Summary
Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.
Abstract
Een belangrijke uitdaging bij het ontwikkelen van een antikanker aptamer is om efficiënt de selectiviteit en specificiteit van het ontwikkelde aptamer voor het doeleiwit te bepalen. Vanwege de verschillende voordelen ten opzichte van monoklonale antilichamen, heeft de ontwikkeling van aptameren een enorme populariteit gewonnen onder kankeronderzoekers. Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is de meest gebruikelijke methode voor het ontwikkelen van aptameren die specifiek zijn voor eiwitten van belang. Na SELEX versnelt een snelle en efficiënte bindingstest het identificatieproces en bevestigt de selectiviteit en specificiteit van het aptamer.
Dit artikel verklaart een stap-voor-stap flow cytometrische bindingstest van een aptamer specifiek voor epitheliale cellulaire adhesie molecuul (EpCAM). Het transmembraanglycoproteïne EpCAM is overexpressie in de meeste carcinomen en speelt een rol bij het initiëren van kanker, progressie en metastase. Daarom is het een waardevolle kandidaat voor gerichte medicijnafgifte aan tumoren. Om de selectiviteit en specificiteit van de aptamer voor de membraangebonden EpCAM te evalueren, zijn EpCAM-positieve en -negatieve cellen vereist. Daarnaast is een niet-bindende EpCAM-aptamer met een vergelijkbare lengte en 2-dimensionale (2D) structuur als de EpCAM-bindende aptamer vereist. De bindingstest omvat verschillende buffers (blokkeringsbuffer, wasbuffer, incubatiebuffer en FACS-buffer) en incubatiestappen.
Het aptamer wordt geïncubeerd met de cellijnen. Na de incubatie- en wasstappen worden de cellen geëvalueerd met behulp van een gevoelige flowcytometrietest. Analyse van de resultaten toont de binding van de EpCAM-specifieke aptamer aan EpCAM-positieve cellen en niet de EpCAM-negatieve cellen. In EpCAM-positieve cellen wordt dit weergegeven als een bandverschuiving in de binding van de EpCAM-aptamer naar rechts in vergelijking met de niet-bindende aptamercontrole. In EpCAM-negatieve cellen overlappen de overeenkomstige banden van EpCAM-bindende en -niet-bindende aptameren elkaar. Dit toont de selectiviteit en specificiteit van de EpCAM aptamer. Hoewel dit protocol gericht is op de EpCAM aptamer, is het protocol van toepassing op andere gepubliceerde aptameren.
Introduction
Kanker is wereldwijd nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken1. Ondanks de aanzienlijke verbetering van de behandeling van kanker in de afgelopen decennia, is de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker nog steeds een veelbesproken onderwerp. Dit komt omdat chemotherapie, als de steunpilaar van de behandeling van kanker, gepaard gaat met ernstige bijwerkingen die de therapietrouw van de patiënt beperken. Bovendien heeft chemotherapie-geïnduceerde kankerresistentie tegen behandeling de toepassing ervan beperkt als de enige keuze voor medische interventie. De toepassing van monoklonale antilichamen (mAbs) introduceerde een verbeterde respons op kankerbehandelingen2. De reden voor het gebruik van mAbs was om de werkzaamheid van chemotherapeutica te verbeteren en hun bijwerkingen te minimaliseren. Het beheer van mAbs werd echter ook een uitdaging. Dit kwam niet alleen door de door mAb geïnduceerde immunologische reacties, maar ook door de dierafhankelijke en dure productiekosten en moeilijke bewaarcondities3. Introductie van aptameren in de jaren 19904 wekte nieuwe hoop in de behandeling van kanker, omdat de toepassing van aptameren de uitdagingen in verband met mAbs zou kunnen aanpakken.
Aptameren zijn korte nucleïnezuursequenties die specifiek voor een bepaald doelwit worden geproduceerd. Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is een veelgebruikte methode bij de productie van aptameren. In SELEX wordt het eiwit van belang geïncubeerd met een bibliotheek van willekeurige nucleotidesequenties en door middel van een reeks iteratieve cycli wordt de aptamer die specifiek is voor dat eiwit gezuiverd. Aptamers hebben een vergelijkbare selectiviteit en specificiteit als mAbs, en daarom laat de ontwikkeling van geneesmiddelen op dit gebied veelbelovende toekomstige toepassingen zien. Aptameren die specifiek zijn voor kankerbiomarkers kunnen worden toegepast als afzonderlijke geneesmiddelen en diagnostische hulpmiddelen voor kanker 5,6,7. Vanwege hun nano-formaat structuur kunnen deze aptameren ook fungeren als medicijndragers om cytotoxische middelen specifiek aan de tumor af te leveren8. Dit zou de werkzaamheid van gerichte medicijnafgifte verhogen en chemotherapie-geassocieerde, off-target bijwerkingen verminderen. Bovendien hebben deze nanogeneesmiddelen een hoge weefselpenetratie, waardoor ze een wenselijke kandidaat zijn voor toediening en behandeling van geneesmiddelen met diepe tumoren. Aptameren kunnen ook worden ontworpen om zich te richten op de transporters die tot expressie komen op de bloed-hersenbarrière (BBB) om de medicijnafgifte aan hersentumoren te verbeteren9. Een goed voorbeeld van zo'n aptamer zijn bifunctionele aptameren, gericht op de transferrinereceptor (TfR)10 om de medicijnafgifte over de BBB te verbeteren en een cytotoxische medicijnlading aan tumorcellen te leveren11.
