Summary
Bu protokol, siklik hücreye nüfuz eden peptitlerin aromatik çapraz bağlarla sentezini ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerinin değerlendirilmesini açıklar.
Abstract
Kanser, küresel sağlıkta büyük bir zorluk olmuştur. Bununla birlikte, karmaşık tümör mikroçevresi genellikle terapötiklerin daha derin tümör hücrelerine erişimini sınırlar ve tümör nüksüne yol açar. Biyolojik bariyerlerin sınırlı penetrasyonunu fethetmek için, mükemmel membran translokasyon kabiliyetine sahip hücre nüfuz eden peptitler (CPP'ler) keşfedilmiş ve çeşitli yükleri hücrelere ulaştırmak için yararlı moleküler taşıyıcılar olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, geleneksel lineer CPP'ler genellikle biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerini sınırlayan tehlikeye atılmış proteolitik stabilite gösterir. Bu nedenle, biyolojik bariyerlere nüfuz edebilen ve gelişmiş proteolitik stabilite sergileyebilen yeni moleküler taşıyıcıların geliştirilmesi, biyomedikal uygulamalarda ilaç dağıtım verimliliğini artırmak için büyük ölçüde arzu edilmektedir. Daha önce, kanser hücrelerinde ve dokularında doğrusal muadillerine kıyasla üstün geçirgenlik sergileyen aromatik çapraz bağlantılara sahip kısa siklik CPP'lerden oluşan bir panel sentezlemiştik. Burada, floresan olarak etiketlenmiş siklik poliarginin R8 peptidinin ve lineer muadilinin sentezi ve hücre geçirgenliklerini araştırmak için anahtar adımlar için kısa bir protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Son birkaç on yıl, ilaç dağıtımı için hücreye nüfuz eden peptitlerin (CPP'ler) geliştirilmesinde hızlı ilerlemelere tanık olmuştur. CPP'ler, nörolojik bozukluklar 1,2, kalp hastalıkları3, diyabet4, dermatoz5 ve kanser 6,7 dahil olmak üzere hayatı tehdit eden bir dizi hastalığın tedavisinde moleküler taşıyıcılar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser, yaygın araştırma çabalarına rağmen yüksek morbidite ve mortalite oranının eşlik ettiği küresel bir sağlık yükü olmaya devam etmektedir8. Kanser tedavisinin önündeki ciddi bir engel, kompakt hücre dışı matriks (ECM), anormal tümör vaskülatürü, çoklu membran bariyerleri ve yüksek interstisyel sıvı basıncı (IFP)9 gibi fizyolojik engeller nedeniyle terapötiklerin daha derin tümör hücrelerine sınırlı erişimidir. Bu nedenle, biyolojik engeller üzerinden kargo teslim etme konusunda üstün yeteneğe sahip yeni CPP'ler geliştirmek, kanser tedavisi için temel bir strateji olarak kabul edilir10,11.
CPP'ler fizikokimyasal özellikleri açısından katyonik, amfipatik ve hidrofobik CPP'ler olarak sınıflandırılabilir12. Bunlar arasında, pozitif yüklü HIV-TAT peptidi ve sentetik poliarginin, biyomedikal araştırmalarda büyük önem taşımaktadır ve hücre içi ilaç dağıtımını kolaylaştırmak için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir13. Tunnemann ve ark., R3 ila R12 peptitleri14 kullanılarak yapılan bir hücre geçirgenliği çalışmasına dayanarak, sentetik poliarginin peptitlerinin etkili hücre penetrasyonu için minimum sekiz arginin uzunluğunun gerekli olduğunu bildirmiştir. Bununla birlikte, bu CPP'ler genellikle in vivo hızlı hidrolizleri nedeniyle kısa plazma yarı ömrüne sahiptir. Ek olarak, birden fazla hücre zarına nüfuz etmek zor olduğu için trans-bariyer yeteneklerini arttırmak için CPP'lerin kimyasal yapısının optimizasyonu hakkında çok az şey bilinmektedir15. Bu nedenle, biyolojik engellere nüfuz edebilen yeni moleküler taşıyıcıların geliştirilmesi, ilaç dağıtım verimliliğini artırmak için şiddetle arzu edilmektedir. 2020 yılında, Komin ve ark.16 , epitel monokatmanını geçmek için bir sarmal motifi (RLLRLLR) ve bir poliarginin kuyruğu (R7) içeren CL peptid adı verilen bir CPP keşfetti. Bir dizi CL peptid varyantı da sarmal paterni değiştirerek sentezlendi. Bu keşif, biyolojik engeller boyunca kargoların teslimatı için yeni CPP'lerin geliştirilmesi için önemli bir rehber olabilir. Dahası, Dietrich ve ark. StAX peptidinin hücre geçirgenliğini optimize ederek, peptitlerin17'sinin genel hidrofobikliğini artırarak Wnt / β-katenin sinyal yolunu inhibe etti.
