Summary
Et nødvendig skritt i anticancer aptamer utvikling er å teste sin binding til målet. Vi demonstrerer en flowcytometrisk-basert analyse for å studere denne bindingen, og understreker viktigheten av å inkludere en negativ kontrollaptamer og kreftceller som er positive eller negative for det aktuelle proteinet.
Abstract
En sentral utfordring i utviklingen av en anticancer aptamer er å effektivt bestemme selektiviteten og spesifisiteten til den utviklede aptameren til målproteinet. På grunn av sine flere fordeler i forhold til monoklonale antistoffer, har aptamer utvikling fått enorm popularitet blant kreftforskere. Systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX) er den vanligste metoden for å utvikle aptamerer som er spesifikke for proteiner av interesse. Etter SEALEX akselererer en rask og effektiv bindingsanalyse identifikasjonsprosessen, og bekrefter selektiviteten og spesifisiteten til aptameren.
Dette papiret forklarer en trinnvis flowcytometrisk-basert bindingsanalyse av en aptamer spesifikk for epitelial cellulær adhesjonsmolekyl (EpCAM). Det transmembrane glykoproteinet EpCAM er overuttrykket i de fleste karsinomer og spiller roller i kreftinitiering, progresjon og metastase. Derfor er det en verdifull kandidat for målrettet legemiddellevering til svulster. For å evaluere selektiviteten og spesifisiteten til aptameren til membranbundet EpCAM, kreves EpCAM-positive og -negative celler. I tillegg er det nødvendig med en ikke-bindende EpCAM-aptamer med tilsvarende lengde og 2-dimensjonal (2D) struktur som EpCAM-bindende aptamer. Bindingsanalysen omfatter forskjellige buffere (blokkeringsbuffer, vaskebuffer, inkubasjonsbuffer og FACS-buffer) og inkubasjonstrinn.
Aptameren inkuberes med cellelinjene. Etter inkubasjons- og vasketrinnene vil cellene bli evaluert ved hjelp av en sensitiv flowcytometrianalyse. Analyse av resultatene viser bindingen av den EpCAM-spesifikke aptameren til EpCAM-positive celler og ikke de EpCAM-negative cellene. I EpCAM-positive celler er dette avbildet som et båndskifte i bindingen av EpCAM-aptameren til høyre sammenlignet med den ikke-bindende aptamerkontrollen. I EpCAM-negative celler overlapper de tilsvarende båndene av EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamerer. Dette demonstrerer selektiviteten og spesifisiteten til EpCAM-aptameren. Mens denne protokollen er fokusert på EpCAM aptamer, er protokollen gjeldende for andre publiserte aptamers.
Introduction
Kreft er fortsatt en av de viktigste årsakene til dødelighet over hele verden1. Til tross for den betydelige forbedringen i kreftbehandling de siste tiårene, er utvikling av kreftmedisiner fortsatt et svært omdiskutert tema. Dette skyldes at kjemoterapi, som bærebjelke i kreftbehandling, er ledsaget av alvorlige bivirkninger som begrenser pasientens overholdelse av behandlingen. Videre har kjemoterapi-indusert kreftresistens mot behandling begrenset sin anvendelse som det eneste valget av medisinsk inngrep. Anvendelsen av monoklonale antistoffer (mAbs) introduserte en forbedret respons på kreftbehandlinger2. Begrunnelsen for å bruke mAbs var å forbedre effekten av kjemoterapeutika og minimere bivirkningene. Men administrasjonen av mAbs ble også en utfordring. Dette var ikke bare på grunn av de mAb-induserte immunologiske reaksjonene, men også på grunn av dyreavhengige og dyre produksjonskostnader og vanskelige lagringsforhold3. Innføring av aptamers på 1990-tallet4 reiste nye forhåpninger i kreftbehandling, da anvendelsen av aptamers kunne løse utfordringene knyttet til mAbs.
