Summary
이 프로토콜은 방향족 가교를 갖는 고리형 세포 침투 펩타이드의 합성과 생물학적 장벽을 통한 투과성 평가를 설명합니다.
Abstract
암은 세계 보건에서 큰 도전이었습니다. 그러나 복잡한 종양 미세 환경은 일반적으로 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 접근을 제한하여 종양 재발을 유발합니다. 생물학적 장벽의 제한된 침투를 극복하기 위해 세포 침투 펩타이드(CPP)가 우수한 막 전위 능력을 가지고 발견되었으며 다양한 화물을 세포로 전달하는 데 유용한 분자 수송체로 부상했습니다. 그러나 기존의 선형 CPP는 일반적으로 단백질 분해 안정성이 손상되어 생물학적 장벽을 가로지르는 투과성을 제한합니다. 따라서, 생물학적 장벽을 뚫을 수 있고 향상된 단백질 분해 안정성을 나타낼 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발은 생물의학 응용에서 약물 전달 효율을 촉진하기 위해 매우 요구되고 있다. 우리는 이전에 방향족 가교결합을 가진 짧은 고리형 CPP 패널을 합성했으며, 이는 선형 CPP에 비해 암세포와 조직에서 우수한 투과성을 나타냈습니다. 여기에서는 형광 표지된 고리형 폴리아르기닌 R8 펩타이드 및 그 선형 대응물의 합성과 세포 투과성을 조사하기 위한 주요 단계에 대한 간결한 프로토콜이 설명되어 있습니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 약물 전달을 위한 세포 침투 펩타이드(CPP) 개발이 급속히 발전했습니다. CPP는 신경 질환 1,2, 심장 질환3, 당뇨병4, 피부병5 및 암 6,7을 포함한 다양한 생명을 위협하는 질병의 치료를위한 분자 수송체로 널리 사용되었습니다. 암은 광범위한 연구 노력에도 불구하고 높은 이환율과 사망률을 동반하는 전 세계적인 건강 부담으로 남아 있습니다8. 암 치료의 심각한 장애물은 조밀한 세포외 기질(ECM), 비정상적인 종양 혈관 구조, 다막 장벽 및 높은 간질액 압력(IFP)과 같은 생리학적 장벽으로 인해 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 제한된 접근입니다9. 따라서 생물학적 장벽을 넘어 화물을 운송할 수 있는 우수한 능력을 가진 새로운 CPP를 개발하는 것은 암 치료를 위한 필수 전략으로 간주됩니다10,11.
CPP는 물리화학적 특성12의 관점에서 양이온성, 양친매성 및 소수성 CPP로 분류할 수 있습니다. 이 중 양전하를 띤 HIV-TAT 펩타이드와 합성 폴리아르기닌은 생물의학 연구에서 상당히 중요하며 세포 내 약물 전달을 촉진하기 위해 광범위하게 연구되었습니다13. Tunnemann et al.은 R3 내지 R12 펩티드를 사용하여 수행된 세포 투과성 연구에 기초하여, 합성 폴리아르기닌 펩티드의 효율적인 세포 침투를 위해 8개의 아르기닌의 최소 길이가 필수적이라고 보고하였다14. 그러나, 이들 CPP는 일반적으로 생체 내에서 이들의 빠른 가수분해로 인해 짧은 혈장 반감기를 갖는다. 또한, 다중 세포막을 관통하는 것이 어렵기 때문에 이들의 트랜스-배리어 능력을 증가시키기 위한 CPP의 화학 구조의 최적화에 관해서는 알려진 바가 거의 없다(15). 따라서, 약물 전달 효율을 향상시키기 위해 생물학적 장벽을 관통할 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발이 강력히 요구되고 있다. 2020년 Komin 등16 은 상피 단층을 가로지르는 나선 모티프(RLLRLLR)와 폴리아르기닌 꼬리(R7)를 포함하는 CL 펩타이드라는 CPP를 발견했습니다. CL 펩티드 변이체 세트는 또한 나선형 패턴을 변경하여 합성되었습니다. 이 탐사는 생물학적 장벽을 넘어 화물을 운송하기 위한 새로운 CPP 개발을 위한 중요한 지침이 될 수 있습니다. 또한, Dietrich et al. StAX 펩티드의 세포 투과성을 최적화하여 펩티드17의 전반적인 소수성을 증가시킴으로써 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하였다.
