Summary
Her presenterer vi en protokoll for en musemodell av støyindusert hørselstap (NIHL). For å indusere NIHL utviklet vi en ny og enkel enhet ved hjelp av bølgepapp, et rottefellebur og en høyttaler. Auditiv hjernestammerespons og immunfluorescensavbildning ble brukt for å vurdere henholdsvis hørselsfunksjonen og ytre hårcelleskader.
Abstract
En dyremodell av støyindusert hørselstap (NIHL) er nyttig for patologer, terapeuter, farmakologer og hørselsforskere for å forstå mekanismen til NIHL grundig, og deretter optimalisere de tilsvarende behandlingsstrategiene. Denne studien tar sikte på å skape en forbedret protokoll for å utvikle en musemodell av NIHL. Mannlige C57BL/6J-mus ble brukt i denne studien. Unanesthetized mus ble utsatt for høye lyder (1 og 6 kHz, presentert samtidig ved 115-125 dB SPL-A) kontinuerlig i 6 timer per dag i 5 påfølgende dager. Hørselsfunksjonen ble vurdert 1 dag og 1 uke etter støyeksponering, ved hjelp av auditiv hjernestammerespons (ABR). Etter ABR-målingen ble musene ofret, og deres organer av Corti ble samlet for immunfluorescensfarging. Fra målinger av auditiv hjernestammerespons (ABR) ble det observert signifikant hørselstap 1 dag etter støyeksponering. Etter 1 uke sank hørselstersklene til eksperimentmusene til ~80 dB SPL, som fortsatt var et betydelig høyere nivå enn kontrollmusene (~40 dB SPL). Fra resultatene av immunfluorescensavbildning ble ytre hårceller (OHC) vist å være skadet. Oppsummert opprettet vi en modell av NIHL ved hjelp av mannlige C57BL/6J-mus. En ny og enkel enhet for å generere og levere ren tonestøy ble utviklet og deretter benyttet. Både kvantitative målinger av hørselsterskler og morfologisk bekreftelse av OHC-skade viste at den påførte støyen induserte et forventet hørselstap.
Introduction
Omtrent 1,3 milliarder mennesker over hele verden lider av hørselstap på grunn av støyeksponering1. I denne studien hadde vi som mål å etablere en klar trinnvis prosess for å indusere og bekrefte støyindusert hørselstap (NIHL). NIHL skyldes en degenerasjon / ødeleggelse av hårceller (HCs) og spiral ganglion nevroner (SGN), skade i HC stereocilia, og / eller tap av synapser mellom cochlea indre HCs og SGNs. Slike avvik kan også forårsake tinnitus og nedsatt taleoppfattelse (spesielt i et komplekst akustisk miljø) i tillegg til NIHL. Sosiale, psykologiske og kognitive funksjoner kan bli sekvensielt påvirket av disse fysiologiske manglene 2,3,4,5,6.
I NIHL-relaterte prekliniske studier basert på mus er de mest populære musestammene CBA / CaJ 2,3,6,7 og C57BL / 6 4,5,8. De mannlige 3,4,7 musene er dessuten mer vanlig brukt enn de kvinnelige, da østrogen har en beskyttende effekt på hørselen. Derfor brukte vi bare hannmus i denne studien9. Etter å ha referert til litteraturen, valgte vi 1 kHz og 6 kHz som frekvensene til den påførte støyen. Intensiteten av den påførte støyen var 115 dB SPL-A (rundt merden) til 125 dB SPL-A (i midten av merden). Etter å ha utsatt de eksperimentelle musene for støyen kontinuerlig i 6 timer per dag, i 5 påfølgende dager, indikerte en optimal økning i hørselsterskelen at en optimal grad av NIHL ble generert i eksperimentelle mus. Operasjonene for å håndtere dyrene, bygge det eksperimentelle oppsettet og indusere støy er alle tydelig beskrevet trinn for trinn i den medfølgende protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk i denne studien ble godkjent av Animal Care Committee of Mackay Medical College. Åtte uker gamle mannlige C57BL/6J-mus ble kjøpt fra National Laboratory Animal Center (New Taipei City, Taiwan). Alle mus ble avlet og plassert i samsvar med standard dyreprotokoll.
1. Induksjon av NIHL hos mus
- Forbered buret for eksperimentelle mus
- For å gjøre det, bruk et rottefellebur med dimensjoner på 14 cm × 17 cm × 24 cm. Klipp fire stykker bølgepapp i passende størrelser, slik at de passer inn i buret (13 cm × 23 cm og 13 cm × 16 cm).
- For å forhindre at musene får føttene kuttet av maskegitteret, plasser to av brikkene henholdsvis nederst og på baksiden. Plasser de to andre delene vinkelrett sammenlåst med hverandre, for å dele rommet i buret i kvartaler.
- Utfør denne studien i en lydisolert boks. Plasser en høyttaler 8,5 cm foran buret, og plasser både høyttaleren og buret i en lydisolert boks.
- Åpne CLIO-programvaren
- Flytt markøren til høyttalerikonet, og klikk deretter på TwoSin. Skriv inn og endre verdien til Freq 1 til 1000 Hz, Freq 2 til 6000 Hz, og klikk på OK for å begynne å spille av lyden.
- Under Leq-fanen endrer du dBV til dBSPL. Etter å ha angitt tiden på programvaregrensesnittet, klikker du på den grønne trekantknappen for å spille av lyden.
- Plasser en mikrofon foran høyttaleren i en avstand på 8,5 cm for å kalibrere støynivået (se tilleggsfil 1). Juster støynivået til 125 dB SPL-A og overvåk kontinuerlig i ikke mindre enn 3 minutter for å sikre at støynivået er tilstrekkelig stabilt. Bruk en generator, en analysator og en forsterker for å skape og kontrollere støyen. (Figur 1)
MERK: Gjør dette trinnet i en lydisolert boks for å unngå skade på operatørens hørsel. - Plasser fire hannmus C57BL/6J i buret (en for hvert kvartal) for støyeksponering. Tilordne musene tilfeldig i hvert kvartal under støyeksponeringen. Plasser en mikrofon på toppen av buret for å overvåke støynivået under støyeksponeringen (figur 2).
MERK: Gjør dette trinnet i en lydisolert boks for å unngå skade på operatørens hørsel. - Utsett musene for støy ved frekvenser på 1 kHz og 6 kHz kontinuerlig i 6 timer per dag, i 5 påfølgende dager.
- Mål hørselstersklene til musene 1 dag etter støyeksponeringen (dvs. på den 6. dagen) ved å måle ABR. Gjenta disse ABR-målingene igjen 1 uke etter støyeksponeringen (dvs. den 13. dagen). Etter ABR-målingene, ofre alle de involverte musene og høst deres cochleae (figur 3).
2. Auditiv hjernestammerespons (ABR)-basert vurdering av hørselsterskel
- Bruk et kommersielt ABR-testsystem spesielt utviklet for små dyr10.
- Intraperitonealt injisere en blanding av tiletamin og zolazepam (40 mg / kg) og xylazin (9,3 mg / kg) i musene for generell anestesi.
MERK: ABR-vurdering tar ~ 2 timer. Sørg for å gi termisk støtte via en varmepute og bruk øyesalve for å forhindre tørrhet mens musen er under anestesi. - Mål ABR i musen under generell anestesi. Plasser subdermale nåleelektroder (12 mm) på toppunktet, bak tinnaen på venstre øre og tilbake nær halen for å måle hørselsterskelen.
- Presenter akustiske stimuli ved hjelp av en høyttaler plassert 1 cm fra dyrets venstre øre.
- Bruk et oscilloskop for å kontrollere de akustiske stimuliene. Velg Sinusbølge for stimuli og 10 k for vindusskala. Vri frekvensknappen for å oppnå ønsket frekvens av de akustiske stimuliene.
- Juster stimulusintensiteten ved å vri AMLP-knappen på funksjonsgeneratoren. Oppnå ønsket stimulusintensitet ved å vri AMLP-knappen til en passende spenning, beregnet ut fra kalibrering.
- Samle ABR-målingene under en rekke stimulusintensiteter, fra 10 dB SPL til 100 dB SPL, med en trinnstørrelse på 10 dB.
MERK: Mål hørselsterskelen i en lydisolert boks. Det minste stimulusintensitetsnivået som kunne gi opphav til en merkbar bølge V i det innsamlede signalet, ble antatt å være ABR-terskelen10,11 (figur 4). Etter ABR-vurdering, overvåk dyret til det kommer seg etter anestesi (~1 time).
3. Mikroskopisk undersøkelse
- Fiksering av høstet vev
- Etter ABR-målingene, ofre musen ved intraperitonealt å injisere en blanding av tiletamin og zolazepam (100 mg / kg) og xylazin (23,25 mg / kg) for den mikroskopiske undersøkelsen.
- Høst cochleae fra musen og senk dem umiddelbart i 10 % formaldehyd (FA) for fiksering (to sneglehus/ml) i minst 8 timer ved 4 °C.
- Etter fiksasjon erstattes FA-oppløsningen med en 10 % etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) oppløsning for avkalking i 3-4 dager ved 4 °C. Sjekk deretter hver cochlea med pinsett for å bekrefte at cochleae er tilstrekkelig myknet.
- Legg cochleae i en petriskål fylt med fosfatbufret saltvann (PBS), og kutt det spiralformede organet til Corti (OC) (hver avkalket cochlea) i tre seksjoner - basalsving, midtsving og apikal sving for vevfarging.
- Under et dissekerende mikroskop (forstørrelse: 8x-35x), fjern de benete strukturer (scala vestibuli, scala tympani og modiolus) av de avkalkede cochleae og oppnå bløtvevet, inkludert OC (tykkelse: ca. 40 μm).
- Cochlea immunfluorescens farging
- Fremstilling av blokkeringsbufferen: Klargjør 2% bovint serumalbumin (BSA) og 0,2% Triton X-100 oppløsninger i PBS.
- Overfør vevet som skal farges fra petriskålen til et mikrosentrifugerør, og senk vevet i 0,1 ml av blokkeringsbufferen i 2 timer ved romtemperatur (RT).
- Fremstilling av primærantistoffbufferen for Myo7A: Fortynn det primære antistoffet Myo7A i blokkeringsbufferen i et volumforhold på 1:200.
- Behandle vevet i mikrosentrifugerøret med 100 μL Myo7A primær antistoffbuffer i 2 timer ved RT.
- Skyll vevet tre ganger i PBS i 5 min hver.
- Fremstilling av Myo7A sekundært antistoff (Myo7A-Rb-488) og falloidinantistoff (phalloidin-594) buffer: Fortynnet Myo7A sekundært antistoff (1:400) og falloidinantistoff (1:200) i blokkeringsbufferen.
- Behandle vevet med 100 μL Myo7A sekundært antistoff og falloidinantistoffbuffer i 2 timer ved RT.
- Etter antistoff + phalloidin antistoff behandling, skyll vevet i PBS tre ganger, i 5 min hver.
- Overfør det skyllede vevet fra mikrosentrifugerøret til en petriskål fylt med PBS ved hjelp av en 1 ml plastoverføringspipette med kuttspiss.
- For å forberede den mikroskopiske undersøkelsen, brett ut vevet, legg det på et glassglass og tilsett 15 μL 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fluoromountmedium på vevet for å dekke det helt. Legg et glassdeksel forsiktig over vevet. La sklien stå over natten på RT før du forsegler den med neglelakk.
- Anskaffelse av bilder
- Skaff deg 2D-bilder ved hjelp av et oppreist fluorescensmikroskop og programvare for bildeopptak.
- Før du utfører den mikroskopiske undersøkelsen, sentrer vevet i synsfeltet og juster følsomheten til ISO 100. Juster eksponeringstiden først ved å klikke på Automatisk modus-knappen i programvaren, og finjuster deretter manuelt ved å klikke på Juster-knappen for å optimalisere signal-støy-forholdet.
- Juster bølgelengden til det innfallende lyset for å opphisse fluoroforene ved å rotere fluorescenskuben. Pseudofarger ble brukt til å markere utslipp fra forskjellige fluorescerende etiketter (blått lys: DAPI; grønt lys: Myo7A; rødt lys: falloidin).
- Ved å skanne vevsprøven, generere og samle bildedataene som .tif og .jpg bildefiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skifte i ABR-hørselsterskelen
Hørselsterskelen til musene ble målt med tonesprengt ABR enten 1 dag eller 1 uke etter støyeksponeringen. En signifikant økning i hørselsterskelen ved alle de tre testede frekvensene ble observert (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL) 1 dag etter støyeksponeringen (dvs. den 6. dagen). Delvis hørselsrestitusjon skjedde 1 uke etter støyeksponeringen (dvs. den 13. dagen), men hørselstersklene var fortsatt forhøyet med mer enn 30 dB ved alle frekvenser (12 kHz: 72,86 ± 2,86 dB SPL; 24 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 32 kHz: 87,14 ± 4,21 dB SPL) sammenlignet med kontrollgruppene (12 kHz: 41 ± 0 dB SPL; 24 kHz: 51 ± 0 dB SPL; 32 kHz: 51 ± 0 dB SPL). I denne studien ble hørselen mer skadet ved høye frekvenser (figur 5). Toveis ANOVA-test ble brukt til analyse, og Bonferroni-korreksjon ble brukt til posttest. En signifikant forskjell (p < 0,001) ble observert mellom kontroll- og eksperimentgruppene både på 6. og 13. dag. Sammenligning mellom hørselstersklene målt på 6. og 13. dag viste en signifikant forskjell (p < 0,05) ved frekvensene 12 kHzog 32 kHz.
Tap av ytre hårceller
Et tap av OHC ble konsekvent observert i de mikroskopiske bildene som ble tatt fra NIHL-musene, sammenlignet med de fra kontrollmusene. Derimot ble de indre hårcellene observert å være intakte i alle bildene. I tillegg ble OHC i basal- og midtsvingen i Corti-organet skadet mer alvorlig, mens OHC-ene i apikalsvingen var nesten intakte (figur 6).
Figur 1: Oppsett av støyeksponering. En mikrofon ble plassert foran høyttaleren i en avstand på 8,5 cm for å kalibrere støynivået. Støynivået ble justert til 125 dB SPL-A, som tilsvarer nivået på en sirene i nærheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Rottefelleburet tilpasset denne studien. Tre hannmus av typen C57BL/6J ble randomisert til hvert kvartal under støyeksponeringen. Mikrofonen ble festet til toppen av buret for å overvåke støynivået under støyeksponering. Lydtrykknivået ble målt flere ganger i flere posisjoner. Disse stillingene er markert i figuren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksperimentell tidslinje for test- og kontrollgruppen. Musene ble utsatt for støy ved frekvensene 1 og 6 kHz kontinuerlig i 6 timer per dag, i 5 dager. Etter 5 påfølgende dager med støyeksponering ble hørselstersklene til eksperimentmusene målt med ABR den 6. dagen. ABR-målingen ble utført i eksperimentmusene igjen og i kontrollmusene på den 13. dagen, etterfulgt av ofring av alle de involverte musene for å høste sine cochleae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: ABR-måling av hørsel. Representative ABR-resultater ved 12 kHz, samlet på den 13. dagen (1 uke etter støyeksponeringen). Bølgen V ved hver intensitet er merket hvis den kan skjelnes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hørselsterskler målt på 6. og 13. dag. Hørselsterskelen ved frekvenser på (A) 12 kHz, (B) 24 kHz og (C) 32 kHz. Toveis ANOVA-test ble brukt til analyse, etterfulgt av Bonferroni-korreksjon. *p < 0,05, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Immunofluorescensavbildningsresultater oppnådd fra OC . (A) Bilde hentet fra cochleas apikale sving. (B) Bilde hentet fra midtsvingen på sneglehuset. (C) Bilde hentet fra basisdreiningen av sneglehuset. Blå: cellekjerner farget med DAPI; Grønn: hårceller farget med Myo7A; Rød: cytoskjelett farget med falloidin. Piler indikerer tap av OHC. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Spenningsberegning ved kalibrering. For hver spesifikke frekvens vil verdien av den valgte spenningen (horisontal akse) bli lagt inn i kalibreringskurven for å oppnå det tilsvarende lydnivået (vertikal akse). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIHL kan deles inn i to typer: midlertidig NIHL, som viser en midlertidig forskyvning av hørselsterskelen, og permanent NIHL, som kjennetegnes av en permanent hørselsterskelforskyvning. Hørselstapet som vi observerte på den 6. dagen (1 dag etter støyeksponeringen) antas å være en kombinasjon av disse to typene. I dette tilfellet vil hørselsterskelen vise en gradvis bedring over tid på grunn av den tidsmessige komponenten av hørselstap. I våre foreløpige eksperimentelle studier, resultatene oppnådd med samme oppsett og dyr, ble hørselstapet generert av 2 dagers støyeksponering fullstendig gjenopprettet etter 2 uker, noe som indikerer at permanent NIHL faktisk ikke ble generert. Tvert imot, i denne studien antydes hørselstapet som genereres av 5 dagers støyeksponering å inkludere en permanent komponent, da hørselsterskelen fortsatt var betydelig høyere enn kontrollnivået på den 13. dagen (1 uke etter støyeksponeringen).
En av begrensningene i den nåværende protokollen er at vi brukte hørselsterskelen oppdaget ved 12 kHz for å representere musens lavfrekvente hørselsterskel, noe som tilsvarer den apikale svingen til cochlea. Strengt tatt er cochleas apikale dreining mer følsom for lyd ved 4 kHz til 8 kHz12. Denne begrensningen reduserer imidlertid neppe verdien av denne studien og protokollen, da den presenterte protokollen gir alle detaljer om operasjonstrinnene og bruker enheter som er involvert i modellopprettelsen. De fleste av de presenterte parametrene, som støyeksponeringsvarigheter, støyfrekvenser, stimulusfrekvenser for ABR, og når man skal utføre ABR-tester og dyreofring, kan endres og optimaliseres ytterligere for forskjellige formål i fremtidige studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikt å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker tilskuddene fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST) fra Taiwans regjering (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), og intramural forskningsstipend fra Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063 (2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173 (2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254 (2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189 (2019).