Aptamerer er korte nukleinsyresekvenser som er spesielt produsert for et bestemt mål. Systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX) er en vanlig metode i aptamerproduksjon. I SELEX inkuberes proteinet av interesse med et bibliotek av tilfeldige nukleotidsekvenser, og gjennom en serie iterative sykluser renses aptameren som er spesifikk for det proteinet. Aptamerer har lignende målselektivitet og spesifisitet som mAbs, og derfor viser stoffutvikling på dette feltet lovende fremtidige applikasjoner. Aptamerer som er spesifikke for kreftbiomarkører, kan brukes som enkeltmedisiner og kreftdiagnostiske verktøy 5,6,7. På grunn av deres nanostørrelsesstruktur kan disse aptamerene også fungere som legemiddelbærere for å levere cytotoksiske midler spesielt til svulsten8. Dette vil øke effekten av målrettet legemiddellevering og redusere kjemoterapi-assosierte, off-target bivirkninger. Videre har disse nanomedisinene en høy vevspenetrasjon, noe som gjør dem til en ønskelig kandidat for levering og behandling av dyp tumormedisin. Aptamers kan også utformes for å målrette transportørene uttrykt på blod-hjernebarrieren (BBB) for å forbedre legemiddellevering til hjernesvulster9. Et godt eksempel på en slik aptamer er bifunksjonelle aptamerer, rettet mot transferrinreseptoren (TfR)10 for å forbedre legemiddelleveringen over BBB, og levere en cytotoksisk legemiddelnyttelast til tumorceller11.
Til tross for alle fordelene med aptamerer, har stoffutvikling på dette feltet ennå ikke gitt et markedsført, vellykket anticancermedikament. En årsak til dette kan være mangelen på standard og reproduserbare metoder som kan følges globalt av forskere på feltet. I dette papiret demonstreres en trinnvis protokoll av en aptamerbinding til et innfødt protein uttrykt på celleoverflaten. Denne protokollen er et nødvendig trinn i den prekliniske vurderingen av anticancer aptamers. Analysen utføres for å vise selektiviteten og spesifisiteten til den rensede aptameren samlet inn fra SELEX eller en publisert aptamersekvens for bekreftelse av selektivitet og spesifisitet. Denne flowcytometriske analysen er en rask, pålitelig, sensitiv analyse som nøyaktig viser selektiviteten og spesifisiteten til aptameren, hvor aptameren blir testet mot proteiner på celleoverflaten12,13,14. Denne metoden er demonstrert ved hjelp av bindingen av en aptamer spesifikk for EpCAM vist i denne artikkelen15. EpCAM, som et transmembrant glykoprotein, spiller roller i tumorcellesignalering, progresjon, migrasjon og metastase16,17. For å vise selektiviteten og spesifisiteten til denne aptameren ble EpCAM-positive og -negative kreftceller brukt. Den tidligere utviklede EpCAM-spesifikke aptameren, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), og en negativ kontrollaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), ble brukt som henholdsvis EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamerer, henholdsvis10. 3'-enden av både TEPP og TENN ble merket med en TYE665 fluorofor.
TEPP er en bifunksjonell aptamer som retter seg mot EpCAM fra den ene enden og TfR i den andre. Dette har gjort TEPP til en egnet kandidat for legemiddellevering til EpCAM+ hjernesvulster. Ved hjelp av sin TfR-spesifikke ende krysser TEPP blod-hjernebarrieren, og ved hjelp av den EpCAM-spesifikke enden finner svulsten og leverer lasten (f.eks. Cytotoksiske stoffer) til svulsten. TENN har en lignende lengde og 2D-struktur som TEPP, men den har ikke affinitet for EpCAM eller TfR, og er derfor en passende negativ kontrollaptamer. Ved hjelp av TEPP og TENN er testing av bindingen av en aptamer til målproteinet ved hjelp av flowcytometri vist i denne artikkelen. Denne protokollen gjelder for utvikling av cellespesifikke aptamerer. Det er også aktuelt for ytterligere komplementære og bekreftelsesanalyser av aptamersekvensene som er tilgjengelige i litteraturen. Protokollen kan også brukes av de som er nye i aptamerfeltet som ser på å bruke en tidligere publisert aptamer for deres forsknings- og utviklingsformål (FoU). I denne artikkelen studeres to aptamersekvenser som er tilgjengelige i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Før du starter eksperimentet, bruk personlig verneutstyr, inkludert laboratoriefrakk, hansker og vernebriller. Se materialtabellen for detaljer om materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Buffere som kreves for analysen
- Forbered bufferne som kreves for dette eksperimentet - SELEX-bufferen som kreves for aptamerfolding, Blocking Buffer (BB), Wash Buffer (WB) og Binding Buffer (BiB) (Tabell 1) - fersk på eksperimentdagen og hold dem på is eller ved 4 ° C.
