Summary
Bu yazıda heterotopik vaskülarize kardiyak transplantasyon için modifiye edilmiş bir teknik, güncel aseptik teknik, analjezi ve anestezi anlatılmaktadır.
Abstract
Hayvanlarda deneysel kalp nakli modellerinin geliştirilmesi, immünoloji ve solid organ transplantasyonu alanlarında birçok ilerlemeye katkıda bulunmuştur. Heterotopik vaskülarize murin kardiyak transplantasyon modeli başlangıçta uyumsuz inbred fare suşlarının kombinasyonları kullanılarak greft reddi çalışmalarında kullanılırken, genetiği değiştirilmiş suşlara ve terapötik modalitelere erişim güçlü yeni klinik öncesi anlayışlar sağlayabilir. Temel olarak, bu tekniğin cerrahi metodolojisi, özellikle cerrahi sonrası morbidite ve mortalite üzerinde maddi etkiler yaratan aseptik teknik, anestezi ve analjezi gibi önemli faktörler açısından, geliştirilmesinden bu yana değişmemiştir. Ek olarak, perioperatif yönetimdeki gelişmelerin hem hayvan refahında hem de deneysel sonuçlarda iyileşmeler sağlaması beklenmektedir. Bu yazıda veteriner anestezi alanında uzman bir konu ile işbirliği içinde geliştirilen bir protokol sunulmakta ve perioperatif yönetime vurgu yapılarak cerrahi teknik anlatılmaktadır. Ek olarak, bu iyileştirmelerin etkilerini tartışıyoruz ve bu prosedür için kritik cerrahi adımların giderilmesi hakkında ayrıntılı bilgi veriyoruz.
Introduction
İmmünoloji ve transplantasyon anlayışımızın çoğunu, hayvan denekleri kullanarak katı organ naklinin deneysel modellerine dayanan araştırmalara borçluyuz. Memelilerde vaskülarize kalp transplantasyonunun ilk tanımından bu yana1, bu tür modeller, hipotermi2'nin terapötik uygulaması, özel sütürlerin kullanılmasının faydaları3 ve toplam akciğer ve kalp homotransplantasyonları için teknikler4 dahil olmak üzere geniş kapsamlı alanlarda bilgiye katkıda bulunmuştur. Sıçanlarda kardiyak transplantasyon modellerinin geliştirilmesi 5,6, farklı üreme hatlarının mevcudiyeti nedeniyle immünolojik deneyler için daha geniş bir kapsam sağlamıştır. Mevcut akraba ve mutant fare suşlarının önemli ölçüde daha geniş yelpazesi, Corry ve ark.7'yi, bu aralığın transplantasyon araştırmalarına getirdiği önemli avantajlar nedeniyle bir murin heterotopik kardiyak transplantasyon tekniği geliştirmeye yönlendirmiştir. Bu model yaygın olarak kullanılmaktadır ve greft reddi8 ve terapötikler9'un daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, ilk tanımından bu yana, teknik, anastomoz bölgelerinin konumundaki ayarlamalar gibi bazı küçük teknik detaylar dışında büyük ölçüde değişmeden kalmıştır10,11.
Corry ve ark.7 tekniğinin deneylerimize entegrasyonundan bu yana, protokolün iyileştirilmesi için umut vaat edilen alanları, yani aseptik teknik, anestezi ve analjezi alanlarını belirledik. Bu alanlardaki gelişmelerin deneysel sonuçlar üzerinde olumlu bir etki yaratması ve hayvan refahını iyileştirmesi bekleniyordu. Bu daha önce küçük hayvan ameliyatlarında aseptik teknik kullanıldığında gösterilmiştir, çünkü postoperatif enfeksiyonların azaltılmasına yardımcı olur12, bu sadece morbidite ve mortaliteyi etkilemekle kalmaz, aynı zamanda transplantasyon cerrahisini takiben bağışıklık tepkisini değerlendirmek için tasarlanmış deneyleri de tehlikeye atabilir. Anestezi ve analjezik bakış açısından, rafine bir rejimin kullanılması, hayvanlara maliyeti düşürmeye ve deneysel deneklerin acı ve ıstırabını hafifleterek bu cerrahi modelin etik argümanını dengelemeye yardımcı olur. Ayrıca, uygun anestezi ve analjezi, ağrıya bağlı stres yanıtını sınırlar, postoperatif iyileşmenin kalitesini arttırır ve sonuçta cerrahi başarı oranını arttırır13.