Ondanks alle voordelen van aptameren, heeft de ontwikkeling van geneesmiddelen op dit gebied nog geen op de markt gebracht, succesvol medicijn tegen kanker opgeleverd. Een reden hiervoor zou het gebrek aan standaard en reproduceerbare methoden kunnen zijn die wereldwijd kunnen worden gevolgd door onderzoekers in het veld. In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol van een aptamerbinding aan een inheems eiwit op het celoppervlak gedemonstreerd. Dit protocol is een eerste vereiste stap in de preklinische beoordeling van antikanker aptameren. De test wordt uitgevoerd om de selectiviteit en specificiteit aan te tonen van de gezuiverde aptamer verzameld uit SELEX of een gepubliceerde aptamersequentie voor bevestiging van selectiviteit en specificiteit. Deze flowcytometrische assay is een snelle, betrouwbare, gevoelige test die nauwkeurig de selectiviteit en specificiteit van het aptamer laat zien, waarbij de aptamer wordt getest tegen eiwitten op het celoppervlak 12,13,14. Deze methode wordt gedemonstreerd met behulp van de binding van een aptamer specifiek voor EpCAM getoond in dit artikel15. EpCAM, als een transmembraan glycoproteïne, speelt een rol bij tumorcelsignalering, progressie, migratie en metastase16,17. Om de selectiviteit en specificiteit van deze aptamer aan te tonen, werden EpCAM-positieve en -negatieve kankercellen gebruikt. De eerder ontwikkelde EpCAM-specifieke aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), en een negatieve controle aptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), werden gebruikt als EpCAM-bindende en -niet-bindende aptameren, respectievelijk10. Het 3'-uiteinde van zowel TEPP als TENN werd gelabeld met een TYE665-fluorofoor.
TEPP is een bifunctionele aptamer die zich richt op EpCAM van het ene uiteinde en TfR van het andere uiteinde. Dit heeft TEPP een geschikte kandidaat gemaakt voor medicijnafgifte aan EpCAM + hersentumoren. Met behulp van het TfR-specifieke uiteinde doorkruist TEPP de bloed-hersenbarrière en met behulp van het EpCAM-specifieke uiteinde vindt het de tumor en levert het zijn lading (bijv. Cytotoxische geneesmiddelen) aan de tumor. TENN heeft een vergelijkbare lengte en 2D-structuur als TEPP, maar het heeft geen affiniteit voor de EpCAM of TfR en is daarom een geschikte negatieve controle aptamer. Met behulp van TEPP en TENN wordt in dit artikel het testen van de binding van een aptamer aan het doeleiwit met behulp van flowcytometrie getoond. Dit protocol is van toepassing op de ontwikkeling van celspecifieke aptameren. Het is ook van toepassing op verdere complementaire en bevestigingsanalyses van de aptamersequenties die beschikbaar zijn in de literatuur. Het protocol kan ook worden gebruikt door degenen die nieuw zijn in het aptamer-veld en die kijken naar het gebruik van een eerder gepubliceerde aptamer voor hun onderzoeks- en ontwikkelingsdoeleinden (R &D). In dit artikel worden twee aptamersequenties bestudeerd die beschikbaar zijn in de literatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Draag voordat u met het experiment begint persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en een bril. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Buffers vereist voor de test
- Bereid de buffers die nodig zijn voor dit experiment - de SELEX-buffer die nodig is voor aptamervouwen, Blocking Buffer (BB), Wash Buffer (WB) en Binding Buffer (BiB) (Tabel 1) - vers voor op de dag van het experiment en bewaar ze op ijs of bij 4 °C.
