Summary
Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.
Abstract
Um modelo animal de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) é útil para patologistas, terapeutas, farmacologistas e pesquisadores da audição entenderem completamente o mecanismo da PAIR e, posteriormente, otimizarem as estratégias de tratamento correspondentes. Este estudo tem como objetivo criar um protocolo aprimorado para o desenvolvimento de um modelo de PAIR em camundongos. Camundongos C57BL/6J machos foram utilizados neste estudo. Camundongos não anestesiados foram expostos a ruídos intensos (1 e 6 kHz, apresentados simultaneamente a 115-125 dB NPS-A) continuamente por 6 h por dia durante 5 dias consecutivos. A função auditiva foi avaliada 1 dia e 1 semana após a exposição ao ruído, por meio do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE). Após a medida do PEATE, os camundongos foram sacrificados e seus órgãos de Corti foram coletados para coloração por imunofluorescência. A partir das medidas do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE), observou-se perda auditiva significativa 1 dia após a exposição ao ruído. Após 1 semana, os limiares auditivos dos camundongos experimentais diminuíram para ~80 dB NPS, que ainda era um nível significativamente maior do que os camundongos controles (~40 dB NPS). A partir dos resultados da imagem de imunofluorescência, as células ciliadas externas (CCE) mostraram-se danificadas. Em resumo, criamos um modelo de PAIR usando camundongos machos C57BL/6J. Um novo e simples dispositivo para gerar e fornecer ruído de tom puro foi desenvolvido e então empregado. As medidas quantitativas dos limiares auditivos e a confirmação morfológica do dano das CCE demonstraram que o ruído aplicado induziu com sucesso uma perda auditiva esperada.
Introduction
Cerca de 1,3 bilhão de pessoas no mundo sofrem de perda auditiva devido à exposição ao ruído1. O objetivo deste estudo foi estabelecer um passo a passo claro para a indução e confirmação da perda auditiva induzida por ruído (PAIR). A PAIR resulta de degeneração/destruição das células ciliadas (HCs) e neurônios do gânglio espiral (SGNs), dano nos estereocílios do HC e/ou perda de sinapses entre os HCs internos da cóclea e os SGNs. Tais anormalidades também podem causar zumbido e prejuízo na percepção da fala (principalmente em ambientes acústicos complexos), além da PAIR. As funções sociais, psicológicas e cognitivas podem ser afetadas sequencialmente por essas deficiências fisiológicas 2,3,4,5,6.
Em estudos pré-clínicos relacionados à PAIR baseados em camundongos, as linhagens de camundongos mais populares são CBA/CaJ 2,3,6,7 e C57BL/6 4,5,8. Além disso, os camundongosmachos 3,4,7 são mais comumente utilizados do que as fêmeas, pois o estrógeno tem um efeito protetor sobre a audição. Portanto, neste estudo foram utilizados apenas camundongos machos9. Após consulta à literatura, optou-se por 1 kHz e 6 kHz como as frequências do ruído aplicado. A intensidade do ruído aplicado foi de 115 dB NPS-A (ao redor da gaiola) a 125 dB NPS-A (no centro da gaiola). Após a exposição contínua dos camundongos experimentais ao ruído por 6 h por dia, durante 5 dias consecutivos, um ótimo aumento no limiar auditivo indicou que uma ótima extensão de PAIR foi gerada nos camundongos experimentais. As operações para o manuseio dos animais, construção do arranjo experimental e indução de ruído estão claramente descritas passo a passo no protocolo fornecido.
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Protocol
Os experimentos em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Mackay Medical College. Camundongos C57BL/6J machos com oito semanas de idade foram comprados do National Laboratory Animal Center (Nova Taipei, Taiwan). Todos os camundongos foram criados e alojados de acordo com o protocolo animal padrão.
1. Indução de PAIR em camundongos
- Preparar a gaiola para os ratos experimentais
- Para isso, use uma gaiola armadilha para ratos com dimensões de 14 cm × 17 cm × 24 cm. Corte quatro pedaços de papelão ondulado em tamanhos adequados, fazendo-os caber na gaiola (13 cm × 23 cm e 13 cm × 16 cm).
- Para evitar que os ratos sejam cortados pela grade de malha, coloque duas das peças na parte inferior e na parte de trás, respectivamente. Coloque as outras duas peças perpendicularmente interligadas uma com a outra, para dividir o espaço dentro da gaiola em quartos.
- Realizar este estudo em uma caixa à prova de som. Coloque um alto-falante de 8,5 cm na frente da gaiola e coloque o alto-falante e a gaiola em uma caixa à prova de som.
- Abra o software de aplicativo CLIO
- Mova o cursor para o ícone do alto-falante e clique em TwoSin. Digite e altere o valor de Freq 1 para 1000 Hz, Freq 2 para 6000 Hz, e clique em OK para começar a reproduzir o som.
- Na guia Leq, altere dBV para dBSPL. Depois de definir a hora na interface do software, clique no botão triângulo verde para reproduzir o som.
- Coloque um microfone na frente do alto-falante a uma distância de 8,5 cm para calibrar o nível de ruído (consulte Arquivo Suplementar 1). Ajuste o nível de ruído para 125 dB SPL-A e monitore continuamente por pelo menos 3 minutos para garantir que o nível de ruído seja suficientemente estável. Use um gerador, um analisador e um amplificador para criar e controlar o ruído. (Gráfico 1)
NOTA: Faça esta etapa em uma caixa à prova de som para evitar danos à audição do operador. - Coloque quatro camundongos C57BL/6J machos na gaiola (um para cada quarto) para exposição ao ruído. Atribua aleatoriamente os ratos em cada trimestre durante a exposição ao ruído. Coloque um microfone na parte superior da gaiola para monitorar o nível de ruído durante a exposição ao ruído (Figura 2).
NOTA: Faça esta etapa em uma caixa à prova de som para evitar danos à audição do operador. - Expor os ratos ao ruído nas frequências de 1 kHz e 6 kHz continuamente durante 6 h por dia, durante 5 dias consecutivos.
- Medir os limiares auditivos dos camundongos 1 dia após a exposição ao ruído (ou seja, no6º dia) medindo o PEATE. Após a aferição do PEATE, sacrificar todos os camundongos envolvidos e colher suas cócleas (Figura 3).
2. Avaliação dos limiares auditivos de tronco encefálico (PEATE)
- Utilizar um sistema comercial de teste ABR projetado especificamente para pequenos animais10.
- Injetar intraperitonealmente uma mistura de tiletamina e zolazepam (40 mg/kg) e xilazina (9,3 mg/kg) nos camundongos para anestesia geral.
NOTA: A avaliação do PEATE leva ~2 h. Certifique-se de fornecer suporte térmico através de uma almofada de aquecimento e aplique pomada ocular para evitar o ressecamento enquanto o mouse estiver sob anestesia. - Medir o PEATE no camundongo sob anestesia geral. Coloque eletrodos de agulha subdérmica (12 mm) no vértice, atrás do pavilhão auricular da orelha esquerda e de volta perto da cauda para medir o limiar auditivo.
- Apresentar estímulos acústicos utilizando uma caixa acústica posicionada a 1 cm da orelha esquerda do animal.
- Use um osciloscópio para controlar os estímulos acústicos. Escolha Onda Sine para os estímulos e 10k para a escala de janela. Gire o botão Frequência para obter a frequência desejada dos estímulos acústicos.
- Ajuste a intensidade do estímulo girando o botão AMLP no gerador de funções. Obter a intensidade de estímulo desejada girando o botão AMLP para uma tensão adequada, calculada a partir da calibração.
- Coletar as medidas do PEATE sob uma série de intensidades de estímulo, de 10 dB NPS a 100 dB NPS, com tamanho de passo de 10 dB.
NOTA: Meça o limiar auditivo em uma caixa à prova de som. O nível mínimo de intensidade do estímulo que poderia dar origem a uma onda V discernível no sinal coletado foi assumido como sendo o limiar do PEATE10,11 (Figura 4). Após a avaliação do PEATE, monitorar o animal até que ele se recupere da anestesia (~1 h).
3. Exame microscópico
- Fixação do tecido colhido
- Após as medidas do PEATE, sacrificar o camundongo injetando intraperitonealmente uma mistura de tiletamina e zolazepam (100 mg/kg) e xilazina (23,25 mg/kg) para o exame microscópico.
- Colher as cócleas do camundongo e mergulhá-las imediatamente em formaldeído (AF) a 10% para fixação (duas cócleas/mL) por pelo menos 8 h a 4 °C.
- Após a fixação, substituir a solução de AG por uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% para descalcificação durante 3-4 dias a 4 °C. Em seguida, verifique cada cóclea com uma pinça para confirmar se as cócleas estão suficientemente amolecidas.
- Coloque as cócleas em uma placa de Petri preenchida com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e corte o órgão espiral de Corti (OC) (cada cóclea descalcificada) em três seções - giro basal, giro médio e giro apical - para coloração tecidual.