고리화에 의한 구조화되지 않은 선형 펩티드의 구조적 제한은 그들의 단백질 분해 안정성 및 투과성을 향상시키는 효과적인 방법이다18,19,20. 구조적 강화는 고리형 펩타이드의 프로테아제 저항성을 증가시켜 선형 펩타이드에 비해 생체 내에서 더 안정적으로 만듭니다. 또한, 펩티드의 고리화는 분자내 수소 결합을 촉진함으로써 잠재적으로 극성 펩티드 골격을 가릴 수 있고, 따라서 펩티드(21)의 막 투과성을 증가시킬 수 있다. 지난 20년 동안 화학선택적 고리화 방법은 모든 탄화수소, 락탐, 트리아졸, m-자일렌, 퍼플루오로아릴 및 기타 가교 결합과 같은 다양한 구조를 가진 고리형 펩타이드의 구성을 위한 효과적인 전략이 되었습니다22,23. 정교한 종양 미세 환경에 의해 부과된 생물학적 장벽은 고형 종양에서 약물의 침투를 감소시킬 수 있다24. 우리는 이전에 순환 CPP가 선형 CPP에 비해 효소 소화에 대해 우수한 저항성을 나타냈다는 것을 발견했다20. 또한, 펩타이드의 전반적인 소수성은 세포 투과성 향상에 매우 중요하다22. 위에서 논의한 연구를 기반으로 양전하를 띤 패턴, 증가된 전체 소수성 및 향상된 단백질 분해 안정성의 조합이 생물학적 장벽을 가로질러 CPP의 투과성을 증가시키는 가설을 세울 수 있습니다. 최근 연구에서, 우리는 위치 i와 i+7에서 방향족 가교결합을 갖는 두 개의 순환 CPP를 확인했는데, 이는 선형 CPP에 비해 종양 세포와 조직에서 향상된 투과성을 나타낸다15. 여기에서는 형광 표지된 순환 CPP의 합성을 위한 간결한 합성 프로토콜과 투과성을 조사하기 위한 주요 단계를 제시합니다.
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Protocol
1. 장비 준비
알림: 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 작동 흄 후드에서 모든 절차를 수행하십시오.
- 흄 후드에 수동 펩타이드 합성 장치를 조립합니다(그림 1). 3방향 마개(재료 표 참조)를 진공 매니폴드(재료 표 참조)에 놓고 질소(N2)에 연결합니다. 사용하지 않는 입구를 막아야 합니다.
- 10mL 폴리프로필렌 컬럼( 재료 표 참조)을 3방향 마개에 부착합니다. 고무 피펫 전구를 사용하거나 폐기물 트랩을 통해 진공을 사용하여 폴리프로필렌 컬럼에서 반응 혼합물 또는 용매를 배출합니다.
2. FITC 표지 선형 R8 펩타이드(FITC-R8) 및 FITC 표지 스테이플 R8 펩타이드(FITC-sR8-4)의 합성
참고: 펩타이드는 표준 Fmoc 기반 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 프로토콜25에 따라 합성되었습니다. 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA 수지(링크 아미드 MBHA 수지, 재료 표 참조)를 연구 전반에 걸쳐 사용했습니다.
주의: N, N-디메틸포름아미드(DMF), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 모르폴린 및 디클로로메탄(DCM)은 모두 무색이며 피부를 통해 흡입하거나 흡수하면 손상됩니다. 에테르는 매우 가연성입니다. 1,2-에탄디티올(EDT)은 특히 냄새가 나는 물질입니다. 트리플루오로아세트산(TFA)은 부식성이 강하고 산도가 아세트산의 105 배입니다. 결과적으로 모든 시약과 화학 물질은 흄 후드의 보호 장비를 사용하여 처리해야 합니다.
