Summary
يوضح هذا البروتوكول الحقن الدقيق لعديد السكاريد الشحمي في منطقة بطين الدماغ في نموذج يرقات الزرد لدراسة الاستجابة الالتهابية العصبية الناتجة والسمية العصبية.
Abstract
الالتهاب العصبي هو لاعب رئيسي في الاضطرابات العصبية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية. لذلك ، من الأهمية بمكان البحث وتطوير نماذج بديلة للالتهابات العصبية في الجسم الحي لفهم دور الالتهاب العصبي في التنكس العصبي. في هذه الدراسة ، تم تطوير نموذج يرقات الزرد للالتهاب العصبي بوساطة الحقن المجهري البطيني لعديد السكاريد الشحمي (LPS) للحث على الاستجابة المناعية والسمية العصبية والتحقق من صحته. تم استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا elavl3: mCherry و ETvmat2: GFP و mpo: EGFP للقياس الكمي في الوقت الفعلي لصلاحية الخلايا العصبية في الدماغ عن طريق التصوير المباشر الفلوري المدمج مع تحليل شدة التألق. تم تسجيل السلوك الحركي ليرقات الزرد تلقائيا باستخدام مسجل تتبع الفيديو. تم التحقيق في محتوى أكسيد النيتريك (NO) ، ومستويات تعبير mRNA للسيتوكينات الالتهابية بما في ذلك interleukin-6 (IL-6) ، interleukin-1β (IL-1β) ، وعامل نخر الورم البشري α (TNF-α) لتقييم الاستجابة المناعية التي يسببها LPS في رأس الزرد اليرقات. في 24 ساعة بعد حقن البطين الدماغي من LPS ، لوحظ فقدان الخلايا العصبية ونقص الحركة في يرقات الزرد. بالإضافة إلى ذلك ، زاد الالتهاب العصبي الناجم عن LPS من عدم إطلاق وتعبير mRNA ل IL-6 و IL-1β و TNF-α في رأس يرقات الزرد بعد 6 أيام من الإخصاب (dpf) ، وأدى إلى تجنيد العدلات في دماغ الزرد. في هذه الدراسة ، تم تحديد حقن الزرد مع LPS بتركيز 2.5-5 مجم / مل عند 5 dpf كحالة مثالية لمقايسة الالتهاب العصبي الدوائي. يقدم هذا البروتوكول منهجية جديدة وسريعة وفعالة للحقن المجهري للبطين الدماغي من LPS للحث على التهاب عصبي بوساطة LPS والسمية العصبية في يرقة الزرد ، وهو أمر مفيد لدراسة الالتهاب العصبي ويمكن استخدامه أيضا كفحص عالي الإنتاجية في الجسم الحي لفحص المخدرات.
Introduction
تم وصف الالتهاب العصبي بأنه عامل حاسم مضاد للأعصاب يشارك في التسبب في العديد من الأمراض التنكسية العصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. بعد الإهانات المرضية ، قد يؤدي الالتهاب العصبي إلى عواقب سلبية مختلفة ، بما في ذلك تثبيط تكوين الخلايا العصبية وتحريض موت الخلايا العصبية 2,3. في العملية الكامنة وراء الاستجابة لتحريض الالتهاب ، يتم إفراز العديد من السيتوكينات الالتهابية (مثل TNF-α و IL-1β و IL-6) في الفضاء خارج الخلية وتعمل كمكونات حاسمة في موت الخلايا العصبية وقمع تكوين الخلايا العصبية4،5،6.
الحقن الدقيق لوسطاء الالتهاب (مثل IL-1β و L-arginine والسموم الداخلية) في الدماغ يمكن أن يسبب تقليل الخلايا العصبية والتهاب الأعصاب7،8،9. عديد السكاريد الشحمي (LPS ، الشكل 1) ، وهو سم داخلي ممرض موجود في جدار الخلية للبكتيريا سالبة الجرام ، يمكن أن يحفز الالتهاب العصبي ، ويؤدي إلى تفاقم التنكس العصبي ، ويقلل من تكوين الخلايا العصبية في الحيوانات10. أدى حقن LPS مباشرة في الجهاز العصبي المركزي لدماغ الفأر إلى زيادة مستويات أكسيد النيتريك والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات ومنظمات أخرى11. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي الحقن التجسيمي ل LPS في بيئة الدماغ المحلية إلى الإفراط في إنتاج الجزيئات السمية العصبية ، مما يؤدي إلى ضعف الوظيفة العصبية والتطور اللاحق للأمراض التنكسية العصبية10،12،13،14،15. في مجال علم الأعصاب ، تعد الملاحظات المجهرية الحية والزمنية للعمليات الخلوية والبيولوجية في الكائنات الحية ضرورية لفهم الآليات الكامنة وراء التسبب في المرض والعمل الدوائي16. ومع ذلك ، فإن التصوير المباشر لنماذج الفئران من الالتهابات العصبية والسمية العصبية مقيد بشكل أساسي بعمق الاختراق البصري المحدود للفحص المجهري ، والذي يمنع التصوير الوظيفي والمراقبة الحية للعمليات التنموية17،18،19. لذلك ، فإن تطوير نماذج بديلة للالتهابات العصبية له أهمية كبيرة لتسهيل دراسة التطور المرضي ، والآلية الكامنة وراء الالتهاب العصبي والتنكس العصبي ، عن طريق التصوير الحي.