MERK: Hver aptamer krever en unik foldetilstand. Dette inkluderer SELEX-bufferen og foldetemperaturforholdene. Det bør tas hensyn til å fullstendig replikere metodene fra det opprinnelige papiret som beskriver aptamer10. I dette eksperimentet fremstilles alle buffere i Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS). Buffervolumet som kreves i hvert eksperiment, avhenger av antall cellelinjer, antall replikasjoner og antall aptamerkonsentrasjoner som testes.
| Ingredienser | Volum kreves | ||
| Vare | Konsentrasjon | ||
| SELEX buffer | MgCl2 | 5 mM | 50 μL per prøve + 10 % pipetteringsfeil |
| Blokkering av buffer | MgCl2 | 5 mM | 500 μL per cellelinje |
| BSA en | 1 mg/ml | ||
| tRNA b | 0,1 mg/ml | ||
| FBS c | 10 % (v/v) | ||
| Vask buffer | MgCl2 | 5 mM | 1 ml for første vask + 100 μL per prøveprøve + 10 % pipetteringsfeil |
| Bindende buffer | MgCl2 | 5 mM | 50 μL per prøve + 10 % pipetteringsfeil |
| BSA | 2 mg/ml | ||
| tRNA | 0,2 mg/ml | ||
| FBS | 20 % (v/v) | ||
Tabell 1: Buffere som kreves for bindingsanalysen. en Bovint serumalbumin, bOverføring ribonukleinsyre, cFoster bovint serum.
2. Fremstilling av aptamerer
MERK: Aptamerene som brukes i analysen er merket med et fluorescensreportermolekyl, og derfor bør det tas hensyn til å beskytte dem mot lys.
- Før forsøket skal det lages en 100 μM-bestand (lager A) av test- og kontrollaptamerer ved bruk av pyrogen- og RNasefritt ultrarent vann (figur 1).
MERK: For langtidskonservering bør lager A oppbevares i fryser ved -20 °C. - Forbered lager B som arbeidskonsentrasjon av aptamerer ved å fortynne lager A ved hjelp av SELEX buffer (tabell 1). For å følge denne protokollen, fortynn lager A til en 1000 nM lager for å forberede lager B (figur 1).
- For å gjøre aptameren klar for dannelsen av den 3-dimensjonale (3D) strukturen, i et 250 μL-rør, fortynnet lager B med SELEX-buffer for å forberede det nødvendige volumet og konsentrasjonen av aptameren for folding.
MERK: De brettede aptamerene vil bli utsatt for et likt volum av celler. Derfor bør konsentrasjonen av aptameren som er satt for folding være 2 ganger mer konsentrert enn ønsket sluttkonsentrasjon. Bruk ligning (1) for å beregne nødvendige volumer og konsentrasjoner. Husk å vurdere et ekstra volum på 10 % for pipetteringsfeilen.
Konsentrasjon lager A × Volum lagerA = Konsentrasjon lager B × Volum lager B (1)
Figur 1: Et diagram som viser trinnene i fremstillingen av aptamerer. 1 Stamstoff 1lagres ved -20 °C for langtidsbevaring. 2 Arbeidskonsentrasjoner fremstilles i SELEX buffer og lagres ikke. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Vedlikehold av kreftceller
MERK: Før studien påbegynnes, må du sørge for at cellene er i tidlig passasje, viser deres typiske morfologiske egenskaper og er mykoplasmafrie. For å teste selektiviteten og spesifisiteten til aptameren, er cellelinjer som er høye, moderate og lave / negative ekspressorer av proteinet av interesse ideelt nødvendig.
- Frø cellene i en T75 kultur kolbe, ved hjelp av passende kulturforhold. Dyrk dem i en 5% CO2 fuktet inkubator, ved 37 ° C.
MERK: I denne studien ble Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (komplett medium) brukt. - Når cellene når ~ 80% sammenløp, pass dem til en ny kolbe som inneholder ferskt komplett medium.
MERK: Avhengig av proteinet av interesse og cellelinjen, kan 80% sammenløp gi en egnet cellepopulasjon for bindingsanalysen. For cellelinjene i dette eksperimentet, MDA-MB-231 og HEK 293T, er 80% sammenløp egnet. På dette stadiet, fortsett til seksjon 4, den bindende analysen. Kontroller alltid uttrykket av proteinet av interesse, ved hjelp av mAbs som er spesifikt for det proteinet.