- Sob microscópio dissecante (aumento: 8x-35x), remova as estruturas ósseas (escala vestibular, escala timpânica e modíolo) das cócleas descalcificadas e obtenha os tecidos moles, incluindo o CO (espessura: cerca de 40 μm).
- Coloração por imunofluorescência da cóclea
- Preparação do tampão de bloqueio: Preparar soluções de albumina de soro bovino (BSA) a 2% e Triton X-100 a 0,2% em PBS.
- Transfira o tecido a ser corado da placa de Petri para um tubo de microcentrífuga e mergulhe o tecido em 0,1 mL do tampão de bloqueio por 2 h à temperatura ambiente (TR).
- Preparação do tampão de anticorpos primários Myo7A: Diluir o anticorpo primário Myo7A no tampão de bloqueio a uma proporção de volume de 1:200.
- Tratar o tecido no tubo de microcentrífuga com 100 μL de tampão primário de anticorpos Myo7A durante 2 h na RT.
- Enxaguar o tecido três vezes em PBS por 5 min cada.
- Preparação do anticorpo secundário Myo7A (Myo7A-Rb-488) e do anticorpo faloidina (faloidina-594): Anticorpo secundário Myo7A diluído (1:400) e anticorpo faloidina (1:200) no tampão de bloqueio.
- Tratar o tecido com 100 μL de anticorpo secundário Myo7A e tampão de anticorpos faloidínicos por 2 h na RT.
- Após o tratamento com anticorpos + anticorpos contra faloidina, enxaguar o tecido em PBS três vezes, por 5 min cada.
- Transfira o tecido enxaguado do tubo de microcentrífuga para uma placa de Petri preenchida com PBS usando uma pipeta de transferência plástica de 1 mL com uma ponta de corte.
- Para se preparar para o exame microscópico, desdobre o tecido, coloque-o em uma lâmina de vidro e adicione 15 μL de meio fluoromount 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) no tecido para cobri-lo completamente. Coloque uma tampa de vidro suavemente sobre o tecido. Deixe a lâmina durante a noite no RT antes de selá-la com esmalte.
- Aquisição de imagens
- Adquira imagens 2D usando um microscópio de fluorescência vertical e um software de aquisição de imagens.
- Antes de realizar o exame microscópico, centralize o tecido no campo de visão e ajuste a sensibilidade para ISO 100. Ajuste o tempo de exposição inicialmente clicando no botão Modo Automático do software e, em seguida, ajuste manualmente clicando no botão Ajustar para otimizar a relação sinal-ruído.
- Ajuste o comprimento de onda da luz incidente para excitar os fluoróforos girando o cubo de fluorescência. Pseudocores foram utilizadas para marcar a emissão de diferentes rótulos fluorescentes (luz azul: DAPI; luz verde: Myo7A; luz vermelha: faloidina).
- Ao escanear a amostra de tecido, gere e colete os dados de imagem como .tif e .jpg arquivos de imagem.
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Representative Results
Alteração do limiar auditivo do PEATE
O limiar auditivo dos camundongos foi medido por meio do PEATE ton-burst 1 dia ou 1 semana após a exposição ao ruído. Observou-se aumento significativo do limiar auditivo nas três frequências testadas (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB NPS; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB NPS; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB NPS) 1 dia após a exposição ao ruído (ou seja, o 6ºdia). A recuperação parcial da audição ocorreu 1 semana após a exposição ao ruído (ou seja, o13º dia), mas os limiares auditivos ainda estavam elevados em mais de 30 dB em todas as frequências (12 kHz: 72,86 ± 2,86 dB NPS; 24 kHz: 84,29 ± 2,77 dB NPS; 32 kHz: 87,14 ± 4,21 dB NPS) em relação aos grupos controle (12 kHz: 41 ± 0 dB NPS; 24 kHz: 51 ± 0 dB NPS; 32 kHz: 51 ± 0 dB NPS). Neste estudo, a audição foi mais prejudicada nas frequências altas (Figura 5). Para análise, utilizou-se o teste ANOVA two-way e pós-teste a correção de Bonferroni. Observou-se diferença significativa (p < 0,001) entre os grupos controle e experimental, tanto no 6ºquanto no 13º dias. A comparação entre os limiares auditivos medidos no 6º e 13ºdias mostrou diferença significativa (p < 0,05) nas frequências de 12 kHze 32 kHz.
Perda de células ciliadas externas
Uma perda de CCE foi consistentemente observada nas imagens microscópicas adquiridas dos camundongos PAIR, em comparação com as dos camundongos controle. Em contraste, as células ciliadas internas foram observadas intactas em todas as imagens. Além disso, as CCE nos giros basal e médio do órgão de Corti foram lesadas de forma mais severa, enquanto as CCE no giro apical estavam quase intactas (Figura 6).
Figura 1: Configuração da exposição ao ruído. Um microfone foi posicionado à frente do alto-falante a uma distância de 8,5 cm para calibrar o nível de ruído. O nível de ruído foi ajustado para 125 dB NPL-A, que é semelhante ao nível de uma sirene próxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A gaiola da armadilha do rato adaptou-se a este estudo. Três camundongos C57BL/6J machos foram distribuídos aleatoriamente para cada quarto durante a exposição ao ruído. O microfone foi fixado na parte superior da gaiola para monitorar os níveis de ruído durante a exposição ao ruído. O nível de pressão sonora foi medido várias vezes em múltiplas posições. Essas posições estão marcadas na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cronograma experimental para os grupos teste e controle. Os camundongos foram expostos ao ruído nas frequências de 1 e 6 kHz continuamente por 6 h por dia, durante 5 dias. Após 5 dias consecutivos de exposição ao ruído, os limiares auditivos dos camundongos experimentais foram medidos com PEATE no6º dia. A medida do PEATE foi realizada novamente nos camundongos experimentais e nos camundongos controle no13º dia, seguida do sacrifício de todos os camundongos envolvidos para a coleta das cócleas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Medida do PEATE da audição. Os resultados representativos do PEATE em 12 kHz, coletados no 13ºdia ( 1 semana após a exposição ao ruído). A onda V em cada intensidade é rotulada se perceptível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Limiares auditivos medidos no 6º e 13º dias. Os limiares auditivos nas frequências de (A) 12 kHz, (B) 24 kHz e (C) 32 kHz. Para análise, foi utilizado o teste ANOVA two-way, seguido da correção de Bonferroni. *p < 0,05, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Resultados da imagem de imunofluorescência obtida da CO. (A) Imagem obtida do giro apical da cóclea. (B) Imagem obtida do giro médio da cóclea. (C) Imagem obtida a partir do giro base da cóclea. Azul: núcleos celulares corados com DAPI; Verde: células ciliadas coradas com Myo7A; Vermelho: citoesqueleto corado com faloidina. As setas indicam a perda das CCE. Barra de escala= 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Cálculo de tensão a partir da calibração. Para cada frequência específica, o valor da tensão selecionada (eixo horizontal) será inserido na curva de calibração para obtenção do nível sonoro correspondente (eixo vertical). Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A PAIR pode ser dividida em dois tipos: a PAIR temporária, que mostra um desvio temporal do limiar auditivo, e a PAIR permanente, que é caracterizada por uma mudança permanente do limiar auditivo. Acredita-se que a perda auditiva observada no6º dia (1 dia após a exposição ao ruído) seja uma combinação destes dois tipos. Neste caso, o limiar auditivo apresentaria uma recuperação gradual ao longo do tempo devido ao componente temporal da perda auditiva. Em nossos estudos experimentais preliminares, os resultados obtidos com o mesmo setup e animais, a perda auditiva gerada por 2 dias de exposição ao ruído se recuperou completamente em 2 semanas, indicando que a PAIR permanente não foi realmente gerada. Ao contrário, neste estudo, sugere-se que a perda auditiva gerada por 5 dias de exposição ao ruído inclua um componente permanente, uma vez que o limiar auditivo ainda foi significativamente maior que o nível controle no13º dia (1 semana após a exposição ao ruído).
Uma das limitações do protocolo atual é que utilizamos o limiar auditivo detectado em 12 kHz para representar o limiar auditivo de baixa frequência dos camundongos, que corresponde ao giro apical da cóclea. Estritamente falando, o giro apical da cóclea é mais sensível ao som nas frequências de 4 kHz a 8 kHz12. No entanto, essa limitação dificilmente reduz o valor deste estudo e protocolo, uma vez que o protocolo apresentado fornece todos os detalhes das etapas da operação e emprega dispositivos envolvidos na criação do modelo. A maioria dos parâmetros apresentados, como tempo de exposição ao ruído, frequência de ruído, frequência de estímulo para PEATE e quando realizar os testes de PEATE e sacrifício dos animais, pode ser alterada e otimizada para diferentes propósitos em estudos futuros.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos as bolsas do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) do Governo de Taiwan (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), e bolsas de pesquisa intramuros do Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
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