- 펩타이드 합성을 위한 수지를 준비합니다.
- 합성에 필요한 수지의 질량 계산:수지의 질량(mg) = 스케일(mmol) / 수지 적재 용량(mmol/g) × 1,000(mg/g)
참고: 예를 들어, 0.2mmol = 0.2mmol/0.572mmol/g × 1,000mg/g = 350mg에 대한 링크 아미드 MBHA 수지(0.572mmol/g)의 질량. - 필요한 양의 수지에 4-5mL의 DMF를 넣고 10mL 폴리프로필렌 컬럼(1.2단계)에 옮기고 30분 동안 부드러운N2 버블링하여 수지를 적절하게 팽창시킨 다음 DMF를 배출합니다.
- 수지에 4-5mL의 50% 모르폴린/DMF(v/v)를 넣고 N2 를 30분 동안 2x 부드럽게 버블링하여 N-말단 Fmoc 그룹을 제거한 다음 혼합물을 배출합니다. 그 후, 컬럼에 4-5mL의 DMF를 첨가하고 매번 최소 1분 동안N2 로 버블링하여 수지를 3배 철저히 세척합니다. 같은 방법으로 DCM(3x)과 DMF(3x)로 수지를 계속 세척합니다.
- 합성에 필요한 수지의 질량 계산:수지의 질량(mg) = 스케일(mmol) / 수지 적재 용량(mmol/g) × 1,000(mg/g)
- 아래에 설명된 대로 Fmoc 보호 아미노산 결합을 수행합니다.
참고: 0.2mmol 규모의 수동 합성에서 아르기닌의 결합이 여기에 예시로 설명되어 있습니다.- Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 당량, 648.8 mg) 및 2-(7-아조벤조트리아졸)-N, N, N', N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 4.9 당량, 372.6 mg)를 DMF 5mL에 원심분리기 튜브에 녹인다.
- DIPEA(10당량, 348.4μL)를 첨가하여 커플링 반응을 활성화시킨 다음, 반응 혼합물을 수지(단계 2.1.3에서 제조됨)가 있는 10 mL 폴리프로필렌 컬럼으로 옮깁니다. 이어서, 혼합물을N2 버블링으로 1-2시간 동안 부드럽게 교반한다.
- 커플링 반응(단계 2.2.1 및 단계 2.2.2)을 한 번 반복한다.
- 커플링이 완료된 후, 반응 혼합물을 배출하고, 매번 적어도 1분 동안 DMF, DCM 및 DMF로 각각 3x씩 순차적으로 수지를 세척한다.
- 순서가 지정된 단계에서 각 아미노산의 커플 링을 수행하십시오 : 4-5 mL의 50 % 모르 폴린 / DMF (v / v)를 수지에 첨가하고 N 2로 30 분 동안 부드럽게 버블링하여 N α-Fmoc 그룹을 제거한 다음 수지를 세척하고 (2.2.4 단계와 같이) 다음 아미노산을 결합합니다 (2.2.1 단계 및 2.2.2 단계). 원하는 펩타이드의 합성을 달성하기 위해 이 단계의 여러 사이클을 진행하십시오.
참고: 이 프로세스는 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 수지를 메탄올로 응축시키고 N2 의 연속 흐름으로 수지를 건조시킨다. 폴리프로필렌 컬럼의 캡을 씌운 다음 수지를 4°C에서 며칠 동안(또는 더 오래 보관하려면 -20°C에서) 보관합니다. 새로운 합성을 시작하기 전에 4-5mL의 DMF로 수지를 0.5-1시간 동안 팽윤시킵니다. 다음 단계로 직접 진행하면 수지를 응축 할 필요가 없습니다.
- 아래에 설명된 대로 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 펩타이드를 라벨링합니다.
- 단계 2.2에서 아미노산 커플링에 사용된 것과 동일한 과정을 사용하여 FITC 라벨링을 위한 스페이서로서 베타 알라닌을 커플링한다.
