Summary
Denna artikel beskriver en modifierad teknik för heterotopisk vaskulariserad hjärttransplantation med uppdaterad aseptisk teknik, analgesi och anestesi.
Abstract
Utvecklingen av experimentella modeller för hjärttransplantation hos djur har bidragit till många framsteg inom immunologi och organtransplantation. Medan den heterotopiska vaskulariserade murina hjärttransplantationsmodellen ursprungligen användes i studier av transplantatavstötning med kombinationer av felaktiga inavlade musstammar, kan tillgång till genetiskt modifierade stammar och terapeutiska modaliteter ge kraftfulla nya prekliniska insikter. I grund och botten har den kirurgiska metoden för denna teknik inte förändrats sedan dess utveckling, särskilt med avseende på viktiga faktorer som aseptisk teknik, anestesi och analgesi, vilket gör materiella effekter på postkirurgisk sjuklighet och dödlighet. Dessutom förväntas förbättringar i perioperativ hantering ge förbättringar i både djurskydd och försöksresultat. Denna uppsats rapporterar om ett protokoll som utvecklats i samarbete med en ämnesexpert inom veterinäranestesi och beskriver den kirurgiska tekniken med tonvikt på perioperativ hantering. Dessutom diskuterar vi konsekvenserna av dessa förbättringar och ger information om felsökning av kritiska kirurgiska steg för denna procedur.
Introduction
Mycket av vår förståelse av immunologi och transplantation har vi att tacka för forskning baserad på experimentella modeller av organtransplantation med hjälp av djur. Sedan den första beskrivningen av vaskulariserad hjärttransplantation hos däggdjur1 har sådana modeller bidragit till kunskap inom omfattande områden, inklusive terapeutisk tillämpning av hypotermi2, fördelarna med att använda specialiserade suturer3 och tekniker för totala lung- och hjärthomotransplantationer4. Utvecklingen av hjärttransplantationsmodeller hos råtta 5,6 gav bredare utrymme för immunologiska experiment på grund av tillgången på olika avelslinjer. Det betydligt bredare utbudet av tillgängliga inavlade och muterade musstammar ledde Corry et al.7 att utveckla en teknik för murin heterotopisk hjärttransplantation på grund av de betydande fördelar som detta sortiment ger transplantationsforskningen. Denna modell har använts i stor utsträckning och har bidragit till en större förståelse för transplantatavstötning8 och terapi9. Sedan den första beskrivningen har tekniken dock varit i stort sett oförändrad förutom några mindre tekniska detaljer som justeringar av positionen för anastomotiska platser10,11.
Sedan integrationen av Corry et al.7-tekniken i våra experiment har vi identifierat lovande områden för att förbättra protokollet, nämligen aseptisk teknik, anestesi och analgesi. Förbättringar på dessa områden förväntades ge en positiv inverkan på försöksresultaten och förbättra djurens välbefinnande. Detta har tidigare visats när aseptisk teknik används vid operationer av små djur eftersom det hjälper till att minska postoperativa infektioner12, vilket inte bara påverkar sjuklighet och dödlighet utan också kan äventyra experiment som är utformade för att bedöma immunsvaret efter transplantationskirurgi. Ur anestesi och smärtstillande synvinkel bidrar användningen av en raffinerad regim till att minska kostnaden för djur och balansera det etiska argumentet för denna kirurgiska modell genom att mildra smärta och lidande hos experimentella ämnen. Vidare begränsar lämplig anestesi och analgesi det smärtassocierade stressresponsen, förbättrar kvaliteten på postoperativ återhämtning och i slutändan ökar den kirurgiska framgångsgraden13.
I syfte att förbättra både djurskydd och försöksresultat utvecklades ett protokoll med justeringar för att överbrygga dessa luckor. Detta protokoll har anpassats från det som ursprungligen beskrivits av Corry et al.7 med samråd från en veterinärmedicinsk anestesiläkare och med vederbörlig hänsyn till både effekterna och varaktigheten av effekterna av de farmakologiska ingrepp som används i anestesi- och smärtstillande regimen. Tillvägagångssättet baserades på principerna om balanserad anestesi och multimodal analgesi för att säkerställa lämplig perioperativ vård14. Förutom tillämpningen av aseptisk teknik administrerades opioiden buprenorfin och lokalbedövningsmedlet bupivakain i förebyggande syfte. Allmän anestesi utfördes med hjälp av inhalationsanestesimedlet isofluran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning utfördes i enlighet med Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes15 och godkändes enligt djuretiska protokoll RA/3/100/1568 och AE173 (University of Western Australia Animal Ethics Committee respektive Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee). Se materialförteckningen för detaljer om alla material, instrument och djur som används i detta protokoll.