Yapılandırılmamış lineer peptitlerin siklizasyon ile konformasyonel kısıtlaması, proteolitik stabilitelerini ve geçirgenliklerini arttırmanın etkili bir yoludur18,19,20. Yapısal takviye, siklik peptitlerin proteaz direncini arttırır ve onları lineer muadillerine kıyasla in vivo olarak daha kararlı hale getirir. Ek olarak, peptitlerin siklizasyonu, molekül içi hidrojen bağını teşvik ederek polar peptid omurgasını potansiyel olarak maskeleyebilir, böylece peptitlerin membran geçirgenliğini artırabilir21. Son yirmi yılda, kemoselektif siklizasyon yöntemleri, tüm hidrokarbon, laktam, triazol, m-ksilen, perfloroaril ve diğer çapraz bağlar gibi farklı mimarilere sahip siklik peptitlerin yapımında etkili stratejiler haline gelmiştir22,23. Sofistike tümör mikroçevresi tarafından dayatılan biyolojik bariyer, katı tümörlerde ilaçların penetrasyonunu azaltabilir24. Daha önce siklik CPP'lerin enzimatik sindirime karşı doğrusal muadillerine göre üstün direnç gösterdiğinibulmuştuk 20. Ayrıca, peptitlerin genel hidrofobikliği, gelişmiş hücre geçirgenlikleri22 için kritik öneme sahiptir. Yukarıda tartışılan çalışmalara dayanarak, pozitif yüklü bir modelin, yüksek genel hidrofobikliğin ve gelişmiş proteoliz stabilitesinin kombinasyonunun, CPP'lerin biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliğini arttırdığı hipotezi varsayılabilir. Yakın tarihli bir çalışmada, i ve i + 7 pozisyonlarında aromatik çapraz bağlantılara sahip iki siklik CPP tanımladık, bu da tümör hücrelerinde ve dokularında doğrusal muadillerine kıyasla daha iyi geçirgenlik sergiledi15. Burada, floresan olarak etiketlenmiş siklik CPP'lerin sentezi için kısa bir sentetik protokol ve geçirgenliklerini araştırmak için temel adımlar sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekipman hazırlama
NOT: Çalışan duman davlumbazındaki tüm prosedürleri uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla gerçekleştirin.
- Manuel peptit sentez aparatını duman davlumbazına monte edin (Şekil 1). Üç yönlü tapaları (bakınız Malzeme Tablosu) vakum manifolduna yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) ve nitrojene bağlayın (N2). Kullanılmayan girişleri kapattığınızdan emin olun.
- Üç yönlü tapalara 10 mL'lik bir polipropilen sütun (bkz. Malzeme Tablosu) takın. Reaksiyon karışımını veya çözücüleri polipropilen kolondan kauçuk pipet ampul veya vakum kullanarak bir atık tutucu aracılığıyla boşaltın.
2. FITC etiketli lineer R8 peptid (FITC-R8) ve FITC etiketli zımbalanmış R8 peptidinin (FITC-sR8-4) sentezi
NOT: Peptitler, standart bir Fmoc bazlı katı faz peptid sentezi (SPPS) protokolü25'e göre sentezlenmiştir. Çalışma boyunca 4-(2',4'-Dimetoksifeil-Fmoc-aminometil)-fenoksiasetamid-norlösil-MBHA reçinesi (rink amid MBHA reçinesi, bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
DİKKAT: N, N-dimetilformamid (DMF), N, N-diizopropiletilamin (DIPEA), morfolin ve diklorometan (DCM) renksizdir ve solunduğunda veya cilt yoluyla emilirse zararlıdır. Eter son derece yanıcıdır. 1,2-Etanedithiol (EDT) özellikle kokulu bir maddedir. Trifloroasetik asit (TFA) oldukça aşındırıcıdır ve asitliği asetik asidin 105 katıdır. Sonuç olarak, tüm reaktiflerin ve kimyasalların bir duman davlumbazında koruyucu ekipman kullanılarak ele alınması gerekir.