- FITC의 혼합물(5당량), DIPEA(10당량) 및 DMF를 폴리프로필렌 컬럼에 첨가하고 암실에서 8시간 동안 반응시켜 수지에 대한 펩타이드의 FITC 라벨링을 수행합니다.
- FITC-sR8-4의 합성을 위해, 아래에 기술된 바와 같이 선형 펩티드의 고리화를 수행한다.
- TFA/트리이소프로필실란(TIS)/DCM(3/5/92, v/v/v) 혼합물을 폴리프로필렌 컬럼에 2분 동안 추가하여 Cys(Trt) 보호기를 선택적으로 제거한 다음 혼합물을 배출합니다. 황색 용액이 무색이 될 때까지 위의 절차를 반복하여 Trt 보호기를 완전히 제거합니다.
- 그 후, DMF 및 DCM으로 수지를 3배 이상 순차적으로 세척합니다. 그 후, 4,4'-비스(브로모메틸)비페닐(2당량)을 DIPEA(4당량)와 함께 DMF에 용해시키고, 이를 컬럼에 첨가하고, 4시간 동안 반응시킨다.
- 설명된 대로 펩티드를 절단: 펩티드 합성이 완료된 후 수지를 4-5mL의 메탄올로 각각 5분 동안 두 번 세척하고N2의 연속 흐름으로 건조시킵니다. 수지 100mg당 약 1mL의 절단 칵테일을 사용하여 시스테인을 함유한 펩타이드의 경우 효과적인 절단 칵테일 TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5, v/v) 또는 TFA/TIS/EDT/H2O(92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v)로 수지를 처리합니다. 펩티드 결합 수지를 2-3시간 동안 처리하여 펩티드를 절단한 다음 N2 스트림으로 TFA를 조심스럽게 제거합니다.
- 미정제 펩티드를 얻기 위해, 4-5 mL의 디에틸 에테르를 절단된 펩티드 제제에 첨가하여 조 펩티드를 침전시키고 10,000 × g 에서 4분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 버리고 효과적인 흄 후드에서 3분 동안 펩타이드를 자연 건조합니다.
- 펩타이드 분석: 800μL의 아세토니트릴(ACN)/H2O(1/1, v/v)에 소규모 미정제 펩타이드(약 10mg의 펩타이드 결합 수지에서 절단됨)를 용해한 다음 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석합니다( 재료 표 참조).
- RP-HPLC 및 LC-MS를 사용하여 펩타이드를 정제합니다.
- 50mg의 미정제 펩타이드 생성물을 4mL의 ACN/H2O(1/1, v/v)에 용해시키고 용액을 C18 컬럼(4.6mm x 150mm, 공극 크기: 120Å, 입자 크기: 4μm, 재료 표 참조)이 장착된 RP-HPLC 시스템에 주입합니다. 0.1% TFA/H2O(v/v) 및 ACN을 포함하는 이동상을 사용하여 30분 동안 10% - 90% ACN의 기울기로 펩타이드를 용리합니다. 기존의 펩타이드는 220nm에서, FITC 표지 펩타이드는 494nm에서 검출되었습니다.
- MS에 의해 확인된 바와 같이 주요 펩티드 피크에 해당하는 분획을 수집하고, 그 후 원하는 펩티드 분획을 동결건조한다. 정제된 펩타이드를 -20°C에서 보관한다.
참고: 정제된 FITC-R8의 발견된 m/z는 다음과 같습니다: [M + 3 H]3+: 576.63; [M + 4 시간] 4+: 432.72; [M + 5 시간] 5+: 346.39; [M + 6 시간] 6+: 288.85입니다. 정제된 FITC-sR8-4의 발견된 m/z는 다음과 같습니다: [M + 3 H]3+: 704.74; [M + 4 시간] 4+: 528.77; [M + 5 시간] 5+: 423.34; [M + 6 시간] 6+: 352.91. MS 분석 조건: 기기: ESI(프로브 바이어스: +4.5kV; 검출기: 1.2kV); 분무기 가스 교류: 1.5 L /min; 곡선 탈용매 라인(CDL): −20V; CDL 온도: 250 °C; 구획 온도: 400 °C; 유속: 0.2mL/min; 이동상: 50% H2O/50% ACN.
3. FITC 표지 펩타이드의 정량
- 소량의 정제된 펩타이드를 원액(예: 40μmol/mL)으로 DMSO에 용해합니다.
- 다중 기술 마이크로플레이트 리더(재료 표 참조)를 사용하여 마이크로타이터 플레이트(재료 표 참조)를 사용하여 10mM 인산염 완충 식염수(1x PBS, pH 7.4)의 498μL에 저장된 용액 2μL의 494nm(A494)에서 흡광도를 측정합니다. 희석 계수는 500 μL/ 2 μL = 250이고, 마이크로타이터 플레이트의 경로 길이는 0.5 mm이다.
- 다음 공식을 사용하여 원액의 농도를 계산하십시오.
농도(mM) =A 494 × 희석 계수 / 0.05 (cm) / 77,000 (cm−1· M−1) × 1,000 (mM·M−1) - 측정된 A494 값이 0.1에서 1.0 사이가 되도록 적절한 희석으로 조정하십시오.
알림: 측정된 농도가 정확한지 확인하기 위해 측정을 여러 번 반복해야 합니다. 소멸계수 77,000 cm−1· M−1 은 FITC 그룹에서 발생합니다.
4. 소 태아 혈청(FBS)에서 펩타이드의 안정성
- 37°C에서 250μL의 25% FBS/H2O(v/v)와 함께 100μM의 농도로 펩타이드를 배양합니다. 0시간, 1시간, 2시간 및 4시간 동안 배양한 후 10μL 분취액을 취한 다음 H2O/ACN(1/3, v/v)에 용해된 150μl의 12% 트리클로로아세트산을 첨가하여 혈청 단백질을 침전시킵니다.
- 샘플을 10,000 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 HPLC (2.8 단계에서 설명)를 사용하여 상청액을 분석하여 펩타이드 분해 정도를 결정합니다.
- 1시간, 2시간, 4시간에서의 피크 면적과 0시간에서의 피크 면적의 비율을 계산하여 해당 시간에 분해되지 않은 펩타이드의 분율을 얻습니다. 결과는 세 개의 병렬 샘플의 평균입니다.
5. 펩타이드의 세포 흡수
- 형광 현미경 이미징
- 둥근 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 커버슬립에 1 x 105 세포를 균일하게 접종하고 2mL의 배지로 밤새 배양합니다. 배지를 제거하고 세포를 1mL의 PBS로 3배 세척합니다.
참고: 이 연구에서, HeLa 세포 및 4T1 세포는 5%CO2를 함유하는 37°C 가습 인큐베이터에서 10% FBS가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, 재료 표 참조)에서 배양되었습니다. - 37°C에서 1시간 동안 FBS가 없는 DMEM에서 3μM FITC 표지 펩타이드 1mL와 함께 세포를 배양합니다. 그 후, 펩타이드 함유 배지를 제거하고, PBS 1 mL로 세포를 3x 세척한다.
- 1mL의 Hoechst 33258로 15분 동안 세포를 염색합니다. 동일한 형광 강도와 노출 시간으로 형광 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 각 펩타이드의 내재화를 관찰합니다.
참고: 형광 현미경 검사에는 다음 설정이 사용되었습니다. 대물렌즈: Plan-Apochromat: 63 x/1.40 Oil DIC M27; FITC용 채널 1: 여기 필터: 450-490 nm, 방출 필터: 500-550 nm, 노출 시간: 230 ms; 채널 2 for Hoechst 33258: 여기 필터: 335-383 nm, 방출 필터: 420-470 nm, 노출 시간: 27 밀리초.