4. Bindende analyse
MERK: Figur 2 oppsummerer trinnene som kreves i bindingsanalysen i adherenteceller.
- I et biosikkerhetsskap i klasse II samler cellene til hver kolbe i rør som følger:
- Samle og kast mediet i kolben, tilsett 2 ml PBS, spre det over cellene, og samle og kast deretter PBS. Gjenta dette trinnet to ganger til for å fjerne alle spor av medier som kan inaktivere trypsin. Tilsett 1 ml 0,25% trypsin/EDTA til hver kolbe og inkuber i 5-10 minutter ved 37 oC. Visualiser løsningen av celler under et mikroskop.
- Tilsett 1 ml komplett medium til cellene, og pipetter cellene opp og ned for å lage en enkeltcellet suspensjon. Pipetter cellene inn i et passende rør og sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter.
MERK: For ikke-adherente celler, samle cellene i et rør, sentrifuge (200 × g, 5 min), og fortsett til trinn 4.1.3. - Kast supernatanten og resuspend cellene i 1 ml friskt medium. Tell cellene ved hjelp av trypanblå farging, ved å fortynne et visst volum cellesuspensjon med trypanblått. Fordel ~ 15 μL av blandingen mellom et hemocytometer og et dekselglass. Tell cellene som tidligere beskrevet18, ved hjelp av ligning (2):
(2)
MERK: Bruk minst mulig volum cellesuspensjon og noter fortynningsfaktoren. For eksempel gir blanding av like mengder cellesuspensjon og 0, 04% trypanblå en fortynningsfaktor på 2. Sørg for høy levedyktighet (levende celler / totale celler × 100) på ~ 90% for de fleste adherente cellelinjer før du fortsetter. Døde celler tar ikke spesifikt opp aptamerer og endrer resultatene19. Det er mulig å bruke andre celletellingsteknikker, for eksempel ved hjelp av en celleteller. - Samle det nødvendige antall celler, og sørg for å ha 10 × 104 celler per testprøve. Vurder et ekstra volum på 10 % for pipetteringsfeil.
MERK: Det er viktig å alltid holde det samme celletallet mellom eksperimenter og replikaer. - Inkuber cellene ved 37 ° C i 2 timer for å tillate stabilisering av proteinet av interesse på cellemembranen etter enzymatisk løsrivelse.
MERK: Denne inkubasjonsperioden kan variere i henhold til proteinet av interesse.
- I løpet av denne 2 timers inkubasjonen:
- Still temperaturen på sentrifugen til 4 °C. La tRNA og lagre av aptamer stå i romtemperatur eller på is for å tine. For å beskytte fluorescensreportermolekylet, beskytt aptamerrørene mot lys.
MERK: Rollen til tRNA er å blokkere nukleinsyrebindingsstedene. - Forbered SELEX-bufferen, BB, WB og BiB (se avsnitt 1), og hold dem alle på is eller ved 4 °C. Sett termosyklusmaskinen på en tom syklus. Plasser en 96-brønns svart plate og flowcytometrirør på is.
MERK: Innstilling av termocykleren på en tom syklus forbereder kjøle- og varmesystemet og bidrar til å generere mer reproduserbare resultater.
- Still temperaturen på sentrifugen til 4 °C. La tRNA og lagre av aptamer stå i romtemperatur eller på is for å tine. For å beskytte fluorescensreportermolekylet, beskytt aptamerrørene mot lys.
- Etter 2 timers inkubasjon sentrifugerer cellene ved 500 × g i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspend cellene i 500 μL BB. Inkuber cellene ved 4 °C i 30 minutter med intermitterende blanding.
- I løpet av denne 30 minutters inkubasjonen, utfør aptamerfolding som følger:
- Utgjør 2x-konsentrasjonene av aptamerer (se avsnitt 2), og bland og inkuber deretter aptamerene i termosyklusmaskinen, i henhold til de nødvendige foldeforholdene. For denne EpCAM aptameren, bruk følgende foldebetingelser på 95 ° C, 5 min, etterfulgt av 22 ° C, 10 min og 37 ° C, 15 min.
MERK: Inkluder alltid en negativ kontroll (dvs. SELEX-buffer uten aptamerer).
- Utgjør 2x-konsentrasjonene av aptamerer (se avsnitt 2), og bland og inkuber deretter aptamerene i termosyklusmaskinen, i henhold til de nødvendige foldeforholdene. For denne EpCAM aptameren, bruk følgende foldebetingelser på 95 ° C, 5 min, etterfulgt av 22 ° C, 10 min og 37 ° C, 15 min.