Hem hayvan refahını hem de deneysel sonuçları iyileştirmek amacıyla, bu boşlukları kapatmak için ayarlamalar içeren bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol, Corry ve ark.7 tarafından orijinal olarak tanımlananlardan bir veteriner anestezistinden konsültasyonla ve anestezik ve analjezik rejimde kullanılan farmakolojik müdahalelerin hem etkileri hem de etkilerinin süresi dikkate alınarak uyarlanmıştır. Yaklaşım, uygun perioperatif bakımı sağlamak için dengeli anestezi ve multimodal analjezi prensiplerine dayanıyordu14. Aseptik tekniğin uygulanmasına ek olarak, opioid buprenorfin ve lokal anestezik bupivakain önleyici olarak uygulandı. Genel anestezi inhalan anestezik ajan izofluran kullanılarak yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma, Bilimsel Amaçlar için Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Uygulama Kuralları15'e uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Hayvan Etiği Protokolleri RA / 3/100/1568 ve AE173 (sırasıyla Batı Avustralya Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi ve Harry Perkins Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hayvan Etik Komitesi) kapsamında onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve hayvanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Hayvanın ameliyat için hazırlanması
NOT: Personel, prosedür boyunca ameliyat yapma veya anesteziyi izleme rolüne adanmıştır.
- Preoperatif analjezi için, alıcı ameliyatın başlamasından en az 1 saat önce alıcı fareye deri altından bir doz buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg, sodyum klorür ile 0.03 mg / mL'ye seyreltilmiş% 0.9) uygulayın. İlaçların uygulanması, dozları, uygulama zamanı ve anestezik kayıttaki etkileri ile ilgili tüm ayrıntıları girin.
NOT: Bu yaklaşım, donörün organın toplanmasından hemen sonra genel anestezi altında ötenazi yapıldığı iyileşmeyen bir ameliyat olduğu için donör için mutlaka gerekli değildir. - Anestezi indüksiyonu
- Fareyi,% 4 izofluran ile 1-2 L·min−1 oksijen akışına sahip anestezik solunum sisteminin indüksiyon odasına yerleştirin. Yatışma, doğru refleks kaybı ve azalmış solunum hızı gözlemleyerek yeterli anesteziyi onaylayın.
- Yeterince anestezi uygulandıktan sonra, fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve saçları çıkarmak için makas kullanarak ventral karnı yakından tıraş edin. Donör durumunda, cinsel organdan ventral toraksın üst kenarına kadar uzanan alanı tıraş edin. Alıcı durumunda, cinsel organdan kostal marja kadar uzanan alanı tıraş edin. Her iki durumda da, tıraş edilen alanın lateral olarak orta aksiller çizgiye ulaştığından emin olun.
- Anesteziyi sürdürmek için, fareyi 1 L·min−1 oranında oksijen sağlayan solunum sisteminin burun konisinden (yeniden nefes almayan) ve izofluran (%1,5-%2,5) oranında anestezik ve oksijen almak üzere dorsal yatışta konumlandırın.
NOT: Cerrahi çalışma yüzeyi, bir ısıtma yastığı üzerinde bir cerrahi tahtadır ve farenin her bir uzvu mikro gözenekli bant kullanılarak sabitlenir. - Farelerde anestezi ile ilişkili fizyolojik değişiklikleri kapsamlı bir şekilde izlemenin zorluğu göz önüne alındığında, sınırlı parametreleri izleyin ve kaydedin. Anestezi süresince sıcaklığı, anestezi derinliğini ve solunum hızını en az 5 dakikada bir izleyin.
- Şiddetli hipotermi ve hipertermiyi önlemek için (ısı yastığı tarafından aktif ısınmadan), prosedür boyunca vücut sıcaklığını izleyin. Hayvanın rektumuna temiz, yağlanmış bir rektal prob yerleştirin ve ardından mikro gözenekli bant kullanarak ameliyat tahtasına sabitleyin.
NOT: Bu prob, vücut sıcaklığını yönetmek için ısıtma yastığı sıcaklığını değiştiren dinamik bir sisteme (anestezik dağıtım sisteminin bir özelliği) geri beslenir. - Anesteziden sorumlu kişinin, atravmatik forseps, palpebral refleks ve kas tonusu tarafından uygulanan basınçtan pençe veya kuyruğun uyarılmasına verilen yanıtları gözlemleyerek anestezik derinliği değerlendirmesini sağlayın.
- Solunum hacmini değerlendirmek için solunum çabasını öznel olarak gözlemlerken göğüs duvarının hareketini gözlemleyerek solunum hızını ölçün. Solunum hızını, 10-15 saniyelik bir süre boyunca nefesleri sayarak ve bir nefes hızı / dak belirlemek için sırasıyla 6 veya 4 ile çarparak hesaplayın.
- Şiddetli hipotermi ve hipertermiyi önlemek için (ısı yastığı tarafından aktif ısınmadan), prosedür boyunca vücut sıcaklığını izleyin. Hayvanın rektumuna temiz, yağlanmış bir rektal prob yerleştirin ve ardından mikro gözenekli bant kullanarak ameliyat tahtasına sabitleyin.
- Cildi hazırlamak için, steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak cerrahi bölgeyi dezenfekte edin. Klorheksidin, cerrahi bölgenin merkezinden kenarlara kadar uzanan dairesel, genişleyen bir hareketle uygulayın. Klorheksidin ve etanol kombinasyonunun aynı desende yeni bir steril pamuk uçlu aplikatör ile son bir uygulamasından önce, cerrahi bölgenin merkezinden kenara doğru hareket ederek bu işlemi 3 kez tekrarlayın (her seferinde yeni bir pamuk uçlu aplikatör ile).