- 둥근 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 커버슬립에 1 x 105 세포를 균일하게 접종하고 2mL의 배지로 밤새 배양합니다. 배지를 제거하고 세포를 1mL의 PBS로 3배 세척합니다.
- 유세포 분석
- 5 x 105 HeLa 세포를 12-웰 플레이트에 균일하게 접종하고 37°C에서 24시간 동안 DMEM에서 배양합니다. 그 후, 배지를 제거하고 PBS 1mL로 세포를 3배 세척한다.
- 37°C에서 1시간 동안 FBS가 없는 DMEM에서 3μM FITC 표지 펩타이드 1mL와 함께 세포를 배양합니다. 펩타이드 함유 배지를 제거하고 PBS에서 0.25%(w/v) 트립신과 0.53mM EDTA로 세포를 5분 동안 해리한 다음 306× g 에서 4분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 세포 펠릿을 PBS로 세척한다.
- 세포를 PBS에서 0.05%(w/v) 트리판 블루 1mL와 함께 3분 동안 배양하여 표면 결합 형광을 소멸시키고 유세포 분석기를 사용하여 세포 내 형광의 정량 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
참고: 유세포 분석 설정: 여기: 488nm, 방출: 530nm. 트리판 블루는 또한 죽은 세포의 형광을 소멸시키고 펩타이드 흡수 분석 중에 살아 있는 세포/죽은 세포를 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. - HeLa 세포에 대해 설명된 것과 동일한 프로토콜에 따라 유세포 분석을 사용하여 4T1 세포를 처리하고 분석합니다. 샘플당 5 x 105 개의 셀을 수집하고 그룹당 3개의 병렬 샘플을 설정합니다.
6. transwell 모델을 이용한 펩타이드의 세포 간 침투 탐색
- 조직 배양 플레이트 삽입물과 함께 12-웰 챔버에서 DMEM 중 2 mL중의 1 x 10 5 HeLa 세포를 접종하고( 재료 표 참조) 5%CO2를 함유하는 37°C 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 그 후, 배지를 제거하고, 1시간 동안 FBS-free DMEM에서 10 μM FITC-R8 또는 FITC-sR8-4 (HPLC를 사용하여 정제됨)의 1 mL와 함께 챔버에서 세포를 배양한다.
- 펩타이드가 포함된 배지를 제거하고 PBS 1mL로 세포를 3배 세척합니다. 1mL의 신선한 FBS가 없는 DMEM을 챔버에 추가한 다음 조직 배양 플레이트와 함께 챔버의 HeLa 세포를 바닥의 둥근 커버슬립에 HeLa 세포와 함께 2시간 동안 공동 배양합니다.
- HeLa 세포를 2.5% 글루타르알데히드로 15분 동안 둥근 커버슬립에 고정한 다음 DAPI로 15분 동안 세포를 염색합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 커버슬립의 HeLa 세포를 관찰합니다. HeLa 세포에 사용된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 4T1 세포를 처리하고 분석합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서는 선형 폴리아르기닌 R8을 고리형 형태로 제한하는 합성 절차가 제시되었습니다. SPPS는 간단한 장치를 사용하여 수동으로 수행되었습니다(그림 1). SPPS의 상세한 합성 공정은 그림 2에 나와 있습니다. 간략하게, 수지를 충분히 팽윤시키고, 이어서 N α-Fmoc 보호기의 탈보호가 뒤따랐다. 이어서, N α-Fmoc-보호된 아미노산을 펩티드 조립이 완료될 때까지 레진 상에 앵커링하였다(도 2의 단계 1-4). 이어서, 미정제 펩티드를 절단 칵테일에 의해 수지로부터 절단하였다(도 2의 단계 5). FITC는 형광 표지된 순환 CPP를 합성하고 생물학적 장벽을 가로지르는 투과성을 추적하기 위해 펩타이드를 표지하는 데 사용되었습니다. 