- Etter 30 minutters inkubasjon, sentrifuger cellene (500 × g, 5 min, 4 ° C), fjern supernatanten, tilsett 1 ml WB og sentrifuger cellene igjen (500 × g, 5 min, 4 ° C). Fjern supernatanten og resuspend cellene i et passende volum av BiB.
- Pipette 50 μL av de resuspenderte cellene inn i hver brønn på en iskald, 96-brønns svart plate. Hold cellene på is for å hemme internalisering av proteinet av interesse.
- Pipette 50 μL av aptamerene på et 50 μL volum av celler, bland og inkuber i mørke ved 4 °C i 30 min. Sentrifuger platen ved 500 × g, 5 min, 4 °C, og fjern supernatanten forsiktig.
- Forsiktig resuspend pelleten i WB og sentrifuge ved 500 × g i 5 min. Gjenta vasketrinnet (4,7) 2x og resuspend i 100 μL WB for flowcytometrisk analyse.
Merk: Se figur 3 for et diagram over interaksjoner mellom aptamerer og celler.
(2)
Figur 2: Et diagram som viser trinnene i å utføre en aptamer-proteinbindende analyse. Forkortelser: SELEX = Systematisk utvikling av ligander ved EXponential Enrichment; BB = Blokkering Buffer; WB = Vask Buffer; BiB = Bindende buffer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et diagram som viser de forskjellige celletypene og aptamerene som kreves for å utføre aptamerbindingsanalysen. Forkortelse: EpCAM = epitelial cellulær adhesjonsmolekyl. Denne figuren ble opprettet ved hjelp av Biorender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Flowcytometri og dataanalyse
MERK: Før du slår på flowcytometeret, må du forsikre deg om at det ikke er noen "bobler" i membranfilterenhetene for avstengningsløsningen, rengjøringsløsningen og kappevæsken (0,9% NaCl). "Blø ut" bobler hvis det er bobler i kapslene. Forsikre deg om at avfallsbeholderen er tom, og beholdere med kappevæske, vann og 1% blekemiddel i ultrarent vann er fulle.
- Slå på flowcytometeret og deretter datamaskinen.
MERK: Detaljene for å kjøre flowcytometeret som er forklart her, er spesifikke for maskinen og programvaren som er demonstrert i videoen (se Materialtabell). Annen programvare vil kreve passende opplæring for å bruke. - Åpne programvaren for flowcytometrianalyse, logg på programmet, og kjør Fluidics Start up under Cytometer-fanen.
- Hvis du vil opprette et nytt eksperiment, klikker du Ny mappe under eksperimentfanen og gir mappen / eksperimentet et passende navn.
- Klikk på ny mappe for å markere, og klikk deretter på Nytt eksperiment under eksperimentfanen igjen, og navngi eksperimentet på riktig måte.
- Hvis du vil legge til den første prøven/prøven, klikker du Nytt eksemplar under eksperimentfanen og gir dette eksemplaret riktig navn (navn på cellelinje/kontrollprøve/eksperimentprøve).
- Hvis du vil legge til en rørprøve, merker du prøven (gruppen) og klikker Ny rørunder under eksperimentfanen. Legg til riktig antall rør og navn.
- For å forberede de nødvendige grafene, åpne et nytt regneark under regnearkfanen . Når det nye regnearkvinduet dukker opp, åpner du følgende ved hjelp av regnearkskjermen (hold musen over logoen / bildene for å finne navnene):
- Forbered en dot blot-graf over fremoverspredning (FSC) versus sidespredning (SCC) for å velge populasjonen av interesse. Definer den første porten ved å identifisere og velge populasjonen av interesse (P1) i et fremre og side scatter tetthetsplott. Ekskluder ruskene, som utgjør befolkningen med lavest spredningssignal.
MERK: FSC-parameteren oppdager celler eller hendelser basert på størrelsen, og SCC diskriminerer dem basert på deres granularitet20. - Klargjør en dot blot-graf over FSC-området (FSC-A) versus FSC-høyde (FSC-H) for å velge enkeltcellepopulasjonen. Definer den andre porten ved å ekskludere dobbelcellepopulasjoner, da dobbelceller påvirker resultatene og konklusjonene betydelig. Utelat dubletter ved å bruke FSC-H versus FSC-A tetthetsplott, der celler av samme størrelse viser et lignende område og høyde. Derfor blir singletene gruppert diagonalt og skilt fra dubletter.