1. Förberedelse av djuret för operation
OBS: Personalen är dedikerad till antingen rollen att utföra kirurgi eller övervaka anestesi under hela proceduren.
- För preoperativ analgesi, administrera en dos buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg, utspädd till 0,03 mg/ml med natriumklorid 0,9 %) subkutant till mottagarmusen minst 1 timme innan mottagaroperationen inleds. Ange alla detaljer relaterade till administrering av läkemedel, deras dos, administreringstid och deras effekter i narkosposten.
OBS: Detta tillvägagångssätt är inte nödvändigtvis nödvändigt för donatorn eftersom det är en icke-återhämtningsoperation, där givaren avlivas under narkos omedelbart efter organets skörd. - Induktion av anestesi
- Placera musen i anestesiandningssystemets induktionskammare med ett syreflöde på 1-2 l·min−1 med 4 % isofluran. Bekräfta adekvat anestesi genom att observera liggande, förlust av rätningsreflexen och minskad andningsfrekvens.
- När den är tillräckligt bedövad, ta bort musen från induktionskammaren och raka den ventrala buken noggrant med klippare för att ta bort hår. När det gäller givaren, raka området som sträcker sig från könsorganen till den övre marginalen av den ventrala bröstkorgen. När det gäller mottagaren, raka området som sträcker sig från könsorganen till kostmarginalen. I båda fallen, se till att det rakade området når midaxillärlinjen i sidled.
- För att upprätthålla anestesi, placera musen i dorsal liggande för att ta emot bedövning och syre från näskonen i andningssystemet (icke-rebreathing), som levererar syre med en hastighet av 1 L·min−1 och isofluran (1,5%-2,5%).
OBS: Den kirurgiska arbetsytan är ett kirurgiskt kort över en värmedyna, och varje lem av musen är säkrad med mikroportejp. - Med tanke på svårigheten att omfattande övervaka de fysiologiska förändringarna i samband med anestesi hos möss, övervaka och registrera begränsade parametrar. Övervaka temperaturen, anestesidjupet och andningsfrekvensen minst var 5: e minut under anestesi.
- För att förhindra allvarlig hypotermi och hypertermi (från aktiv uppvärmning av värmedynan), övervaka kroppstemperaturen under hela proceduren. Sätt in en ren, smord rektal sond i djurets rektum och säkra den sedan på operationskortet med mikroportejp.
OBS: Denna sond matar tillbaka till ett dynamiskt system (en funktion i anestesitillförselsystemet), som modifierar värmedynans temperatur för att hantera kroppstemperaturen. - Låt den person som ansvarar för anestesi bedöma bedövningsdjupet genom att observera svar på stimulering av tassen eller svansen från tryck som appliceras av atraumatiska pincett, palpebralreflexen och muskeltonus.
- Mät andningsfrekvensen genom att observera bröstväggens rörelse medan du observerar andningsansträngningen subjektivt för att bedöma tidalvolymen. Beräkna andningsfrekvensen genom att räkna andetag under en period på 10-15 s och multiplicera med 6 respektive 4 för att bestämma en andningsfrekvens / min.
- För att förhindra allvarlig hypotermi och hypertermi (från aktiv uppvärmning av värmedynan), övervaka kroppstemperaturen under hela proceduren. Sätt in en ren, smord rektal sond i djurets rektum och säkra den sedan på operationskortet med mikroportejp.
- För att förbereda huden, desinficera operationsområdet med sterila bomullsspetsade applikatorer. Applicera klorhexidin i en cirkulär, expanderande rörelse som arbetar från mitten av operationsområdet till kanterna. Upprepa denna process 3x (med en ny bomullsspetsad applikator varje gång) innan en slutlig applicering av en kombination av klorhexidin och etanol med en ny steril bomullsspetsapplikator i samma mönster, som rör sig från mitten av operationsområdet till kanten.
