Summary
تصف هذه الورقة تقنية معدلة لزراعة القلب الوعائي غير المتجانس مع تقنية معقمة محدثة وتسكين الألم والتخدير.
Abstract
ساهم تطوير النماذج التجريبية لزراعة القلب في الحيوانات في العديد من التطورات في مجالات علم المناعة وزرع الأعضاء الصلبة. في حين تم استخدام نموذج زرع قلب الفئران الوعائية غير المتجانسة في البداية في دراسات رفض الكسب غير المشروع باستخدام مجموعات من سلالات الفئران الفطرية غير المتطابقة ، فإن الوصول إلى السلالات المعدلة وراثيا والطرائق العلاجية يمكن أن يوفر رؤى جديدة قوية قبل السريرية. في الأساس ، لم تتغير المنهجية الجراحية لهذه التقنية منذ تطويرها ، خاصة فيما يتعلق بالعوامل المهمة مثل تقنية التعقيم والتخدير وتسكين الألم ، والتي لها تأثيرات مادية على المراضة والوفيات بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع أن توفر التحسينات في الإدارة المحيطة بالجراحة تحسينات في كل من رعاية الحيوان والنتائج التجريبية. تقدم هذه الورقة تقريرا عن بروتوكول تم تطويره بالتعاون مع خبير متخصص في التخدير البيطري وتصف التقنية الجراحية مع التركيز على الإدارة المحيطة بالجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش الآثار المترتبة على هذه التحسينات ونقدم تفاصيل حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها الخطوات الجراحية الهامة لهذا الإجراء.
Introduction
نحن مدينون بالكثير من فهمنا لعلم المناعة وزرع الأعضاء للبحث القائم على النماذج التجريبية لزراعة الأعضاء الصلبة باستخدام الحيوانات. منذ الوصف الأول لزراعة القلب الوعائي في الثدييات1 ، ساهمت هذه النماذج في المعرفة في مجالات واسعة النطاق ، بما في ذلك التطبيق العلاجي لانخفاض حرارة الجسم2 ، وفوائد استخدام الغرز المتخصصة3 ، وتقنيات زرع الرئة والقلب الكلي4. قدم تطوير نماذج زرع القلب في الفئران 5,6 نطاقا أوسع للتجارب المناعية بسبب توفر خطوط تكاثر مختلفة. أدى النطاق الأوسع بكثير من سلالات الفئران الفطرية والطافرة المتاحة إلى قيام Corry et al.7 بتطوير تقنية زرع القلب غير المتجانس للفئران بسبب المزايا الكبيرة التي يجلبها هذا النطاق لأبحاث الزرع. تم استخدام هذا النموذج على نطاق واسع وساهم في فهم أكبر لرفض الكسب غير المشروع8 والعلاجات9. ومع ذلك ، منذ وصفها الأول ، ظلت التقنية دون تغيير إلى حد كبير بخلاف بعض التفاصيل الفنية البسيطة مثل التعديلات على موضع مواقع المفاغرة10,11.
منذ دمج تقنية Corry et al.7 في تجاربنا ، حددنا مجالات واعدة لتحسين البروتوكول ، وهي تقنية التعقيم والتخدير وتسكين الألم. كان من المتوقع أن تقدم التحسينات في هذه المجالات تأثيرا إيجابيا على النتائج التجريبية وتحسين رفاهية الحيوان. وقد ظهر هذا سابقا عند استخدام تقنية التعقيم في جراحات الحيوانات الصغيرة لأنها تساعد في الحد من التهابات ما بعد الجراحة12 ، والتي لا تؤثر فقط على المراضة والوفيات ولكن يمكن أن تعرض أيضا التجارب المصممة لتقييم الاستجابة المناعية بعد جراحة الزرع. من وجهة نظر التخدير والمسكنات ، يساعد استخدام نظام مكرر على تقليل التكلفة على الحيوانات وتحقيق التوازن بين الحجة الأخلاقية لهذا النموذج الجراحي من خلال تخفيف آلام ومعاناة الأشخاص التجريبيين. علاوة على ذلك ، يحد التخدير المناسب وتسكين الألم من استجابة الإجهاد المرتبطة بالألم ، مما يحسن جودة التعافي بعد الجراحة ، وفي النهاية يزيد من معدل النجاح الجراحي13.
بهدف تحسين كل من رعاية الحيوان والنتائج التجريبية ، تم تطوير بروتوكول مع تعديلات لسد هذه الفجوات. تم تكييف هذا البروتوكول من البروتوكول الذي وصفه في الأصل Corry et al.7 بالتشاور مع طبيب التخدير البيطري ومع إيلاء الاعتبار الواجب لكل من آثار ومدة تأثيرات التدخلات الدوائية المستخدمة في نظام التخدير والمسكنات. استند النهج إلى مبادئ التخدير المتوازن وتسكين الألم متعدد الوسائط لضمان الرعاية المناسبة المحيطة بالجراحة14. بالإضافة إلى تطبيق تقنية التعقيم ، تم إعطاء البوبرينورفين الأفيوني وبوبيفاكايين المخدر الموضعي بشكل استباقي. تم إجراء التخدير العام باستخدام عامل التخدير المستنشق إيزوفلوران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء هذا البحث وفقا لمدونة قواعد الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية15 وتمت الموافقة عليها بموجب بروتوكولات أخلاقيات الحيوان RA/3/100/1568 و AE173 (لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة غرب أستراليا ولجنة أخلاقيات الحيوان التابعة لمعهد هاري بيركنز للبحوث الطبية ، على التوالي). انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل بشأن جميع المواد والأدوات والحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد الحيوان للجراحة
ملاحظة: الموظفون مكرسون إما لدور إجراء الجراحة أو مراقبة التخدير طوال العملية.
- للتسكين قبل الجراحة، يتم تطبيق جرعة من البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغ/كغ، مخففة إلى 0.03 ملغ/مل مع كلوريد الصوديوم 0.9٪) تحت الجلد للفأر المتلقي قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء الجراحة المتلقية. إدخال جميع التفاصيل المتعلقة بإعطاء الأدوية وجرعاتها ووقت تناولها وآثارها في سجل التخدير.
ملاحظة: هذا النهج ليس مطلوبا بالضرورة للمتبرع لأنه جراحة غير تعافي ، حيث يتم القتل الرحيم للمتبرع تحت التخدير العام مباشرة بعد حصاد العضو. - تحريض التخدير
- ضع الماوس في غرفة الحث لنظام التنفس المخدر مع تدفق الأكسجين من 1-2 لتر · دقيقة − 1 مع 4٪ إيزوفلوران. تأكيد التخدير الكافي من خلال مراقبة الاستلقاء وفقدان رد الفعل الصحيح وانخفاض معدل التنفس.
- بمجرد تخديره بشكل كاف ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وحلق البطن البطني عن كثب باستخدام كليبرز لإزالة الشعر. في حالة المتبرع ، احلق المنطقة الممتدة من الأعضاء التناسلية إلى الهامش العلوي للصدر البطني. في حالة المتلقي ، احلق المنطقة الممتدة من الأعضاء التناسلية إلى الهامش الساحلي. في كلتا الحالتين ، تأكد من أن المنطقة المحلوقة تصل إلى خط منتصف الإبط بشكل جانبي.
- للحفاظ على التخدير ، ضع الفأر في الاستلقاء الظهري لتلقي التخدير والأكسجين من مخروط الأنف في نظام التنفس (عدم إعادة التنفس) ، والذي يوفر الأكسجين بمعدل 1 لتر دقيقة − 1 وإيزوفلوران (1.5 ٪ -2.5٪).
ملاحظة: سطح العمل الجراحي عبارة عن لوحة جراحية فوق وسادة تدفئة ، ويتم تأمين كل طرف من أطراف الماوس باستخدام شريط micropore. - نظرا لصعوبة المراقبة الشاملة للتغيرات الفسيولوجية المرتبطة بالتخدير في الفئران ، قم بمراقبة وتسجيل معلمات محدودة. راقب درجة الحرارة وعمق التخدير ومعدل التنفس كل 5 دقائق على الأقل طوال مدة التخدير.
- لمنع انخفاض حرارة الجسم الشديد وارتفاع الحرارة (من الاحترار النشط بواسطة وسادة الحرارة) ، راقب درجة حرارة الجسم طوال العملية. أدخل مسبارا مستقيميا نظيفا ومشحما في مستقيم الحيوان ثم ثبته على اللوحة الجراحية باستخدام شريط micropore.
ملاحظة: يعود هذا المسبار إلى نظام ديناميكي (إحدى ميزات نظام توصيل التخدير) ، والذي يعدل درجة حرارة وسادة التدفئة لإدارة درجة حرارة الجسم. - اطلب من الشخص المسؤول عن التخدير تقييم عمق التخدير من خلال مراقبة الاستجابات لتحفيز المخلب أو الذيل من الضغط الذي يطبقه الملقط الرضحي ، والمنعكس الجفني ، وتوتر العضلات.
- قياس معدل التنفس من خلال مراقبة حركة جدار الصدر مع مراقبة الجهد التنفسي بشكل شخصي لتقييم حجم المد والجزر. احسب معدل التنفس عن طريق عد الأنفاس خلال فترة 10-15 ثانية والضرب في 6 أو 4 ، على التوالي ، لتحديد معدل التنفس / دقيقة.
- لمنع انخفاض حرارة الجسم الشديد وارتفاع الحرارة (من الاحترار النشط بواسطة وسادة الحرارة) ، راقب درجة حرارة الجسم طوال العملية. أدخل مسبارا مستقيميا نظيفا ومشحما في مستقيم الحيوان ثم ثبته على اللوحة الجراحية باستخدام شريط micropore.
- لتحضير الجلد ، قم بتطهير موقع الجراحة باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية. ضع الكلورهيكسيدين في حركة دائرية وموسعة تعمل من مركز موقع الجراحة إلى الحواف. كرر هذه العملية 3x (مع قضيب جديد ذو رأس قطني في كل مرة) قبل التطبيق النهائي لمزيج من الكلورهيكسيدين والإيثانول مع قضيب جديد معقم برأس قطني بنفس النمط ، مع الانتقال من مركز موقع الجراحة إلى الحافة.
- اطلب من الجراح وضع جل يد قائم على الإيثانول قبل ارتداء رداء جراحي معقم وقفازات جراحية معقمة.
- لتحضير المجال الجراحي ، ضع ستائر جراحية معقمة (مقطوعة مسبقا إلى 25 سم × 25 سم) على جانبي اللوحة الجراحية ، لتكون بمثابة موقع لوضع الأدوات المعقمة. استخدم مقصا معقما لتثبيت ثنى معقم أوسع مقاس 25 سم × 40 سم لقطع فتحة صغيرة (أطول قليلا من موقع الشق) بيضاوية الشكل. ضع هذه الستارة فوق الجزء العلوي من الحيوان بحيث يقع fenestration في موقع شق المقترح. تأكد من أن الأطراف الجانبية لهذه الستارة الثالثة تتداخل مع الستارتين الأصغر على كلا الجانبين لإنشاء مجال جراحي مستمر.
2. جراحة المتبرع
ملاحظة: انظر الشكل التكميلي S1 لمعرفة الجوانب الرئيسية لجراحة المتبرع.
- إجراء جراحة المتبرع بمساعدة مجهر جراحي. للبدء ، استخدم تكبيرا قدره 8x ، وقم بإجراء شق جلدي في خط الوسط البطني باستخدام شفرة مشرط جراحية (# 23). تأكد من أن الشق يمتد من الطرف الذيلي للمنطقة المحلوقة إلى الهامش الساحلي بهامش سليم من الجلد المجهز في كلا الطرفين.
ملاحظة: يتم اختيار تكبير البداية 8x لتمكين التصور الكافي للبنية الكلية للموضوع في بداية الجراحة. من هذه النقطة فصاعدا ، يكون التكبير وفقا لتقدير المشغل ويجب اختياره لتوفير توازن مناسب بين الوعي الظرفي الذي يوفره التكبير المنخفض والتفاصيل الدقيقة التي يمكن تصورها بتكبير أعلى. - باستخدام قضيبين معقمين برأس قطني مبللين بمحلول ملحي طبيعي دافئ ، قم بتحويل الأمعاء الدقيقة لكشف الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي (IVC). استخدم أدوات التطبيق لتشريح هذه الأوعية بصراحة من الأنسجة المحيطة.
- استخدم حقنة 3.0 مل مع إبرة 30 جم ، 0.5 بوصة لسحب 2.5 مل من 100 وحدة دولية · مل −1 من محلول كلوريد الصوديوم الهيبارين 0.9٪ (يتم الاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية حتى الحاجة إليه أثناء الجراحة). باستخدام ملقط خياطة الجسم المستدير ذو الرأس المستقيم مع اليد غير المهيمنة لتأمين الشريان الأورطي البطني في منطقة الحجاب الحاجز تحت ، استخدم اليد المهيمنة لحقن 1.5 مل من المحلول في الشريان الأورطي في اتجاه القلب. أغلق بضع الأبهر الناتج بضغط من قضيب ذو رأس قطني.
- استخدم مقص الجراحة المجهرية ذات الرؤوس المستقيمة لنقل IVC للسماح بالاستنزافة.
- إجراء بضع الصدر باستخدام مقص جراحي لعمل شقين في خطوط منتصف الإبط الثنائية. عند هذه النقطة ، تأكد من وفاة الحيوان وأوقف تشغيل مبخر الأيزوفلوران.
- قم بتأمين الجزء المتوسط الناتج من جدار الصدر باستخدام مشبك البلدغ الصغير. مرر هذا إلى المساعد الجراحي غير المعقم الذي يمكنه تأمينه في مخروط الأنف باستخدام شريط جراحي micropore.
ملاحظة: الهدف هو توفير الجر على هذا الجزء من الصدر ، والذي يساعد في التعرض لأنسجة القلب. - باستخدام ملقط خياطة الجسم المستدير ، حدد وحرك IVC داخل الصدر.
ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الملقط ذو الرأس المستقيم في اليد غير المهيمنة والملقط المنحني في اليد السائدة. - مع تثبيت IVC في ملقط اليد غير المهيمنة ، استخدم اليد المهيمنة لحقن 1.5 مل المتبقية من محلول كلوريد الصوديوم 100 وحدة دولية − مل − 1 في القلب.
- باستخدام كلتا المجموعتين من الملقط ، اربط IVC باستخدام حرير مضفر 7/0 بطول 2 سم. استخدم عقدة الجراح مع رميتين إضافيتين للأمان. اجعل هذه العقدة قريبة على طول الوعاء إلى القلب قدر الإمكان.
- تأمين طرفي هذه العقدة باستخدام ملقط الشريان. ضع هذه الملقط بحيث توفر قوة جر لطيفة للقلب في الاتجاه الذيلي لتسهيل وضع الوعاء الأمثل للتشريح اللاحق.
- تحديد الغدة الصعترية في الجانب الأمامي العلوي من القلب. استخدم الملقط لتشريح هذا العضو من المتبرع لتحديد الوريد الأجوف العلوي (SVC).
- إزالة adventitia والأنسجة المرتبطة SVC باستخدام ملقط. استخدم ملقط منحني لتشريح بصراحة وجعل قناة صغيرة خلفية للوعاء. تأكد من أن هذه القناة قريبة من القلب قدر الإمكان.
- مرر قطعة من الحرير المضفر 7/0 بطول 2 سم عبر هذه القناة باستخدام ملقط ثم اربطها باستخدام التقنية المذكورة أعلاه.
- عند نقطة حوالي 2 مم من هذا الربط (على الجانب المقابل للقلب) ، قسم SVC باستخدام مقص جراحي مجهري منحني.
- باستخدام أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية ، اقلب القلب إلى اليمين التشريحي.
- تحديد الوريد الأزيجوتي على اليسار التشريحي للقلب. باستخدام ملقط ، تشريح بصراحة من الهياكل المحيطة. كما كان من قبل ، استخدم ملقط منحني الرأس لإنشاء قناة صغيرة خلفية لهذا الوعاء.
- استخدم قطعة ثالثة من الحرير المضفر 7/0 مقطوعة إلى 2 سم لربط الوريد الأزيجتي على مقربة قصوى من القلب باستخدام نفس تقنية ربط العقدة. قطع الوعاء 2 مم من الربط على الجانب بعيدا عن القلب.
- باستخدام أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية ، اقلب قمة القلب مرة أخرى إلى اليسار التشريحي. استخدم الملقط لتحديد الأبهر الصاعد وتعبئته. مرر الملقط المنحني أسفل قوس الأبهر لإنشاء قناة بين الشريان الأورطي الصاعد والنازل.
- باستخدام مقص جراحي مجهري مستقيم الرأس ، قم بنقل قوس الأبهر القريب من فروعه.
- باستخدام ملقط ، وتحديد وتعبئة الشريان الرئوي. باستخدام ملقط منحني ، قم بعمل قناة خلفية للوعاء.
- باستخدام مقص جراحي مجهري مستقيم الرأس ، قم بنقل الشريان عند نقطة قريبة من تشعبه.
- استخدم قنية ري Rycroft لحقن 2 مل بلطف من 10 وحدة دولية · مل − 1 من كلوريد الصوديوم الهيبارين 0.9٪ من خلال الشريان الرئوي والشريان الأورطي الصاعد لطرد أي دم متبقي من القلب.
ملاحظة: يشار إلى تدفق كاف من خلال إزالة الدم المرئي من الأوعية التاجية. - باستخدام قطعة 3 سم من الحرير المضفر 7/0 ، قم بربط الأوعية الخلفية المتبقية (الأوردة الرئوية) باستخدام عقدة الجراح برميتين لاحقتين. افصل القلب عن جدار الصدر الخلفي عن طريق القطع بعناية باستخدام المقص الجراحي.
- أخرج القلب برفق من الصدر ، واغمره في محلول جامعة ويسكونسن (UWS) ، ثم ضعه على الثلج للتخزين (عند 4 درجات مئوية).
3. جراحة المتلقي
- بعد إعداد الحيوان كما هو موضح في القسم 1 ، ضع مواد تشحيم العين. حقن جرعة على أساس الوزن (8 ملغم / كغم) من بوبيفاكايين (0.25٪ مخفف إلى 0.625 ملغ / مل في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪) في الأنسجة تحت الجلد من البطن البطني على طول موقع الشق المخطط له. استخدم حقنة أنسولين 29 جم لهذا الحقن وابحث عن خط مستقيم من الفقاعة المرئية التي تغطي مدى الشق المخطط له (الشكل التكميلي S2A-C).
ملاحظة: يجب إعطاء خمس إلى سبع دقائق لإتاحة الوقت لتأثير الذروة للمخدر الموضعي. - مع ضبط المجهر على تكبير 8x ، قم بعمل شق جلدي في خط الوسط البطني باستخدام شفرة مشرط جراحية معقمة (# 23). تأكد من أن بضع البطن يمتد من أسفل البطن إلى الهامش الساحلي. أدخل ضامنا لزيادة المجال الجراحي إلى أقصى حد (الشكل التكميلي S2D).
- بلل قطعة 5 سم × 5 سم من الشاش المعقم بمحلول كلوريد الصوديوم الدافئ بنسبة 0.9٪ وضعه في الجانب العلوي من موقع الجراحة. باستخدام براعم قطنية معقمة مبللة ، قم بإزالة الأمعاء برفق ، وضعها فوق هذا الشاش ، ولف الشاش حول العضو (الشكل التكميلي S3A).
ملاحظة: يساعد هذا الإجراء على تقليل فقدان السوائل غير المحسوس أثناء الجراحة ويساعد في التراجع. - حرر وحرك الشريان الأورطي البطني و IVC من الأنسجة المحيطة باستخدام تقنية تشريح حادة. استخدمي مزيجا من أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية وملقط خياطة الجسم المستدير لهذه الخطوة. تأكد من أن منطقة الخلوص تقع بين الجانب تحت الكلوي للأوعية وفوق تشعب الشريان الأورطي مباشرة (الشكل التكميلي S3B).
ملاحظة: التصور المناسب في هذه المرحلة سيسهل مفاغرة الأوعية الدموية عالية الجودة. - تحديد الأوعية البطنية الخلفية. باستخدام الملقط ، قم بسحب الشريان الأورطي برفق في اتجاه بعيد عن العمود الفقري (أي طولي إلى محور الأوعية البطنية).
ملاحظة: من المهم أن يتم التعامل مع الشريان الأورطي فقط وليس IVC بهذه الطريقة بسبب قابلية هذا الأخير للتفتيت. - ربط كل وعاء البطن المحددة في منطقة مفاغرة المخطط لها. اصنع قناة على جانبي هذه الأوعية رأسيا عن طريق تمرير الملقط المنحني الخلفي إلى الأوعية البطنية على كلا الجانبين. تم تحديد كل وعاء وتعبئته بهذه الطريقة باستخدام أطوال 10/0 نايلون مربوطة بأدوات في عقدة الجراح برمية إضافية واحدة (الشكل التكميلي S3C).
- عزل موقع مفاغرة من الدورة الدموية. للقيام بذلك ، قم بتثبيت مشبك جراحي في الرأس ثم الأطراف الذيلية للأوعية البطنية (الأهم من ذلك ، بهذا الترتيب الدقيق). تأكد من أن المشابك تعبر كلا السفينتين بدرجة كافية لضمان الانسداد الكامل.
- باستخدام ملقط في اليد غير المهيمنة لتثبيت الشريان الأورطي ، قم بإجراء بضع الأبهر باستخدام إبرة 30 G في الجانب الأمامي من الشريان الأورطي. قم بتمديده باستخدام مقص جراحي مجهري مستقيم الرأس (الشكل التكميلي S3D).
- أداء بضع الوريد. باستخدام ملقط مستقيم ، ضع الجر الأمامي اللطيف على IVC عند النقطة التي تتماشى مع منتصف بضع الأبهر. استخدم مقص الجراحة المجهرية المنحنية بحيث يكون الجانب المقعر مواجها للأمام لإزالة جزء من IVC بطول متساو مع بضع الأبهر (الشكل التكميلي S4A).
- باستخدام 10 وحدة دولية · مل − 1 محلول كلوريد الصوديوم الهيبارين ، اغسل الأجزاء الداخلية من الأوعية المفتوحة للدم المتبقي.
- ضع قلب المتبرع في البطن. تأكد من أن الوضع بحيث يكون الشريان الأورطي الصاعد بجانب بضع الأبهر البطني مباشرة ويتم تدوير القلب بحيث يمكن سحب الشريان الرئوي عبر المفاغرة الثانية.
- باستخدام 10/0 نايلون ، ضع خياطة البقاء بين موضع الساعة 12 من بضع الأبهر والطرف المقابل من تجويف الشريان الأورطي الصاعد. قم بإجراء ذلك باستخدام ملقط ذو رأس مستقيم وحامل إبرة مجهرية واربطه باستخدام عقدة الجراح بثلاث رميات لاحقة. قطع الأطراف لترك حوالي 2 مم من خياطة.
- ضع خياطة إقامة ثانية بين موضع الساعة 6 من بضع الأبهر والجانب المقابل من الشريان الأورطي الصاعد. نظرا لأن هذا الخيط سيكون أيضا بمثابة قاعدة للخيوط الجراحية اللاحقة ، اترك 10 مم على الأقل من الذيل للربط النهائي.
- ضع خياطة جري مستمرة من 10/0 نايلون بطريقة تصاعدية لمعارضة الحافة اليمنى التشريحية لبضع الأبهر والحافة الحرة المقابلة للشريان الأورطي الصاعد. استخدم ما يقرب من أربع رميات لهذا الخط.
- مرر الطرف الحر للخياطة حول خياطة البقاء البعيدة قبل وضع خياطة الجري المستمرة الثانية أسفل الجانب الأيسر التشريحي للتأثير على الوضع مع الحافة الحرة المتبقية من بضع الأبهر. اربط الخيط بالذيل باستخدام عقدة الجراح برميتين إضافيتين.
- ضع خياطة البقاء بين موضع الساعة 12 من بضع الوريد IVC والطرف المقابل من تجويف الشريان الرئوي.
- من نقطة الربط هذه ، ضع خياطة جارية مستمرة بطريقة تنازلية بين الحافة اليسرى التشريحية للشريان الرئوي والحافة المقابلة لبضع الوريد. استخدم في المتوسط أربع رميات لهذا الخط متبوعة بواحدة بين موضع الساعة 6 من بضع الوريد والطرف المقابل من تجويف الشريان الرئوي. قم بأربع رميات أخرى لرسم الحواف الحرة النهائية للشريان الرئوي وبضع الوريد معا.
- اربط الطرف الحر للخياطة بنهاية المرساة باستخدام عقدة جراح ربط أداة برميتين إضافيتين.
- أعد وضع القلب للجلوس مركزيا في البطن باستخدام أعواد القطن. تحقق من الأوعية بحثا عن التواء ، مما قد يتداخل مع تدفق الدم.
- ضع رغوة الجل على جميع خطوط الخياطة (الشكل التكميلي S4B). ضع وشكل قطعتين من حوالي 2 مم لكل منهما حولها بحيث يتم تغطية جميع خطوط الخياطة المرئية.
- الافراج عن المشابك الوعائية: أولا المشبك الذيلية ، ثم المشبك الرأسي. نظرا لأنه من المتوقع حدوث كمية صغيرة من النزف ، ضع أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية بشكل استباقي على مواقع المفاغرة لتوفير الضغط.
- بمجرد خلوه من التسريبات التي يمكن ملاحظتها ، قم بتقييم القلب بحثا عن النبض (الشكل التكميلي S4C). إذا لم يحدث هذا ، فتحقق للتأكد من عدم حدوث التواء في الأوعية القلبية (خاصة بالنسبة لل IVC).
- أعد وضع الأمعاء الآن فوق القلب وحوله. إذا ظهرت جافة ، بلل التجويف البريتوني باستخدام محلول كلوريد الصوديوم الدافئ.
- أغلق تجويف البطن باستخدام خيوط أحادية البرولين 6/0 غير القابلة للامتصاص بواسطة طبقات:
أولا الطبقة العضلية ، ثم الجلد (الشكل التكميلي S4D). استخدم تقنية عدم الانقطاع المستمر. - قم بإزالة المتلقي برفق من اللوحة الجراحية وإزالته من المخدر.
- تطبيق 1 مل من محلول ملحي دافئ تحت الجلد ووضع المتلقي في قفص معد مسبقا مع الاحترار للمراقبة وفقا لبروتوكولات التعافي بعد العملية الجراحية (الشكل التكميلي S4E).
4. رعاية ما بعد الجراحة
- مباشرة بعد الجراحة ، ضع المتلقي في قفص نظيف على وسادة التدفئة تحت المراقبة الدقيقة لمدة 3 ساعات على الأقل. خلال هذه الفترة ، راقب المعلمات المختلفة (النشاط ، وضعية الجسم ، حالة المعطف ، تعبيرات الوجه ، المشية ، التهوية ، ظهور موقع الجراحة ، وجود نبضات قلب البطن الواضحة) كل 30 دقيقة على الأقل. انسب درجة إلى كل معلمة (0 = عادي ، 1 = غير طبيعي قليلا أو متقطعا ، 2 = غير طبيعي بشكل معتدل أو ثابت).
ملاحظة: يتم تشغيل التدخلات من خلال مجموع المعلمات المراقبة التي تتجاوز درجات الرفاهية المحددة في بروتوكول الأخلاقيات المتعلق بهذا النموذج. - انقل المستلمين إلى خزانة دافئة تحفظ عند 25 درجة مئوية ، حيث يظلون حتى اليوم 7 بعد العملية. خلال أول 3 أيام ، راقبها على الأقل 2x يوميا. خلال ال 4 أيام المتبقية ، راقبها على الأقل 1x يوميا. للتسكين بعد الجراحة، يتم تطبيق جرعة من البوبرينورفين (0.5-0.1 ملغ/كغ، مخففة إلى 0.03 ملغ/مل مع كلوريد الصوديوم 0.9٪) تحت الجلد للفأر المتلقي في المساء بعد الجراحة ومرتين يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة.
- بمجرد إزالته من الخزانة الدافئة ، راقب المستلمين على الأقل 2x أسبوعيا حتى نقطة النهاية التجريبية المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد فعالية التقنية الجراحية في تعزيز النتائج الجيدة لالتئام الجروح واستعادة الفئران ، حددت التجارب المبكرة في المختبر خصائص البقاء على قيد الحياة لمجموعة من ترقيع القلب ذات المناعة المتغيرة للمتلقي. وشملت هذه الطعوم الخلقية (ن = 5) و syngenec (n = 5) ، والتي تشترك في نفس علامات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) مثل المتلقي ، والطعوم غير المتطابقة الرئيسية (n = 9) ، حيث يكون للطعم والمتلقي علامات MHC مختلفة. استخدمنا الجس المباشر لنبضات قلب البطن غير المتجانسة لتقييم وظيفة الكسب غير المشروع المستمرة وقابليتها للحياة ، والتي تعمل كعلامة بديلة للرفض مقابل التسامح.
في كلتا المجموعتين الضابطتين ، كانت جميع الطعوم قابلة للحياة عند نقطة النهاية الزمنية التجريبية البالغة 100 يوم (يعني غير محدد). كان متوسط وقت البقاء على قيد الحياة للمجموعة غير المتطابقة 9 أيام. يعرض الشكل 1 منحنيات بقاء كابلان ماير التي توضح التناقض الصارخ في بقاء الكسب غير المشروع بين ترقيع القلب غير المتطابقة والسيطرة16. تشير هذه البيانات إلى أن التقنية كافية لتعزيز استجابة الشفاء المناسبة بعد الإجراء. ومع ذلك ، في وجود التهاب مرضي ، في هذه الحالة يمثله رفض الكسب غير المشروع في حالة عدم التطابق ، يؤدي تدمير الأنسجة إلى فقدان سريع للوظيفة.
الشكل 1: تأثير عدم التطابق على بقاء عمليات زرع القلب التقويمية. منحنيات البقاء على قيد الحياة التي توضح الشفاء التام وقبول عمليات زرع قلب الفئران غير المتجانسة (ن = 5) والخلقية (ن = 5) لمدة 100 يوم على الأقل بعد الجراحة على عكس الرفض السريع لعمليات زرع قلب الفئران غير المتجانسة الرئيسية غير المتطابقة (ن = 7) من وقت مبكر من اليوم السابع بعد الجراحة. تم نشر هذه البيانات في Prosser et al.16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مرحلة الجراحة | وقت نقص التروية البارد | وقت نقص التروية الدافئ |
| المتبرع | 13 – 15 دقيقة | |
| التخزين 4 درجة مئوية | 20 - 25 دقيقة | |
| المستلم | 22 – 25 دقيقة |
الجدول 1: مجموعة من أوقات نقص التروية الدافئة والباردة لجراحات المتبرعين والمتلقين المرتبطة بزراعة القلب العظمي.
الشكل التكميلي S1: الجوانب الرئيسية لجراحة المتبرع. (أ) تخدير إيزوفلوران؛ (ب) حقن الهيبارين؛ (ج) قلب المتبرع المعرض؛ د: تدفق القلب بمحلول ملحي هيباريني. (ه) ربط السفينة؛ (و) قلب المتبرع لتخزين نقص التروية الباردة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: الجوانب الرئيسية لإعداد جراحة المتلقي وكي الأوعية الجلدية المقطوعة. (أ) إعداد موقع الجراحة المتلقي؛ (ب) حقن بوبيفاكايين؛ (ج) اللف الجراحي المعقم لموقع الجراحة ؛ د: كي الأوعية الجلدية المقطوعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: الجوانب الرئيسية للجراحة المتلقية - من إعادة وضع الأمعاء إلى بضع الأبهر. (أ) إعادة وضع الأمعاء مؤقتا؛ (ب) الوريد الأجوف السفلي مكشوف ومثبت ؛ (ج) وضع خياطة البقاء؛ د: المرحلة الأولى: بضع الأبهر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S4: الجوانب الرئيسية لجراحة المتلقي - من بضع الوريد إلى الشفاء. (أ) المرحلة الثانية: بضع الوريد؛ (ب) وضع رغوة الهلام؛ (ج) إعادة التروية؛ (د) الإغلاق الجراحي؛ (ه) الاسترداد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج زرع القلب التقويمي للفئران هو نموذج قوي قبل سريري يستخدم في المقام الأول للتحقيق في آثار عدم تطابق MHC على مستوى وطبيعة الرفض المناعي ، ومؤخرا ، تأثير الزرع على الاحتفاظ بالمناعة المقيمة في أنسجةالكسب غير المشروع 16. بينما نتبع في البداية عن كثب بروتوكول Corry et al.7 ، قمنا بتحسين البروتوكول لدمج معايير أفضل الممارسات لتقنية التعقيم وتسكين الألم والتخدير. تم تحديث هذه الممارسات الجديدة من خلال التدريب الإضافي ، وتوفير القفازات الجراحية المعقمة ، والعباءات ، والستائر الجراحية ، وتطبيق التخدير الإضافي ، وتحديث جرعات التسكين. أدت هذه التغييرات إلى زيادة طفيفة في وقت الإعداد الجراحي وتكاليف إضافية لكل عملية جراحية.
يسمح باستخدام الحيوانات لمعالجة المخاوف البحثية المهمة بموجب عقد بين الباحثين ولجنة أخلاقيات الحيوان (AEC) للحفاظ على ترخيص اجتماعي للقيام بهذا العمل. تستند قرارات لجنة الطاقة الذرية إلى إرشادات أخلاقية واضحة15 ، مع مبدأ مهيمن يتمثل في موازنة التكاليف التي يتحملها الحيوان مقابل الفوائد التي تعود على المجتمع. يعد مفهوم الثلاثة روبية (التخفيض والاستبدال والصقل) أمرا حيويا في معالجة كيفية تخفيف تكاليف المشروع.
إن تقليل الضرر الذي يلحق بالحيوانات المعنية من خلال اعتماد تسكين وتخدير مناسبين للأنواع والفترة المحيطة بالجراحة له دور لا غنى عنه في النماذج الحيوانية للجراحة وهو مثال على الصقل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الرعاية والتقنيات التي تقلل من مخاطر النواقل البيئية والسلوكية للعدوى إلى المتلقي الجراحي لها آثار إيجابية على كل من الحد من الضرر الذي يلحق بالحيوان من حيث المراضة والوفيات والمساعدة في تقليل التكاليف المالية المرتبطة بتكرار العمليات الجراحية الفاشلة. على الرغم من أن نظافة "غرفة العمليات" للحيوان التجريبي لا تقترب بشكل وثيق من نظافة ما يعادلها في المستشفى ، إلا أنه لا ينبغي أن يكون فكرة لاحقة في مثل هذا العمل.
من منظور علمي ، تؤثر عدوى ما بعد الجراحة بالضرورة على ملف السيتوكينات الالتهابية والخلايا المناعية ، وهي القراءات النموذجية للتجارب التي تقيم التعافي من الزرع أو رفضه. لذلك ، يجب بذل أقصى جهد للسيطرة على عدوى ما بعد الجراحة ، نظرا للتأثير السلبي الذي يمكن أن يحدثه ذلك على صحة البحث. التركيز على التسكين مهم من وجهة نظر رعاية الحيوان. جراحات زرع الحيوانات هي إجراءات رئيسية ، ويجب بذل جهد كبير في الحد من الألم والمعاناة غير الضرورية للأشخاص. للعودة إلى النتائج العملية لهذا التركيز ، هناك فائدة عملية إضافية للتحكم الفعال في الألم وهي تقليل احتمالية إزالة الحيوانات من البروتوكول التجريبي بسبب علامات الضيق المرتبطة بالألم.
منذ أن تم وصف هذا الإجراء لأول مرة ، أبلغ العديد من المؤلفين عن استكشاف المشكلات الشائعة التي تحدث أثناء الإجراء10,11 وإصلاحها. يتم وصف السيطرة على النزف بعد إطلاق المشابك بشكل جيد وتعكس التقنيات المستخدمة في العمليات الجراحية البشرية ، وهي استخدام الضغط على موقع النزف ، والمزيد من الخياطة ، وعوامل مرقئ. لقد لاحظنا أن النزيف يحدث غالبا من أحد موقعين رئيسيين: مواقع المفاغرة أو تلف عضلة القلب. تم الإبلاغ عن طرق لوقف النزيف من القلب من قبل Niimi10 ، الذي سيطر على النزيف من القلب من خلال ربط الأذين. في تجربتنا ، فإن وقف تدفق الدم من عضلة القلب نفسها يمثل تحديا استثنائيا بسبب الأوعية الدموية الغنية.
لذلك ، يجب توخي الحذر الواجب لتجنب مثل هذه الإصابة ، والتي تحدث بشكل شائع بسبب طرف ملقط غير متحكم فيه يلامس عضلة القلب أثناء الجراحة. لذلك ، نسعى فقط إلى الاتصال المباشر بعضلة القلب باستخدام أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية المبللة. لتقليل الاتصال المباشر في معالجة القلب ، يمكن استخدام الأطراف الحرة لربط الحرير النهائي لتحريك القلب ، كما هو الحال عند نقله من UWS إلى التجويف الصدري.
التحدي الرئيسي الثاني هو الوقاية من شلل الأطراف الخلفية بعد العملية الجراحية ، وهو أحد المضاعفات التي تفرض القتل الرحيم. من الناحية القصصية ، وجدنا أن الوقت الإقفاري الدافئ البالغ >30 دقيقة يرتبط بزيادة خطر حدوث هذا الشلل. تتم مراقبة أوقات نقص تروية الدم لدينا بدقة وتسجيلها كمعيار غير رسمي للأداء. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الوقت الإقفاري لا يبدو أنه يتنبأ بشكل موثوق بهذه المضاعفات. على سبيل المثال ، أفاد Niimi10 ، وهو جراح يتمتع بخبرة جراحية كبيرة (أكثر من 3000 عملية جراحية) ، أن أوقات نقص تروية تصل إلى 2 ساعة مقبولة.
ربما يكون الأمر الأكثر إثارة للدهشة من ذلك ، أن Abbott et al.5 ، الذي طور تقنية مماثلة في الفئران ولكنه استخدم إعدادا مفاغرا من طرف إلى طرف في البطن (أي ، تم ربط IVC والشريان الأورطي البطني بشكل دائم) ، أبلغ عن اثنين من الفئران التي تم الاحتفاظ بها كناجين على المدى الطويل لأكثر من 100 يوم دون أي آثار سيئة واضحة. ربما يتم تفسير هذه الاختلافات بين المجموعات في النتائج من خلال تقنيات مختلفة بمهارة أو ، بدلا من ذلك ، من خلال الاختلافات الجينية بين سلالات مختلفة من الفئران. على سبيل المثال ، نلاحظ أن الفئران Ly5.1 أكثر عرضة لهذه المضاعفات من الفئران BALB / c. لتحسين الوضوح بشأن آثار الوقت الإقفاري على حالات شلل الأطراف الخلفية ، يمكن التحقيق في تأثير طول وقت انسداد الأوعية البطنية.
باختصار ، يوفر هذا البروتوكول الموصوف تحسينات مباشرة للتقنيات المعمول بها باستخدام الأدوية والمواد المتاحة بسهولة. تعمل هذه التحسينات على مواءمة المعيار الذي يتم به تنفيذ هذا النموذج الجراحي مع المعايير البيطرية السريرية وتفيد الحيوانات ، وفي النهاية البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للجهود الرائعة التي بذلها موظفو رعاية الحيوانات في جامعة غرب أستراليا ومعهد هاري بيركنز للأبحاث الطبية ، الذين ساهم تفانيهم وخبرتهم في جدوى ونجاح هذه العمليات الجراحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved - 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator - 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight - 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp - 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape - 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors - curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture - 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle - 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe - 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe - 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | ||
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M.
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F.
- Downie, H. G.
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C.
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