MERK: FSC er omtrent proporsjonal med cellestørrelsen. Spenningspulsene er definert som FSC-H, intensiteten av signalet, FSC-bredde som reflekterer cellestørrelse og varigheten av signalet, og FSC-A, som er H × W. Doublets har en dobbel bredde og arealverdi; Derfor er gating for singlets basert på å oppdage disproporsjoner mellom H, W og A forårsaket av dubletter. - Forbered et histogram av antall hendelser mot fluoroforen av interesse.
- Forbered en dot blot-graf over fremoverspredning (FSC) versus sidespredning (SCC) for å velge populasjonen av interesse. Definer den første porten ved å identifisere og velge populasjonen av interesse (P1) i et fremre og side scatter tetthetsplott. Ekskluder ruskene, som utgjør befolkningen med lavest spredningssignal.
- Før du starter flowcytometri, må du sørge for at innsamlingsdashbordet for å kontrollere prøvetaking, inspektør og cytometer for å justere spenningsparametere, samt regnearket med alle grafene er åpent.
MERK: Minst 100 μL av en 10 × 10 4-cellers suspensjon i et flowcytometrirør er nødvendig for å utføre analysen. Spesielt ved lavere levedyktighet kan propidiumjodidfarging utføres for å velge den levedyktige cellepopulasjonen21,22. - For å kjøre den første prøven, må du på venstre side av skjermen sørge for at pilen som peker på røret er grønn. Hvis denne pilen ikke er grønn, klikker du på pilen for å gjøre den grønn.
- Ved hjelp av en pipette, overfør hver prøve fra den 96-brønns svarte platen til et flowcytometrirør. Kjør den ubehandlede, ufargede kontrollprøven på lav hastighet.
- På innhentingsinstrumentbordet velger du et passende antall hendelser som skal registreres (30 000), endrer flythastigheten til lav og klikker på Hent inn data.
- Juster spenningen for FSC- og SCC-parametrene. Sørg for at cellepopulasjonen er sentralisert i punktdiagrammet, og at ingen celler berører noen av aksene i grafen for å unngå å miste cellene av interesse.
- Øk innsamlingshastigheten til middels eller høy for å analysere prøvene raskere, men ikke overskride mer enn 200 hendelser/s. Klikk deretter Registrer data.
- Utfør gating for P1 (figur 4A) og encellet populasjon (figur 4B). Konstruer histogrammet av hendelser mot brukt fluorokrom og velg P1 basert på dataene (allophycocyanin (APC) i dette tilfellet) (figur 4C).
- Etter å ha justert spenningen, gating og registrert dataene, ta ut prøven og klikk Neste rør.
- Sett inn neste prøve, og gjenta registreringen av data for alle kontroll- og testprøver (figur 3).
- Når alle dataene er samlet inn, vask flowcytometeret ved å kjøre tre rør med 50% blekemiddel, FACS-skylling og ultrarent vann, hver i 5 minutter med høy strømningshastighet.
- Deretter, fra rullegardinmenyen Cytometer , klikker du Fluidics Avslutt.
- Før du lukker programvaren og slår av maskinen og datamaskinen, eksporterer du resultatene som .fcs-filer til en USB-stasjon for å overføre og analysere dem, som følger:
- I analyseprogramvaren trykker du på NY-knappen for å opprette et nytt dokument og vindu for å håndtere analysen. Dra eksempelfilene til det nye vinduet.
- Dobbeltklikk for å åpne prøven som ikke er farget. Velg P1-populasjonen, dobbeltklikk på P1-populasjonen for å opprette en FSC-H versus FSC-A-graf, og port enkeltcellepopulasjonen.
- Dobbeltklikk på de inngjerdede enkeltcellene for å lage et histogram av hendelser mot den brukte fluorokrom.
- I det opprinnelige vinduet velger du P1 og enkeltceller og drar dem til Alle prøver slik at alle prøvene nå inneholder samme gating.