- Låt kirurgen applicera en etanolbaserad handgel innan du tar på dig en steril kirurgisk klänning och sterila kirurgiska handskar.
- För att förbereda det kirurgiska fältet, placera sterila kirurgiska draperier (förskurna till 25 cm x 25 cm) på vardera sidan av operationskortet, som fungerar som plats för att placera sterila instrument. Använd steril sax för att fenestrera ett bredare 25 cm x 40 cm sterilt draperi för att skära en liten (något längre än snittstället), ovalformad öppning. Lägg detta draperi över toppen av djuret så att fenestrationen ligger vid det föreslagna snittstället. Se till att sidoändarna på detta tredje draperi överlappar de två mindre draperierna på vardera sidan för att skapa ett kontinuerligt kirurgiskt fält.
2. Donatorkirurgi
OBS: Se kompletterande figur S1 för de viktigaste aspekterna av donatorkirurgi.
- Utför donatoroperationen med hjälp av ett kirurgiskt binokulärt mikroskop. För att börja, använd en förstoring på 8x och utför ett ventralt mittlinjesnitt med ett kirurgiskt skalpellblad (# 23). Se till att snittet sträcker sig från den kaudala änden av det rakade området till costalmarginalen med en intakt marginal av beredd hud i vardera änden.
OBS: Startförstoringen på 8x väljs för att möjliggöra tillräcklig visualisering av försökspersonens makrostruktur i början av operationen. Från och med nu är förstoringen efter operatörens eget gottfinnande och bör väljas för att ge en lämplig balans mellan situationsmedvetenheten som ges av lägre förstoring och de fina detaljerna som kan visualiseras med högre förstoring. - Använd två sterila bomullsspetsade applikatorer fuktade med uppvärmd normal saltlösning, flytta tunntarmen för att exponera bukaortan och sämre vena cava (IVC). Använd applikatorerna för att trubbigt dissekera dessa kärl från den omgivande vävnaden.
- Använd en 3,0 ml spruta med en 30 G, 0,5 tum nål för att dra upp 2,5 ml 100 IE · ml −1 hepariniserad natriumklorid 0,9% lösning (hålls vid 4 ° C tills det krävs under operationen). Använd rakspetsade, runda kroppssuturpincett med den icke-dominerande handen för att säkra bukaortan i det infradiafragmatiska området, använd den dominerande handen för att injicera 1,5 ml lösning i aortan i riktning mot hjärtat. Försegla den resulterande aortotomin med tryck från en bomullsspetsad applikator.
- Använd rak spets mikrokirurgisk sax för att transektera IVC för att möjliggöra exsanguination.
- Utför en thorakotomi med kirurgisk sax för att göra två snitt i de bilaterala midaxillära linjerna. Vid denna punkt, bekräfta djurets död och stäng av isofluranförångaren.
- Säkra det resulterande mediansegmentet av bröstväggen med hjälp av en mikrobulldoggklämma. Skicka detta till den icke-sterila kirurgiska assistenten som kan säkra detta till näskonen med hjälp av mikroporkirurgisk tejp.
OBS: Målet är att ge dragkraft på detta segment av bröstkorgen, vilket hjälper till med exponering av hjärtvävnaderna. - Använd runda kroppssuturpincett, identifiera och mobilisera intra-thorax IVC.
OBS: Helst bör de raka spetsarna vara i den icke-dominerande handen och de böjda pincetterna i den dominerande handen. - Med IVC säkrad i den icke-dominanta handens pincett, använd den dominerande handen för att injicera de återstående 1,5 ml 100 IE · ml − 1 hepariniserad natriumklorid 0,9% lösning i hjärtat.
- Använd båda uppsättningarna pincett och ligera IVC med 7/0 flätat siden med 2 cm längd. Använd en instrumentknut med kirurgknut med ytterligare två kast för säkerhet. Gör denna knut så proximal längs kärlet till hjärtat som möjligt.
- Säkra de två ändarna av denna knut med hjälp av artärpincett. Placera dessa pincett så att de ger mild dragkraft i hjärtat i kaudalriktningen för att underlätta optimal kärlpositionering för efterföljande dissektion.