- Cerrahın steril bir cerrahi elbise ve steril cerrahi eldiven giymeden önce etanol bazlı bir el jeli uygulamasını sağlayın.
- Cerrahi alanı hazırlamak için, cerrahi tahtanın her iki tarafına steril cerrahi örtüler (25 cm x 25 cm'ye kadar önceden kesilmiş) yerleştirin ve steril aletlerin yerleştirileceği yer olarak hizmet edin. Küçük (kesi yerinden biraz daha uzun), oval şekilli bir açıklığı kesmek için daha geniş bir 25 cm x 40 cm steril örtü felenleştirmek için steril makas kullanın. Bu örtüyü hayvanın üstüne, fenestrasyon önerilen insizyon bölgesinde bulunacak şekilde yerleştirin. Sürekli bir cerrahi alan oluşturmak için bu üçüncü örtünün yanal uçlarının her iki taraftaki iki küçük örtüyle örtüştüğünden emin olun.
2. Donör cerrahisi
NOT: Donör cerrahisinin temel yönleri için Ek Şekil S1'e bakınız.
- Donör ameliyatını cerrahi bir dürbün mikroskobu yardımıyla gerçekleştirin. Başlamak için, 8x'lik bir büyütme kullanın ve cerrahi bir neşter bıçağı kullanarak ventral orta hat cilt insizyonu yapın (# 23). İnsizyonun, traş edilen bölgenin kaudal ucundan, her iki ucunda da hazırlanmış cildin sağlam bir marjı ile kostal marja kadar uzandığından emin olun.
NOT: Ameliyatın başlangıcında konunun makroyapısının yeterli görselleştirilmesini sağlamak için 8x'in başlangıç büyütmesi seçilir. Bu noktadan itibaren, büyütme operatörün takdirine bağlıdır ve daha düşük büyütme ile sağlanan durumsal farkındalık ile daha yüksek büyütme ile görselleştirilebilen ince detaylar arasında uygun bir denge sağlamak için seçilmelidir. - Isıtılmış normal salin ile nemlendirilmiş iki steril pamuk uçlu aplikatör kullanarak, abdominal aort ve inferior vena kava (IVC) açığa çıkarmak için ince bağırsağı kaydırın. Bu damarları çevreleyen dokudan açıkça diseke etmek için aplikatörleri kullanın.
- 2.5 mL 100 IU · mL − 1 heparinize sodyum klorür% 0.9 çözeltisi (ameliyat sırasında gerekli olana kadar 4 ° C'de tutulur) elde etmek için 30 G, 0.5 iğneli 3.0 mL'lik bir şırınga kullanın. İnfra-diyafragmatik bölgede abdominal aortu sabitlemek için baskın olmayan el ile düz uçlu, yuvarlak gövdeli sütür forseps kullanarak, aort içine kalp yönünde 1.5 mL çözelti enjekte etmek için baskın eli kullanın. Elde edilen aortotomi, pamuk uçlu bir aplikatörün basıncıyla kapatın.
- Ekssanguinasyona izin vermek için IVC'yi transekte etmek için düz uçlu mikrocerrahi makas kullanın.
- Bilateral orta aksiller hatlarda iki insizyon yapmak için cerrahi makas kullanarak torakotomi yapın. Bu noktada, hayvanın ölümünü onaylayın ve izofluran buharlaştırıcısını kapatın.
- Torasik duvarın ortaya çıkan medyan segmentini bir mikro-bulldog kelepçesi kullanarak sabitleyin. Bunu, mikro gözenekli cerrahi bant kullanarak burun konisine sabitleyebilen steril olmayan cerrahi asistana iletin.
NOT: Amaç, kalp dokularının maruz kalmasına yardımcı olan bu toraks segmentinde çekiş sağlamaktır. - Yuvarlak vücut sütür forsepslerini kullanarak, intratorasik IVC'yi tanımlayın ve harekete geçirin.
NOT: İdeal olarak, düz uçlu forsepsler baskın olmayan elde ve kavisli forsepsler baskın elde olmalıdır. - IVC, baskın olmayan elin forsepslerine sabitlendiğinde, kalan 1.5 mL'lik 100 IU · mL − 1 heparinize sodyum klorür % 0.9 çözeltisini kalbe enjekte etmek için baskın eli kullanın.
- Her iki forseps setini kullanarak, IVC'yi 2 cm uzunluğunda 7/0 örgülü ipek kullanarak bağlayın. Güvenlik için iki ek atışla bir alet bağı cerrahının düğümünü kullanın. Bu düğümü damar boyunca kalbe mümkün olduğunca proksimal hale getirin.
- Bu düğümün iki ucunu arter forseps kullanarak sabitleyin. Bu forsepsleri, sonraki diseksiyon için en uygun damar pozisyonlamasını kolaylaştırmak için kalbin kaudal yönde yumuşak çekişini sağlayacak şekilde konumlandırın.
- Timusu kalbin anterosuperior yönünde tanımlayın. Üstün vena kavayı (SVC) tanımlamak için bu organı donörden diseke etmek için forseps kullanın.
- Forseps kullanarak SVC'nin macerasını ve ilişkili dokularını çıkarın. Açıkça diseksiyon yapmak ve damarın arkasında küçük bir kanal yapmak için kavisli forseps kullanın. Bu kanalın kalbe mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun.
- Forseps kullanarak bu kanaldan 2 cm uzunluğunda 7/0 örgülü bir ipek parçası geçirin ve yukarıda belirtilen tekniği kullanarak bağlayın.
- Bu ligasyondan yaklaşık 2 mm'lik bir noktada (kalbin karşısındaki tarafta), SVC'yi kavisli mikrocerrahi makas kullanarak bölün.
- Pamuk uçlu aplikatörleri kullanarak, kalbi anatomik sağa çevirin.
- Kalbin anatomik solundaki azigot damarı tanımlayın. Forseps kullanarak, onu çevreleyen yapılardan açıkça inceleyin. Daha önce olduğu gibi, bu damarın arkasında küçük bir kanal oluşturmak için kavisli uçlu forseps kullanın.
- Aynı düğüm bağlama tekniğini kullanarak azigot damarı kalbe maksimum yakınlıkta bağlamak için 2 cm'ye kadar kesilmiş üçüncü bir 7/0 örgülü ipek parçası kullanın. Damarı kalpten uzak taraftaki ligasyondan 2 mm kesin.
- Pamuk uçlu aplikatörleri kullanarak, kalbin tepesini anatomik sola geri çevirin. Yükselen aortu tanımlamak ve harekete geçirmek için forseps kullanın. Yükselen ve inen aort arasında bir kanal oluşturmak için kavisli forsepsleri aort arkının altından geçirin.
- Düz uçlu mikrocerrahi makas kullanarak, aort arkını dallarına proksimal olarak transekte edin.
- Forseps kullanarak, pulmoner arteri tanımlayın ve harekete geçirin. Kavisli forseps kullanarak, damarın arkasında bir kanal yapın.
- Düz uçlu mikrocerrahi makas kullanarak, arteri bifurkasyonuna çok yakın bir noktada transekte edin.
- Kalan kanı kalpten temizlemek için pulmoner arter ve yükselen aorttan 2 mL 10 IU · mL − 1 heparinize sodyum klorür% 0.9 oranında nazikçe enjekte etmek için bir Rycroft sulama kanülü kullanın.
NOT: Yeterli bir kızarıklık, koroner damarlardan görünür kanın temizlenmesi ile gösterilir. - 3 cm'lik 7/0 örgülü ipek parçası kullanarak, kalan arka damarları (pulmoner damarlar) bir cerrahın düğümünü kullanarak blok halinde iki atışla birleştirin. Cerrahi makas kullanarak dikkatlice keserek kalbi arka torasik duvardan ayırın.
- Kalbi göğüs kafesinden yavaşça çıkarın, Wisconsin Üniversitesi Çözeltisi'ne (UWS) batırın ve ardından depolama için buzun üzerine yerleştirin (4 ° C'de).
3. Alıcı ameliyatı
- Hayvanın bölüm 1'de açıklandığı gibi hazırlanmasını takiben, göz yağlayıcısı uygulayın. Planlanan insizyon bölgesi boyunca ventral karın bölgesinin deri altı dokusuna ağırlık bazlı bir doz (8 mg / kg) bupivakain (% 0.25 sodyum klorür çözeltisi içinde 0.625 mg / mL'ye seyreltilmiş% 0.9) enjekte edin. Bu enjeksiyon için 29 G'lik bir insülin şırıngası kullanın ve planlanan insizyonun kapsamını kapsayan düz bir görünür lekelenme çizgisi arayın (Ek Şekil S2A-C).
NOT: Lokal anestezinin pik etkisi için zaman tanımak için beş-yedi dakika süre verilmelidir. - Mikroskop 8x büyütmeye ayarlandığında, steril bir cerrahi neşter bıçağı kullanarak ventral orta hat cilt insizyonu yapın (# 23). Laparotominin alt karın bölgesinden kostal marja kadar uzandığından emin olun. Cerrahi alanı en üst düzeye çıkarmak için bir retraktör takın (Ek Şekil S2D).
- 5 cm x 5 cm'lik bir steril gazlı bez segmentini% 0.9 oranında ısıtılmış sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin ve cerrahi bölgenin üstün yönüne yerleştirin. Nemlendirilmiş steril pamuk tomurcukları kullanarak, bağırsakları nazikçe boşaltın, bu gazlı bezin üzerine yerleştirin ve gazlı bezi organın etrafına sarın (Ek Şekil S3A).
NOT: Bu prosedür, ameliyat sırasında duyarsız sıvı kaybını azaltmaya yardımcı olur ve geri çekilmeye yardımcı olur. - Künt diseksiyon tekniği kullanarak abdominal aort ve IVC'yi çevre dokulardan serbest bırakın ve mobilize edin. Bu adım için pamuk uçlu aplikatörler ve yuvarlak gövdeli sütür forsepslerin bir kombinasyonunu kullanın. Boşluk alanının damarların böbrek altı yönü arasında ve aortun bifurkasyonunun hemen üzerinde olduğundan emin olun (Ek Şekil S3B).
NOT: Bu noktada uygun görselleştirme, yüksek kaliteli vasküler anastomozları kolaylaştıracaktır. - Arka karın damarlarını tanımlayın. Forseps kullanarak, aortu vertebral kolondan uzak bir yönde hafifçe çekiştirin (yani, karın damarlarının eksenine uzunlamasına doğru).
NOT: IVC'nin değil, sadece aortun bu şekilde ele alınması, ikincisinin gevrekliği nedeniyle önemlidir. - Planlanan anastomoz bölgesinde tanımlanan her karın damarını bağla. Kavisli forsepsleri posteriordan her iki taraftaki karın damarlarına geçirerek bu damarların her iki tarafında sefalokodal olarak bir kanal açın. Ligate her bir damar, aletlerle bağlanmış 10/0 naylon uzunluklarını cerrahın düğümlerine ek bir atışla (Ek Şekil S3C) kullanarak bu şekilde tanımlanmış ve mobilize edilmiştir.
- Anastomoz bölgesini dolaşımdan izole edin. Bunu yapmak için, hem kafaya hem de daha sonra karın damarlarının kaudal uçlarına (daha da önemlisi, bu kesin sırayla) cerrahi bir kelepçe takın. Kelepçelerin tam tıkanmayı sağlamak için her iki damarı da yeterli derecede geçtiğinden emin olun.
- Aortu sabitlemek için baskın olmayan elde forseps kullanarak, aortun ön tarafında 30 G'lik bir iğne kullanarak aortotomi yapın. Düz uçlu mikrocerrahi makas kullanarak uzatın (Ek Şekil S3D).
- Venotomi yapın. Düz forseps kullanarak, aortotominin ortasına uygun noktada IVC'ye nazik anterior traksiyon uygulayın. Aortotomiye eşit uzunlukta bir IVC segmentini çıkarmak için içbükey tarafı önden bakacak şekilde kavisli mikrocerrahi makas kullanın (Ek Şekil S4A).
- 10 IU · mL − 1 heparinize sodyum klorür çözeltisi kullanarak, kalan kanın açık damarlarının iç kısımlarını yıkayın.
- Donör kalbini karın içine yerleştirin. Pozisyonun, yükselen aortun doğrudan abdominal aortotominin yanında olacağı ve kalbin döndürüleceğinden, pulmoner arterin ikinci anastomoz için çekilebileceği şekilde olduğundan emin olun.
- 10/0 naylon kullanarak, aortotominin saat 12 pozisyonu ile yükselen aortun lümeninin karşılık gelen ekstremitesi arasına bir konaklama sütürü yerleştirin. Bunu düz uçlu forseps ve mikrocerrahi iğne tutucu kullanarak gerçekleştirin ve sonraki üç atışla bir cerrahın düğümünü kullanarak bağlayın. Yaklaşık 2 mm dikiş bırakmak için uçları kesin.
- Aortotominin saat 6 pozisyonu ile yükselen aortun karşılık gelen yönü arasına ikinci bir kalış sütürü yerleştirin. Bu dikiş aynı zamanda sonraki koşu dikişleri için temel görevi göreceğinden, nihai bağlantı için kuyruğun en az 10 mm'sini bırakın.
- Aortotominin anatomik sağ kenarına ve yükselen aortun karşılık gelen serbest kenarına karşı çıkmak için artan bir şekilde 10/0 naylondan sürekli akan bir sütür yerleştirin. Bu çizgi için yaklaşık dört atış kullanın.
- Aortotominin kalan serbest kenarı ile appozisyonu etkilemek için anatomik sol taraftan aşağıya ikinci bir sürekli çalışan sütür yerleştirmeden önce dikişin serbest ucunu distal kalış sütürünün etrafından geçirin. İki ek atışla bir cerrahın düğümünü kullanarak dikişi kuyruğa bağlayın.
- IVC venotominin saat 12 pozisyonu ile pulmoner arter lümeninin karşılık gelen ekstremitesi arasına bir kalış sütürü yerleştirin.
- Bu ankraj noktasından, pulmoner arterin anatomik sol kenarı ile venotominin karşılık gelen kenarı arasına azalan bir şekilde sürekli çalışan bir sütür yerleştirin. Bu çizgi için ortalama dört atış kullanın, ardından venotominin saat 6 pozisyonu ile pulmoner arter lümeninin karşılık gelen ekstremitesi arasında bir atış yapın. Pulmoner arterin ve venotominin son serbest kenarlarını birlikte çizmek için dört atış daha yapın.
- Dikişin serbest ucunu bir alet bağı cerrahının düğümünü iki ek atışla kullanarak çapa ucuna bağlayın.
- Pamuklu tomurcukları kullanarak kalbi karnında merkezi olarak oturacak şekilde yeniden konumlandırın. Damarları, kan akışına müdahale edecek bükülme açısından kontrol edin.
- Jel köpüğü tüm dikiş hatlarının üzerine yerleştirin (Ek Şekil S4B). Etraflarına her biri yaklaşık 2 mm'lik iki parça yerleştirin ve kalıplayın, böylece tüm görünür dikiş çizgileri kaplanır.
- Vasküler kelepçeleri serbest bırakın: önce kaudal kelepçe, sonra sefalo-kelepçe. Az miktarda kanama bekleneceğinden, basınç sağlamak için pamuk uçlu aplikatörleri anastomoz bölgelerine önceden yerleştirin.
- Gözlemlenebilir sızıntılardan arındırıldıktan sonra, kalbi nabız atışı için değerlendirin (Ek Şekil S4C). Bu gerçekleşmiyorsa, kalp damarlarında herhangi bir bükülme olmadığından emin olun (özellikle IVC için).
- Bağırsakları şimdi kalbin üzerinde ve çevresinde yeniden konumlandırın. Kuru görünüyorsa, ısıtılmış sodyum klorür çözeltisi kullanarak periton boşluğunu nemlendirin.
- Emilemeyen 6/0 prolen monofilament kullanarak karın boşluğunu katmanlar halinde kapatın:
önce kas tabakası, sonra cilt (Ek Şekil S4D). Sürekli kesintisiz tekniği kullanın. - Alıcıyı ameliyat tahtasından yavaşça çıkarın ve anesteziden çıkarın.
- Deri altından 1 mL ılık salin uygulayın ve alıcıyı postoperatif iyileşme protokollerine göre gözlem için ısınma ile önceden hazırlanmış bir kafese yerleştirin (Ek Şekil S4E).
4. Postoperatif bakım
- Ameliyattan hemen sonra, alıcıyı en az 3 saat boyunca yakın gözlem altında bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Bu süre zarfında, en az her 30 dakikada bir çeşitli parametreleri (aktivite, vücut duruşu, ceket durumu, yüz ifadesi, yürüyüş, ventilasyon, cerrahi bölgenin görünümü, palpe edilebilir bir karın kalp atışının varlığı) izleyin. Her parametreye bir puan atfedin (0 = normal, 1 = hafif veya aralıklı olarak anormal, 2 = orta veya tutarlı bir şekilde anormal).
NOT: Müdahaleler, izlenen parametrelerin toplamının, bu modelle ilgili etik protokol tarafından belirtilen refah puanlarını aşmasıyla tetiklenir. - Alıcıları, ameliyat sonrası 7. güne kadar kalacakları 25 ° C'de tutulan ısıtılmış bir kabine taşıyın. İlk 3 gün boyunca, onları günde en az 2 kez izleyin. Kalan 4 gün boyunca, onları günde en az 1 kez izleyin. Postoperatif analjezi için, ameliyat sonrası akşamları alıcı fareye deri altından ve sonraki 3 postoperatif gün boyunca günde iki kez bir doz buprenorfin (0.5-0.1 mg / kg,% 0.9 sodyum klorür ile 0.03 mg / mL'ye seyreltilmiş) uygulayın.
- Isıtılmış dolaptan çıkarıldıktan sonra, alıcıları uygun deneysel son noktaya kadar haftada en az 2 kez izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cerrahi tekniğin yara iyileşmesi ve fare iyileşmesinin iyi sonuçlarını teşvik etmedeki etkinliğini belirlemek için, laboratuvardaki erken deneyler, alıcıya değişken immünojeniteye sahip bir dizi kalp greftinin hayatta kalma özelliklerini belirlemiştir. Bunlar, alıcı ile aynı majör histokompatibilite kompleksi (MHC) belirteçlerini paylaşan konjenik (n = 5) ve sinjenik (n = 5) greftleri ve greft ile alıcının farklı MHC belirteçlerine sahip olduğu majör uyumsuzluk greftlerini (n = 9) içeriyordu. Devam eden greft fonksiyonunu ve canlılığını değerlendirmek için heterotopik abdominal kalp atışının doğrudan palpasyonunu kullandık, bu da reddedilmeye karşı toleransın vekil bir belirteci olarak hizmet eder.
Her iki kontrol grubunda da, tüm greftler 100 günlük deneysel zaman bitiş noktasında (ortalama tanımlanmamış) yaşayabilirdi. Uyumsuz grubun ortalama sağkalım süresi 9 gündü. Şekil 1 , uyumsuz ve kontrol kalp greftleri arasındaki greft sağkalımındaki keskin kontrastı gösteren Kaplan-Meier sağkalım eğrilerini göstermektedir16. Bu veriler, tekniğin prosedürü takiben uygun bir iyileşme yanıtını teşvik etmek için yeterli olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, patolojik inflamasyon varlığında, uyumsuzluk durumunda greft reddi ile temsil edilen bu durumda, doku yıkımı hızlı fonksiyon kaybına yol açar.