- Reçineyi peptit sentezi için hazırlayın.
- Sentez için gerekli reçine kütlesini hesaplayın: Reçine kütlesi (mg) = ölçek (mmol) / reçine yükleme kapasitesi (mmol / g) × 1.000 (mg / g)
NOT: Örneğin, 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol / 0,572 mmol / g × 1.000 mg / g = 350 mg için pist amid MBHA reçinesi kütlesi (0,572 mmol / g). - Gerekli reçine miktarına 4-5 mL DMF ekleyin ve reçineyi yeterince şişirmek için 30 dakika boyunca hafif N 2 köpürme ile 10 mL polipropilen kolona (adım1.2 ) aktarın ve ardından DMF'yi boşaltın.
- Reçineye 4-5 mL% 50 morfolin / DMF (v / v) ekleyin, N-terminal Fmoc grubunu çıkarmak için N2'yi 30 dakika 2x hafifçe kabarcıklayın ve ardından karışımı boşaltın. Daha sonra, kolona 4-5 mL DMF ekleyerek ve her seferinde en az 1 dakika boyuncaN2 ile köpürterek reçineyi 3 kat iyice yıkayın. Reçineyi DCM (3x) ve DMF (3x) ile aynı şekilde yıkamaya devam edin.
- Sentez için gerekli reçine kütlesini hesaplayın: Reçine kütlesi (mg) = ölçek (mmol) / reçine yükleme kapasitesi (mmol / g) × 1.000 (mg / g)
- Aşağıda açıklandığı gibi Fmoc korumalı amino asit bağlantısı gerçekleştirin.
NOT: Arjininin 0.2 mmol ölçekli manuel sentezde birleşmesi burada bir örnek olarak açıklanmıştır.- Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 eşdeğeri, 648.8 mg) ve 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetrametiluronyum hekzaflorofosfat (HATU, 4.9 eşdeğeri, 372.6 mg) bir santrifüj tüpünde 5 mL DMF içinde çözün.
- Kaplin reaksiyonunu aktive etmek için DIPEA (10 eşdeğeri, 348.4 μL) ekleyin ve ardından reaksiyon karışımını reçine ile 10 mL polipropilen kolona aktarın (adım 2.1.3'te hazırlanır). Daha sonra, karışımı 1-2 saat boyunca N2 köpürterek hafifçe çalkalayın.
- Kaplin reaksiyonunu (adım 2.2.1 ve adım 2.2.2) bir kez tekrarlayın.
- Kaplinin tamamlanmasından sonra, reaksiyon karışımını boşaltın ve reçineyi her seferinde en az 1 dakika boyunca DMF, DCM ve DMF 3x ile sırayla yıkayın.
- Her amino asidin sırayla bağlanmasını gerçekleştirin: Reçineye 4-5 mL% 50 morfolin / DMF (v / v) ekleyin, N α-Fmoc grubunu çıkarmak için 30 dakika 2x boyunca N 2 ile hafifçe kabarcıklayın, ardından reçineyi yıkayın (adım 2.2.4'te gösterildiği gibi) ve bir sonraki amino asidi çiftleştirmeye devam edin (adım 2.2.1 ve adım 2.2.2'de gösterildiği gibi). İstenilen peptidin sentezini sağlamak için bu adımın birkaç döngüsü ile devam edin.
NOT: Bu işlem burada duraklatılabilir. Reçineyi metanol ile yoğunlaştırın ve reçineyi sürekli birN2 akışı ile kurutun. Polipropilen kolonu kapatın ve ardından reçineyi birkaç gün boyunca 4 ° C'de (veya daha uzun depolama için -20 ° C'de) saklayın. Yeni bir senteze başlamadan önce reçineyi 4-5 mL DMF ile 0.5-1 saat şişirin. Doğrudan bir sonraki adıma geçerseniz, reçineyi yoğunlaştırmaya gerek yoktur.
- Peptitleri aşağıda açıklandığı gibi floresein izotiyosiyanat (FITC) ile etiketleyin.