- Identifiera tymus vid den anterosuperior aspekten av hjärtat. Använd pincett för att dissekera detta organ från givaren för att identifiera överlägsen vena cava (SVC).
- Ta bort adventitia och tillhörande vävnader i SVC med hjälp av pincett. Använd böjda pincett för att trubbigt dissekera och göra en liten kanal bakom kärlet. Se till att denna kanal är så proximal för hjärtat som möjligt.
- För en bit 7/0 flätat siden med 2 cm längd genom denna kanal med pincett och bind den sedan med ovannämnda teknik.
- Vid en punkt ungefär 2 mm från denna ligering (på sidan mittemot hjärtat), dela SVC med böjd mikrokirurgisk sax.
- Använd bomullsspetsapplikatorer, vänd hjärtat till anatomiskt höger.
- Identifiera den azygota venen på den anatomiska vänstra delen av hjärtat. Använd pincett, dissekera det helt enkelt från omgivande strukturer. Som tidigare, använd böjda pincett för att skapa en liten kanal bakom detta kärl.
- Använd en tredje bit 7/0 flätat siden skuren till 2 cm för att ligera den azygota venen i maximal närhet till hjärtat med samma knutbindningsteknik. Skär kärlet 2 mm från ligeringen på sidan bort från hjärtat.
- Använd bomullsspetsade applikatorer, vänd hjärtans topp tillbaka till den anatomiska vänster. Använd pincett för att identifiera och mobilisera den stigande aortan. För de böjda pincetterna under aortabågen för att skapa en kanal mellan den stigande och nedåtgående aortan.
- Använd en mikrokirurgisk sax med rak spets och överför aortabågen proximalt till dess grenar.
- Använd pincett, identifiera och mobilisera lungartären. Använd böjda pincett och gör en kanal bakom kärlet.
- Använd en rak mikrokirurgisk sax och transektera artären vid en punkt som bara är proximal till dess bifurkation.
- Använd en Rycroft-bevattningskanyl för att försiktigt injicera 2 ml 10 IE · ml-1 hepariniserad natriumklorid 0,9% genom lungartären och stigande aorta för att spola eventuellt kvarvarande blod från hjärtat.
OBS: En adekvat spolning indikeras av clearance av synligt blod från kranskärlen. - Använd en 3 cm bit 7/0 flätat siden, ligera de återstående bakre kärlen (lungvenerna) en bloc med hjälp av en kirurgknut med två efterföljande kast. Separera hjärtat från den bakre bröstväggen genom att försiktigt klippa med kirurgisk sax.
- Ta försiktigt bort hjärtat från bröstkorgen, sänk ner det i University of Wisconsin Solution (UWS) och lägg det sedan på is för förvaring (vid 4 ° C).
3. Mottagande kirurgi
- Efter beredning av djuret enligt beskrivningen i avsnitt 1, applicera ögonsmörjmedel. Injicera en viktbaserad dos (8 mg/kg) bupivakain (0,25 % utspädd till 0,625 mg/ml i natriumklorid 0,9 % lösning) i den subkutana vävnaden i buken längs det planerade snittstället. Använd en 29 G insulinspruta för denna injektion och leta efter en rak linje av synligt blebbing som täcker omfattningen av det planerade snittet (kompletterande figur S2A-C).
OBS: Fem-sju minuter bör ges för att ge tid för maximal effekt av lokalbedövningen. - Med mikroskopet inställt på 8x förstoring, gör ett ventralt mittlinjesnitt med ett sterilt kirurgiskt skalpellblad (# 23). Se till att laparotomi sträcker sig från underlivet till kostmarginalen. Sätt i ett upprullningsdon för att maximera operationsfältet (kompletterande figur S2D).
- Fukta ett 5 cm x 5 cm segment av steril gasbindning med uppvärmd 0,9% natriumkloridlösning och placera den på den överlägsna aspekten av operationsområdet. Använd fuktade sterila bomullspinnar, ta försiktigt bort tarmarna, placera dem ovanpå denna gasväv och linda gasväven runt organet (kompletterande figur S3A).