Şekil 1: Uyumsuzluğun ortotopik kalp nakillerinin sağkalımına etkisi. Sinjenik (n = 5) ve konjenik (n = 5) heterotopik murin kalp nakillerinin ameliyat sonrası en az 100 gün boyunca tam iyileşmesini ve kabul edildiğini gösteren sağkalım eğrileri, majör uyumsuz (n = 7) heterotopik murin kalp nakillerinin ameliyat sonrası 7. günden itibaren hızlı bir şekilde reddedilmesinin aksine. Bu veriler Prosser ve ark.16'da yayınlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Ameliyat Aşaması | Soğuk Ischemia zamanlı | Sıcak Ischemia zamanlı |
| Donör | 13 – 15 dk | |
| Depolama 4 °C | 20- 25 dk | |
| Alıcı | 22 – 25 dk |
Tablo 1: Ortotopik kalp nakli ile ilişkili donör ve alıcı ameliyatları için sıcak ve soğuk iskemi zaman aralığı.
Ek Şekil S1: Donör cerrahisinin temel yönleri. (A) İzofluran anestezisi; (B) heparin enjeksiyonu; (C) donör kalbinin açığa çıkması; (D) kalbin heparinize salin ile yıkanması; (E) Geminin bağlanması; (F) Soğuk iskemi depolaması için donör kalbi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Alıcı cerrahisinin temel yönleri-kesilmiş cilt damarlarının hazırlanması ve koterizasyonu. (A) Alıcının cerrahi saha hazırlığı; (B) bupivakain enjeksiyonu; (C) Cerrahi bölgenin steril cerrahi örtülmesi; (D) Kesilen deri damarlarının koterizasyonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S3: Bağırsakların yeniden konumlandırılmasından aortotomiye kadar alıcı cerrahisinin temel yönleri. (A) Bağırsakların geçici olarak yeniden konumlandırılması; (B) inferior vena kava açıkta bırakılmış ve kelepçelenmiş; (C) kalış dikişinin yerleştirilmesi; (D) birinci aşama: aortotomi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S4: Venotomiden iyileşmeye kadar alıcı cerrahisinin temel yönleri. (A) İkinci aşama: venotomi; (B) jel köpüğün yerleştirilmesi; (C) reperfüzyon; (D) cerrahi kapatma; (E) kurtarma. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murin ortotopik kalp nakli modeli, öncelikle MHC uyumsuzluğunun immünolojik rejeksiyonun seviyesi ve doğası üzerindeki etkilerini ve daha yakın zamanda transplantasyonun greft dokusunda yerleşik bağışıklığın tutulması üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılan sağlam bir klinik öncesi modeldir16. Başlangıçta Corry ve ark.7 protokolünü yakından takip ederken, protokolü aseptik teknik, analjezi ve anestezinin en iyi uygulama standartlarını içerecek şekilde geliştirdik. Bu yeni uygulamaların güncellenmesi, ek eğitim, steril cerrahi eldiven, önlük ve cerrahi örtülerin sağlanması, ek anestezi uygulanması ve analjezi dozunun güncellenmesi ile sağlanmıştır. Bu tür değişiklikler, cerrahi kurulum süresinde küçük bir artışa ve ameliyat başına ek maliyetlere yol açtı.
Önemli araştırma kaygılarını ele almak için hayvanların kullanımına, araştırmacılar ve bir hayvan etik komitesi (AEC) arasındaki bir sözleşme uyarınca, bu tür bir çalışmayı üstlenmek için sosyal bir lisans sağlamak üzere izin verilir. Bir AEC'nin kararları, hayvana olan maliyetleri topluma sağlanan faydalarla dengelemek için baskın bir ilke olan açık etik ilkelere15'e dayanmaktadır. Üç R kavramı (azaltma, değiştirme ve arıtma), bir projenin maliyetlerinin nasıl azaltıldığını ele almak için hayati öneme sahiptir.
Türe uygun, perioperatif analjezi ve anestezinin benimsenmesiyle ilgili hayvanlara verilen zararı en aza indirmek, hayvan cerrahi modellerinde yeri doldurulamaz bir role sahiptir ve bir arıtma örneğidir. Ek olarak, cerrahi alıcıya çevresel ve davranışsal enfeksiyon vektörleri riskini azaltan bakım ve teknikler, hem hayvana morbidite ve mortalite açısından verilen zararı azaltmak hem de tekrarlanan başarısız ameliyatlarla ilişkili finansal maliyetleri en aza indirmeye yardımcı olmak için olumlu etkilere sahiptir. Deney hayvanı "ameliyathanesinin" temizliği, bir hastane eşdeğerininkine yakından yaklaşmasa da, bu tür çalışmalarda sonradan düşünülmemelidir.