- Beta-alanini, adım 2.2'de amino asit kuplajında kullanılanla aynı işlemi kullanarak FITC etiketlemesi için bir ara parça olarak birleştirin.
- Polipropilen kolona bir FITC (5 eşdeğer), DIPEA (10 eşdeğer) ve DMF karışımı ekleyerek ve karanlıkta 8 saat boyunca reaksiyona girerek reçine üzerindeki peptitlerin FITC etiketlemesini gerçekleştirin.
- FITC-sR8-4'ün sentezi için, aşağıda açıklandığı gibi doğrusal peptidin siklizasyonunu gerçekleştirin.
- Cys (Trt) koruma grubunu seçici olarak çıkarmak için 2 dakika boyunca polipropilen kolona TFA / triizopropilsilan (TIS) / DCM (3/5/92, v / v / v) karışımı ekleyin ve ardından karışımı boşaltın. Trt koruma grubunu tamamen çıkarmak için sarımsı çözelti renksiz hale gelene kadar yukarıdaki prosedürü tekrarlayın.
- Daha sonra, reçinenin DMF ve DCM ile en az 3x sıralı yıkamasını gerçekleştirin. Daha sonra, 4,4'-bis (bromometil) bifenil (2 eşdeğer) DMF'de DIPEA (4 eşdeğeri) ile çözülür, sütuna eklenir ve 4 saat boyunca reaksiyona sokulur.
- Peptitleri tarif edildiği gibi ayırın: Peptit sentezinin tamamlanmasından sonra, reçineyi her biri 5 dakika boyunca iki kez 4-5 mL metanol ile yıkayın ve sürekli birN2 akışı ile kurutun. Reçine, sistein içeren peptitler için etkili bir bölünme kokteyli TFA/TIS/H 2 O (95/2.5/2.5, v/v/v) veya TFA/TIS/EDT/H 2 O (92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v) ile muamele edin, 100 mg reçine başına yaklaşık 1 mL bölünme kokteyli kullanın. Peptide bağlı reçineyi 2-3 saat boyunca peptidi parçalamak için tedavi edin ve ardından TFA'yıN2 akışıyla dikkatlice çıkarın.
- Ham peptitleri elde etmek için, ham peptitleri çökeltmek için parçalanmış peptit preparatına 4-5 mL dietil eter ekleyin ve 4 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın ve peptidi etkili bir duman davlumbazında 3 dakika boyunca havayla kurutun.
- Peptitlerin analizi: 800 μL asetonitril (ACN) / H2O (1/1, v / v) içinde küçük ölçekli bir ham peptidi (yaklaşık 10 mg peptit bağlı reçineden bölünmüş) çözün ve daha sonra ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) kullanarak analiz edin (bkz.
- Peptitleri RP-HPLC ve LC-MS kullanarak saflaştırın.
- 50 mg ham peptit ürününü 4 mL ACN/H2O (1/1, v/v) içinde çözün ve çözeltiyi C18 kolonlu bir RP-HPLC sistemine enjekte edin (4,6 mm x 150 mm, gözenek boyutu: 120 Å, partikül boyutu: 4 μm ; bkz. Peptidi, %0,1 TFA/S2O (v/v) ve ACN içeren bir mobil faz kullanarak, 30 dakika boyunca %10 ila %90 ACN gradyanı ile etkisiz hale getirin. Konvansiyonel peptitler 220 nm'de ve FITC etiketli peptitler 494 nm'de tespit edildi.
- MS tarafından tanımlanan majör peptid zirvesine karşılık gelen fraksiyonları toplayın ve ardından istenen peptid fraksiyonlarını liyofilize edin. Saflaştırılmış peptidi -20 ° C'de saklayın.
NOT: Saflaştırılmış FITC-R8'in bulunan m/z'si aşağıdaki gibidir: [M + 3 H]3+: 576.63; [M + 4 Saat] 4+: 432,72; [M + 5 Saat] 5+: 346,39; [M + 6 Saat] 6+: 288,85. Saflaştırılmış FITC-sR8-4'ün bulunan m / z'si aşağıdaki gibidir: [M + 3 H]3+: 704.74; [M + 4 Saat] 4+: 528,77; [M + 5 Saat] 5+: 423,34; [M + 6 Saat] 6+: 352,91. MS analitik koşulları: cihaz: ESI (prob yanlılığı: +4,5 kV; dedektör: 1,2 kV); nebülizör gaz akışı: 1,5 L / dak; kavisli çözünme çizgisi (CDL): -20 V; CDL sıcaklığı: 250 °C; blok sıcaklığı: 400 °C; akış hızı: 0.2 mL / dak; mobil faz:% 50 H2O /% 50 ACN.