OBS: Denna procedur hjälper till att minska okänslig vätskeförlust under operationen och hjälper till med indragning. - Frigör och mobilisera bukaorta och IVC från omgivande vävnader med hjälp av en trubbig dissektionsteknik. Använd en kombination av bomullsspetsade applikatorer och suturpincett med rund kropp för detta steg. Se till att frigångsområdet ligger mellan kärlens infrarenala aspekt och strax ovanför förgreningen av aortan (kompletterande figur S3B).
OBS: Lämplig visualisering vid denna tidpunkt kommer att underlätta vaskulära anastomoser av hög kvalitet. - Identifiera de bakre bukkärlen. Dra försiktigt aortan i en riktning bort från ryggraden (dvs längsgående till bukkärlens axel) med hjälp av pincett.
OBS: Det är viktigt att endast aortan och inte IVC hanteras på ett sådant sätt på grund av den senares sprödhet. - Ligera varje bukkärl som identifierats i den planerade anastomotiska zonen. Gör en kanal på vardera sidan av dessa kärl cefalocaudalt genom att föra de krökta pincetterna bakom bukkärlen på vardera sidan. Ligate varje fartyg identifieras och mobiliseras på detta sätt med längder av 10/0 nylon bunden med instrument i kirurgens knutar med ytterligare ett kast (kompletterande figur S3C).
- Isolera det anastomotiska stället från cirkulationen. För att göra det, installera en kirurgisk klämma både i huvudet och sedan de kaudala ändarna av bukkärlen (viktigare, i den exakta ordningen). Se till att klämmorna korsar båda kärlen i tillräcklig grad för att säkerställa fullständig ocklusion.
- Använd pincett i den icke-dominerande handen för att stabilisera aortan, utför en aortotomi med en 30 G nål vid den främre aspekten av aortan. Förläng den med rak spets mikrokirurgisk sax (kompletterande figur S3D).
- Utför en venotomi. Använd raka pincett, applicera mild främre dragkraft på IVC vid punkten i linje med mitten av aortotomi. Använd böjd mikrokirurgisk sax med den konkava sidan vänd framåt för att ta bort ett segment av IVC av samma längd som aortomin (kompletterande figur S4A).
- Använd 10 IE · ml-1 hepariniserad natriumkloridlösning, tvätta insidan av de öppnade kärlen av kvarvarande blod.
- Placera donatorhjärtat i buken. Se till att positioneringen är sådan att den stigande aortan är direkt vid sidan av bukaortomin och hjärtat roteras så att lungartären kan dras över för den andra anastomosen.
- Använd 10/0 nylon, placera en stag sutur mellan klockan 12 av aortotomi och motsvarande extremitet av lumen i den stigande aortan. Utför detta med rakspetsad pincett och en mikrokirurgisk nålhållare och knyt den med en kirurgknut med tre efterföljande kast. Skär ändarna för att lämna ca 2 mm sutur.
- Placera en andra vistelsesutur mellan aortotomis position klockan 6 och motsvarande aspekt av den stigande aortan. Eftersom denna sutur också kommer att fungera som bas för efterföljande löpande suturer, lämna minst 10 mm av svansen för den ultimata bindningen.
- Placera en kontinuerlig löpsutur av 10/0 nylon på ett stigande sätt för att motsätta sig den anatomiska högra kanten av aortomin och motsvarande fria kanten av den stigande aortan. Använd ungefär fyra kast för den här raden.
- För den fria änden av suturen runt den distala vistelsesuturen innan du placerar en andra kontinuerlig löpande sutur längs den anatomiska vänstra sidan för att påverka appositionen med den återstående fria kanten av aortotemi. Bind av suturen till svansen med hjälp av en kirurgknut med ytterligare två kast.
- Placera en vistelsesutur mellan klockan 12 för IVC-venotomi och motsvarande extremitet av lungartärens lumen.
- Från denna ankarpunkt, placera en kontinuerlig löpande sutur på ett fallande sätt mellan lungartärens anatomiska vänstra kant och motsvarande kant av venotomi. Använd i genomsnitt fyra kast för denna linje följt av en mellan klockan 6 för venotomi och motsvarande extremitet av lungartärlumen. Gör ytterligare fyra kast för att dra de sista fria kanterna i lungartären och venotomi tillsammans.