OPMERKING: Elke aptamer vereist een unieke vouwconditie. Dit omvat de SELEX-buffer en vouwtemperatuuromstandigheden. Er moet voor worden gezorgd dat de methoden uit het oorspronkelijke artikel waarin de aptamer10 wordt beschreven, volledig worden gerepliceerd. In dit experiment worden alle buffers bereid in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS). Het buffervolume dat in elk experiment nodig is, is afhankelijk van het aantal cellijnen, het aantal replicaties en het aantal aptamerconcentraties dat wordt getest.
| Ingrediënten | Vereist volume | ||
| Item | Concentratie | ||
| SELEX buffer | MgCl2 | 5mM | 50 μL per monster + 10% pipetteerfout |
| Buffer blokkeren | MgCl2 | 5mM | 500 μL per cellijn |
| BSA een | 1 mg/ml | ||
| tRNA b | 0,1 mg/ml | ||
| FBS c | 10% (v/v) | ||
| Wasbuffer | MgCl2 | 5mM | 1 ml voor de eerste wasbeurt + 100 μL per testmonster + 10% pipetteerfout |
| Bindingsbuffer | MgCl2 | 5mM | 50 μL per monster + 10% pipetteerfout |
| BSA | 2 mg/ml | ||
| Trna | 0,2 mg/ml | ||
| FBS | 20% (v/v) | ||
Tabel 1: Buffers vereist voor de bindingstest. een Runderserum albumine, bTransfer Ribonucleïnezuur, cFoetaal Runderserum.
2. Bereiding van aptameren
OPMERKING: De aptameren die in de test worden gebruikt, zijn gelabeld met een fluorescentierapporteurmolecuul en daarom moet ervoor worden gezorgd dat ze tegen licht worden beschermd.
- Bereid voorafgaand aan het experiment een voorraad van 100 μM (voorraad A) van test- en controle-aptameren met pyrogeen- en RNase-vrij ultrapuur water (figuur 1).
OPMERKING: Voor langdurige bewaring moet voorraad A in een vriezer bij -20 °C worden bewaard. - Bereid voorraad B voor als de werkconcentratie van aptameren door voorraad A te verdunnen met behulp van SELEX-buffer (tabel 1). Om dit protocol te volgen, verdunt u voorraad A tot een voorraad van 1.000 nM om voorraad B voor te bereiden (figuur 1).
- Om het aptamer klaar te maken voor de vorming van de 3-dimensionale (3D) structuur, verdunt u in een buis van 250 μL voorraad B met SELEX-buffer om het vereiste volume en de concentratie van het aptamer voor te bereiden voor vouwen.
OPMERKING: De gevouwen aptameren worden blootgesteld aan een gelijk volume cellen. Daarom moet de concentratie van het aptamer dat is ingesteld voor vouwen 2x meer geconcentreerd zijn dan de gewenste eindconcentratie. Gebruik vergelijking (1) om de vereiste volumes en concentraties te berekenen. Vergeet niet om rekening te houden met een extra volume van 10% voor de pipetteerfout.
Concentratievoorraad A ×Volumevoorraad A =Concentratievoorraad B ×Volumevoorraad B (1)
Figuur 1: Een diagram met de stappen in de bereiding van aptameren. 1Stam 1 wordt bewaard bij -20 °C voor langdurige bewaring. Arabisch cijfer Werkconcentraties worden bereid in SELEX-buffer en worden niet opgeslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Onderhoud van kankercellen
OPMERKING: Voordat u met het onderzoek begint, moet u ervoor zorgen dat de cellen zich op hun vroege passagenummers bevinden, hun typische morfologische kenmerken vertonen en mycoplasmavrij zijn. Om de selectiviteit en specificiteit van de aptamer te testen, zijn idealiter cellijnen nodig die hoge, matige en lage / negatieve expressoren van het eiwit van belang zijn.
- Zaai de cellen in een T75 kweekkolf, onder geschikte kweekomstandigheden. Kweek ze in een 5% CO2 bevochtigde incubator, bij 37 °C.
OPMERKING: In deze studie werd Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (volledig medium) gebruikt. - Wanneer de cellen ~80% samenvloeiing bereiken, breng ze dan naar een nieuwe kolf met vers compleet medium.
OPMERKING: Afhankelijk van het eiwit van belang en de cellijn, kan 80% samenvloeiing een geschikte celpopulatie bieden voor de bindingstest. Voor de cellijnen in dit experiment, MDA-MB-231 en HEK 293T, is 80% confluency geschikt. Ga in dit stadium verder met sectie 4, de bindende test. Controleer altijd de expressie van het eiwit van belang, met behulp van mAbs specifiek voor dat eiwit.
4. Bindende bepaling
OPMERKING: Figuur 2 geeft een overzicht van de stappen die nodig zijn in de bindingstest in hechte cellen.