3. FITC etiketli peptitlerin miktarının belirlenmesi
- DMSO'da az miktarda saflaştırılmış peptidi stok çözeltisi olarak çözün (örneğin, 40 μmol / mL).
- Çok teknolojili bir mikroplaka okuyucu kullanarak bir mikrotiter plaka (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak 498 μL 10 mM fosfat tamponlu salin (1x PBS, pH 7.4) 498 μL'lik stok çözeltisinin 494 nm'sinde (A494) absorbansı bir mikrotiter plaka (bkz. Seyreltme faktörü 500 μL / 2 μL = 250'dir ve mikrotitre plakasının yol uzunluğu 0,5 mm'dir.
- Aşağıdaki formülü kullanarak stok çözeltisinin konsantrasyonunu hesaplayın:
Konsantrasyon (mM) = A494 × seyreltme faktörü / 0.05 (cm) / 77.000 (cm−1· M−1) × 1.000 (mM·M−1) - Ölçülen A 494 değeri 0,1 ile1,0 arasında olacak şekilde uygun bir seyreltmeye ayarlayın.
NOT: Ölçülen konsantrasyonun doğru olduğundan emin olmak için ölçümler birkaç kez tekrarlanmalıdır. 77.000 cm−1· yok olma katsayısı M−1 , FITC grubundan kaynaklanır.
4. Fetal sığır serumunda (FBS) peptitlerin stabilitesi
- Peptidi 37 °C'de 250 μL% 25 FBS / H2O (v / v) ile 100 μM konsantrasyonda inkübe edin. 0 saat, 1 saat, 2 saat ve 4 saat boyunca inkübe ettikten sonra, 10 μL aliquot alın ve daha sonra serum proteinlerini çökeltmek için H2 O / ACN'de (1/3, v / v) çözünmüş 150 μl%12trikloroasetik asit ekleyin.
- Numuneleri 5 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj edin ve peptid bozunmasının derecesini belirlemek için HPLC (adım 2.8'de açıklandığı gibi) kullanarak süpernatantı analiz edin.
- İlgili zamanda bozulmamış peptidin fraksiyonunu elde etmek için 1 saat, 2 saat ve 4 saatteki tepe alanının 0 saatteki orana oranını hesaplayın. Sonuç, üç paralel numunenin ortalamasıdır.
5. Peptitlerin hücresel alımı
- Floresan mikroskobik görüntüleme
- 12 delikli bir plakaya yuvarlak bir kapak parçası yerleştirin. Daha sonra, 1 x 105 hücreyi, 2 mL orta ile gece boyunca örtü ve kültür üzerine eşit olarak aşılayın. Ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın.
NOT: Bu çalışmada, HeLa hücreleri ve 4T1 hücreleri, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM, bakınız Malzeme Tablosu) kültürlenerek,% 5 CO2 içeren 37 ° C nemlendirilmiş bir inkübatörde% 10 FBS ile desteklenmiştir. - FBS'siz DMEM'de 1 mL 3 μM FITC etiketli peptitlerle hücreleri 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, peptit içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL PBS ile 3x yıkayın.
- Hücreleri 15 dakika boyunca 1 mL Hoechst 33258 ile lekeleyin. Her peptidin içselleştirilmesini, aynı floresan yoğunluğu ve maruz kalma süresine sahip bir floresan mikroskobu (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak gözlemleyin.
NOT: Floresan mikroskobu için aşağıdaki ayarlar kullanılmıştır. Amaç: Plan-Apochromat: 63 x/1.40 Oil DIC M27; FITC için Kanal 1: uyarma filtresi: 450-490 nm, emisyon filtresi: 500-550 nm, maruz kalma süresi: 230 ms; Hoechst 33258 için Kanal 2: uyarma filtresi: 335-383 nm, emisyon filtresi: 420-470 nm, maruz kalma süresi: 27 ms.