- Bind av suturens fria ände till ankaränden med hjälp av en instrumentknut med kirurgknut med ytterligare två kast.
- Flytta hjärtat så att det sitter centralt i buken med bomullspinnar. Kontrollera kärlen för vridning, vilket skulle störa blodflödet.
- Placera gelskum över alla suturlinjer (kompletterande figur S4B). Placera och forma två stycken på ca 2 mm vardera runt dem så att alla synliga suturlinjer täcks.
- Släpp kärlklämmorna: först den kaudala klämman och sedan cephalo-klämman. Eftersom en liten mängd blödning kan förväntas, placera i förebyggande syfte bomullsspetsade applikatorer över de anastomotiska platserna för att ge tryck.
- När det är fritt från observerbara läckor, bedöm hjärtat för pulsation (kompletterande figur S4C). Om detta inte inträffar, kontrollera att ingen vridning av hjärtkärlen har inträffat (särskilt för IVC).
- Flytta tarmarna nu över och runt hjärtat. Om det verkar torrt, fukta bukhålan med uppvärmd natriumkloridlösning.
- Stäng bukhålan med icke-absorberbar 6/0 prolene monofilament med lager:
först muskelskiktet och sedan huden (kompletterande figur S4D). Använd den kontinuerliga oavbrutna tekniken. - Ta försiktigt bort mottagaren från operationskortet och ta bort det från bedövningsmedlet.
- Administrera 1 ml varm saltlösning subkutant och placera mottagaren i en förberedd bur med uppvärmning för observation enligt postoperativa återhämtningsprotokoll (kompletterande figur S4E).
4. Postoperativ vård
- Omedelbart efter operationen, placera mottagaren i en ren bur på en värmedyna under noggrann observation i minst 3 timmar. Under denna period, övervaka olika parametrar (aktivitet, kroppshållning, pälstillstånd, ansiktsuttryck, gång, ventilation, utseende på operationsområdet, närvaro av en palpabel bukhjärtslag) minst var 30: e minut. Tillskriv en poäng till varje parameter (0 = normal, 1 = något eller intermittent onormal, 2 = måttligt eller konsekvent onormal).
OBS: Interventioner utlöses av summan av de övervakade parametrarna som överstiger välfärdspoäng som anges i det etiska protokollet relaterat till denna modell. - Flytta mottagarna till ett uppvärmt skåp som hålls vid 25 °C, där de förblir till post-op dag 7. Under de första 3 dagarna, övervaka dem minst 2x dagligen. Under de återstående 4 dagarna, övervaka dem minst 1x dagligen. För postoperativ analgesi, administrera en dos buprenorfin (0,5-0,1 mg/kg, utspädd till 0,03 mg/ml med natriumklorid 0,9 %) subkutant till mottagarmusen på kvällen efter operationen och två gånger dagligen under de kommande 3 postoperativa dagarna.
- När du har tagit bort det uppvärmda skåpet ska du övervaka mottagarna minst 2x varje vecka tills lämplig experimentell slutpunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma effektiviteten av den kirurgiska tekniken för att främja goda resultat av sårläkning och musåterhämtning bestämde tidiga experiment i laboratoriet överlevnadsegenskaperna hos en rad hjärttransplantat med varierande immunogenicitet för mottagaren. Dessa inkluderade kongena (n = 5) och syngena (n = 5) transplantat, som delar samma stora histokompatibilitetskomplex (MHC) markörer som mottagaren, och större missmatchningstransplantat (n = 9), där transplantatet och mottagaren har olika MHC-markörer. Vi använde direkt palpation av den heterotopiska bukhjärtslaget för att bedöma pågående transplantatfunktion och livskraft, vilket fungerar som en proxymarkör för avstötning kontra tolerans.
I båda kontrollgrupperna var alla transplantat livskraftiga vid experimentets tidsslutpunkt på 100 dagar (medelvärde odefinierat). Den felmatchade gruppen hade en genomsnittlig överlevnadstid på 9 dagar. Figur 1 visar Kaplan-Meiers överlevnadskurvor som visar den skarpa kontrasten i transplantatöverlevnad mellan felmatchade och kontrollhjärttransplantat16. Dessa data tyder på att tekniken är tillräcklig för att främja ett lämpligt läkningssvar efter proceduren. I närvaro av patologisk inflammation, i detta fall representerad av transplantatavstötning i mismatch-tillståndet, leder vävnadsförstöring till snabb funktionsförlust.