- Verzamel in een bioveiligheidskast van klasse II de cellen van elke kolf als volgt in buizen:
- Verzamel en gooi de media in de kolf weg, voeg 2 ml PBS toe, verdeel het over de cellen en verzamel en gooi het PBS vervolgens weg. Herhaal deze stap nog twee keer om alle sporen van media te verwijderen die trypsine kunnen inactiveren. Voeg 1 ml 0,25% trypsine/EDTA toe aan elke kolf en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 oC. Visualiseer het losmaken van cellen onder een microscoop.
- Voeg 1 ml compleet medium toe aan de cellen en pipetteer de cellen op en neer om een eencellige suspensie te maken. Pipetteer de cellen in een geschikte buis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 × g .
OPMERKING: Voor niet-hechtende cellen verzamelt u de cellen in een buis, centrifugeert u (200 × g, 5 minuten) en gaat u verder met stap 4.1.3. - Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in 1 ml vers medium. Tel de cellen met behulp van trypan blue-kleuring, door een bepaald volume celsuspensie te verdunnen met trypan blue. Verdeel ~15 μL van het mengsel tussen een hemocytometer en een dekglas. Tel de cellen zoals eerder beschreven18, met behulp van vergelijking (2):
(2)
OPMERKING: Gebruik het minimaal mogelijke volume celsuspensie en noteer de verdunningsfactor. Het mengen van gelijke volumes celsuspensie en 0,04% trypanblauw geeft bijvoorbeeld een verdunningsfactor van 2. Zorg voor een hoge levensvatbaarheid (levende cellen /totale cellen × 100) van ~ 90% voor de meeste adherente cellijnen voordat u doorgaat. Dode cellen nemen niet-specifiek aptameren op en veranderen de resultaten19. Het is mogelijk om andere celteltechnieken te gebruiken, zoals het gebruik van een celteller. - Verzamel het vereiste aantal cellen en zorg ervoor dat u 10 × 104 cellen per testmonster heeft. Overweeg een extra volume van 10% voor pipetteerfouten.
OPMERKING: Het is belangrijk om altijd hetzelfde aantal cellen te behouden tussen experimenten en replicaties. - Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 2 uur om de stabilisatie van het eiwit van belang op het celmembraan na enzymatisch losmaken mogelijk te maken.
OPMERKING: Deze incubatietijd kan verschillen afhankelijk van het eiwit van belang.
- Tijdens deze incubatie van 2 uur:
- Stel de temperatuur van de centrifuge in op 4 °C. Laat tRNA en voorraden aptamer bij kamertemperatuur of op ijs ontdooien. Om het fluorescentierapporteurmolecuul te beschermen, beschermt u de aptamerbuizen tegen licht.
OPMERKING: De rol van tRNA is om de nucleïnezuurbindingsplaatsen te blokkeren. - Bereid de SELEX-buffer, BB, WB en BiB (zie rubriek 1) en bewaar ze allemaal op ijs of bij 4 °C. Zet de thermocyclermachine op een lege cyclus. Plaats een 96-well zwarte plaat en flow cytometriebuizen op ijs.
OPMERKING: Het instellen van de thermocycler op een lege cyclus bereidt het koel- en verwarmingssysteem voor en helpt bij het genereren van meer reproduceerbare resultaten.
- Stel de temperatuur van de centrifuge in op 4 °C. Laat tRNA en voorraden aptamer bij kamertemperatuur of op ijs ontdooien. Om het fluorescentierapporteurmolecuul te beschermen, beschermt u de aptamerbuizen tegen licht.
- Na de incubatie van 2 uur centrifugeert u de cellen gedurende 5 minuten op 500 × g . Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in 500 μL BB. Incubeer de cellen bij 4 °C gedurende 30 minuten met intermitterend mengen.
- Tijdens deze incubatie van 30 minuten voert u aptamer-vouwing als volgt uit:
- Vul de 2x-concentraties aptameren aan (zie rubriek 2) en meng en incubeer vervolgens de aptameren in de thermocyclermachine, afhankelijk van de vereiste vouwomstandigheden. Gebruik voor deze EpCAM-aptamer de volgende vouwomstandigheden van 95 °C, 5 min, gevolgd door 22 °C, 10 min, en 37 °C, 15 min.
OPMERKING: Neem altijd een negatief besturingselement op (d.w.z. SELEX-buffer zonder aptameren).
- Vul de 2x-concentraties aptameren aan (zie rubriek 2) en meng en incubeer vervolgens de aptameren in de thermocyclermachine, afhankelijk van de vereiste vouwomstandigheden. Gebruik voor deze EpCAM-aptamer de volgende vouwomstandigheden van 95 °C, 5 min, gevolgd door 22 °C, 10 min, en 37 °C, 15 min.
- Na de incubatie van 30 minuten centrifugeert u de cellen (500 × g, 5 min, 4 °C), verwijdert u het supernatant, voegt u 1 ml WB toe en centrifugeert u de cellen opnieuw (500 × g, 5 min, 4 °C). Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in een geschikt volume van de BiB.