- 12 delikli bir plakaya yuvarlak bir kapak parçası yerleştirin. Daha sonra, 1 x 105 hücreyi, 2 mL orta ile gece boyunca örtü ve kültür üzerine eşit olarak aşılayın. Ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın.
- Akış sitometrisi analizi
- 5 x 105 HeLa hücrelerini DMEM'de 12 delikli plakalarda ve kültürde 37 ° C'de 24 saat boyunca eşit olarak aşılayın. Daha sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL PBS ile 3x yıkayın.
- FBS'siz DMEM'de 1 mL 3 μM FITC etiketli peptitlerle hücreleri 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. Peptit içeren ortamı çıkarın, PBS'de% 0.25 (w / v) tripsin ve 0.53 mM EDTA ile hücreleri 5 dakika boyunca ayırın ve daha sonra hücreleri 4 dakika boyunca 306 × g'da santrifüjleme yoluyla toplayın. Hücre peletini PBS ile yıkayın.
- Yüzeye bağlı floresanı söndürmek için PBS'de 1 mL% 0.05 (w / v) tripan mavisi ile hücreleri 3 dakika boyunca inkübe edin ve bir akış sitometresi kullanarak hücre içi floresanın kantitatif analizini yapın (bkz.
NOT: Akış sitometri ayarları: uyarım: 488 nm, emisyon: 530 nm. Tripan mavisi ayrıca ölü hücrelerin floresansını söndürebilir ve peptid alımının analizi sırasında canlı / ölü hücrelerin ayırt edilmesine yardımcı olabilir. - HeLa hücreleri için tarif edilenle aynı protokolü izleyerek akış sitometrisini kullanarak 4T1 hücrelerini tedavi edin ve test edin. Örnek başına 5 x 105 hücre toplayın ve grup başına üç paralel örnek ayarlayın.
6. Transwell modelleri kullanılarak peptitlerin hücreden hücreye penetrasyonunun araştırılması
- 1 x 10 5 HeLa hücrelerini 2 mL DMEM içinde bir doku kültürü plakası eki ile 12 delikli bir odada aşılayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve%5 CO2 içeren 37 °C nemlendirilmiş bir inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı çıkarın ve FBS'siz DMEM'de 1 saat boyunca 1 mL 10 μM FITC-R8 veya FITC-sR8-4 (HPLC kullanılarak saflaştırılmış) ile odalardaki hücreleri inkübe edin.
- Peptitleri içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL PBS ile 3 kat yıkayın. Odalara 1 mL taze FBS içermeyen DMEM ekleyin ve daha sonra odadaki HeLa hücrelerini, alttaki yuvarlak kapaklardaki HeLa hücreleri ile doku kültürü plakası eki ile 2 saat boyunca birlikte inkübe edin.
- HeLa hücrelerini yuvarlak kapaklara 15 dakika boyunca% 2.5 glutaraldehit ile sabitleyin ve ardından hücreleri 15 dakika boyunca DAPI ile boyayın. Daha sonra, bir floresan mikroskobu altında kapaklardaki HeLa hücrelerini gözlemleyin. HeLa hücreleri için kullanılanla aynı protokolü kullanarak 4T1 hücrelerini tedavi edin ve test edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, lineer poliarginin R8'i siklik formuna sınırlamak için sentetik bir prosedür sunulmuştur. SPPS, basit bir aparat kullanılarak manuel olarak gerçekleştirildi (Şekil 1). SPPS'nin ayrıntılı sentetik süreci Şekil 2'de gösterilmiştir. Kısaca, reçine yeterince şişirildi, ardından N α-Fmoc koruma grubunun korumasızlaştırılması izledi. Daha sonra, N α-Fmoc korumalı amino asit, peptit tertibatının tamamlanmasına kadar reçine üzerine sabitlendi (Şekil 2'deki 1-4 adımları). Daha sonra, ham peptitler reçineden bölünme kokteyli ile ayrıldı (Şekil 2'deki 5. adım). FITC, floresan olarak etiketlenmiş siklik CPP'leri sentezlemek ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerini izlemek için peptitleri etiketlemek için kullanıldı. Daha sonra, sisteinlerin trityl koruyucu grupları reçine üzerinde seçici olarak deproteksiyona tabi tutuldu, bunu 4,4'-bis (bromometil) bifenil çapraz bağ ile peptid siklizasyonu izledi (Şekil 3A). FITC-R8 ve FITC-sR8-4'ün HPLC ve MS spektrumları Şekil 3B'de gösterilmiştir. FITC-sR8-4'ün tutma süresi, doğrusal analogunkinden önemli ölçüde daha uzundu, bu da hidrofobik çapraz bağ ile siklizasyondan sonra peptidin genel hidrofobikliğinin arttığını gösteriyordu. Ayrıca, Şekil 3C'de gösterildiği gibi, siklik R8, inkübasyondan