- Klikk på Layout Editor-knappen for å åpne vinduet Layouts . Dra to eksempler (kontroll og test) over hverandre for å opprette et histogram for overlegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et viktig aspekt ved oppdagelse og utvikling av nye legemidler er å sikre selektiviteten og spesifisiteten til legemiddelkandidaten. Dette betyr at legemiddelkandidaten skal kunne diskriminere mellom ulike celler og kun påvirke cellepopulasjonen av interesse (selektivitet). Selektivitet studeres ved hjelp av cellelinjer som er forskjellige når det gjelder ekspresjon av proteinet av interesse. I denne studien ble MDA-MB-231 og HEK 293T cellelinjer valgt som EpCAM-positive og -negative celler. Spesifisitet er en annen determinant som viser at proteinet av interesse bare reagerer på en enkelt legemiddelkandidat. Her, ved å bruke en EpCAM ikke-bindende aptamer, TENN, ble det vist at bare TEPP festet til EpCAM. I EpCAM-positive celler (MDA-MB-231) viser overlegging av histogrammene som representerer celler behandlet med TEPP og TENN at de TEPP-behandlede cellene forskyves til høyre sammenlignet med de TENN-behandlede cellene. Dette viser bindingen av aptameren, TEPP, til proteinet av interesse, EpCAM (figur 4D). I HEK 293T-celler med negativ kontroll gjenspeiler ikke overliggende histogrammer av TEPP og TENN noe skifte (figur 4E). Dette betyr at i EpCAM-uttrykkende celler, TEPP som EpCAM aptamer festet til reseptoren, og dessuten ble det ikke observert noen binding i EpCAM-negative celler. Disse resultatene bekrefter selektiviteten og spesifisiteten til den utviklede aptameren.
Figur 4: Gating og histogrammer som viser bindingen av cellene til aptameren. (A) Velge populasjonen av celler, (B) enkeltcellene, og (C) histogrammet til cellene festet til aptameren (200 nM). Bindingen av EpCAM aptamer (TEPP) versus en ikke-EpCAM-bindende aptamer (TENN) i (D) EpCAM+ MDA-MB-231-celler og (E) EpCAM- HEK 293T-celler sammenlignes. Forkortelser: EpCAM = epitelial cellulær adhesjonsmolekyl; FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; APC = allophycocyanin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedutfordringen med å utvikle nye aptamerer er mangelen på standardretningslinjer som gjelder for ulike trinn i denne prosessen. McKeague og medarbeidere har nylig demonstrert noen av de tilhørende utfordringene, noe som fører til uklare presentasjoner av data i publikasjoner og manglende replikering av forskningen. De foreslo grunnleggende retningslinjer som er nødvendige for å vurdere karakterisering av aptamers19. En aptamerbindingsanalyse er et kritisk trinn i screening og / eller karakterisering av aptamers23, som er mye brukt av forskere på feltet. Siden det ikke finnes noen enkelt retningslinje for å vise trinn-for-trinn-protokollen, er en flowcytometrimetode, som vanligvis brukes til å studere aptamer-proteinbindingen, demonstrert i den medfølgende videoprotokollen.
Det finnes flere metoder som måler samspillet mellom aptameren og målet. Flowcytometri er en av disse metodene. Andre eksempler inkluderer fluorescenspolarisering, overflateplasmonresonans, kapillærelektroforese og isotermisk titreringskalorimetri24. Å velge riktig metode avhenger av påføringen av aptameren. Det er imidlertid viktig å vite at hver metode har sine begrensninger, og at anvendelsen av flere analyser er mer gunstig for karakteriseringen av småmolekylære aptamerer24. Metoden beskrevet her har flere fordeler. Det er en av de mest pålitelige, presise og nøyaktige metodene, og er også rask og kostnadseffektiv. Den flowcytometriske analysen av aptamerbinding kan brukes i ulike trinn av aptamerutvikling, inkludert kandidatscreening, trunkering og optimalisering, karakterisering og validering.
Med fluorescensmerking er det valg å enten merke eller bruke den inneboende fluorescensen til målet eller merke aptameren24. Etter forfatternes erfaring er det pålitelig og enkelt å sette opp merkede aptamere. Aptamerer kan merkes med en fluorophore i hvilken som helst ende (3 'eller 5') 25; Slutten med mindre guanin er imidlertid gunstigere, da guanin kan slukke fluorescensen og dens deteksjon26. En ulempe med denne metoden er at aptameren skal merkes til en fluorofor. Videre, selv om denne metoden gjenspeiler bindingen av aptameren til det spesifikke proteinet, viser den ikke plasseringen av interaksjonsstedet. Derfor kan det være nødvendig med ytterligere studier, for eksempel fluorescensmikroskopi, for å bekrefte aptamer-protein-interaksjonsplasseringen25.