이어서, 시스테인의 트리틸 보호기는 수지에서 선택적으로 탈보호되었고, 이어서 4,4'-비스(브로모메틸)비페닐 가교결합으로 펩티드 고리화되었다(도 3A). FITC-R8 및 FITC-sR8-4의 HPLC 및 MS 스펙트럼은 도 3B에 도시되어 있다. FITC-sR8-4의 머무름 시간은 선형 유사체의 머무름 시간보다 실질적으로 더 길었으며, 이는 소수성 가교결합을 이용한 고리화 후 펩티드의 전반적인 소수성이 향상되었음을 나타냅니다. 또한, 그림 3C에 나타난 바와 같이, 고리형 R8은 4시간 동안 25% FBS로 배양한 후 77.3% 온전한 상태를 유지한 반면, 선형 대응물은 대부분 분해되어 고리형 R8 펩티드의 향상된 단백질 분해 안정성을 시사합니다. 후속 세포 기반 연구에서, 방향족 가교 고리가 있는 고리형 R8로 처리된 세포는 생세포 형광 현미경 이미징에 의해 입증된 바와 같이 선형 R8로 처리된 세포보다 더 높은 세포 내 형광을 나타냈습니다(그림 4A). 유세포 분석 분석에서도 유사한 결과가 얻어졌다(도 4B). 순환 R8이 향상된 세포 간 침투를 제공하는지 여부를 추가로 조사하기 위해 트랜스웰 모델을 사용하여 한 세포층에서 다른 세포층으로 펩타이드의 장벽 투과성을 시뮬레이션했습니다. 고리형 R8은 선형 R8 펩타이드보다 더 높은 트랜스-배리어 침투를 분명히 나타냈으며, 이는 세포 내 형광의 현저한 증가에 의해 나타났다(도 4C). 요약하자면, 고리형 R8 펩타이드는 선형 펩타이드에 비해 생물학적 장벽에 걸쳐 우수한 투과성을 나타냈습니다.
그림 1: 수동 펩타이드 합성 장치의 장비 설정. 10mL 폴리프로필렌 컬럼은 3방향 스톱 밸브를 사용하여 진공 매니폴드에 설치됩니다. N2 는 교반에 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Fmoc 고체상 펩타이드 합성(SPPS)의 일반적인 절차. N α-Fmoc-보호된 아미노산을 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA 수지(rink amide MBHA resin)에 고정하고(단계 1), 아미노산의 Nα-Fmoc 보호기의 탈보호(단계 2) 및 후속 아미노산 커플링(단계 3)을 수행합니다. 단계 2와 단계 3을 여러 번 반복하여 목적 펩타이드를 합성합니다(단계 4). 합성이 완료된 후, 절단 칵테일을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거하고 수지로부터 원하는 펩타이드를 절단한다(단계 5). 약어: DMF = N, N-디메틸포름아미드; DCM = 디클로로메탄; HATU = 2- (7- 아조 벤조 트리 아졸) -N, N, N ', N'- 테트라 메틸 우로늄 헥사 플루오로 포스페이트; DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민; TFA = 트리플루오로아세트산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 고체상 펩타이드 합성(SPPS)을 사용한 FITC 표지 선형 R8 펩타이드(FITC-R8) 및 FITC 라벨 스테이플 R8 펩타이드(FITC-sR8-4)의 합성. (A) FITC-R8 및 FITC-sR8-4의 합성 개략도. (b) FITC-R8 및 FITC-sR8-4의 HPLC 및 MS 스펙트럼 (삽입). (C) 25% FBS의 존재 하에서 FITC-R8 및 FITC-sR8-4의 안정성. 온전한 펩타이드(%)는 분해되지 않은 펩타이드의 분율을 의미한다. 이 수치는 Shi et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FITC 표지 선형 R8 펩타이드(FITC-R8) 및 FITC 표지 스테이플 R8 펩타이드(FITC-sR8-4)의 침투. (A) 3μM FITC-R8 및 FITC-sR8-4로 1시간 배양한 후 HeLa 세포 및 4T1 세포의 생세포 형광 현미경 이미지. FITC(녹색), Hoechst(파란색). 스케일 바 = 20 μm. (B) 상대 평균 형광 (선형 R8 펩티드에 관한), 평균 ± s.d. 및 n = 3; (C) HeLa 세포를 사용한 트랜스웰 모델에서 FITC-R8 및 FITC-sR8-4의 세포 간 침투. 라이브 셀 형광 현미경 이미지(스케일 바 = 20μm) 및 상대 평균 형광(선형 R8 펩타이드에 대해), 평균 ± s.d. 및 n = 3. ** P < 0.01, *** P < 0.001. 이 수치는 Shi et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
구조적 제약을 통합함으로써 펩티드의 화학적 안정화는 펩티드26의 안정성 및 세포 투과성을 개선하기 위한 효과적인 전략인 것으로 입증되었다. 이 프로토콜에서는 방향족 가교를 갖는 고리형 CPP의 합성 및 생물학적 장벽에 걸친 투과성 평가를 위한 단계별 절차가 설명됩니다. 친수성 락탐 또는 트리아 졸 가교 결합22,27과 비교하여, 방향족 가교 결합 (이 연구에서 사용됨)의 통합은 CPP의 전반적인 소수성을 향상시켜 세포 투과성을 크게 증가시킵니다. 반면에, 펩타이드 고리화는 금속 촉매 없이 시스테인과의 치환 반응을 통해 쉽게 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 CPP의 고리화는 수지에서 수행되었습니다. 그러나, 고리화 효율은 또한 입체 효과로 인한 펩티드의 특정 서열 및 길이에 의존하며, 이는 이량체 부산물28의 형성을 초래할 수 있다. 이러한 경우 적재 용량이 낮은 수지를 사용하는 것이 도움이 될 것입니다. 또한, 용액 단계29에서 희석된 농도 하에서 이들 특정 펩티드를 고리화하는 것이 또한 추천된다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 사항이 있습니다. 먼저, 절단 칵테일 TFA/TIS/EDT/H2O(92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v)는 시스테인 함유 펩타이드의 절단에 사용되어 설프하이드릴기의 산화를 방지한다. 둘째, 적절한 분열 조건을 얻기 위해 소규모 예비 연구를 수행하는 것이 좋습니다. 수지에서 펩타이드를 절단하는 데 필요한 최적의 시간은 2-3시간이며, 절단 시간이 길수록(5시간 이상) 미확인 부산물이 더 많이 생성되는 경향이 있습니다. 펩타이드 합성은 절단 시간을 최적화하기 위해 LC-MS로 모니터링할 수 있습니다. 셋째, FITC 라벨링은 형광 소광을 피하기 위해 어두운 곳에서 이루어져야 합니다.
또한, 유세포 분석에서는 세포 내 형광과 표면 결합 형광을 구별할 수 없으므로 트립판 블루를 사용하여 표면 결합 형광을 소멸해야 합니다. 이는 암세포에 의해 내재화된 펩타이드를 특이적으로 정량화하는 데 도움이 될 것이다27. 또한, 양이온성 펩타이드도 비특이적 막 용해를 일으킬 수 있기 때문에(30), 용혈 활성 및 세포 생존율 또한 고리형 CPPs의 독성을 평가하기 위한 실시가 가능할 수 있다.
순환 CPP는 생물학적 장벽을 극복하기 위한 효과적인 약물 전달 수단 중 하나입니다. 그러나, 양이온성 CPP의 막 상호작용 및 섭동은 일반적으로 잠재적인 비특이적 세포독성을 유발한다31. 최소한의 세포 독성으로 생물학적 장벽을 관통하는 차세대 순환 CPP의 발견을 도울 상세한 침투 메커니즘을 이해하는 데 더 많은 노력을 기울일 것입니다. 이러한 매우 활동적이고 안정적인 CPP는 생명을 위협하는 중요한 질병의 치료를 개선할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 자연 과학 재단 (21708031), 중국 박사후 과학 재단 (BX20180264, 2018M643519) 및 중앙 대학 기초 연구 기금 (2682021ZTPY075)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
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