sonra% 77.3 bozulmadan kalırken, 4 saat boyunca% 25 FBS ile, doğrusal muadili çoğunlukla bozunmuştur, bu da siklik R8 peptidinin proteolitik stabilitesinin arttığını düşündürmektedir. Daha sonraki hücre bazlı çalışmalarda, aromatik çapraz bağ ile siklik R8 ile tedavi edilen hücreler, canlı hücre floresan mikroskobu görüntüleme ile gösterildiği gibi, doğrusal muadili ile tedavi edilenlerden daha yüksek hücre içi floresan sergilemiştir (Şekil 4A). Benzer sonuçlar flow sitometri analizi ile de elde edilmiştir (Şekil 4B). Siklik R8'in gelişmiş hücreden hücreye penetrasyon sağlayıp sağlamadığını daha fazla araştırmak için, peptitlerin bariyer geçirgenliğini bir hücre katmanından diğerine simüle etmek için transwell modelleri kullanıldı. Döngüsel R8, hücre içi floresandaki önemli bir artışla gösterildiği gibi, doğrusal R8 peptidinden daha yüksek bariyer ötesi penetrasyon sergiledi (Şekil 4C). Özetlemek gerekirse, siklik R8 peptidi, doğrusal muadili üzerinde biyolojik bariyerler boyunca üstün geçirgenlik sergiledi.
Resim 1: Manuel peptit sentez aparatı için ekipman kurulumu. Vakum manifolduna üç bir durdurma valfi kullanılarak 10 mL'lik bir polipropilen kolon yerleştirilir. N2 ajitasyon için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fmoc katı faz peptid sentezinin (SPPS) genel prosedürü. N α-Fmoc korumalı bir amino asit, 4-(2',4'-Dimetoksifeil-Fmoc-aminometil)-fenoksiasetamid-norlösil-MBHA reçinesine (rink amid MBHA reçinesi) (adım 1), ardından amino asitlerin Nα-Fmoc koruma gruplarının korunmasının kaldırılması (adım 2) ve ardından amino asit eşleşmesi (adım 3) ile sabitlenir. Adım 2 ve adım 3, istenen peptidi sentezlemek için birkaç kez tekrarlanır (adım 4). Sentezin tamamlanmasından sonra, yan zincir koruma gruplarını çıkarmak ve istenen peptidi reçineden ayırmak için bir bölünme kokteyli eklenir (adım 5). Kısaltmalar: DMF = N, N-dimetilformamid; DCM = diklorometan; HATU = 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetrametiluronyum hekzaflorofosfat; DIPEA = N, N-diizopropiletilamin; TFA = trifloroasetik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Katı faz peptid sentezi (SPPS) kullanılarak FITC etiketli lineer R8 peptid (FITC-R8) ve FITC etiketli zımbalanmış R8 peptidinin (FITC-sR8-4) sentezi. (A) FITC-R8 ve FITC-sR8-4 sentezinin şematik diyagramı. (B) FITC-R8 ve FITC-sR8-4'ün HPLC ve MS spektrumları (girinti). (C) %25 FBS varlığında FITC-R8 ve FITC-sR8-4'ün kararlılığı. Bozulmamış peptid (%), bozulmamış peptidin fraksiyonunu ifade eder. Bu rakam Shi ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FITC etiketli lineer R8 peptidinin (FITC-R8) ve FITC etiketli zımbalanmış R8 peptidinin (FITC-sR8-4) penetrasyonu. (A) 3 μM FITC-R8 ve FITC-sR8-4 ile 1 saatlik inkübasyondan sonra HeLa hücrelerinin ve 4T1 hücrelerinin canlı hücre floresan mikroskobu görüntüleri. FITC (yeşil), Hoechst (mavi). Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Bağıl ortalama floresan (doğrusal R8 peptidine göre), ortalama ± s.d. ve n = 3; (C) HeLa hücreleri kullanılarak bir transwell modelinde FITC-R8 ve FITC-sR8-4'ün hücreden hücreye penetrasyonu. Canlı hücre floresan mikroskopi görüntüleri (ölçek çubuğu = 20 μm) ve göreceli ortalama floresan (doğrusal R8 peptidine göre), ortalama ± s.d. ve n = 3. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Bu rakam Shi ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konformasyonel kısıtlamalar dahil edilerek peptitlerin kimyasal stabilizasyonunun, peptid26'nın stabilitesini ve hücre geçirgenliğini arttırmak için etkili bir strateji olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolde, siklik CPP'lerin aromatik çapraz bağlarla sentezlenmesi ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerinin değerlendirilmesi için adım adım bir prosedür açıklanmaktadır. Hidrofilik laktam veya triazol çapraz bağları22,27 ile karşılaştırıldığında, aromatik