Det er noen kritiske notater som skal vurderes mens du utfører denne analysen. Det er viktig å vurdere at hver aptamer har spesifikke krav til håndtering og folding. Dette inkluderer valg av rekonstituerings- og fortynningsbuffere og foldeforholdene. Rekonstituering av lyofiliserte aptamerer skjer i renset sterilt pyrogen- og RNasefritt ultrarent vann. Dette er for å minimere konsentrasjonen av ioner rundt nukleotidene. Ionkonsentrasjon påvirker i stor grad dannelsen av 2D-strukturer av aptamerer og deres affinitet og stabilitet. Ved videre rekonstituering av aptamerstammen bør det derfor utvises forsiktighet ved riktig fremstilling av andre buffere og metallkationiske løsninger, slik som MgCl225,27. Den optimale konsentrasjonen av metallkationisk løsning skjermer den negative ladningen til aptameren ennå, hemmer ikke samspillet mellom aptameren og målet.
Videre, fordi aptameren har potensial for en ikke-spesifikk, off-target binding, spiller anvendelsen av blokkeringsbuffer en kritisk rolle i bindingsanalysen. I tillegg til den negativt ladede BSA, som ofte brukes til antistoffer, er laksesperm-DNA eller tRNA også nødvendig her. Denne blandingen blokkerer de positivt ladede proteiner og nukleinsyrebindingssteder. Dette blokkeringsstadiet er spesielt viktig for selektiviteten og spesifisiteten til aptamerer mot kreftceller, på grunn av deres negative ladning sammenlignet med nøytrale og positivt ladede normale celler28. Videre er 3D-folding av aptamerer avhengig av andre faktorer som temperatur. Betydningen av forhold som påvirker 3D-dannelsen av aptameren, inkludert valg av rør og varigheten av PCR-faser, er gjennomgått25. Videre bør inkubasjonstiden til aptameren med målet optimaliseres for hver spesifikk aptamer. Inkubasjonstemperaturen er også svært viktig. Vedlikehold av en temperatur på 4 °C er spesielt kritisk for celleoverflateproteiner som lett kan internaliseres, for eksempel EpCAM25.
Den andre viktige faktoren i denne analysen er anvendelsen av riktige kontroller. Kreftceller som enten uttrykker eller ikke uttrykker målproteinet, bør brukes til å evaluere selektiviteten til aptameren. I hvert eksperiment, i tillegg til aptameren av interesse, kreves en negativ kontrollaptamer (en tilfeldig sekvens eller en kryptert sekvens) for å vise spesifisiteten til aptameren. Ideelt sett bør denne kontrollen ha en lignende lengde nukleotider og gjennomgå lignende folding som aptameren. I dette eksperimentet ble en negativ kontroll (TENN), en aptamer med en lignende struktur som TEPP vist seg å ha en lav bindingsaffinitet med EpCAM, brukt10.
Protokollen som presenteres her er en kvalitativ analyse og kan videre brukes til kvantitativ vurdering av bindende affinitet og bestemmelse av dissosiasjonskonstanten (Kd)29,30,31. Det er imidlertid viktig å vise reproduserbarheten av resultatene ved hjelp av tekniske og biologiske replikasjoner. For å oppnå dette er det svært viktig å vurdere viktige determinanter for å utføre denne analysen på riktig måte. Dette kan inkludere, men er ikke begrenset til, bruk av et lavt passasje antall mykoplasmafrie celler som er riktig dyrket under deres optimale forhold, ved å bruke et konstant antall celler som skal eksponeres med aptameren i hver replikasjon, påføring av riktig temperatur og foldeforhold, opprettholde lignende eksperimentelle forhold for både aptameren og kontrollen, opprettholde minimal eksponering av aptamerene for miljølys, ved hjelp av optimalisert aptamercelleeksponeringstid og temperatur, opprettholde en temperatur på 4 ° C for cellene, som inkluderer forkjøling av sentrifugen, 96-brønnplaten og flowcytometrirørene, og nøyaktig klargjøring av bufferne, med en ionisk konsentrasjon så nær de påståtte konsentrasjonene som mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT) SEED-finansiering, "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" -programmet ved Deakin University og "Australian Government Research Training Program Scholarship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
- Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al.
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., et al. Tissue Culture. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