Figur 1: Påverkan av missmatchning på överlevnaden av ortotopiska hjärttransplantationer. Överlevnadskurvor som illustrerar fullständig återhämtning och acceptans av syngena (n = 5) och kongena (n = 5) heterotopiska murina hjärttransplantationer i minst 100 dagar efter operationen i motsats till den snabba avstötningen av större felmatchade (n = 7) heterotopiska murina hjärttransplantationer från så tidigt som dag 7 efter operationen. Dessa data publicerades i Prosser et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Kirurgi stadium | Kall ischemi tid | Varm ischemi tid |
| Givare | 13 – 15 min | |
| Förvaring 4 °C | 20- 25 minuter | |
| Mottagare | 22 – 25 minuter |
Tabell 1: Intervall för varma och kalla ischemitider för givar- och mottagaroperationer i samband med ortotopisk hjärttransplantation.
Kompletterande figur S1: Viktiga aspekter av donatorkirurgi. a) Isofluranbedövning. b) Injektion av heparin. c) givarhjärtat exponeras, d) Spolning av hjärtat med hepariniserad saltlösning. E) Bindning av fartyget. F) donatorhjärta för förvaring av kall ischemi. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Viktiga aspekter av mottagarkirurgi-förberedelse och cauterization av skurna hudkärl. (A) Mottagande förberedelse av operationsområdet; b) Injektion av bupivakain. c) Steril drapering av operationsområdet. d) Kauterisering av de skurna hudkärlen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Viktiga aspekter av mottagarkirurgi - från ompositionering av tarmar till aortotomi. (A) Tillfällig omplacering av tarmar; (B) sämre vena cava exponerad och fastklämd; c) placering av vistelsesuturen, D) Första fasen: aortotomi. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: Viktiga aspekter av mottagarkirurgi - från venotomi till återhämtning. A) Andra fasen: venotomi. b) placering av gelskummet, c) reperfusion, d) Kirurgisk stängning. E) återvinning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den murina ortotopiska hjärttransplantationsmodellen är en robust preklinisk modell som främst används för att undersöka effekterna av MHC-matchning på nivån och arten av immunologisk avstötning och, mer nyligen, effekten av transplantation på bibehållandet av transplantatvävnadsresident immunitet16. Medan vi inledningsvis noggrant följer Corry et al.7-protokollet har vi förfinat protokollet för att införliva bästa praxis för aseptisk teknik, analgesi och anestesi. Uppdateringen av dessa nya metoder uppnåddes genom ytterligare utbildning, tillhandahållande av sterila kirurgiska handskar, klänningar och kirurgiska draperier, applicering av ytterligare anestesi och uppdatering av smärtlindringsdoseringen. Sådana förändringar ledde till en liten ökning av kirurgisk installationstid och extra kostnader per operation.
Användning av djur för att ta itu med viktiga forskningsproblem är tillåtet enligt ett avtal mellan forskare och en djurförsöksetisk kommitté (AEC) för att upprätthålla en social licens för att utföra sådant arbete. Beslut av en AEC baseras på tydliga etiska riktlinjer15, med en övergripande princip om att balansera kostnaderna för djuret mot fördelarna för samhället. Konceptet med de tre R:en (minskning, ersättning och förfining) är avgörande för att hantera hur kostnaderna för ett projekt mildras.
Att minimera skadan på de djur som är involverade genom antagandet av artanpassad, perioperativ analgesi och anestesi har en oersättlig roll i djurmodeller för kirurgi och är ett exempel på förfining. Dessutom har vård och tekniker som minskar risken för miljö- och beteendevektorer av infektion till den kirurgiska mottagaren positiva konsekvenser för att både minska skadan på djuret när det gäller sjuklighet och dödlighet och hjälpa till att minimera de ekonomiska kostnaderna i samband med upprepade misslyckade operationer. Även om renheten hos försöksdjurets "operationssal" inte närmar sig den hos en sjukhusekvivalent, borde det inte vara en eftertanke i sådant arbete.