- Pipetteer 50 μL van de geresuspendeerde cellen in elke put van een ijskoude, 96-well zwarte plaat. Houd de cellen op ijs om de internalisering van het eiwit van belang te remmen.
- Pipetteer 50 μL van de aptameren op een volume cellen van 50 μL, meng en incubeer in duisternis bij 4 °C gedurende 30 minuten. Centrifugeer de plaat bij 500 × g, 5 min, 4 °C en verwijder het supernatant voorzichtig.
- Resuspeneer de pellet voorzichtig in WB en centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten. Herhaal de wasstap (4.7) 2x en resuspendeer in 100 μL WB voor flowcytometrische analyse.
OPMERKING: Zie figuur 3 voor een diagram van interacties tussen aptameren en cellen.
(2)
Figuur 2: Een diagram met de stappen voor het uitvoeren van een aptamer-eiwitbindingstest. Afkortingen: SELEX = Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment; BB = Blokkerende buffer; WB = Wasbuffer; BiB = Bindingsbuffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een diagram met de verschillende soorten cellen en aptameren die nodig zijn om de aptamerbindingstest uit te voeren. Afkorting: EpCAM = epithelial cellular adhesion molecule. Deze figuur is gemaakt met behulp van Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Flowcytometrie en data-analyse
OPMERKING: Voordat u de flowcytometer inschakelt, moet u ervoor zorgen dat er geen "bellen" in de membraanfiltereenheden zijn voor de afsluitoplossing, reinigingsoplossing en mantelvloeistof (0,9% NaCl). "Bloed uit" bubbels als er bubbels in de capsules zitten. Zorg ervoor dat de afvalcontainer leeg is en dat containers met mantelvloeistof, water en 1% bleekmiddel in ultrapuur water vol zijn.
- Schakel de flowcytometer in en vervolgens de computer.
OPMERKING: De details van het uitvoeren van de flowcytometer die hier worden uitgelegd, zijn specifiek voor de machine en software die in de video wordt gedemonstreerd (zie Materiaaltabel). Andere software zou een passende training vereisen om te gebruiken. - Open de flowcytometrie-analysesoftware, log in op het programma en voer fluidics opstarten uit op het tabblad Cytometer.
- Als u een nieuw experiment wilt maken, klikt u op het tabblad Experiment op Nieuwe map en geeft u de map/het experiment de juiste naam.
- Klik op nieuwe map om te markeren, klik vervolgens nogmaals op het tabblad Experiment op Nieuw experiment en geef het experiment de juiste naam.
- Als u het eerste monster/monster wilt toevoegen, klikt u op het tabblad Experiment op Nieuw exemplaar en geeft u dit specimen de juiste naam (naam van cellijn/controlemonster/experimentmonster).
- Als u een buismonster wilt toevoegen, markeert u het monster (groep) en klikt u onder het tabblad Experiment op Nieuwe buis. Voeg het juiste aantal buizen en naam toe.
- Als u de vereiste grafieken wilt voorbereiden, opent u op het tabblad Werkblad een nieuw werkblad. Zodra het nieuwe werkbladvenster verschijnt, opent u het volgende met behulp van het werkbladscherm (beweeg de muis over het logo / de afbeeldingen om de namen te vinden):
- Maak een dot blot grafiek van forward scatter (FSC) versus side scatter (SCC) om de populatie van belang te selecteren. Definieer de eerste poort door de populatie van belang (P1) te identificeren en te selecteren in een voor- en zijverstrooiingsdichtheidsdiagram. Sluit het puin uit, dat de populatie vormt met het laagste voorwaartse spreidingssignaal.
OPMERKING: De FSC-parameter detecteert cellen of gebeurtenissen op basis van hun grootte en de SCC discrimineert ze op basis van hun granulariteit20. - Maak een dot blot grafiek van FSC-gebied (FSC-A) versus FSC-hoogte (FSC-H) om de eencellige populatie te selecteren. Definieer de tweede poort door doubletcelpopulaties uit te sluiten, omdat doubletcellen de resultaten en conclusies aanzienlijk beïnvloeden. Sluit doubletten uit door FSC-H versus FSC-A dichtheidsdiagrammen te gebruiken, waarbij cellen van dezelfde grootte een vergelijkbaar gebied en dezelfde hoogte vertonen. Vandaar dat de singlets diagonaal worden geclusterd en gescheiden van doubletten.