çapraz bağların dahil edilmesi (bu çalışmada kullanılan), CPP'lerin genel hidrofobikliğini arttırır, böylece hücre geçirgenliklerini önemli ölçüde arttırır. Öte yandan, peptid siklizasyonu, herhangi bir metal katalizör gerektirmeden sisteinlerle ikame reaksiyonları yoluyla kolayca elde edilebilir. Bu protokolde, CPP'lerin döngüselleştirilmesi reçine üzerinde gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte, döngüselleştirme verimliliği aynı zamanda sterik etkiler nedeniyle peptitlerin spesifik dizilerine ve uzunluklarına da bağlıdır, bu da dimerik bir yan ürün28'in oluşmasına neden olabilir. Böyle bir durumda, daha düşük yükleme kapasitesine sahip bir reçine kullanmak yararlı olacaktır. Ek olarak, bu spesifik peptitlerin, çözelti fazı29'daki seyreltik konsantrasyonlar altında siklize edilmesi de önerilir.
Bu protokolde birkaç kritik nokta vardır. İlk olarak, bölünme kokteyli TFA / TIS / EDT / H 2 O (92.5/ 2.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5, v / v / v / v), sülfhidril grubunun oksidasyonunu önlemek için sistein içeren peptitlerin bölünmesi için kullanılır. İkincisi, uygun bölünme koşulunu elde etmek için küçük ölçekli bir ön çalışma yapılması önerilmektedir. Peptitleri reçineden ayırmak için gereken en uygun süre 2-3 saattir ve daha uzun bir bölünme süresi (5 saatten fazla) daha fazla tanımlanamayan yan ürün üretme eğilimindedir. Peptid sentezi, bölünme süresini optimize etmek için LC-MS tarafından izlenebilir. Üçüncüsü, floresan söndürmeyi önlemek için FITC etiketlemesi karanlıkta yapılmalıdır.
Ayrıca, akış sitometri analizi hücre içi veya yüzeye bağlı floresanı ayırt edemediğinden, yüzeye bağlı floresanı söndürmek için tripan mavisi kullanılmalıdır. Bu, kanser hücreleri27 tarafından içselleştirilen peptidi spesifik olarak ölçmeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, katyonik peptitler spesifik olmayan membran lizis30'a da neden olabileceğinden, siklik CPP'lerin toksisitesini değerlendirmek için hemolitik aktivite ve hücre canlılığı da yapılabilir.
Döngüsel CPP'ler, biyolojik engelleri aşmak için etkili ilaç dağıtım araçlarından birini oluşturur. Bununla birlikte, katyonik CPP'lerin membran etkileşimi ve pertürbasyonu genellikle potansiyel spesifik olmayan sitotoksisiteye yol açar31. Daha fazla çaba, biyolojik bariyerleri minimum sitotoksisite ile nüfuz etmek için yeni nesil siklik CPP'lerin keşfine yardımcı olacak ayrıntılı penetrasyon mekanizmasını anlamaya ayrılacaktır. Bu son derece aktif ve istikrarlı CPP'ler, yaşamı tehdit eden önemli hastalıkların tedavisini iyileştirmek için büyük umut vaat etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Doğa Bilimleri Vakfı (21708031), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (BX20180264, 2018M643519) ve Merkezi Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (2682021ZTPY075) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
- Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
- He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
- Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
- Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
- Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
- Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
- Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
- Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
- Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
- Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
- Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
- Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
- Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
- Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
- Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
- Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
- Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
- Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).