Ur ett vetenskapligt perspektiv påverkar postoperativa infektioner nödvändigtvis profilen för inflammatoriska cytokiner och immunceller, som är de typiska avläsningarna för experiment som bedömer transplantationsåterhämtning eller avstötning. Maximal ansträngning bör därför göras för att kontrollera postoperativ infektion, med tanke på den negativa inverkan detta kan ha på forskningens giltighet. Fokuseringen på smärtlindring är viktig ur djurskyddssynpunkt. Djurtransplantationsoperationer är stora ingrepp, och stora ansträngningar bör göras för att minska onödig smärta och onödigt lidande hos försökspersonerna. För att återgå till de praktiska resultaten av detta fokus är en ytterligare praktisk fördel med effektiv smärtkontroll den minskade sannolikheten för att djur tas bort från försöksprotokollet på grund av smärtrelaterade tecken på nöd.
Sedan denna procedur först beskrevs har flera författare rapporterat felsökning av vanliga problem som uppstår under proceduren10,11. Kontrollen av blödning efter frisättning av klämmorna är väl beskriven och speglar tekniker som används vid mänskliga operationer, nämligen användning av tryck till blödningsstället, ytterligare suturering och hemostatiska medel. Vi har märkt att blödning ofta uppstår från en av två huvudplatser: anastomosställen eller skador på myokardiet. Metoder för att stoppa blödning från hjärtat har rapporterats av Niimi10, som kontrollerade blödning från hjärtat genom ligering av förmaket. Enligt vår erfarenhet är stammen av blodflödet från själva myokardiet exceptionellt utmanande på grund av dess rika vaskularisering.
Vederbörlig försiktighet måste därför iakttas för att undvika sådan skada, som oftast orsakas av en felkontrollerad tångspets som kontaktar hjärtmuskeln under operationen. Vi strävar därför efter att endast kontakta hjärtmuskeln direkt med hjälp av fuktade bomullsapplikatorer. För att minska direktkontakt vid manipulation av hjärtat kan de fria ändarna av den slutliga silkeligeringen användas för att flytta hjärtat, till exempel när det flyttas från UWS till brösthålan.
En andra stor utmaning är att förebygga postoperativ förlamning av bakbenen, en komplikation som kräver dödshjälp. Anekdotiskt har vi funnit att en varm ischemisk tid på >30 min är förknippad med en högre risk för att denna förlamning uppstår. Våra ischemiska tider övervakas strikt och registreras som en informell prestationsstandard. Det bör dock noteras att ischemisk tid inte verkar förutsäga denna komplikation på ett tillförlitligt sätt. Niimi10, till exempel, en kirurg med betydande operativ erfarenhet (över 3 000 operationer), rapporterade att ischemiska tider på upp till 2 timmar är acceptabla.
Kanske ännu mer häpnadsväckande än detta, Abbott et al.5, som utvecklade en liknande teknik hos råttor men använde en anastomotisk inställning i buken (dvs. IVC och bukaorta ligerades permanent), rapporterade om två råttor som hölls som långsiktiga överlevande som varade över 100 dagar utan några uppenbara skadeverkningar. Dessa skillnader mellan grupper i resultat förklaras kanske av subtilt olika tekniker eller alternativt av de genetiska skillnaderna mellan olika mössstammar. Till exempel noterar vi att Ly5.1-möss är mycket mer mottagliga för denna komplikation än BALB / c-möss. För att förbättra klarheten om effekterna av ischemisk tid på incidensen av förlamning i bakbenen kan effekten av ocklusionstidslängd för bukkärl undersökas.
Sammanfattningsvis ger detta beskrivna protokoll enkla förbättringar av etablerade tekniker med lättillgängliga läkemedel och material. Dessa förbättringar anpassar standarden till vilken denna kirurgiska modell utförs till den för kliniska veterinärmedicinska standarder och gynnar djuren och i slutändan forskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna de fantastiska ansträngningarna från djurvårdspersonalen vid University of Western Australia och Harry Perkins Institute of Medical Research, vars engagemang och expertis bidrog till genomförbarheten och framgången för dessa operationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved - 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator - 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight - 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp - 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape - 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors - curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture - 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle - 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe - 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe - 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | ||
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M.
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F.
- Downie, H. G.
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C.
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
