Summary
ここでは、騒音性難聴(NIHL)のマウスモデルのプロトコルを提示します。NIHLを誘導するために、波形プラスチック、ラットトラップケージ、スピーカーを使用した新しいシンプルなデバイスを開発しました。聴覚脳幹反応と免疫蛍光イメージングを使用して、それぞれ聴覚機能と外有毛細胞の損傷を評価しました。
Abstract
騒音性難聴(NIHL)の動物モデルは、病理学者、セラピスト、薬理学者、および聴覚研究者がNIHLのメカニズムを完全に理解し、その後対応する治療戦略を最適化するのに役立ちます。この研究は、NIHLのマウスモデルを開発するための改良されたプロトコルを作成することを目的としています。この研究では、雄のC57BL / 6Jマウスを使用しました。麻酔をかけていないマウスを、大きな騒音(1および6kHz、115〜125dB SPL−Aで同時に提示)に1日6時間連続して5日間連続して曝露した。聴覚機能は、聴覚脳幹反応(ABR)を使用して、騒音曝露の1日後および1週間後に評価されました。ABR測定後、マウスを屠殺し、免疫蛍光染色のためにコルチの器官を採取した。聴性脳幹反応(ABR)測定から、騒音曝露の1日後に重大な難聴が観察されました。1週間後、実験マウスの聴力閾値は~80 dB SPLに低下し、対照マウス(~40 dB SPL)よりも有意に高いレベルであった。免疫蛍光イメージングの結果から、外有毛細胞(OHC)が損傷していることが示されました。要約すると、雄のC57BL / 6Jマウスを使用してNIHLのモデルを作成しました。純音ノイズを生成・配信するための新しいシンプルな装置を開発し、採用しました。聴力閾値の定量的測定とOHC損傷の形態学的確認は、いずれも印加された騒音が予想される難聴を誘発することに成功したことを示した。
Introduction
世界中で約13億人が騒音曝露による難聴に苦しんでいます1。本研究では,騒音性難聴(NIHL)の誘導・確認プロセスを明確に確立することを目的とした。NIHLは、有毛細胞(HC)およびらせん神経節ニューロン(SGN)の変性/破壊、HCステレオ繊毛の損傷、および/または蝸牛内部HCとSGNの間のシナプスの喪失に起因します。このような異常は、NIHLに加えて、耳鳴りや音声知覚障害(特に複雑な音響環境)を引き起こす可能性もあります。社会的、心理的、および認知機能は、これらの生理学的欠陥によって順次影響を受ける可能性があります2,3,4,5,6。
マウスを用いたNIHL関連の前臨床試験では、最も一般的なマウス系統はCBA/CaJ 2,3,6,7およびC57BL/6 4,5,8です。さらに、雄の3,4,7匹のマウスは、エストロゲンが聴覚を保護する効果があるため、雌のマウスよりも一般的に使用されています。したがって、この研究では雄マウスのみを使用しました9。文献を参照した後、印加ノイズの周波数として1kHzと6kHzを選択しました。印加されたノイズの強度は、115 dB SPL-A(ケージの周囲)から125 dB SPL-A(ケージの中央)でした。実験マウスを1日当たり6時間連続して騒音にさらした後、5日間連続して、聴覚閾値の最適な増加は、NIHLの最適な範囲が実験マウスにおいて生成されたことを示した。動物の取り扱い、実験セットアップの構築、およびノイズの誘導のための操作はすべて、提供されたプロトコルで段階的に明確に説明されています。
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Protocol
本研究における動物実験は、マッカイ医科大学の動物管理委員会によって承認された。8週齢の雄性C57BL/6Jマウスを国立実験動物センター(台湾新北市)から購入した。全てのマウスを、標準的な動物プロトコールに従って飼育および飼育した。
1. マウスにおけるNIHLの誘導
- 実験用マウス用のケージを準備する
- これを行うには、14 cm×17 cm×24 cmの寸法のラットトラップケージを使用します。4枚の段ボールを適切なサイズに切り、ケージに収まるようにします(13 cm × 23 cmおよび13 cm × 16 cm)。
- マウスがメッシュグリッドで足を切るのを防ぐために、2つのピースをそれぞれ底面と裏面に置きます。他の2つのピースを互いに垂直に連動させて配置し、ケージ内のスペースを四分の一に分割します。
- 防音ボックスでこの調査を実施してください。ケージの前にスピーカーを8.5cm置き、スピーカーとケージの両方を防音ボックスに入れます。
- CLIOアプリケーションソフトウェアを開きます
- カーソルをスピーカーアイコンに移動し、[TwoSin]をクリックします。Freq 1 を 1000 Hz に、Freq 2 を 6000 Hz に入力して変更し、[OK] をクリックしてサウンドの再生を開始します。
- Leq タブで、dBV を dBSPL に変更します。ソフトウェアインターフェイスで時間を設定した後、緑色の三角形のボタンをクリックしてサウンドを再生します。
- マイクをスピーカーの前に8.5 cm離して置き、ノイズレベルを調整します( 補足ファイル1を参照)。ノイズレベルを125 dB SPL-Aに調整し、3分以上継続的に監視して、ノイズレベルが十分に安定していることを確認します。発生器、アナライザ、アンプを使用して、ノイズを生成および制御します。(図1)
注意: オペレーターの聴覚への損傷を避けるために、防音ボックスでこの手順を実行してください。 - 4匹の雄のC57BL / 6Jマウスをケージに入れます(各四半期に1匹)。ノイズ曝露中の各四半期にマウスをランダムに割り当てます。ケージの上部にマイクロホンを置き、騒音にさらされている間の騒音レベルを監視します(図2)。
注意: オペレーターの聴覚への損傷を避けるために、防音ボックスでこの手順を実行してください。 - マウスを1 kHzおよび6 kHzの周波数のノイズに1日あたり6時間、5日間連続してさらします。
- ABRを測定することにより、騒音曝露の1日後(すなわち、6日目 )にマウスの聴力閾値を測定する。 騒音曝露の1週間後(すなわち、13日目 )にこれらのABR測定を再度繰り返す。ABR測定後、関与するすべてのマウスを犠牲にし、蝸牛を収穫します(図3)。
2. 聴覚脳幹反応(ABR)に基づく聴力閾値の評価
- 小動物用に特別に設計された市販のABR試験システムを使用する10.
- 全身麻酔のために、チレタミンとゾラゼパム(40 mg / kg)およびキシラジン(9.3 mg / kg)の混合物をマウスに腹腔内注射します。.
注:ABR評価には~2時間かかります。マウスが麻酔下にある間、必ず加熱パッドを介して熱サポートを提供し、目の軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。 - 全身麻酔下でマウスのABRを測定します。皮下針電極(12 mm)を頂点、左耳介の後ろ、尾の近くに配置して、聴力閾値を測定します。
- 動物の左耳から1 cm離れた場所に置かれたスピーカーを使用して音響刺激を提示します。
- オシロスコープを使用して音響刺激を制御します。刺激には 正弦波 を選択し、ウィンドウスケールには 10k を選択します。周波数ノブを回して、音響刺激の目的の 周波数 を取得します。
- ファンクションジェネレーターの AMLP ノブを回して刺激強度を調整します。 AMLP ノブをキャリブレーションから計算された適切な電圧に回して、目的の刺激強度を取得します。
- 10 dB SPL から 100 dB SPL までの一連の刺激強度で、10 dB ステップサイズで ABR 測定値を収集します。
注意: 防音ボックスで聴覚閾値を測定します。収集された信号に識別可能な波Vを生じさせることができる最小刺激強度レベルは、ABR閾値10,11であると仮定された(図4)。ABR評価後、麻酔から回復するまで(~1時間)動物を監視します。
3.顕微鏡検査
- 収穫した組織の固定
- ABR測定後、顕微鏡検査のためにチレタミンとゾラゼパム(100 mg / kg)およびキシラジン(23.25 mg / kg)の混合物を腹腔内注射することにより、マウスを犠牲にします。
- マウスから蝸牛を採取し、直ちに10%ホルムアルデヒド(FA)に浸して固定します(2つの蝸牛/ mL)4°Cで少なくとも8時間。
- 固定後、FA溶液を10%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液に交換し、4°Cで3〜4日間脱灰します。 次に、ピンセットで各蝸牛をチェックして、蝸牛が十分に柔らかくなっていることを確認します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填したシャーレに蝸牛を置き、螺旋状のコルチ(OC)器官(それぞれ脱灰蝸牛)を基底ターン、中ターン、頂端ターンの3つのセクションに切断して組織染色します。
- 解剖顕微鏡(倍率8倍-35倍)で脱灰蝸牛の骨構造(前庭窩骨、鱗膜、モディオラス)を除去し、OCを含む軟組織(厚さ約40μm)を得る。
- 蝸牛免疫蛍光染色
- ブロッキングバッファーの調製:PBS中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.2%Triton X-100溶液を調製します。
- 染色する組織をシャーレからマイクロ遠心チューブに移し、組織を0.1 mLのブロッキングバッファーに室温(RT)で2時間浸漬します。
- Myo7A一次抗体バッファーの調製:ブロッキングバッファーでMyo7A一次抗体を1:200の容量比で希釈します。
- マイクロ遠心チューブ内の組織を100 μLのMyo7A一次抗体バッファーでRTで2時間処理します。
- 組織をPBSでそれぞれ5分間3回すすぎます。
- Myo7A二次抗体(Myo7A-Rb-488)およびファロイジン抗体(ファロイジン-594)バッファーの調製:ブロッキングバッファーでMyo7A二次抗体(1:400)およびファロイジン抗体(1:200)を希釈します。
- 組織を100 μLのMyo7A二次抗体およびファロイジン抗体バッファーでRTで2時間処理します。
- 抗体+ファロイジン抗体処理後、組織をPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。
- 切断先端付きの1 mLプラスチックトランスファーピペットを使用して、すすぎた組織をマイクロ遠心チューブからPBSで満たされたペトリ皿に移します。
- 顕微鏡検査の準備をするには、組織を広げてスライドガラスの上に置き、15 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)フルオロマウント培地を組織に添加して完全に覆います。ガラスのカバーガラスをティッシュの上に置きます。マニキュアで密封する前に、スライドをRTで一晩放置します。
- 画像取得
- 正立型蛍光顕微鏡と画像取得ソフトウェアを使用して2D画像を取得します。
- 顕微鏡検査を行う前に、組織を視野の中央に配置し、感度をISO100に調整します。最初にソフトウェアの [自動モード ]ボタンをクリックして露出時間を調整し、次に [調整 ]ボタンをクリックして手動で微調整し、信号対雑音比を最適化します。
- 入射光の波長を調整し、蛍光キューブを回転させて蛍光色素を励起します。異なる蛍光標識(青色光:DAPI;緑色光:Myo7A;赤色光:ファロイジン)からの発光をマークするために擬似色を使用した。
- 組織サンプルをスキャンすることで、画像データを.tifおよび.jpg画像ファイルとして生成および収集します。
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Representative Results
ABR聴力閾値の変化
マウスの聴力閾値は、騒音曝露の1日後または1週間後にトーンバーストABRを使用して測定されました。試験した3つの周波数すべてで聴力閾値の有意な増加が観察された(12 kHz:84.29 ± 2.77 dB SPL; 24 kHz:91.43 ± 0.92 dB SPL; 32 kHz:98.57 ± 1.43 dB SPL)騒音曝露の1日後(すなわち、6日目)。部分的な聴力回復は騒音曝露の1週間後(すなわち、13日目)に起こったが、対照群(12 kHz:±41 ± 0 dB SPL、24 kHz: 41 0 dB SPL、24 kHz: 24 kHz: 84.29 ± 2.77 dB SPL、32 kHz: 87.14 ± 4.21 dB SPL)と比較して、すべての周波数で30 dB以上上昇した(12 kHz: 41 0 dB SPL; 24 kHz: 51 ± 0デシベルSPL;32 kHz: 51 ± 0 dB SPL)。この研究では、聴覚は高周波でより損傷を受けました(図5)。分析には二元配置分散分析テストを使用し、事後テストにはボンフェローニ補正を使用しました。6日目と13日目の両方で対照群と実験群の間で有意差(p < 0.001)が観察されました。6日目と13日目に測定された聴力閾値の比較は、12kHzと32kHzの周波数で有意差(p < 0.05)を示した。
外有毛細胞の損失
OHCの損失は、対照マウスからのものと比較して、NIHLマウスから取得した顕微鏡画像で一貫して観察されました。対照的に、内側の有毛細胞は、すべての画像で無傷であることが観察されました。さらに、コルティの器官の基底ターンと中ターンのOHCはより深刻な損傷を受けましたが、頂端ターンのOHCはほとんど無傷でした(図6)。
図1:ノイズ曝露のセットアップ。 マイクをスピーカーの前に8.5cmの距離で配置して、ノイズレベルを校正しました。騒音レベルは、近くのサイレンのレベルと同様の125 dB SPL-Aに調整されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:この研究に適応したラットトラップケージ。 3匹の雄のC57BL / 6Jマウスを、騒音曝露中の各四半期にランダムに割り当てました。マイクは、騒音にさらされる際の騒音レベルを監視するためにケージの上部に貼り付けられました。音圧レベルは、複数の位置で数回測定されました。これらの位置は図にマークされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:試験群と対照群の実験タイムライン。 マウスを1kHzおよび6kHzの周波数のノイズに1日6時間、5日間連続して曝露した。5日間の連続した騒音曝露の後、実験マウスの聴力閾値を6日目 にABRで測定した。ABR測定は、13日目 に実験マウスで再び、対照マウスで実行され、その後、関与するすべてのマウスが犠牲になって蝸牛を収穫しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:聴覚のABR測定。 12 kHzでの代表的なABR結果は、13日目 (ノイズ曝露の1週間後)に収集されました。各強度の波Vは、識別可能な場合はラベル付けされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:6日目と13日目に測定された聴力閾値。(A)12kHz、(B)24kHz、および(C)32kHzの周波数における聴力閾値。分析には二元配置ANOVA検定を使用し、続いてボンフェローニ補正を行いました。*p < 0.05, **p < 0.001.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:OCから得られた免疫蛍光イメージング結果(A)蝸牛の頂端回転から得られた画像。(B)蝸牛の中回転から得られた画像。(C)蝸牛の基底旋回から得られた画像。青:DAPIで染色された細胞核。緑:Myo7Aで染色された有毛細胞。赤:細胞骨格をファロイジンで染色。矢印はOHCの損失を示す。スケールバー= 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:キャリブレーションからの電圧計算。特定の周波数ごとに、選択した電圧の値(横軸)が検量線に入力され、対応するサウンドレベル(縦軸)を取得します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
NIHLは、聴力閾値の時間的シフトを示す一時的なNIHLと、永続的な聴力閾値シフトを特徴とする永続的なNIHLの2つのタイプに分けることができます。6日目 (騒音曝露の1日後)に観察された難聴は、これら2つのタイプの組み合わせであると考えられています。この場合、聴力閾値は、難聴の時間的要素のために、時間の経過とともに徐々に回復します。我々の予備的な実験的研究では、同じセットアップおよび動物で得られた結果は、2日間の騒音曝露によって生成された難聴は2週間で完全に回復し、永久的なNIHLが実際に生成されなかったことを示しています。それどころか、この研究では、5日間の騒音曝露によって生じる難聴は、聴力閾値が13日目 (騒音曝露の1週間後)の対照レベルよりも有意に高かったため、永続的な要素を含むことが示唆されています。
現在のプロトコルの制限の1つは、12kHzで検出された聴力閾値を使用して、蝸牛の頂端回転に対応するマウスの低周波聴力閾値を表すことです。厳密に言えば、蝸牛の頂端回転は4 kHzから8 kHz12の音に対してより敏感です。ただし、提示されたプロトコルは操作手順の詳細をすべて提供し、モデルの作成に関与するデバイスを採用しているため、この制限はこの研究とプロトコルの価値を低下させることはほとんどありません。ノイズ曝露時間、ノイズ周波数、ABRの刺激周波数、ABRテストと動物の犠牲をいつ実行するかなど、提示されたパラメーターのほとんどは、将来の研究でさまざまな目的のために変更およびさらに最適化できます。
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Disclosures
開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
台湾政府の科学技術部(MOST)からの助成金(MOST 110-2314-B-715-005、MOST 111-2314-B-715-009-MY3)、およびマッカイ医科大学(MMC-RD-110-1B-P030、MMC-RD-111-CF-G002-03)からの壁内研究助成金に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
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