Summary
여기서는 소음성 난청(NIHL)의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제시합니다. NIHL을 유도하기 위해 골판지 플라스틱, 쥐덫 케이지 및 스피커를 사용하여 새롭고 간단한 장치를 개발했습니다. 청각 뇌간 반응과 면역형광 영상을 각각 사용하여 청력 기능과 외부 유모 세포 손상을 평가했습니다.
Abstract
소음성 난청(NIHL)의 동물 모델은 병리학자, 치료사, 약리학자 및 청력 연구자가 NIHL의 메커니즘을 철저히 이해하고 이후에 해당 치료 전략을 최적화하는 데 유용합니다. 이 연구는 NIHL의 마우스 모델을 개발하기 위한 개선된 프로토콜을 만드는 것을 목표로 합니다. 수컷 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다. 마취되지 않은 마우스는 연속 5일 동안 하루 6시간 동안 지속적으로 시끄러운 소음(1kHz 및 6kHz, 115-125dB SPL-A에서 동시에 표시됨)에 노출되었습니다. 청각 기능은 청각 뇌간 반응(ABR)을 사용하여 소음 노출 후 1일 및 1주일 후에 평가되었습니다. ABR 측정 후, 마우스를 희생시키고, 면역형광 염색을 위해 그들의 코르티(Corti) 기관을 수집하였다. 청각 뇌간 반응(ABR) 측정에서 소음 노출 후 1일 후에 상당한 청력 손실이 관찰되었습니다. 1주일 후, 실험용 마우스의 청력 역치는 ~80dB SPL로 감소했으며, 이는 여전히 대조군 마우스(~40dB SPL)보다 훨씬 높은 수준이었습니다. 면역형광 영상의 결과로부터, 외모세포(OHC)가 손상된 것으로 나타났다. 요약하면, 우리는 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 NIHL 모델을 만들었습니다. 순음 노이즈를 생성하고 전달하기 위한 새롭고 간단한 장치가 개발되어 채택되었습니다. 청력 역치의 정량적 측정과 OHC 손상의 형태학적 확인은 모두 적용된 소음이 예상되는 청력 손실을 성공적으로 유도했음을 입증했습니다.
Introduction
전 세계적으로 약 13억 명의 사람들이 소음 노출로 인한 청력 손실로 고통받고 있습니다1. 본 연구에서는 소음성 난청(NIHL)을 유도하고 확인하기 위한 명확한 단계별 프로세스를 확립하는 것을 목표로 했습니다. NIHL은 유모 세포(HC) 및 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 변성/파괴, HC 입체섬모의 손상 및/또는 달팽이관 내부 HC와 SGN 사이의 시냅스 손실로 인해 발생합니다. 이러한 이상은 NIHL 외에도 이명 및 언어 인식 장애(특히 복잡한 음향 환경에서)를 유발할 수 있습니다. 사회적, 심리적, 인지적 기능은 이러한 생리적 결함에 의해 순차적으로 영향을 받을 수 있다 2,3,4,5,6.
마우스를 기반으로 한 NIHL 관련 전임상 연구에서 가장 인기 있는 마우스 균주는 CBA/CaJ 2,3,6,7 및 C57BL/6 4,5,8입니다. 또한 수컷 3,4,7 마우스는 에스트로겐이 청력에 보호 효과가 있기 때문에 암컷 마우스보다 더 일반적으로 사용됩니다. 따라서 본 연구에서는 수컷 마우스만을 사용하였다9. 문헌을 참조한 후 적용된 노이즈의 주파수로 1kHz와 6kHz를 선택했습니다. 적용된 노이즈의 강도는 115dB SPL-A(케이지 주변) 내지 125dB SPL-A(케이지 중앙)였습니다. 실험 마우스를 하루에 6시간 동안 연속적으로 소음에 노출시킨 후, 연속 5일 동안, 청력 역치의 최적 증가는 실험 마우스에서 NIHL의 최적 정도가 생성되었음을 나타냅니다. 동물을 다루고, 실험 설정을 구축하고, 소음을 유도하는 작업은 모두 제공된 프로토콜에 단계별로 명확하게 설명되어 있습니다.
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Protocol
이 연구의 동물 실험은 Mackay Medical College의 Animal Care Committee의 승인을 받았습니다. 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 National Laboratory Animal Center(대만 신베이시)에서 구입하였다. 모든 마우스는 표준 동물 프로토콜에 따라 사육되고 사육되었습니다.
1. 생쥐에서 NIHL 유도
- 실험용 마우스를 위한 케이지 준비
- 이렇게하려면 14cm × 17cm × 24cm 크기의 쥐덫 케이지를 사용하십시오. 골판지 플라스틱 보드 4 개를 적절한 크기로 잘라 케이지 (13cm × 23cm, 13cm × 16cm)에 맞도록합니다.
- 쥐가 메쉬 그리드에 의해 발이 잘리는 것을 방지하려면 두 조각을 각각 바닥과 뒷면에 놓습니다. 다른 두 조각을 서로 수직으로 맞물려 배치하여 케이지 내의 공간을 4등분합니다.
- 방음 상자에서이 연구를 수행하십시오. 케이지 앞 8.5cm에 스피커를 놓고 스피커와 케이지를 방음 상자에 넣습니다.
- CLIO 애플리케이션 소프트웨어 열기
- 커서를 스피커 아이콘으로 이동한 다음 TwoSin을 클릭합니다. 주파수 1을 1000Hz로, 주파수 2를 6000Hz로 입력하고 변경한 다음 확인을 클릭하여 사운드 재생을 시작합니다.
- Leq 탭에서 dBV를 dBSPL로 변경합니다. 소프트웨어 인터페이스에서 시간을 설정한 후 녹색 삼각형 버튼을 클릭하여 사운드를 재생합니다.
- 소음 수준을 보정하기 위해 스피커 앞에 8.5cm 떨어진 곳에 마이크를 배치합니다( 보충 File 1). 소음 수준을 125dB SPL-A로 조정하고 소음 수준이 충분히 안정적인지 확인하기 위해 3분 이상 지속적으로 모니터링합니다. 발생기, 분석기 및 증폭기를 사용하여 잡음을 생성하고 제어합니다. (그림 1)
알림: 작업자의 청력 손상을 방지하기 위해 방음 상자에서 이 단계를 수행하십시오. - 소음 노출을 위해 4마리의 수컷 C57BL/6J 마우스를 케이지에 넣습니다(분기마다 하나씩). 소음에 노출되는 동안 각 분기에 마우스를 무작위로 할당합니다. 케이지 상단에 마이크를 놓고 소음이 노출되는 동안 소음 수준을 모니터링합니다(그림 2).
알림: 작업자의 청력 손상을 방지하기 위해 방음 상자에서 이 단계를 수행하십시오. - 마우스를 1kHz 및 6kHz의 주파수에서 연속 5일 동안 하루 6시간 동안 지속적으로 소음에 노출시킵니다.
- ABR을 측정하여 소음 노출 1일 후(즉, 6일째 되는 날)에 마우스의 청력 역치를 측정합니다. 소음 노출 1주 후(즉, 13일째) 이러한 ABR 측정을 다시 반복합니다. ABR 측정 후 관련된 모든 마우스를 희생하고 달팽이관을 수확합니다(그림 3).
2. 청각 뇌간 반응(ABR) 기반 청력 역치 평가
- 작은 동물을 위해 특별히 설계된 상업용 ABR 테스트 시스템을 사용하십시오10.
- 전신 마취를 위해 틸레타민과 졸라제팜(40mg/kg) 및 자일라진(9.3mg/kg)의 혼합물을 생쥐에 복강 주사합니다.
참고: ABR 평가에는 ~2시간이 소요됩니다. 가열 패드를 통해 열 지원을 제공하고 마우스가 마취 상태에있는 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오. - 전신 마취 하에 마우스의 ABR을 측정합니다. 피하 바늘 전극(12mm)을 꼭지점, 왼쪽 귀의 귓바퀴 뒤, 꼬리 근처에 다시 배치하여 청력 역치를 측정합니다.
- 동물의 왼쪽 귀에서 1cm 떨어진 곳에 위치한 스피커를 사용하여 음향 자극을 나타냅니다.
- 오실로스코프를 사용하여 음향 자극을 제어합니다. 자극에 대해 사인파 를 선택하고 창 눈금에 대해 10k 를 선택합니다. 주파수 노브를 돌려 원하는 음향 자극 주파수 를 얻습니다.
- 함수 발생기의 AMLP 노브를 돌려 자극 강도를 조정합니다. AMLP 노브를 적절한 전압으로 돌려 원하는 자극 강도를 얻습니다.tage, 보정에서 계산됩니다.
- 10dB 스텝 크기로 10dB SPL에서 100dB SPL까지의 일련의 자극 강도에서 ABR 측정값을 수집합니다.
알림: 방음 상자에서 청력 역치를 측정하십시오. 수집된 신호에서 식별 가능한 파동 V를 발생시킬 수 있는 최소 자극 강도 레벨은 ABR 임계값10,11로 가정되었습니다(그림 4). ABR 평가 후 마취에서 회복될 때까지(~1시간) 동물을 모니터링합니다.
3. 현미경 검사
- 채취한 조직을 고정하는 단계
- ABR 측정 후 현미경 검사를 위해 틸레타민과 졸라제팜(100mg/kg) 및 자일라진(23.25mg/kg)의 혼합물을 복강 주사하여 마우스를 희생시킵니다.
- 마우스에서 달팽이관을 채취한 후 4°C에서 최소 8시간 동안 고정을 위해 10% 포름알데히드(FA)(달팽이관 2개/mL)에 즉시 담급니다.
- 고정 후, FA 용액을 10 °C에서 3-4 일 동안 석회질 제거를 위해 4 % 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액으로 교체하십시오. 그런 다음 핀셋으로 각 달팽이관을 확인하여 달팽이관이 충분히 부드러워졌는지 확인합니다.
- 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 페트리 접시에 달팽이관을 넣고 나선형 코르티(OC) 기관(각 석회질 제거 달팽이관)을 기저 회전, 중간 회전 및 정점 회전의 세 부분으로 자릅니다.
- 해부 현미경(배율: 8x-35x)에서 석회질된 달팽이관의 뼈 구조(스칼라 현정, 스칼라 고막 및 모디올러스)를 제거하고 OC(두께: 약 40μm)를 포함한 연조직을 얻습니다.
- 달팽이관 면역형광 염색
- 블로킹 완충액의 제조: PBS 중의 2% 소혈청알부민(BSA)과 0.2% Triton X-100 용액을 준비한다.
- 염색하고자 하는 조직을 페트리 디쉬로부터 미세원심분리 튜브로 옮기고, 실온(RT)에서 2시간 동안 블로킹 완충액 0.1 mL에 조직을 침지시킨다.
- Myo7A 1차 항체 완충액의 제조: Myo7A 1차 항체를 블로킹 완충액에 1:200의 부피비로 희석한다.
- 미세 원심분리 튜브의 조직을 RT에서 2시간 동안 100μL의 Myo7A 1차 항체 완충액으로 처리합니다.
- PBS에서 각각 5분 동안 티슈를 세 번 헹굽니다.
- Myo7A 2차 항체(Myo7A-Rb-488) 및 팔로이딘 항체(phalloidin-594) 완충액의 제조: Myo7A 2차 항체(1:400)와 팔로이딘 항체(1:200)를 블로킹 완충액에 희석한다.
- 실온에서 2시간 동안 100μL의 Myo7A 2차 항체와 팔로이딘 항체 완충액으로 조직을 처리합니다.
- 항체 + 팔로이딘 항체 처리 후 PBS에서 각각 5분 동안 조직을 세 번 헹굽니다.
- 절단된 팁이 있는 1mL 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 미세 원심분리 튜브에서 PBS로 채워진 페트리 접시로 헹굼된 조직을 옮깁니다.
- 현미경 검사를 준비하려면 조직을 펼치고 유리 슬라이드에 놓고 15μL의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 플루오로마운트 배지를 조직에 추가하여 완전히 덮습니다. 유리 커버슬립을 티슈 위에 부드럽게 놓습니다. 매니큐어로 밀봉하기 전에 슬라이드를 RT에서 밤새 그대로 두십시오.
- 이미지 획득
- 정립 형광 현미경 및 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 2D 이미지를 획득합니다.
- 현미경 검사를 수행하기 전에 조직을 시야의 중앙에 놓고 감도를 ISO 100으로 조정합니다. 처음에 소프트웨어의 자동 모드 버튼을 클릭하여 노출 시간을 조정한 다음 조정 버튼을 클릭하여 수동으로 미세 조정 하여 신호 대 잡음비를 최적화합니다.
- 입사광의 파장을 조정하여 형광 큐브를 회전시켜 형광단을 여기시킵니다. 의사 색상은 다른 형광 라벨 (청색광 : DAPI, 초록색 광 : Myo7A, 적색광 : phalloidin)의 방출을 표시하는 데 사용되었습니다.
- 조직 샘플을 스캔하여 이미징 데이터를 .tif 및 .jpg 이미지 파일로 생성 및 수집합니다.
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Representative Results
ABR 청력 역치의 변화
마우스의 청력 역치는 소음 노출 후 1일 또는 1주일 후에 톤 버스트 ABR을 사용하여 측정되었습니다. 세 가지 테스트 주파수 모두에서 청력 역치의 상당한 증가가 관찰되었습니다(12kHz: 84.29 ± 2.77dB SPL, 24kHz: 91.43 ± 0.92dB SPL, 32kHz: 98.57 ± 1.43dB SPL) 소음 노출 후 1일(즉,6일째). 부분적인 청력 회복은 소음 노출 후 1주일(즉, 13일째)에 발생했지만 청력 역치는 대조군(12kHz: 41kHz± 2.86dB SPL, 24kHz: 84.29dB SPL, 32kHz: 87.14dB SPL)± 비교하여 모든 주파수(12kHz: 41dB SPL, 24kHz±± 비해 여전히 30dB 이상 상승했습니다. 51 ± 0 dB SPL; 32kHz: 51± 0dB SPL). 이 연구에서 청력은 고주파에서 더 많이 손상되었습니다(그림 5). 분석을 위해 양방향 ANOVA 검정을 사용하였고, 사후 검정을 위해 Bonferroni 보정을 사용하였다. 유의한 차이(p < 0.001)가 6일째와 13일째 모두에서 대조군과 실험군 간에 관찰되었다. 6일째 및 13일째에 측정된 청력 역치 사이의 비교는 12kHz및 32kHz의 주파수에서 유의한 차이(p < 0.05)를 나타내었다.
외부 유모 세포 손실
대조군 마우스의 손실과 비교하여 NIHL 마우스에서 얻은 현미경 이미지에서 OHC의 손실이 일관되게 관찰되었습니다. 대조적으로, 내부 유모 세포는 모든 이미지에서 손상되지 않은 것으로 관찰되었습니다. 또한, Corti 기관의 기저부와 중간 회전의 OHC는 더 심하게 손상된 반면, 정점 회전의 OHC는 거의 손상되지 않았습니다 (그림 6).
그림 1: 노이즈 노출 설정 소음 수준을 보정하기 위해 스피커 앞에 8.5cm 떨어진 곳에 마이크를 배치했습니다. 소음 수준은 125dB SPL-A로 조정되었으며, 이는 근처의 사이렌 수준과 유사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이 연구에 적응한 쥐덫 케이지. 3마리의 수컷 C57BL/6J 마우스가 소음 노출 동안 각 분기에 무작위로 할당되었습니다. 마이크는 소음에 노출되는 동안 소음 수준을 모니터링하기 위해 케이지 상단에 부착되었습니다. 음압 레벨은 여러 위치에서 여러 번 측정되었습니다. 이 위치는 그림에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 시험군과 대조군에 대한 실험 타임라인. 마우스는 5 일 동안 하루에 6 시간 동안 지속적으로 1 및 6 kHz의 주파수에서 소음에 노출되었습니다. 연속 5일간의 소음 노출 후, 실험용 마우스의 청력 역치를6일째 에 ABR로 측정하였다. ABR 측정은 실험 마우스에서 다시 수행되었고, 13일째 에 대조군 마우스에서 수행되었으며, 이어서 관련된 모든 마우스를 희생하여 달팽이관을 수확했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 청력의 ABR 측정. 13일째 (노이즈 노출 후 1주일)에 수집된 12kHz에서의 대표적인 ABR 결과. 각 강도의 파동 V는 식별 가능한 경우 레이블이 지정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 6일과 13일에 측정한 청력 역치. (A) 12kHz, (B) 24kHz 및 (C) 32kHz 주파수에서의 청력 역치. 분석을 위해 양방향 ANOVA 테스트를 사용한 후 Bonferroni 보정을 수행했습니다. *p < 0.05, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: OC에서 얻은 면역형광 이미징 결과 . (A) 달팽이관의 정점 회전에서 얻은 이미지. (B) 달팽이관의 중간 회전에서 얻은 이미지. (C) 달팽이관의 기저부 회전에서 얻은 이미지. 파란색: DAPI로 염색된 세포핵; 녹색: Myo7A로 염색된 유모 세포; 빨간색: 팔로이딘으로 염색된 세포골격. 화살표는 OHC의 손실을 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 권tage 교정에서 계산. 각 특정 주파수에 대해 선택한 전압(가로축)의 값은 해당 사운드 레벨(수직축)을 얻기 위해 교정 곡선에 입력됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
NIHL은 청력 역치의 시간적 이동을 나타내는 일시적 NIHL과 영구적인 청력 역치 이동을 특징으로 하는 영구 NIHL의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. 6일째 (소음 노출 후 1일)에 관찰한 청력 손실은 이 두 가지 유형의 조합으로 여겨집니다. 이 경우 청력 역치는 청력 손실의 시간적 구성 요소로 인해 시간이 지남에 따라 점진적인 회복을 보여줍니다. 우리의 예비 실험 연구에서, 동일한 설정 및 동물로 얻은 결과, 2 일 소음 노출에 의해 생성 된 청력 손실은 2 주 만에 완전히 회복되었으며, 이는 영구적 인 NIHL이 실제로 생성되지 않았 음을 나타냅니다. 반대로, 본 연구에서는 5일간의 소음 노출에 의해 발생하는 청력 손실이 13일째(소음 노출 후 1주일) 의 청력 역치가 여전히 대조군 수준보다 유의하게 높았기 때문에 영구적인 구성 요소를 포함하는 것으로 제안됩니다.
현재 프로토콜의 한계 중 하나는 달팽이관의 정점 회전에 해당하는 마우스의 저주파 청력 역치를 나타내기 위해 12kHz에서 감지된 청력 역치를 사용했다는 것입니다. 엄밀히 말하면, 달팽이관의 정점 회전은 4kHz에서 8kHz12의 소리에 더 민감합니다. 그러나 이러한 제한은 제시된 프로토콜이 작동 단계의 모든 세부 사항을 제공하고 모델 생성과 관련된 장치를 사용하기 때문에 이 연구 및 프로토콜의 가치를 거의 감소시키지 않습니다. 소음 노출 기간, 잡음 주파수, ABR에 대한 자극 주파수, ABR 테스트 및 동물 희생 수행 시기와 같은 제시된 매개변수의 대부분은 향후 연구에서 다양한 목적을 위해 변경 및 추가로 최적화될 수 있습니다.
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Disclosures
공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
대만 정부 과학기술부(MOST)의 보조금(MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3)과 Mackay Medical College(MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03)의 교내 연구 보조금에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
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