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  6. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  7. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  8. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  9. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  10. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
  11. Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
  12. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  13. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  14. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  15. Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
  16. Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
  17. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  18. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  19. Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
  20. Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
  21. Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
  22. Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
  23. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
  24. Barrière, A., Félix, M. -A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
  25. Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
  26. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
  27. Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).
  28. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  29. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  30. Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
  31. Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
  32. Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).

Tags

Biyoloji Sayı 186 Caenorhabditis elegans konakçı-mikrobiyota etkileşimleri elma kompost Ochrobactrum Pseudomonas lurida
Model Nematod <em>Caenorhabditis elegans'ın</em> Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, C., Dierking, K., Johnke,… More

Petersen, C., Dierking, K., Johnke, J., Schulenburg, H. Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (186), e64249, doi:10.3791/64249 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter