Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering och karakterisering av den naturliga mikrobiotan i modellen Nematode Caenorhabditis elegans

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans är en av de viktigaste modellarterna inom biologi, men nästan all forskning utförs i avsaknad av dess naturligt associerade mikrober. De metoder som beskrivs här kommer att bidra till att förbättra vår förståelse för mångfalden av associerade mikrober som grund för framtida funktionell C. elegans-forskning.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans interagerar med en stor mångfald av mikroorganismer i naturen. I allmänhet finns C. elegans vanligtvis i ruttna växtmaterial, särskilt ruttna frukter som äpplen eller på komposthögar. Det är också förknippat med vissa ryggradslösa värdar som sniglar och trälök. Dessa livsmiljöer är rika på mikrober, som fungerar som mat för C. elegans och som också ihållande kan kolonisera nematoden tarmen. Hittills är den exakta mångfalden och konsistensen hos den inhemska C. elegans-mikrobioten över livsmiljöer och geografiska platser inte helt förstådd. Här beskriver vi ett lämpligt tillvägagångssätt för att isolera C. elegans från naturen och karakterisera maskarnas mikrobiota. Nematoder kan lätt isoleras från kompostmaterial, ruttnande äpplen, sniglar eller lockas genom att placera äpplen på komposthögar. Den bästa tiden för att hitta C. elegans på norra halvklotet är från september till november. Ormar kan tvättas ur uppsamlat substratmaterial genom att nedsänka substratet i buffertlösning, följt av insamling av nematoder och deras överföring till nematodtillväxtmedium eller PCR-buffert för efterföljande analys. Vi illustrerar vidare hur proverna kan användas för att isolera och rena de maskassocierade mikroorganismerna och för att bearbeta maskar för 16S ribosomal RNA-analys av mikrobiotasamhällets sammansättning. Sammantaget kan de beskrivna metoderna stimulera ny forskning om karakterisering av C. elegans-mikrobiotan över livsmiljöer och geografiska platser, vilket bidrar till att få en omfattande förståelse för mångfalden och stabiliteten hos nematodens mikrobiota som grund för framtida funktionell forskning.

Introduction

I naturen finns C. elegans vanligtvis i ruttna växtmaterial, särskilt ruttna frukter som äpplen eller på komposthögar1. Det är också förknippat med vissa ryggradslösa värdar som sniglar och skogslök 2,3. Dessa livsmiljöer är rika på mikrober, som inte bara fungerar som mat för masken, men kan också bilda stabila föreningar med den. Information om mångfalden av naturligt associerade mikroorganismer publicerades först 2016 4,5,6. Sedan dess har dessa och bara några nyare studier avslöjat att C. elegans är associerad med en mängd olika bakterier och svampar, oftast inklusive bakterier av släktet Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter och flera andra 6,7,8. Flera associerade bakterier kan stabilt kolonisera masktarmen, men inte alla 6,9,10,11,12. De kommer sannolikt att vara av avgörande betydelse för vår förståelse av C. elegans biologi eftersom de kan ge näring, skydda mot patogener och eventuellt andra stressfaktorer och påverka centrala livshistoriska egenskaper som reproduktionshastighet, utveckling eller beteendemässiga svar.

Som ett exempel kan naturligt associerade isolat av släktena Pseudomonas, Ochrobactrum och även Enterobacter eller Gluconobacter skydda masken från patogeninfektion och dödande på olika sätt 5,6,11,13,14. Ett specifikt isolat av släktet Comamonas påverkar nematodens kostrespons, utveckling, livslängd och fertilitet15,16,17. Providencia-bakterier producerar neuromodulatortyramin och modulerar därmed värdens nervsystemaktivitet och resulterande beteendemässiga svar18. En uppsättning olika naturligt associerade bakterier visade sig påverka befolkningstillväxt, fertilitet och beteendemässiga svar 5,6,9,11,19.

Hittills är den exakta mångfalden och konsistensen hos den inhemska C. elegans-mikrobioten över livsmiljöer och geografiska platser inte helt förstådd, och ytterligare föreningar mellan masken och mikroberna från dess miljö återstår att avslöja. Flera tidigare studier använde bakteriestammar isolerade från någon markmiljö, naturliga C. elegans-livsmiljöer eller från mesokosmexperiment (dvs. laboratoriebaserade miljöer som återskapar naturliga livsmiljöer) med C. elegans laboratoriestammar 4,5,20. Även om dessa studier fick nya insikter om mikrobernas påverkan på specifika nematodegenskaper (t.ex. nematodmetabolism21), är relevansen av dessa interaktioner för C. elegans biologi i naturen oklar. Därför beskriver detta manuskript metoderna för att direkt isolera C. elegans från naturen och att isolera och därefter karakterisera de naturligt associerade mikroberna från både enskilda maskar och grupper av maskar. De beskrivna metoderna är en uppdaterad och förbättrad version av de procedurer som tidigare använts för isolering och karakterisering av naturliga C. elegans och dess ursprungliga mikrobiota 2,6,7. Med tanke på att C. elegans finns i stor utsträckning i sönderdelande växtmaterial över hela världen (särskilt i ruttnande frukter, tempererade regioner och på hösten)1,2,22,23,24,25, kan detta protokoll tillämpas av alla laboratorier när det finns intresse för att relatera C. elegans egenskaper till naturligt associerade mikrober och därmed ett mer naturligt relevant sammanhang. Det senare är avgörande för en fullständig förståelse av nematodens biologi eftersom det är känt från en mångfald av andra värdsystem att den associerade mikrobiotan kan påverka olika livshistoriska egenskaper26, en aspekt som för närvarande till stor del försummas i mängden C. elegans-studier inom nästan alla life science-discipliner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av buffertar och media

  1. Bered S-buffert genom att tillsätta 5,85 g NaCl, 1,123 gK2HPO4, 5,926 g KH2PO4 och 1 L avjoniserat H2O-kolv och autoklav i 20 minuter vid121°C.
  2. Bered ett visköst medium genom att tillsätta S-buffert innehållande 1,2% (w/v) hydroximetylcellulosa (ämnet som orsakar viskositet hos mediet), 5 mg/ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 och 0,1% (v/v) aceton. Autoklav och rör om det viskösa mediet tills det är helt homogent.
    OBS: Det kan ta flera timmar. S-buffert kan också beredas direkt och tillsättas till det viskösa mediet utan föregående sterilisering.
  3. Bered M9-buffert genom att tillsätta 3 gKH2PO4, 6 gNA2HPO4·2H2O, 5 g NaCl och 1 L avjoniserad H2OOtill en 1 L kolv. Autoklavera lösningen och tillsätt 1 ml 1 ml 1 M MgSO4 (123,24 g MgSO4·7H2Oi 500 ml avjoniseratH2O, filtrerat steriliserat).
  4. Bered 10% (v/v) Triton X-100 stamlösning genom att blanda 5 ml Triton X-100 med 45 ml M9-buffert. Filtrera lösningen med ett 0,2 μm filter.
  5. Förbered M9-buffert med Triton X-100 (M9-T) genom att tillsätta 2,5 ml av 10% (v/v) Triton X-100 stamlösning till 1 L M9-buffert efter autoklavering för att erhålla 0,025% (v/v) M9-T.
  6. Förbered 30% (v / v) glycerol i S-buffert genom att blanda 15 ml steril 100% glycerol och 35 ml steril S-buffert i ett 50 ml rör.

2. Beredning av miljöprover (figur 1)

  1. Samla miljöprover som kompost eller ruttna frukter och lägg varje prov i en enskild plastpåse, rör eller annan ren behållare.
    OBS: För att locka nematoder kan äpplen placeras på kompost flera veckor före provtagningen.
  2. Sprid bitar av miljöprovet jämnt i en tom, steril, 9 cm petriskål.
    OBS: Prover med högre sönderfallsnivåer är mer benägna att innehålla C. elegans. Eventuellt kan en petriskål fylld med peptonfritt agarmedium (PFM) användas för att öka kontrasten.
  3. Täck provet försiktigt med cirka 20 ml sterilt visköst medium.
    OBS: Nematoder flyter till ytan inom 1-2 h. Det viskösa mediet saktar ner maskarnas rörelse och gör det lättare att prova dem. Steril M9-buffert kan användas som ett alternativ, men maskrörelsen blir snabbare.

Figure 1
Figur 1: Isolering av nematoder från substrat. Substratprover placeras i tomma petriskålar och täcks med visköst medium för att spola ut nematoder. Nematoder överförs till M9-T och tvättas upprepade gånger för att avlägsna bakterier från utsidan. Enskilda nematoder kan användas för DNA-isolering, isolering av associerade bakterier eller placeras på agarplattor för att odla maskpopulationer. Figur skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Isolering av Caenorhabditis nematoder (figur 1)

  1. Sök efter Caenorhabditis nematoder med hjälp av ett dissekerande mikroskop, enligt riktlinjerna som presenteras i WormBook-kapitlet om isolering av C. elegans och relaterade nematoder av Barrière och Félix27.
    OBS: Caenorhabditis hermafroditer /honor har en tarm av ljusbrun färg (under överförd belysning). Dessutom har tarmcellerna stora cellkärnor, som är synliga som vita prickar. Däremot har andra nematodarter ofta en mörkbrun tarm och kan visa anteroposterior asymmetri i pigmentintensitet och vanligtvis inga synliga kärnor. Vulva hos vuxna Caenorhabditis hermafroditer /honor finns i mitten av djuret. Denna vulvalokalisering visas inte alltid av andra nematodtaxa. Caenorhabditis nematoder har två faryngeala lökar, som båda är synliga med tillräcklig förstoring och överförd belysning och kontrast till många andra nematodtaxa. Caenorhabditis nematoder har en spetsig svans, medan vissa andra nematoder har en rund svans.
  2. Samla Caenorhabditis nematoderna under ett dissekerande mikroskop i så lite vätska som möjligt med en 20-100 μL pipett. Överför de uppsamlade nematoderna direkt till 1-3 ml steril M9-T i en steril 3 cm petriskål för att tvätta maskarna för att avlägsna icke-fästa mikrober (steg 3.3) eller alternativt överföra enskilda maskar till en platta med nematodtillväxtmedium (NGM) för att etablera en maskpopulation (steg 3.4).
  3. Tvätta nematoderna för att ta bort mikrober från utsidan av nematoden.
    OBS: Detta protokoll berikar för tarmbakterier men eliminerar inte helt bakterier som fastnar på maskens nagelband.
    1. Inkubera nematoderna i 10-15 min i M9-T.
    2. Pipettera nematoderna i så lite vätska som möjligt till 1-3 ml färsk M9-T i en ny steril 3 cm petriskål.
    3. Upprepa inkubationen och överför nematoderna till färsk M9-T ytterligare två gånger.
      OBS: Följande steg kan göras antingen med enskilda maskar eller med maskpopulationer. Maskarna kan nu användas för karakterisering av C. elegans och tillhörande mikrober, liksom isolering av bakterier (steg 4 och 5). Alternativt kan de överföras individuellt till NGM-plattor för att etablera en maskpopulation (steg 3.4).
  4. För att få en maskpopulation, pipettera en individuell nematod till en NGM-platta.
    OBS: Endast hermafroditiska nematoder som C. elegans eller C . briggsae kan producera avkommor från enstaka maskar. Enstaka maskar av andra arter kan dock fortfarande producera avkommor om de redan var parade.
    1. Naturligt isolerade nematoder innehåller vanligtvis bakterier i tarmen, som de kasta på NGM-plattorna, där dessa bakterier växer och är tillgängliga som mat för C. elegans. Lägg inte till separata livsmedelsorganismer som den vanliga laboratoriematorganismen, E. coli-stammen OP50.
      OBS: Uppfödning av maskar på plattor påverkar sammansättningen av det associerade bakteriesamhället, men sammansättningen är fortfarande jämförbar med den för den naturliga C. elegans-isolat 6,7.
    2. Låt nematoderna sprida sig i upp till 10 dagar vid lämplig temperatur (t.ex. 15–20 °C för tempererade platser). Frys dessa nematoder (steg 3.5) eller använd dem för karakterisering av C. elegans och tillhörande mikrober samt isolering av mikrober (steg 4 och 5).
  5. Frysning av nematoder för långvarig lagring
    1. Lämna nematoderna på tallrikar tills matbakterierna har försvunnit, och det finns främst små larvstadier på plattorna. Tvätta maskarna från plattorna i 1,5 ml S-buffert.
    2. Blanda 500 μl maskinnehållande S-buffert noggrant med 500 μl 30 % (v/v) glycerol i S-buffert i ett sterilt 2 ml rör. Frys rören omedelbart vid -80 °C för långvarig lagring, annars kan glycerolen skada nematoderna.

4. Beredning av maskarna för molekylär identifiering av C. elegans och mikrober

  1. För opartisk identifiering av nematodassocierade mikrober, förbered en 96-brunnsplatta med tre sterila 1 mm pärlor, 19,5 μL PCR-buffert och 0,5 μL proteinas K (20 mg / ml) per brunn. Pipettera en individ, tvättad nematod till varje brunn, överföra så lite vätska som möjligt.
  2. Maskpopulationer kan också användas. För detta, tvätta maskarna från plattorna med M9-buffert och överför ~ 300 μL maskinnehållande M9-buffert till 2 ml rör med 10-15 pärlor.
  3. Bryt upp nematoderna med hjälp av en pärlhomogenisator (t.ex. pärlslag i 3 minuter vid 30 Hz). Centrifugera plattan eller rören kort för att få vätskan till botten (t.ex. i 10 s vid 8000 x g vid rumstemperatur [RT]).
  4. Identifiering av C. elegans
    1. Isolera DNA från enskilda nematoder genom att upphetta proverna i en PCR-cykel i 1 timme vid 50 °C och 15 min vid 95 °C. Isolera DNA från maskpopulationer med valfri isoleringsmetod (exempelprotokoll för olika isoleringsmetoder med kommersiella kit 7,9). Frys DNA vid -20 °C för långvarig lagring.
    2. För identifiering av C. elegans, använd DNA och primerparet nlp30-F (tabell 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') och nlp30-R (tabell 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') i en PCR, enligt instruktionerna från en valfri Taq-leverantör.
    3. Använd följande PCR-förhållanden: inledande denatureringssteg vid 95 °C i 2 minuter, följt av 35 cykler med 95 °C i 45 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 1 min och ett slutligt töjningssteg vid 72 °C i 5 minuter.
  5. Karakterisera de nematodassocierade bakterierna via 16S ampliconsekvensering av V3-V4-regionen med hjälp av isolerat DNA.
    1. Förbered ett 16S-bibliotek med de 16S-primers du väljer och följ protokollet för biblioteksförberedelsepaket. Ett alternativ är att använda primers 341F (tabell 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') och 806R (tabell 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') som täcker V3-V4-regionen i 16S rRNA-genen, vilket resulterar i sekvenser som kan klassificeras med standarddatabaser med bra upplösning7.
      OBS: Mängden inmatat DNA är avgörande i detta steg. DNA som förvärvats från enstaka maskar kommer att bli mycket mindre än det som erhålls från maskpopulationer. För enstaka maskar kan det vara nödvändigt att öka mängden inmatat DNA eller att öka mängden PCR-cykler7.
    2. Bibliotek kan sekvenseras på en sekvenseringsplattform med hjälp av ett lämpligt sekvenseringssats.
      OBS: Här används MiSeq-plattformen med ett lämpligt MiSeq Reagent Kit. Reagenserna förbättras ständigt och bör väljas enligt de senaste standarderna.

5. Isolering och odling av nematodassocierade bakterier (figur 2)

  1. För att isolera bakterier, förbered en 96-brunnsplatta med tre sterila 1 mm pärlor, 20 μL M9-buffert per brunn och pipettera en individ, tvättad nematod till varje brunn och överför så lite vätska som möjligt.
    OBS: Alternativt kan maskpopulationer tvättas från plattorna med M9-buffert och ~ 300 μL maskinnehållande M9-buffert kan överföras till 2 ml rör med 10-15 pärlor. I alla fall bör maskarna komma från en kultur som identifierades vara C. elegans med hjälp av steg 4.1-4.4.
  2. Bryt upp nematoderna med hjälp av en pärlhomogenisator (t.ex. pärlslag i 3 minuter vid 30 Hz). Centrifugera plattan eller rören kort för att få vätskan till botten (t.ex. i 10 s vid 8000 x g vid RT).
    OBS: Användningen av denna metod ledde till isolering av bakteriella taxa som liknar dem som avslöjas av 16S rDNA-ampliconsekvensering7, vilket tyder på att den beskrivna pärlslagen lämnar de flesta bakterieceller intakta.
  3. Samla supernatanten, späd den seriellt vid 1:10 och platta upp till 100 μL på 9 cm agarplattor.
    1. För att säkerställa att de flesta bakterier kan odlas, använd en mängd alternativa medier med olika näringskompositioner, inklusive utspädd trypticase sojaagar (TSA, 1:10 utspädning), MacConkey-agar, Sabouraud-glukosagar, potatisdextrosagar eller jästpeptondextrosagar.
  4. Inkubera plattorna vid de genomsnittliga temperaturförhållandena på provtagningsplatsen (t.ex. temperaturer mellan 15 och 20 °C för tempererade platser) i 24–48 timmar.
  5. Använd standardtekniken med tre streck och en steril slinga för att erhålla rena bakteriekulturer (figur 2).
    1. Välj en enda koloni från en tallrik med en steril slinga eller tandpetare och stryk ut den på en ny agarplatta som innehåller samma agarmedium som används för rening. Se till att endast använda ungefär 1/3 av plattan.
    2. Använd antingen en ny steril slinga eller sterilisera en återanvändbar slinga och dra den genom den första strimman för att skapa en andra strimma på ytterligare 1/3 av samma platta.
    3. Upprepa detta steg genom att dra en steril slinga genom den andra raden.
    4. Inkubera plattan vid samma tillväxtförhållanden som används för isolering. Denna teknik måste resultera i att enstaka kolonier växer i området för den tredje raden.
      OBS: Det kan vara nödvändigt att upprepa reningssteget flera gånger eftersom naturliga isolat tenderar att bilda biofilmer och / eller aggregat.
  6. Odla de rena kolonierna i ett flytande medium (av samma typ som agarmediet) med samma temperatur och tillväxttid som ovan (steg 5.4)
  7. Förbered bakterielager genom att tillsätta 300 μl av bakteriekulturen till 200 μl av 86% (v / v) glycerol (i respektive tillväxtmedium, t.ex. TSB) och pipettera upp och ner för att blanda ordentligt. Alternativt kan du bereda DMSO-aktier genom att blanda 50 μl bakteriekultur med 50 μl 7 % (v/v) DMSO. Frys vid -80 °C för långvarig förvaring.
  8. Karakterisering av bakterier med hjälp av sekvensering av hela 16S ribosomala RNA-genen
    1. Extrahera bakterie-DNA från rena flytande kulturer med en lämplig teknik (t.ex. ett DNA-extraktionssats; av erfarenhet fungerar ett CTAB-baserat extraktionsprotokoll mycket bra22).
    2. Förstärk 16S rRNA-genen med hjälp av primers 27F (tabell 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') och 1495R (tabell 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 och följande PCR-förhållanden: 95 °C, 2 min, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) och en slutlig förlängningsperiod vid 72 °C, 5 min.
    3. För att förvärva de fullständiga sekvenserna, använd dessutom två interna sekvenseringsprimrar, såsom 701F (tabell 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') och 785R (tabell 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.

Figure 2
Figur 2: Artidentifiering och isolering av enskilda bakterier. Enskilda nematoder bryts upp med hjälp av en pärlhomogenisator, och DNA isoleras för artbestämning via PCR eller sekvensering. Alternativt späds det uppbrutna nematodmaterialet seriellt och pläteras på tillväxtmediumplattor. Plattorna inkuberas tills bakteriekolonier dyker upp, och enstaka kolonier streckas till nya plattor för att erhålla rena kulturer. Enstaka kolonier av de rena kulturerna används för att odla flytande bakteriekulturer för beredning av bakteriestammar för långvarig lagring vid -80 °C. Figur skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nematoden C. elegans finns ofta i sönderdelande frukter, såsom äpplen, och även kompostprover. I norra Tyskland finns C. elegans samt kongeneriska arter (särskilt C. remanei men även C. briggsae) huvudsakligen från september till2 november. Nematoderna finns oftast i sönderdelande växtmaterial, särskilt ruttnande frukter som äpplen eller päron, och även kompost, särskilt material som visar en hög grad av sönderdelning. Frukt- och kompostproverna kan tas in i labbet (figur 3A,B), fördelas i petriskålar (figur 3C,D) och därefter nedsänkas i ett flytande eller visköst medium för att tvinga maskarna att lämna substratmaterialet och simma till mediets yta (figur 3E,F). Därefter kan maskarna samlas upp, överföras till agarplattor eller mikrocentrifugrör, och artidentiteten bestämmas med hjälp av diagnostiska PCR 2,6,7,22.

Figure 3
Figur 3: Beredning av äpplen för isolering av nematoder. (A,B) Nematoder kan isoleras från miljöprover som kompost eller ruttna frukter och dessutom lockas genom att äpplen placeras på kompost. (C,D) Proverna delas upp och små bitar placeras i en petriskål. (E,F) Visköst medium tillsätts till proverna, vilket vanligtvis leder till att nematoder lämnar substratmaterialet och simmar till ytan av mediet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

PCR med C. elegans-specifika primers nlp30-F och nlp30-R resulterar i en PCR-produkt med en längd på 154 bp för C. elegans och ingen produkt för andra nematoder (figur 4). För att bekräfta PCR: s framgångsrika prestanda bör DNA från en laboratoriestam såsom N2 köras som positiv kontroll samtidigt med DNA från de isolerade nematoderna. Små mängder biologiskt material, såsom små larvstadier, kan resultera i svaga PCR-band (figur 4A). PCR-bandens synlighet kan förbättras genom att använda mer DNA i PCR (observera att detta minimerar mängden DNA som finns kvar för bakteriell 16S rDNA-ampliconsekvensering, t.ex. 2 μL DNA istället för 1 μL), genom att applicera en större mängd PCR-produkt på gelén (t.ex. 10-15 μL), eller genom att öka antalet PCR-cykler. I jämförelse med enstaka maskar ger maskpopulationer som består av minst 50 maskar vanligtvis en större mängd DNA, och banden i elektroforesgelén är tydligt synliga (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: PCR-produkt av C. elegans-specifik PCR. (A,B) De C. elegans-specifika primersna nlp30-F och nlp30-R producerar en PCR-produkt med en längd på 154 bp. Som ett exempel utfördes PCR på (A) enstaka maskar och (B) maskpopulationer (t.ex. 300-500 individer), alla isolerade med det beskrivna protokollet från ruttnande växtmaterial från komposten i Botaniska trädgården i Kiel, Tyskland. (A) DNA från enstaka maskar och i synnerhet från små larvstadier resulterar ofta i svaga PCR-band. (B) DNA isolerat från maskpopulationer (t.ex. 300-500 individer) resulterar i tydligare band. DNA från C. elegans N2 användes som positiv kontroll (+), ingen mall användes som negativ kontroll (-). Utstryken under PCR-band är gelartefakter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mikroberna, som är associerade med C. elegans, kan isoleras från maskar och även de maskinnehållande substratproverna. Mikrobisolering följer allmänna mikrobiologiska standarder, inklusive isolering av rena kulturer från agarplattor, deras tillväxt i flytande medier och deras efterföljande karakterisering (t.ex. med hjälp av sekvenserna av 16S ribosomala RNA -genen för bakterier). Det är viktigt att mikroberna isoleras som rena enskilda kolonier från plattor, med hjälp av vanliga mikrobiologiska procedurer (figur 5). Detta är viktigt eftersom vissa av de C. elegans-associerade bakterierna kan bilda biofilmer och/eller lätt aggregera, vilket resulterar i kulturer med flera arter (figur 5C,D). Renheten hos de isolerade bakteriekulturerna kan bekräftas genom sekvenserna av 16S rRNA-genen, vilket görs för tidigare isolerade C. elegans-associerade mikrober 6,7. De erhållna mikroberna kan därefter användas i experiment med C. elegans.

Figure 5
Figur 5: Bakterieisolat på agarplattor. Enskilda bakterieisolat stryks ut på agarplattor, i detta fall tryptiska sojaagarplattor (TSA), som exempel visar ett isolat av (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens och ett exempel med flera bakteriearter, som visas som en (C) översikt över hela plattan och (D) förstoring av en del av denna platta, där distinkta kolonityper är synliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Lista över primers som används i denna studie Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nematoden Caenorhabditis elegans är en av de mest intensivt studerade modellorganismerna inom biologisk forskning. Det introducerades av Sydney Brenner på 1960-talet, ursprungligen för att förstå nervsystemets utveckling och funktion29. Sedan dess har C. elegans blivit en kraftfull modell för att studera grundläggande processer inom alla biologiska discipliner, inklusive beteendebiologi, neurobiologi, åldrande, evolutionsbiologi, cellbiologi, utvecklingsbiologi och immunologi. Dess framgång bygger på en unik kombination av fördelaktiga egenskaper, inklusive en kort generationstid på cirka 3 dagar, enkel odling, transparent kropp (möjliggör effektiv fenotypning), överlevnad av frysning, effektiv sterilisering och utvecklingssynkronisering, och även effektiva metoder för genetisk manipulation genom mutagenes, CRISPR-Cas eller RNAi. Idag studeras C. elegans i cirka 1 500 laboratorier världen över. När Sydney Brenner först etablerade C. elegans som ett modellsystem i laboratoriet odlade han bakterivonematoden på den gramnegativa bakterien Escherichia coli OP50 som matkälla. Ända sedan dess har C. elegans bibehållits i monoxenisk kultur på E. coli OP50 i laboratorier över hela världen29. Dessutom är C. elegans-populationer vanligtvis synkroniserade eller deförorenade genom ett blekningsförfarande som endast överlevs av sterila ägg och ingen associerad mikrob. Det är alltså lätt att generera sterila djur som sedan kan utsättas för enskilda bakterier under mycket kontrollerade förhållanden. Men som ett resultat av dessa standardiserade C. elegans laboratorieunderhållsprotokoll gjordes nästan alla studier på C. elegans biologi i frånvaro av dess naturligt associerade bakterier. Faktum är att information om mångfalden av naturligt associerade mikroorganismer publicerades först 2016 4,5,6, och den exakta mångfalden av associerade mikrober är fortfarande inte helt utforskad.

De beskrivna metoderna kommer att bidra till att ytterligare karakterisera mångfalden av mikrober som är associerade med C. elegans i naturen. Dessa mikrober är sannolikt viktiga determinanter för nematodens livshistoria och bör därför vara en viktig resurs för framtida arbete med denna mask. De beskrivna metoderna är en uppdaterad version av de enda tidigare publicerade metoderna för att isolera mikrober från naturliga C. elegans-prover som samlats in direkt från fältet 6,7. Protokollet utnyttjar det faktum att C. elegans bor i sönderdelande växtmaterial i naturen. Sådant ruttande material är rikt på mikrober, som fungerar som mat för C. elegans och sannolikt kommer att uppfylla andra funktioner, såsom immunskydd (dvs skydd mot patogener)5,6,11,13,14. Det första nyckelsteget är således att erhålla lämpliga substrat för maskisolering. Lämpligheten kan bero på årstiden. i norra Tyskland finns C. elegans främst från september till2 november. Det här är den tid då frukter som äpplen eller päron blir tillgängliga och börjar ruttna på marken. Den exakta tiden kommer sannolikt att variera mellan geografiska regioner23,24,25,30. Allt växtmaterial verkar lämpligt för C. elegans, så länge det visar en hög grad av sönderdelning och därmed bär ett rikt mikrobiellt samhälle - förutom material som domineras av svampar, som ofta är patogena för C. elegans1. Dessutom är C. elegans vanligtvis särskilt vanligt när den allmänna luftfuktigheten inte är för låg2. Hittills saknas systematisk information om huruvida Caenorhabditis nematoder varierar i överflöd i växtmaterial från industriellt kontra ekologiskt jordbruk eller yta kontra djupare lager av detritus eller beroende av regn eller inte.

När proverna har samlats in och överförts till labbet måste maskar "lockas" ut ur sina substrat. Detta har uppnåtts med ett par olika tillvägagångssätt, till exempel genom maskutvinning genom Baermann-trattar31 eller placering av prover på en agarplatta innehållande E. coli-laboratoriemat som ett lockmedel i mittenav 27. Enligt vår erfarenhet är protokollet som beskrivs här i allmänhet snabbare och effektivare. Det bygger på tanken att substratproverna är nedsänkta i en flytande eller viskös lösning, vilket effektivt tvingar maskarna ut ur substratet och upp till vätskans yta, varifrån de lätt kan samlas in. Mediets viskositet är inte absolut nödvändig, men det saktar ner maskarnas rörelse och kan därmed göra det lättare att samla dem. Den effektiva samlingen av maskar underlättas när vätskan tillsätts försiktigt till substratet, vilket undviker solubilisering av några humana ämnen, vilket kan mörka vätskan och kan göra det svårt att se nematoderna.

Nästa utmaning är att identifiera C. elegans. Vissa morfologiska egenskaper kan hjälpa till att skilja Caneorhabditis-maskar från andra nematoder27, men är ändå otillräckliga för exakt artidentifiering. Ruttnande växtmaterial innehåller ofta andra liknande nematoder, inklusive kongeneriska arter, såsom C. briggsae eller C. remanei 2,6,23,25, som är omöjliga att skilja vid första anblicken. Därför kan C. elegans bäst och mest tillförlitligt identifieras med hjälp av diagnostisk PCR med hjälp av artspecifika primers 2,6,7, som beskrivs i protokollet. I detta sammanhang kan det vara användbart att etablera en växande population av de isolerade naturliga C. elegans i labbet, till exempel på standard NGM-plattor. De naturliga C. elegans tar vanligtvis med sig associerade bakterier, som kastas på NGM-plattorna, där bakterierna vanligtvis växer och därefter fungerar som mat för maskarna 6,7. Även om den exakta sammansättningen av de associerade mikroberna förändras under C. elegans spridning på plattor, är den fortfarande jämförbar med den för omedelbart karakteriserade naturliga nematodprover6,7, och är således en användbar kompromiss som möjliggör isolering av både C. elegans och tillhörande mikrober.

När C. elegans väl har identifierats framgångsrikt kan nematoderna eller de associerade substratproverna användas för isolering och karakterisering av de associerade mikroberna. För att säkerställa att mikroberna verkligen är associerade med C. elegans i naturen är det av största vikt att undvika föroreningar i alla steg i protokollen. Insamling av kompost- och fruktprover i fältet bör göras med särskild försiktighet av forskaren med steriliserat material. All bearbetning av material i laboratoriet måste säkerställa en hög hygiennivå och återigen steriliserade plastvaror och buffertar. För att minska föroreningsrisken bör allt laboratoriearbete helst utföras i ett separat laboratorierum, som uteslutande är dedikerat till isolering av mikroberna. Som ett alternativ bör allt arbete med öppna plattor, rör eller andra behållare utföras i ett laminärt flödesskåp. För att bedöma kontamineringsrisken bör lämpliga kontrollprover (t.ex. utan prover eller utan maskar) behandlas parallellt. Dessutom kan en mängd olika medier användas för att säkerställa att alla olika typer av bakterier med sina olika tillväxtbehov kan odlas och isoleras. Ändå indikerade tidigare arbete att alla hittills isolerade bakterier, som är associerade med naturliga C. elegans-isolat , lätt växer på NGM- och TSA-plattor. Det kan alltså räcka med att fokusera på dessa medier.

De isolerade och karakteriserade mikroberna kommer att bidra till en förbättrad förståelse av C. elegans naturhistoria. Ännu viktigare är att det hittills inte är väl förstått hur C. elegans svarar på dess naturligt associerade mikrober, vilka molekylära processer som är involverade och vilka funktioner som förmedlar maskens interaktion med dess mikrobiella medarbetare. Ett av de viktigaste undantagen är Walhout-gruppens omfattande arbete om samspelet mellan C. elegans och Comamonas DA 1877. Det avslöjade vitamin B12 som en central metabolit som tillhandahålls av bakterien, vilket påverkar maskgenuttryck, fertilitet, livslängd och utveckling15,16,17. Walhout-gruppen visade vidare att vitamin B12-effekten på fertilitet och utveckling beror på metionin / S-adenosylmetionincykeln och påverkas av flera transkriptionsfaktorer, såsom kärnhormonreceptorn NHR-2315,16,17. Dessutom bidrar bakteriellt vitamin B12 till nedbrytningen av den potentiellt giftiga kortkedjiga fettsyrapropionatsyran, som i frånvaro av vitamin B12 kan kompenseras genom metabolisk nätverksomkoppling, tydligen genom produktion av 3-hydroxipropionat16,32. Ett annat exempel är den neuromodulerande effekten av Providencia, upptäckt av Sengupta-laboratoriet, där bakteriellt tyramin omvandlas av C. elegans tyramin β-hydroxylas till oktopamin, som därefter påverkar maskbeteende genom dess interaktion med OCTR-1-oktopaminreceptorn i specifika sensoriska neuroner18. Ytterligare ett exempel är immunskydd, som tillhandahålls av olika bakterier, särskilt de av släktet Pseudomonas. Detta sker antingen genom produktion av antimikrobiella föreningar eller genom en indirekt effekt, eventuellt genom aktivering av specifika värdsvar 6,11,14. Ytterligare mikrober och särskilt användningen av naturligt associerade mikrobiella samhällen kommer att bidra till att få en mer realistisk förståelse för biologin i denna modellnematod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi förklarar att vi inte har någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi erkänner ekonomiskt stöd från den tyska vetenskapsstiftelsen (projekt A1.1 och A1.2 från Collaborative Research Center 1182 om metaorganismernas ursprung och funktion). Vi tackar medlemmarna i Schulenburg-labbet för deras råd och stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schulenburg, H., Félix, M. -A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  2. Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
  3. Petersen, C., et al. Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
  4. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  5. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  6. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  7. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  8. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  9. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  10. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
  11. Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
  12. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  13. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  14. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  15. Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
  16. Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
  17. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  18. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  19. Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
  20. Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
  21. Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
  22. Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
  23. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
  24. Barrière, A., Félix, M. -A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
  25. Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
  26. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
  27. Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).
  28. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  29. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  30. Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
  31. Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
  32. Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).

Tags

Biologi Utgåva 186 Caenorhabditis elegans värd-mikrobiota interaktioner äpple kompost Ochrobactrum Pseudomonas lurida
Isolering och karakterisering av den naturliga mikrobiotan i modellen Nematode <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, C., Dierking, K., Johnke,… More

Petersen, C., Dierking, K., Johnke, J., Schulenburg, H. Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (186), e64249, doi:10.3791/64249 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter