Summary
يصف هذا البروتوكول تخليق الببتيدات المخترقة للخلايا الحلقية مع الروابط المتقاطعة العطرية وتقييم نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية.
Abstract
لقد كان السرطان تحديا كبيرا في مجال الصحة العالمية. ومع ذلك ، فإن البيئة المكروية المعقدة للورم تحد عموما من وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة ، مما يؤدي إلى تكرار الورم. للتغلب على الاختراق المحدود للحواجز البيولوجية ، تم اكتشاف الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) بقدرة ممتازة على نقل الغشاء وظهرت كناقلات جزيئية مفيدة لتوصيل الشحنات المختلفة إلى الخلايا. ومع ذلك ، تظهر CPPs الخطية التقليدية عموما استقرارا محللا للبروتين ، مما يحد من نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة يمكنها اختراق الحواجز البيولوجية وإظهار استقرار محسن للبروتين أمر مرغوب فيه للغاية لتعزيز كفاءة توصيل الأدوية في التطبيقات الطبية الحيوية. لقد قمنا سابقا بتجميع لوحة من CPPs الدورية القصيرة مع روابط متقاطعة عطرية ، والتي أظهرت نفاذية فائقة في الخلايا والأنسجة السرطانية مقارنة بنظيراتها الخطية. هنا ، يتم وصف بروتوكول موجز لتوليف الببتيد البولي أرجينين R8 الدوري المسمى بالفلورسنت ونظيره الخطي ، بالإضافة إلى الخطوات الرئيسية للتحقيق في نفاذية الخلية.
Introduction
شهدت العقود القليلة الماضية تقدما سريعا في تطوير الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) لتوصيل الأدوية. تم استخدام CPPs على نطاق واسع كناقلات جزيئية لعلاج مجموعة من الأمراض التي تهدد الحياة ، بما في ذلك الاضطرابات العصبية1,2 ، وأمراض القلب3 ، والسكري4 ، والتهاب الجلد5 ، والسرطان 6,7. لا يزال السرطان يشكل عبئا صحيا عالميا مصحوبا بمعدل مرتفع من المراضة والوفيات على الرغم من الجهود البحثية واسعة النطاق8. تتمثل إحدى العقبات الخطيرة أمام علاج السرطان في محدودية وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة بسبب الحواجز الفسيولوجية مثل المصفوفة المدمجة خارج الخلية (ECM) ، والأوعية الدموية غير الطبيعية للورم ، وحواجز الأغشية المتعددة ، وارتفاع ضغط السائل الخلالي (IFP) 9. وبالتالي ، فإن تطوير CPPs جديدة ذات قدرة فائقة على توصيل الشحنات عبر الحواجز البيولوجية يعتبر استراتيجية أساسية لعلاج السرطان10,11.
يمكن تصنيف CPPs إلى CPPs الموجبة والبرمائية والكارهة للماء من حيث خصائصها الفيزيائية والكيميائية12. من بين هذه ، الببتيد HIV-TAT المشحون إيجابيا والبوليارجينين الاصطناعي لهما أهمية كبيرة في البحوث الطبية الحيوية وقد تمت دراستهما على نطاق واسع لتسهيل توصيل الدواء داخل الخلايا13. أفاد Tunnemann et al. أن الحد الأدنى لطول ثمانية أرجينين ضروري لاختراق الخلايا بكفاءة لببتيدات البولي أرجينين الاصطناعية ، بناء على دراسة نفاذية الخلية التي أجريت باستخدام الببتيدات R3 إلى R1214. ومع ذلك ، فإن هذه CPPs عموما لها نصف عمر بلازما قصير بسبب التحلل المائي السريع في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، لا يعرف سوى القليل فيما يتعلق بتحسين التركيب الكيميائي ل CPPs لزيادة قدرتها على عبور الحاجز لأنه من الصعب اختراق أغشية خلايا متعددة15. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة قادرة على اختراق الحواجز البيولوجية أمر مرغوب فيه بشدة لتعزيز كفاءة توصيل الدواء. في عام 2020 ، اكتشف Komin et al.16 CPP يسمى CL peptide ، والذي يحتوي على شكل حلزوني (RLLRLLR) وذيل بولي أرجينين (R7) لعبور الطبقة الأحادية الظهارية. كما تم تصنيع مجموعة من متغيرات الببتيد CL عن طريق تغيير النمط الحلزوني. يمكن أن يكون هذا الاستكشاف دليلا مهما لتطوير CPPs جديدة لتسليم الشحنات عبر الحواجز البيولوجية. علاوة على ذلك ، قام Dietrich et al. بتحسين نفاذية الخلية لببتيد StAX ، مما أدى إلى تثبيط مسار إشارات Wnt / β-catenin عن طريق زيادة الكارهة للماء الكلية للببتيدات17.
يعد التقييد المطابق للببتيدات الخطية غير المنظمة عن طريق التدوير طريقة فعالة لتعزيز استقرارها المحلل للبروتين ونفاذيتها18،19،20. يزيد التعزيز الهيكلي من مقاومة الأنزيم البروتيني للببتيدات الحلقية ، مما يجعلها أكثر استقرارا في الجسم الحي مقارنة بنظيراتها الخطية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تدوير الببتيدات إلى إخفاء العمود الفقري للببتيد القطبي من خلال تعزيز الترابط الهيدروجيني داخل الجزيئات ، وبالتالي زيادة نفاذية الغشاء للببتيدات21. في العقدين الماضيين ، أصبحت طرق التدوير الكيميائي الانتقائي استراتيجيات فعالة لبناء الببتيدات الحلقية ذات البنى المختلفة ، مثل جميع الهيدروكربونات ، واللاكتام ، والتريازول ، و m-xylene ، والبيرفلورواريل ، وغيرها من الروابط المتقاطعة22,23. يمكن للحاجز البيولوجي الذي تفرضه البيئة المكروية المتطورة للورم أن يقلل من تغلغل الأدوية في الأورام الصلبة24. لقد وجدنا سابقا أن CPPs الدورية أظهرت مقاومة فائقة للهضم الأنزيمي على نظيراتهاالخطية 20. علاوة على ذلك ، فإن الكارهة للماء الكلية للببتيدات أمر بالغ الأهمية لتعزيز نفاذية الخلية22. بناء على الدراسات التي نوقشت أعلاه ، يمكن افتراض الجمع بين نمط موجب الشحنة ، وارتفاع الكارهة للماء بشكل عام ، وتعزيز استقرار التحلل البروتيني لزيادة نفاذية CPPs عبر الحواجز البيولوجية. في دراسة حديثة ، حددنا اثنين من CPPs الدورية مع وصلات متقاطعة عطرية في المواضع i و i + 7 التي تظهر نفاذية محسنة في الخلايا والأنسجة السرطانية مقارنة بنظيراتها الخطية15. هنا ، يتم تقديم بروتوكول اصطناعي موجز لتوليف CPPs الدورية ذات العلامات الفلورية والخطوات الرئيسية للتحقق من نفاذيتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المعدات
ملاحظة: نفذ جميع الإجراءات في غطاء دخان التشغيل باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- قم بتجميع جهاز تخليق الببتيد اليدوي في غطاء الدخان (الشكل 1). ضع محبس ثلاثي الاتجاهات (انظر جدول المواد) على مشعب الفراغ (انظر جدول المواد) وقم بتوصيله بالنيتروجين (N2). تأكد من تغطية المداخل غير المستخدمة.
- قم بتوصيل عمود بولي بروبيلين سعة 10 مل (انظر جدول المواد) على محبس ثلاثي الاتجاهات. قم بتصريف خليط التفاعل أو المذيبات من عمود البولي بروبلين باستخدام لمبة ماصة مطاطية أو فراغ عبر مصيدة نفايات.
2. تخليق الببتيد الخطي R8 المسمى FITC (FITC-R8) وببتيد R8 المسمى FITC (FITC-SR8-4)
ملاحظة: تم تصنيع الببتيدات وفقا لبروتوكول تخليق الببتيد ذو الطور الصلب (SPPS) القياسي القائم على Fmoc25. تم استخدام راتنج 4- (2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA (راتنج حلبة أميد MBHA ، انظر جدول المواد) طوال فترة الدراسة.
تنبيه: N و N-dimethylformamide (DMF) و N و N-diisopropylethylamine (DIPEA) والمورفولين وثنائي كلورو الميثان (DCM) كلها عديمة اللون وتكون ضارة إذا تم استنشاقها أو امتصاصها من خلال الجلد. الأثير قابل للاشتعال للغاية. 1،2-إيثانديثيول (EDT) هو مادة ذات رائحة خاصة. حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) شديد التآكل ، وحموضته 105 أضعاف حمض الأسيتيك. وبالتالي ، من المفترض أن يتم التعامل مع جميع الكواشف والمواد الكيميائية باستخدام معدات واقية في غطاء الدخان.
- تحضير الراتنج لتوليف الببتيد.
- احسب كتلة الراتنج اللازمة للتوليف: كتلة الراتنج (ملغ) = مقياس (مليمول) / قدرة تحميل الراتنج (مليمول / جم) × 1000 (ملغم / جم)
ملاحظة: على سبيل المثال ، كتلة راتنج MBHA أميد حلبة التزلج (0.572 مليمول / جم) ل 0.2 مليمول = 0.2 مليمول / 0.572 مليمول / جم × 1000 مجم / جم = 350 مجم. - أضف 4-5 مل من DMF إلى الكمية المطلوبة من الراتنج وانقلها إلى عمود البولي بروبلين سعة 10 مل (الخطوة 1.2) مع فقاعات N2 اللطيفة لمدة 30 دقيقة لانتفاخ الراتنج بشكل كاف ، ثم استنزاف DMF.
- أضف 4-5 مل من 50٪ مورفولين / DMF (v / v) إلى الراتنج ، وقم بفقاعة N2 برفق لمدة 30 دقيقة 2x لإزالة مجموعة Fmoc الطرفية N ، ثم صفي الخليط. بعد ذلك ، اغسل الراتنج جيدا 3 مرات بإضافة 4-5 مل من DMF إلى العمود والفقاعات ب N2 لمدة 1 دقيقة على الأقل في كل مرة. استمر في غسل الراتنج باستخدام DCM (3x) و DMF (3x) بنفس الطريقة.
- احسب كتلة الراتنج اللازمة للتوليف: كتلة الراتنج (ملغ) = مقياس (مليمول) / قدرة تحميل الراتنج (مليمول / جم) × 1000 (ملغم / جم)
- قم بإجراء اقتران الأحماض الأمينية المحمي من Fmoc كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: يوصف اقتران الأرجينين في توليف يدوي بمقياس 0.2 مليمول هنا كمثال.- قم بإذابة Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 مكافئات ، 648.8 مجم) و 2- (7-أزوبنزوتريازول) -N ، N ، N '، N'-رباعي ميثيل يورونيوم سداسي فلورو فوسفات (HATU ، 4.9 مكافئ ، 372.6 مجم) في 5 مل من DMF في أنبوب طرد مركزي.
- أضف DIPEA (10 مكافئات ، 348.4 ميكرولتر) لتنشيط تفاعل الاقتران ثم انقل خليط التفاعل إلى عمود البولي بروبلين 10 مل مع الراتنج (محضر في الخطوة 2.1.3). ثم حرك الخليط برفق مع فقاعات N 2 لمدة1-2 ساعة.
- كرر تفاعل الاقتران (الخطوة 2.2.1 والخطوة 2.2.2) مرة واحدة.
- بعد الانتهاء من أداة التوصيل ، قم بتصريف خليط التفاعل وغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DMF و DCM و DMF 3x لكل منها لمدة 1 دقيقة على الأقل في كل مرة.
- قم بإجراء اقتران لكل حمض أميني في خطوات مرتبة: أضف 4-5 مل من 50٪ مورفولين / DMF (v / v) إلى الراتنج ، ضع فقاعة برفق باستخدام N 2 لمدة 30 دقيقة 2x لإزالة مجموعة N α-Fmoc ، ثم اغسل الراتنج (كما هو موضح في الخطوة 2.2.4) ، وتابع إقران الحمض الأميني التالي (كما هو موضح في الخطوة 2.2.1 والخطوة 2.2.2). المضي قدما في عدة دورات من هذه الخطوة لتحقيق توليف الببتيد المطلوب.
ملاحظة: يمكن إيقاف هذه العملية مؤقتا هنا. تكثيف الراتنج مع الميثانول وتجفيف الراتنج مع تدفق مستمر من N2. قم بتغطية عمود البولي بروبلين ثم قم بتخزين الراتنج في 4 درجات مئوية لبضعة أيام (أو عند -20 درجة مئوية لتخزين أطول). تضخم الراتنج مع 4-5 مل من DMF لمدة 0.5-1 ساعة قبل البدء في توليف جديد. إذا انتقلت مباشرة إلى الخطوة التالية ، فليست هناك حاجة لتكثيف الراتنج.
- قم بتسمية الببتيدات بإيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) كما هو موضح أدناه.
- قم بإقران بيتا ألانين كفاصل لوضع العلامات FITC باستخدام نفس العملية المستخدمة في اقتران الأحماض الأمينية في الخطوة 2.2.
- قم بإجراء وضع علامات FITC على الببتيدات على الراتنج عن طريق إضافة خليط من FITC (5 مكافئات) و DIPEA (10 مكافئات) و DMF إلى عمود البولي بروبلين والتفاعل في الظلام لمدة 8 ساعات.
- لتوليف FITC-sR8-4 ، قم بإجراء تدوير الببتيد الخطي كما هو موضح أدناه.
- أضف مزيجا من TFA / triisopropylsilane (TIS) / DCM (3/5/92 ، v / v / v) إلى عمود البولي بروبلين لمدة 2 دقيقة لإزالة مجموعة حماية Cys (Trt) بشكل انتقائي ، ثم استنزاف الخليط. كرر الإجراء أعلاه حتى يصبح المحلول المصفر عديم اللون لإزالة مجموعة حماية Trt تماما.
- بعد ذلك ، قم بإجراء عمليات غسل متسلسلة للراتنج باستخدام DMF و DCM على الأقل 3x. بعد ذلك ، قم بإذابة 4،4'-bis (bromomethyl) biphenyl (2 مكافئ) في DMF مع DIPEA (4 مكافئات) ، وأضفه إلى العمود ، وتفاعل لمدة 4 ساعات.
- شق الببتيدات كما هو موضح: بعد الانتهاء من تخليق الببتيد ، اغسل الراتنج ب 4-5 مل من الميثانول مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما وجففه بتدفق مستمر من N2. عالج الراتنج بكوكتيل انشقاق فعال TFA / TIS / H 2 O (95 / 2.5 / 2.5 ، v / v / v) ، أو TFA / TIS / EDT / H 2 O (92.5/ 2.5 / 2.5 / 2.5 ، v / v / v / v) للببتيدات التي تحتوي على cysteines ، باستخدام ما يقرب من 1 مل من كوكتيل الانقسام لكل 100 ملغ من الراتنج. عالج الراتنج المرتبط بالببتيد لمدة 2-3 ساعات لشق الببتيد ثم قم بإزالة TFA بعناية بتيار من N2.
- للحصول على الببتيدات الخام ، أضف 4-5 مل من ثنائي إيثيل الأثير إلى تحضير الببتيد المشقوق لترسيب الببتيدات الخام وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 4 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية وجفف الببتيد في الهواء لمدة 3 دقائق في غطاء دخان فعال.
- تحليل الببتيدات: قم بإذابة الببتيد الخام صغير الحجم (المشقوق من حوالي 10 ملغ من الراتنج المرتبط بالببتيد) في 800 ميكرولتر من الأسيتونيتريل (ACN) / H2O (1/1 ، v / v) ثم قم بالتحليل باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور العكسي (RP-HPLC) وقياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) (انظر جدول المواد).
- تنقية الببتيدات باستخدام RP-HPLC و LC-MS.
- قم بإذابة 50 مجم من منتج الببتيد الخام في 4 مل من ACN / H2O (1/1 ، v / v) ، وحقن المحلول في نظام RP-HPLC مزود بعمود C18 (4.6 مم × 150 مم ، حجم المسام: 120 Å ، حجم الجسيمات: 4 ميكرومتر ؛ انظر جدول المواد). تخلص من الببتيد باستخدام طور متحرك يحتوي على 0.1٪ TFA / H2O (v / v) و ACN ، مع تدرج من 10٪ إلى 90٪ ACN على مدار 30 دقيقة. تم الكشف عن الببتيدات التقليدية عند 220 نانومتر والببتيدات التي تحمل علامة FITC عند 494 نانومتر.
- اجمع الكسور المقابلة لذروة الببتيد الرئيسية كما حددها مرض التصلب العصبي المتعدد ، ثم جفف كسور الببتيد المطلوبة بالتجميد. قم بتخزين الببتيد المنقى في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: m / z الموجود من FITC-R8 المنقى هو كما يلي: [M + 3 H] 3+: 576.63 ؛ [م + 4 ح] 4+: 432.72 ؛ [م + 5 ساعة] 5+: 346.39 ؛ [م + 6 ح] 6+: 288.85. m / z الموجود من FITC-sR8-4 المنقى هو كما يلي: [M + 3 H] 3+: 704.74 ؛ [م + 4 ح] 4+: 528.77; [م + 5 ساعة] 5+: 423.34; [م + 6 ح] 6+: 352.91. الشروط التحليلية لمرض التصلب العصبي المتعدد: الأداة: ESI (انحياز المسبار: +4.5 كيلو فولت ؛ الكاشف: 1.2 كيلو فولت) ؛ تدفق غاز البخاخات: 1.5 لتر / دقيقة ؛ خط الذوبان المنحني (CDL): −20 فولت ؛ درجة حرارة CDL: 250 °C ؛ درجة حرارة الكتلة: 400 °C ؛ معدل التدفق: 0.2 مل / دقيقة ؛ المرحلة المتنقلة: 50٪ H2O / 50٪ ACN.
3. القياس الكمي للببتيدات التي تحمل علامة FITC
- قم بإذابة كمية صغيرة من الببتيد المنقى في DMSO كمحلول مخزون (على سبيل المثال ، 40 ميكرومول / مل).
- قم بقياس الامتصاص عند 494 نانومتر (A 494) من 2 ميكرولتر من محلول المخزون في498 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10 مللي متر (1x PBS ، درجة الحموضة 7.4) باستخدام لوحة عيار دقيق (انظر جدول المواد) باستخدام قارئ صفائح دقيقة متعدد التقنيات (انظر جدول المواد). عامل التخفيف هو 500 ميكرولتر / 2 ميكرولتر = 250 ، وطول مسار لوحة المعايرة الدقيقة 0.5 مم.
- احسب تركيز محلول المخزون باستخدام الصيغة التالية:
التركيز (مللي مول) =عامل تخفيف × 494 / 0.05 (سم) / 77000 (سم −1 · M−1) × 1,000 (mM·M−1) - اضبط على التخفيف المناسب بحيث تكون قيمة A494 المقاسة بين 0.1 و 1.0.
ملاحظة: يجب تكرار القياسات عدة مرات للتأكد من دقة التركيز المقاس. معامل الانقراض 77000 cm−1· ينشأ M−1 من مجموعة FITC.
4. استقرار الببتيدات في مصل الجنين البقري (FBS)
- احتضان الببتيد بتركيز 100 ميكرومتر مع 250 ميكرولتر من 25٪ FBS / H2O (v / v) عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة لمدة 0 ساعة و 1 ساعة و 2 ساعة و 4 ساعات ، خذ 10 ميكرولتر من القسمة ثم أضف 150 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو الخليك 12٪ المذاب في H2O / ACN (1/3 ، v / v) لترسيب بروتينات المصل.
- أجهزة الطرد المركزي العينات عند 10000 × جم لمدة 5 دقائق وتحليل المادة الطافية باستخدام HPLC (كما هو موضح في الخطوة 2.8) لتحديد مدى تدهور الببتيد.
- احسب نسبة مساحة الذروة عند 1 h و 2 h و 4 h إلى تلك عند 0 h للحصول على جزء من الببتيد غير المتحلل في الوقت المقابل. والنتيجة هي متوسط ثلاث عينات متوازية.
5. الامتصاص الخلوي للببتيدات
- التصوير المجهري الفلوري
- ضع غطاء دائريا في طبق من 12 بئرا. بعد ذلك ، قم بتلقيح 1 × 105 خلايا بشكل موحد على أغطية وثقافة طوال الليل مع 2 مل من الوسط. إزالة الوسط وغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استزراع خلايا HeLa وخلايا 4T1 في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM ، انظر جدول المواد) مع 10٪ FBS في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2. - احتضان الخلايا ب 1 مل من 3 ميكرومتر من الببتيدات التي تحمل علامة FITC في DMEM الخالي من FBS لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط المحتوي على الببتيد واغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS.
- تلطيخ الخلايا مع 1 مل من Hoechst 33258 لمدة 15 دقيقة. راقب استيعاب كل ببتيد باستخدام مجهر مضان (انظر جدول المواد) بنفس كثافة التألق ووقت التعرض.
ملاحظة: تم استخدام الإعدادات التالية للفحص المجهري الفلوري. الهدف: خطة - Apochromat: 63 x / 1.40 النفط DIC M27 ؛ القناة 1 ل FITC: مرشح الإثارة: 450-490 نانومتر ، مرشح الانبعاثات: 500-550 نانومتر ، وقت التعرض: 230 مللي ثانية ؛ القناة 2 ل Hoechst 33258: مرشح الإثارة: 335-383 نانومتر ، مرشح الانبعاثات: 420-470 نانومتر ، وقت التعرض: 27 مللي ثانية.
- ضع غطاء دائريا في طبق من 12 بئرا. بعد ذلك ، قم بتلقيح 1 × 105 خلايا بشكل موحد على أغطية وثقافة طوال الليل مع 2 مل من الوسط. إزالة الوسط وغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS.
- تحليل التدفق الخلوي
- تلقيح 5 × 105 خلايا هيلا بشكل موحد في 12 لوحة جيدة وزرعها في DMEM لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS.
- احتضان الخلايا ب 1 مل من 3 ميكرومتر من الببتيدات التي تحمل علامة FITC في DMEM الخالي من FBS لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة الوسط المحتوي على الببتيد ، وافصل الخلايا بنسبة 0.25٪ (وزن / حجم) من التربسين و 0.53 مللي متر EDTA في PBS لمدة 5 دقائق ، ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 306 × جم لمدة 4 دقائق. اغسل بيليه الخلية باستخدام برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا ب 1 مل من 0.05٪ (وزن / حجم) تريبان أزرق في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق لإخماد التألق المرتبط بالسطح ، وإجراء تحليل كمي للتألق داخل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: إعدادات قياس التدفق الخلوي: الإثارة: 488 نانومتر ، الانبعاثات: 530 نانومتر. يمكن أن يطفئ التريبان الأزرق أيضا مضان الخلايا الميتة ويساعد على تمييز الخلايا الحية / الميتة أثناء تحليل امتصاص الببتيد. - علاج وفحص خلايا 4T1 باستخدام قياس التدفق الخلوي باتباع نفس البروتوكول كما هو موضح لخلايا هيلا. اجمع 5 × 105 خلايا لكل عينة وقم بإعداد ثلاث عينات متوازية لكل مجموعة.
6. استكشاف تغلغل الببتيدات من خلية إلى خلية باستخدام نماذج ترانسويل
- تلقيح 1 × 10 5 خلايا هيلا في 2 مل من DMEM في غرفة ذات 12 بئرا مع إدخال لوحة زراعة الأنسجة (انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة 24 ساعة في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية تحتوي على5٪ CO2. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط واحتضان الخلايا في الغرف ب 1 مل من 10 ميكرومتر FITC-R8 أو FITC-sR8-4 (منقى باستخدام HPLC) في DMEM الخالي من FBS لمدة 1 ساعة.
- قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على الببتيدات واغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS. أضف 1 مل من DMEM الطازج الخالي من FBS إلى الغرف ثم شارك في احتضان خلايا HeLa في الغرفة مع إدخال لوحة زراعة الأنسجة مع خلايا HeLa على أغطية مستديرة في الأسفل لمدة 2 ساعة.
- ثبت خلايا HeLa على أغطية مستديرة مع 2.5٪ جلوتارالدهيد لمدة 15 دقيقة ثم قم بتلطيخ الخلايا باستخدام DAPI لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، راقب خلايا هيلا الموجودة على أغطية الغطاء تحت المجهر الفلوري. علاج وفحص خلايا 4T1 باستخدام نفس البروتوكول المستخدم لخلايا هيلا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول ، تم تقديم إجراء اصطناعي لتقييد البوليارجينين الخطي R8 في شكله الدوري. تم إجراء SPPS يدويا باستخدام جهاز بسيط (الشكل 1). يظهر الشكل 2 العملية التركيبية التفصيلية ل SPPS. لفترة وجيزة ، تضخم الراتنج بما فيه الكفاية ، تليها إزالة الحماية من مجموعة الحماية N α-Fmoc. بعد ذلك ، تم تثبيت الحمض الأميني المحمي من N α-Fmoc على الراتنج حتى الانتهاء من تجميع الببتيد (الخطوات 1-4 في الشكل 2). بعد ذلك ، تم شق الببتيدات الخام من الراتنج بواسطة كوكتيل الانقسام (الخطوة 5 في الشكل 2). تم استخدام FITC لتسمية الببتيدات لتجميع CPPs الدورية الموسومة بالفلورسنت وتتبع نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية. بعد ذلك ، تم إزالة الحماية من مجموعات حماية trityl من cysteines بشكل انتقائي على الراتنج ، تليها دورة الببتيد مع 4،4'-bis (bromomethyl) biphenyl crosslink (الشكل 3A). يتم عرض أطياف HPLC و MS ل FITC-R8 و FITC-sR8-4 في الشكل 3B. كان وقت الاحتفاظ ب FITC-sR8-4 أطول بكثير من وقت التناظرية الخطية ، مما يشير إلى تعزيز الكارهة الكلية للماء للببتيد بعد التدوير باستخدام الوصلة المتقاطعة الكارهة للماء. علاوة على ذلك ، كما هو موضح في الشكل 3C ، ظل R8 الدوري سليما بنسبة 77.3٪ بعد الحضانة مع 25٪ FBS لمدة 4 ساعات ، في حين أن نظيره الخطي قد تحلل في الغالب ، مما يشير إلى تعزيز الاستقرار المحلل للبروتين للببتيد الدوري R8. في الدراسات اللاحقة القائمة على الخلايا ، أظهرت الخلايا المعالجة ب R8 الدوري مع الوصلة المتقاطعة العطرية مضانا داخل الخلايا أعلى من تلك التي عولجت بنظيرتها الخطية ، كما يتضح من التصوير المجهري لمضان الخلايا الحية (الشكل 4 أ). تم الحصول على نتائج مماثلة مع تحليل قياس التدفق الخلوي (الشكل 4B). لمزيد من التحقيق فيما إذا كان R8 الدوري يمنح اختراقا معززا من خلية إلى أخرى ، تم استخدام نماذج transwell لمحاكاة نفاذية حاجز الببتيدات من طبقة خلية إلى أخرى. أظهر R8 الدوري بوضوح تغلغلا أعلى عبر الحاجز من الببتيد الخطي R8 ، كما يتضح من زيادة كبيرة في التألق داخل الخلايا (الشكل 4C). باختصار ، أظهر الببتيد R8 الدوري نفاذية فائقة عبر الحواجز البيولوجية على نظيره الخطي.
الشكل 1: إعداد المعدات لجهاز تخليق الببتيد اليدوي. يتم وضع عمود بولي بروبيلين سعة 10 مل على مشعب التفريغ باستخدام صمام توقف ثلاثي الاتجاهات. يستخدم N2 للإثارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإجراء العام لتخليق الببتيد في الطور الصلب Fmoc (SPPS). يرتكز الحمض الأميني المحمي من N α-Fmoc على راتنج 4- (2 '، 4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl) -phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA (راتنج rink amide MBHA) (الخطوة 1) ، متبوعا بإزالة الحماية من مجموعات حماية Nα-Fmoc من الأحماض الأمينية (الخطوة 2) واقتران الأحماض الأمينية اللاحقة (الخطوة 3). يتم تكرار الخطوة 2 والخطوة 3 عدة مرات لتوليف الببتيد المطلوب (الخطوة 4). بعد الانتهاء من التوليف ، يضاف كوكتيل الانقسام لإزالة مجموعات حماية السلسلة الجانبية وشق الببتيد المطلوب من الراتنج (الخطوة 5). الاختصارات: DMF = N ، N-dimethylformamide ؛ DCM = ثنائي كلورو ميثان ؛ HATU = 2- (7-أزوبنزوتريازول) -N ، N ، N '، N'-رباعي ميثيل يورونيوم سداسي فلورو فوسفات ؛ DIPEA = N ، N- ثنائي أيزوبروبيل إيثيل أمين ؛ TFA = حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تخليق الببتيد الخطي R8 المسمى FITC (FITC-R8) وببتيد R8 المسمى FTC (FITC-SR8-4) باستخدام تخليق الببتيد ذو الطور الصلب (SPPS). (أ) رسم تخطيطي لتخليق FITC-R8 و FITC-sR8-4. (ب) أطياف HPLC و MS (داخلية) من FITC-R8 و FITC-sR8-4. (ج) استقرار FITC-R8 و FITC-sR8-4 بحضور 25٪ FBS. يشير الببتيد السليم (٪) إلى جزء من الببتيد غير المتحلل. تم تعديل هذا الرقم من Shi et al.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تغلغل الببتيد الخطي R8 المسمى FITC (FITC-R8) والببتيد R8 المسمى FITC (FITC-SR8-4). (أ) صور مجهرية مضان للخلايا الحية لخلايا هيلا وخلايا 4T1 بعد حضانة لمدة ساعة واحدة باستخدام 3 ميكرومتر FITC-R8 و FITC-sR8-4. FITC (أخضر) ، Hoechst (أزرق). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ب) المتوسط النسبي الفلوري (فيما يتعلق بالببتيد الخطي R8) ، والمتوسط ± s.d. ، و n = 3 ؛ (ج) اختراق FITC-R8 و FITC-sR8-4 من خلية إلى خلية في نموذج ترانسويل باستخدام خلايا هيلا. صور مجهرية مضان الخلية الحية (شريط المقياس = 20 ميكرومتر) ، والمتوسط النسبي الفلوري (فيما يتعلق بالببتيد الخطي R8) ، يعني ± s.d. ، و n = 3. ** ف < 0.01 ، *** ف < 0.001. تم تعديل هذا الرقم من Shi et al.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثبت التثبيت الكيميائي للببتيدات من خلال دمج القيود المطابقة أنه استراتيجية فعالة لتحسين استقرار ونفاذية الخلية للببتيد26. في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتخليق CPPs الدورية مع الروابط المتقاطعة العطرية وتقييم نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية. بالمقارنة مع الروابط المتقاطعة المحبة للماء أو التريازول22,27 ، فإن دمج الروابط المتقاطعة العطرية (المستخدمة في هذه الدراسة) يحسن الكارهة للماء بشكل عام ل CPPs ، وبالتالي يزيد بشكل كبير من نفاذية خلاياها. من ناحية أخرى ، يمكن تحقيق تدوير الببتيد بسهولة من خلال تفاعلات الاستبدال مع السيستين دون الحاجة إلى أي محفزات معدنية. في هذا البروتوكول ، تم إجراء تدوير CPPs على الراتنج. ومع ذلك ، تعتمد كفاءة التدوير أيضا على التسلسلات والأطوال المحددة للببتيدات بسبب التأثيرات العقيمة ، مما قد يؤدي إلى تكوين منتج ثانوي ثنائي28. في مثل هذه الحالة ، سيكون من المفيد استخدام راتنج بسعة تحميل أقل. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى أيضا بتدوير هذه الببتيدات المحددة تحت تركيزات مخففة في مرحلةالمحلول 29.
هناك بعض النقاط الحرجة في هذا البروتوكول. أولا ، يتم استخدام كوكتيل الانقسام TFA / TIS / EDT / H 2 O (92.5/ 2.5 / 2.5 / 2.5 ، v / v / v / v) لانقسام الببتيدات المحتوية على السيستين لمنع أكسدة مجموعة سلفهيدريل. ثانيا ، يقترح إجراء دراسة أولية صغيرة النطاق للحصول على حالة الانقسام المناسبة. الوقت الأمثل اللازم لشق الببتيدات من الراتنج هو 2-3 ساعات ، مع وقت انقسام أطول (أكثر من 5 ساعات) يميل إلى إنتاج المزيد من المنتجات الثانوية غير المحددة. يمكن مراقبة تخليق الببتيد بواسطة LC-MS لتحسين وقت الانقسام. ثالثا ، يجب وضع العلامات FITC في الظلام لتجنب التبريد الفلوري.
علاوة على ذلك ، يجب استخدام التريبان الأزرق لإخماد التألق المرتبط بالسطح لأن تحليل التدفق الخلوي لا يمكن أن يميز التألق داخل الخلايا أو السطح. سيساعد هذا على تحديد كمية الببتيد على وجه التحديد التي تستوعبها الخلايا السرطانية27. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الببتيدات الكاتيونية قد تسبب أيضا تحلل غشاء غير محدد30 ، يمكن أيضا إجراء النشاط الانحلالي وصلاحية الخلية لتقييم سمية CPPs الحلقية .
تشكل CPPs الدورية واحدة من وسائل توصيل الأدوية الفعالة للتغلب على الحواجز البيولوجية. ومع ذلك ، فإن تفاعل الغشاء واضطراب CPPs الموجبة يؤدي عموما إلى سمية خلوية محتملة غير محددة31. وستكرس جهود إضافية لفهم آلية الاختراق التفصيلية، التي من شأنها أن تساعد في اكتشاف الجيل القادم من CPPs الدورية لاختراق الحواجز البيولوجية بأقل قدر من السمية الخلوية. وتحمل هذه البرامج النشطة والمستقرة للغاية وعدا كبيرا بتحسين علاج الأمراض الهامة التي تهدد الحياة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (21708031) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (BX20180264 ، 2018M643519) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2682021ZTPY075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
- Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
- He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
- Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
- Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
- Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
- Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
- Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
- Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
- Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
- Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
- Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
- Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
- Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
- Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
- Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
- Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
- Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
- Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).