Bilimsel bir bakış açısına göre, postoperatif enfeksiyonlar mutlaka transplantasyon iyileşmesini veya reddini değerlendiren deneyler için tipik okumalar olan inflamatuar sitokinlerin ve bağışıklık hücrelerinin profilini etkiler. Bu nedenle, postoperatif enfeksiyonu kontrol etmek için maksimum çaba gösterilmelidir, bunun araştırmanın geçerliliği üzerindeki olumsuz etkisi göz önüne alındığında. Analjeziye odaklanmak, hayvan refahı açısından önemlidir. Hayvan nakli ameliyatları önemli prosedürlerdir ve deneklerin gereksiz acı ve ıstıraplarını azaltmak için büyük çaba gösterilmelidir. Bu odağın pratik sonuçlarına geri dönmek için, etkili ağrı kontrolünün ek bir pratik yararı, ağrıyla ilişkili sıkıntı belirtileri nedeniyle hayvanların deneysel protokolden çıkarılma olasılığının azalmasıdır.
Bu prosedür ilk kez tanımlandığından beri, birkaç yazar prosedür sırasında ortaya çıkan yaygın sorunların giderildiğini bildirmiştir10,11. Kelepçelerin serbest bırakılmasını takiben kanamanın kontrolü iyi tanımlanmıştır ve insan ameliyatlarında kullanılan teknikleri, yani kanama bölgesine basınç kullanımı, daha fazla dikiş ve hemostatik ajanları yansıtmaktadır. Kanamanın genellikle iki ana bölgeden birinden meydana geldiğini fark ettik: anastomoz bölgeleri veya miyokardın zarar görmesi. Kalpten kanamayı durdurmaya yönelik yaklaşımlar, atriyumun bağlanması yoluyla kalpten kanamayı kontrol eden Niimi10 tarafından bildirilmiştir. Deneyimlerimize göre, miyokardın kendisinden kan akışının kaynaklanması, zengin vaskülarizasyonu nedeniyle son derece zordur.
Bu nedenle, en sık ameliyat sırasında kalp kasına temas eden yanlış kontrol edilen bir forseps ucunun neden olduğu bu tür yaralanmalardan kaçınmak için gerekli özen gösterilmelidir. Bu nedenle, sadece nemlendirilmiş pamuk uçlu aplikatörler kullanarak kalp kasına doğrudan temas etmeye çalışıyoruz. Kalbin manipülasyonunda doğrudan teması azaltmak için, son ipek ligasyonunun serbest uçları, UWS'den göğüs boşluğuna taşınırken olduğu gibi kalbi hareket ettirmek için kullanılabilir.
İkinci büyük zorluk, ötenaziyi zorunlu kılan bir komplikasyon olan postoperatif arka ekstremite felcinin önlenmesidir. Anekdotsal olarak, >30 dakikalık sıcak bir iskemik sürenin, bu felcin meydana gelme riskinin daha yüksek olmasıyla ilişkili olduğunu bulduk. İskemik zamanlarımız sıkı bir şekilde izlenir ve gayri resmi bir performans standardı olarak kaydedilir. Bununla birlikte, iskemik zamanın bu komplikasyonu güvenilir bir şekilde öngörmediği belirtilmelidir. Örneğin, önemli cerrahi deneyime sahip bir cerrah olan Niimi10 (3.000'den fazla ameliyat), 2 saate kadar iskemik sürelerin kabul edilebilir olduğunu bildirmiştir.
Belki de bundan daha da şaşırtıcı olanı, sıçanlarda benzer bir teknik geliştiren, ancak karın bölgesinde uçtan uca bir anastomoz kurulumu kullanan Abbott ve ark.5 (yani, IVC ve abdominal aort kalıcı olarak bağlandı), herhangi bir belirgin kötü etki olmadan 100 günden fazla süren uzun süreli hayatta kalanlar olarak tutulan iki sıçan hakkında rapor verdiler. Sonuçlardaki bu gruplar arası farklılıklar belki de ince bir şekilde farklı tekniklerle veya alternatif olarak, farklı fare suşları arasındaki genetik farklılıklarla açıklanmaktadır. Örneğin, Ly5.1 farelerinin bu komplikasyona BALB / c farelerden çok daha duyarlı olduğunu not ediyoruz. İskemik zamanın arka ekstremite paralizisi insidansı üzerindeki etkilerinin netliğini artırmak için, abdominal damar tıkanıklığı zaman uzunluğunun etkisi araştırılabilir.
Özetle, açıklanan bu protokol, hazır bulunan ilaçları ve materyalleri kullanarak yerleşik tekniklere basit iyileştirmeler sağlar. Bu iyileştirmeler, bu cerrahi modelin gerçekleştirildiği standardı klinik veterinerlik standartlarına uygun hale getirir ve hayvanlara ve nihayetinde araştırmaya fayda sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Batı Avustralya Üniversitesi hayvan bakım personelinin ve Harry Perkins Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nün özveri ve uzmanlıklarının bu ameliyatların fizibilitesine ve başarısına katkıda bulunan mükemmel çabalarını kabul etmek isterler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved - 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator - 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight - 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp - 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape - 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors - curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture - 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle - 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe - 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe - 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | ||
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M.
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F.
- Downie, H. G.
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C.
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