OPMERKING: FSC is ongeveer evenredig met de celgrootte. De spanningspulsen worden gedefinieerd als FSC-H, de intensiteit van het signaal, FSC-breedte die de celgrootte en de duur van het signaal weerspiegelt, en FSC-A, dat is H × W. Doubletten hebben een dubbele breedte en oppervlaktewaarde; daarom is gating voor singlets gebaseerd op het detecteren van disproporties tussen H, W en A veroorzaakt door doubletten. - Bereid een histogram voor van het aantal gebeurtenissen tegen de fluorofoor van belang.
- Maak een dot blot grafiek van forward scatter (FSC) versus side scatter (SCC) om de populatie van belang te selecteren. Definieer de eerste poort door de populatie van belang (P1) te identificeren en te selecteren in een voor- en zijverstrooiingsdichtheidsdiagram. Sluit het puin uit, dat de populatie vormt met het laagste voorwaartse spreidingssignaal.
- Voordat u stroomcytometrie start, moet u ervoor zorgen dat het acquisitiedashboard voor het besturen van de monsteracquisitie, inspecteur en cytometer om spanningsparameters aan te passen, evenals het werkblad met alle grafieken open zijn.
OPMERKING: Ten minste 100 μL van een 10 × 10 4-celsuspensie in een flowcytometriebuis is nodig om de analyse uit te voeren. Vooral in het geval van lagere viabiliteiten kan propidiumjodidekleuring worden uitgevoerd om de levensvatbare celpopulatie21,22 te selecteren. - Als u het eerste voorbeeld wilt uitvoeren, controleert u aan de linkerkant van het scherm of de pijl die naar de buis wijst groen is. Als deze pijl niet groen is, klikt u op de pijl om deze groen te maken.
- Breng met behulp van een pipet elk monster over van de 96-well zwarte plaat naar een flowcytometriebuis. Voer het onbehandelde, onbevlekte controlemonster op een lage snelheid uit.
- Kies op het acquisitiedashboard een geschikt aantal gebeurtenissen dat u wilt vastleggen (30.000), wijzig de stroomsnelheid in laag en klik op Gegevens verkrijgen.
- Pas de spanning aan voor de FSC- en VCA-parameters. Zorg ervoor dat de celpopulatie gecentraliseerd is binnen de dot plot en dat er geen cellen een van beide assen van de grafiek raken om te voorkomen dat de cellen van belang verloren gaan.
- Verhoog de acquisitiesnelheid tot gemiddeld of hoog om de monsters sneller te analyseren, maar overschrijd niet meer dan 200 gebeurtenissen / s. Klik vervolgens op Recordgegevens.
- Voer de gating uit voor P1 (figuur 4A) en de eencellige populatie (figuur 4B). Construeer het histogram van gebeurtenissen tegen het gebruikte fluorochroom en selecteer P1 op basis van de gegevens (allophycocyanine (APC) in dit geval) (figuur 4C).
- Nadat u de spanning hebt aangepast, gating en het opnemen van de gegevens, neemt u het monster en klikt u op Volgende buis.
- Voeg het volgende monster in en herhaal de registratiegegevens voor alle controle- en testmonsters (figuur 3).
- Zodra alle gegevens zijn verzameld, wast u de flowcytometer door drie buizen van 50% bleekmiddel, FACS-spoeling en ultrapuur water te laten lopen, elk gedurende 5 minuten met een hoog debiet.
- Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu Cytometer op Fluidics Afsluiten.
- Voordat u de software sluit en de machine en de computer uitschakelt, exporteert u de resultaten als FCS-bestanden naar een USB-station om ze als volgt over te zetten en te analyseren:
- Druk in de analysesoftware op de knop NIEUW om een nieuw document en venster te maken om de analyse af te handelen. Sleep de voorbeeldbestanden naar het nieuwe venster.
- Dubbelklik om het niet-gekleurde monster te openen. Kies de P1-populatie , dubbelklik op de P1-populatie om een FSC-H versus FSC-A-grafiek te maken en sluit de eencellige populatie af.
- Dubbelklik op de gated enkele cellen om een histogram te maken van gebeurtenissen tegen het gebruikte fluorochroom.
- Selecteer in het oorspronkelijke venster P1 en enkele cellen en sleep ze naar Alle voorbeelden , zodat alle monsters nu dezelfde gating bevatten.
- Klik op de knop Lay-outeditor om het venster Lay-outs te openen. Sleep twee voorbeelden (controle en test) over elkaar om een overlayhistogram te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een belangrijk aspect van de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is het verzekeren van de selectiviteit en specificiteit van het kandidaat-geneesmiddel. Dit betekent dat het kandidaat-geneesmiddel in staat moet zijn om onderscheid te maken tussen verschillende cellen en alleen de celpopulatie van belang moet beïnvloeden (selectiviteit). Selectiviteit wordt bestudeerd met behulp van cellijnen die verschillen in termen van expressie van het eiwit van belang. In deze studie werden MDA-MB-231 en HEK 293T cellijnen gekozen als EpCAM-positieve en -negatieve cellen. Specificiteit is een andere determinant die aantoont dat het eiwit van belang slechts reageert op een enkel kandidaat-geneesmiddel. Hier werd met behulp van een EpCAM niet-bindende aptamer, TENN, aangetoond dat alleen TEPP aan EpCAM was gekoppeld. In EpCAM-positieve cellen (MDA-MB-231) toont het overlappen van de histogrammen die cellen vertegenwoordigen die zijn behandeld met TEPP en TENN aan dat de met TEPP behandelde cellen naar rechts zijn verschoven in vergelijking met de met TENN behandelde cellen. Dit toont de binding van het aptamer, TEPP, aan het eiwit van belang, EpCAM (figuur 4D). In hek 293T-cellen met negatieve controle geeft het overlappen van histogrammen van TEPP en TENN geen verschuiving weer (figuur 4E). Dit betekent dat in EpCAM-tot expressie brengende cellen TEPP als de EpCAM-aptamer aan zijn receptor is bevestigd, en bovendien werd er geen binding waargenomen in EpCAM-negatieve cellen. Deze resultaten bevestigen de selectiviteit en specificiteit van het ontwikkelde aptamer.
Figuur 4: Gating en histogrammen die de binding van de cellen aan het aptamer laten zien. (A) Selectie van de populatie van cellen, (B) de afzonderlijke cellen en (C) het histogram van de cellen die aan het aptamer zijn bevestigd (200 nM). De binding van EpCAM aptamer (TEPP) versus een niet-EpCAM-binding aptamer (TENN) in (D) EpCAM+ MDA-MB-231 cellen en (E) EpCAM- HEK 293T cellen wordt vergeleken. Afkortingen: EpCAM = epithelial cellular adhesion molecule; FSC-A = voorwaarts strooippuntgebied; SSC-A = zijwaarts strooipuntgebied; FSC-H = voorwaartse strooiphoogte; APC = allofycocyanine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe aptameren is het ontbreken van standaardrichtlijnen die van toepassing zijn op verschillende stappen van dit proces. McKeague et al. hebben onlangs enkele van de bijbehorende uitdagingen aangetoond, die leiden tot onduidelijke presentaties van gegevens in publicaties en het niet repliceren van het onderzoek. Zij stelden fundamentele richtlijnen voor die nodig zijn om in aanmerking te komen bij het karakteriseren van aptameren19. Een aptamerbindingstest is een cruciale stap in het screenen en / of karakteriseren van aptameren23, die veel wordt gebruikt door onderzoekers in het veld. Omdat er geen enkele richtlijn bestaat om het stapsgewijze protocol weer te geven, wordt een flowcytometriemethode, die vaak wordt gebruikt om de aptamer-eiwitbinding te bestuderen, gedemonstreerd in het bijbehorende videoprotocol.
Er zijn verschillende methoden die de interactie van de aptamer en zijn doelwit meten. Flowcytometrie is een van deze methoden. Andere voorbeelden zijn fluorescentiepolarisatie, oppervlakteplasmonresonantie, capillaire elektroforese en isotherme titratiecalorimetrie24. Het kiezen van de juiste methode hangt af van de toepassing van de aptamer. Het is echter belangrijk om te weten dat elke methode zijn beperkingen heeft en dat de toepassing van verschillende testen gunstiger is voor de karakterisering van aptameren met kleine moleculen24. De hier beschreven methode heeft verschillende voordelen. Het is een van de meest betrouwbare, nauwkeurige en nauwkeurige methoden en is ook snel en kosteneffectief. De flowcytometrische analyse van aptamerbinding kan worden toegepast in verschillende stappen van aptamerontwikkeling, waaronder kandidaatscreening, afkapping en optimalisatie, karakterisering en validatie.
Met fluorescentielabeling zijn er keuzes om de intrinsieke fluorescentie van het doelwit te labelen of te gebruiken of de aptamer24 te labelen. In de ervaring van de auteurs is het gebruik van gelabelde aptameren betrouwbaar en eenvoudig in te stellen. Aptameren kunnen worden geëtiketteerd met een fluorofoor aan elk uiteinde (3' of 5')25; het einde met minder guanine is echter gunstiger, omdat guanine de fluorescentie en de detectie ervan kan doven26. Een nadeel van deze methode is dat de aptamer moet worden getagd aan een fluorofoor. Bovendien, hoewel deze methode de binding van het aptamer aan het specifieke eiwit weerspiegelt, geeft het niet de locatie van de interactieplaats weer. Daarom kunnen verdere studies, zoals fluorescentiemicroscopie, nodig zijn om de aptamer-eiwitinteractielocatie25 te bevestigen.
Er zijn enkele kritische opmerkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van deze test. Het is belangrijk om te bedenken dat elke aptamer specifieke vereisten heeft voor het hanteren en vouwen. Dit omvat de keuze van reconstitutie- en verdunningsbuffers en de vouwomstandigheden. Reconstitutie van gelyofiliseerde aptameren vindt plaats in gezuiverd steriel pyrogeen- en RNase-vrij ultrapuur water. Dit is om de concentratie van ionen rond de nucleotiden te minimaliseren. Ionenconcentratie heeft een grote invloed op de vorming van 2D-structuren van aptameren en hun affiniteit en stabiliteit. Voor verdere reconstitutie van de aptamerenvoorraad moet derhalve worden gezorgd voor de juiste bereiding van andere buffers en metaalkationische oplossingen, zoals MgCl225,27. De optimale concentratie van metalen kationische oplossing beschermt de negatieve lading van het aptamer nog niet, remt de interactie van het aptamer met zijn doelwit niet.
Bovendien, omdat de aptamer een potentieel heeft voor een niet-specifieke, off-target binding, speelt de toepassing van de blokkerende buffer een cruciale rol in de bindingstest. Naast de negatief geladen BSA, die vaak wordt gebruikt voor antilichamen, is hier ook zalmsperma-DNA of tRNA vereist. Dit mengsel blokkeert de positief geladen eiwitten en nucleïnezuurbindingsplaatsen. Deze blokkeringsfase is specifiek belangrijk voor de selectiviteit en specificiteit van aptameren ten opzichte van kankercellen, vanwege hun negatieve lading in vergelijking met neutrale en positief geladen normale cellen28. Verder is het 3D vouwen van aptameren afhankelijk van andere factoren zoals temperatuur. Het belang van omstandigheden die van invloed zijn op de 3D-vorming van het aptamer, inclusief de keuze van de buis en de duur van PCR-fasen, is beoordeeld25. Bovendien moet de incubatietijd van de aptamer met het doel worden geoptimaliseerd voor elke specifieke aptamer. De incubatietemperatuur is ook zeer belangrijk. Het handhaven van een temperatuur van 4 °C is vooral van cruciaal belang voor celoppervlakeiwitten die gemakkelijk kunnen worden geïnternaliseerd, zoals EpCAM25.
De andere belangrijke factor in deze test is de toepassing van de juiste controles. Kankercellen die het doeleiwit tot expressie brengen of niet tot expressie brengen, moeten worden gebruikt om de selectiviteit van het aptamer te evalueren. In elk experiment is, naast de aptamer van belang, een negatieve controle aptamer (een willekeurige sequentie of een gecodeerde sequentie) vereist om de specificiteit van de aptamer aan te tonen. Idealiter zou deze controle een vergelijkbare lengte van nucleotiden moeten hebben en een vergelijkbare vouwing moeten ondergaan als de aptamer. In dit experiment werd een negatieve controle (TENN), een aptamer met een vergelijkbare structuur als TEPP waarvan is aangetoond dat deze een lage bindingsaffiniteit met EpCAM heeft, gebruikt10.
Het hier gepresenteerde protocol is een kwalitatieve test en kan verder worden gebruikt voor de kwantitatieve beoordeling van bindingsaffiniteit en de bepaling van de dissociatieconstante (Kd)29,30,31. Het is echter belangrijk om de reproduceerbaarheid van de resultaten aan te tonen met behulp van technische en biologische replicaties. Om dit te bereiken, is het zeer belangrijk om belangrijke determinanten te overwegen om deze test goed uit te voeren. Dit kan omvatten, maar is niet beperkt tot, het gebruik van een laag doorgangsaantal mycoplasmavrije cellen die op de juiste manier zijn gekweekt in hun optimale omstandigheden, het gebruik van een constant aantal cellen dat moet worden blootgesteld met het aptamer in elke replicaat, de toepassing van de juiste temperatuur- en vouwomstandigheden, het handhaven van vergelijkbare experimentele omstandigheden voor zowel de aptamer als de controle, het handhaven van minimale blootstelling van de aptameren aan omgevingslicht, het gebruik van geoptimaliseerde aptamer-celblootstellingstijd en -temperatuur, het handhaven van een temperatuur van 4 °C voor de cellen, waaronder het voorkoelen van de centrifuge, de 96-well plaat en de flowcytometriebuizen, en het nauwkeurig voorbereiden van de buffers, met een ionische concentratie die zo dicht mogelijk bij de geclaimde concentraties ligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de SEED-financiering van het Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT), het "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" -programma aan de Deakin University en de "Australian Government Research Training Program Scholarship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
- Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al.
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., et al. Tissue Culture. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