برز الزرد (Danio rerio) كنموذج واعد لدراسة الالتهاب العصبي والتنكس العصبي بسبب نظام المناعة الفطري المحفوظ تطوريا ، والشفافية البصرية ، وحجم القابض الجنيني الكبير ، وقابلية السحب الجيني ، ومدى ملاءمته للتصوير في الجسم الحي 19،20،21،22،23 . قامت البروتوكولات السابقة إما بحقن LPS مباشرة في صفار وبطين الدماغ الخلفي لأسماك الزرد اليرقية دون تقييم ميكانيكي ، أو ببساطة إضافة LPS إلى مياه الأسماك (وسط الاستزراع) للحث على استجابة مناعية جهازية قاتلة24،25،26،27. هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول للحقن الدقيق ل LPS في البطينين الدماغيين ، لتحفيز استجابة مناعية فطرية أو سمية عصبية في يرقات الزرد بعد 5 أيام من الإخصاب (dpf). تتجلى هذه الاستجابة من خلال فقدان الخلايا العصبية ، وعجز السلوك الحركي ، وزيادة إطلاق أكسيد النتريت ، وتفعيل التعبير الجيني الالتهابي ، وتجنيد العدلات في دماغ الزرد في 24 ساعة بعد الحقن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على سلالات الزرد من النوع البري AB والزرد المعدلة وراثيا elavl3: mCherry و ETvmat2: GFP و mpo: EGFP من معهد العلوم الطبية الصينية (ICMS). تم منح الموافقة الأخلاقية (UMARE-030-2017) للتجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية ، جامعة ماكاو ، ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوان.
1. جنين الزرد وتربية اليرقات
- توليد أجنة الزرد (200-300 جنين لكل تزاوج) عن طريق التزاوج الزوجي الطبيعي كما ورد سابقا28.
- تحضير ماء البيض (E3) مرق متوسط (60×) عن طريق إذابة 34.8 جم من كلوريد الصوديوم ، 1.6 جم من KCl ، 5.8 جم من CaCl 2 · 2H 2 O ، و 9.78 جم من MgCl 2 · 6H 2 O في ddH 2 O إلى حجم نهائي قدره 2 لتر وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام NaOH و HCl. لتحضير تركيز العمل لوسط E3 (1×) ، قم بتخفيف المخزون 60 مرة في ddH2O. يخزن عند 28.5 درجة مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.
- استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل أجنة الزرد إلى طبق يحتوي على وسط E3. رفع الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في حاضنة ومراقبة نموها وصحتها. قم بإزالة الأجنة الميتة واستبدل وسط E3 غير النظيف بوسط طازج يوميا.
- بالنسبة لتجارب تصوير أسماك الزرد ، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لجمع أجنة 0-2 ساعة بعد الإخصاب (hpf) (حوالي 200 بيضة) في حوالي 15 مل من وسط 1× E3 يحتوي على 0.003٪ N-phenylthiourea (PTU).
ملاحظة: PTU يمكن أن تمنع تشكيل الميلانوفورات أثناء التطور الجنيني29. يمكن أن يؤدي علاج الأجنة باستخدام PTU أثناء التطور الجنيني إلى تحسين اكتشاف الإشارات في الفحص المجهري أو التعبير عن التألق30. - الحفاظ على أجنة الزرد في ظل الظروف المذكورة أعلاه حتى تصل الأجنة إلى مرحلة اليرقات التنموية المطلوبة.
2. التحضير للحقن المجهري
- استعد للحقن عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة (انظر جدول المواد) ، باتباع بروتوكول الخطوات الخمس لسحب الأنبوب الشعري الزجاجي (الجدول 1).
- افتح طرف الإبرة (الشعيرات الدموية الزجاجية ذات الجدار الرقيق [3.5 بوصة] بخيوط ، OD 1.14 مم) إلى الحجم المناسب بزاوية باستخدام ملقط (الشكل 2 أ).
- املأ الإبرة ب 0.1 مل من الزيت المعدني لضمان عدم وجود فقاعات.
- قم بإزالة الغطاء اللولبي للإبرة الفولاذية لجهاز الحقن المجهري. قم بمحاذاة فتحة الإبرة الزجاجية مع الإبرة الفولاذية ثم شد الغطاء اللولبي. قم بتركيب جهاز الحقن المجهري بالإبرة المحمل في مناور دقيق (انظر جدول المواد).
- اضبط موضع جهاز الحقن المجهري بحيث يمكن للمناور الدقيق تحريك الجهاز بمرونة تحت المجهر. تفريغ كمية معينة من زيت البارافين لجعل الإبرة الفولاذية تدخل الأنبوب الزجاجي الشعري.
- قم بإسقاط محلول الحقن (مثل 1× PBS أو 5 مجم / مل LPS) على شريحة زجاجية معقمة بنسبة 70٪ من الإيثانول واضبط جهاز الحقن الدقيق بحيث يتم إدخال الطرف في قطرة السائل. تحميل ~ 2 ميكرولتر من محلول الحقن في الإبرة.
- قم بإعداد المعالج الدقيق (إعدادات الضبط الدقيقة لأعلى ولأسفل ولليسار ولليمين) بحيث يكون طرف إبرة جهاز الحقن المجهري في نفس مجال الرؤية مثل اليرقات عند التكبير العالي (الشكل 2 ب).
3. تصاعد الزرد للحقن المجهرية
ملاحظة: يحدث نمو دماغ الزرد في حدود 3 dpf وينضج عند 5 dpf مع نظام عصبي مركزي متطور31,32. لذلك ، فإن 5 يرقات dpf مناسبة بالفعل لدراسة الأضرار العصبية بوساطة LPS بالإضافة إلى الاستجابات السلوكية والالتهابية.
- حقن يرقات الزرد في غضون 30 دقيقة تقريبا من الوصول إلى مرحلة الاهتمام ، للحفاظ على اتساق توقيت الحقن.
- لتخدير يرقات الزرد ، يمزج التريكايين مع ماء حوض السمك النظيف (التركيز النهائي 0.02٪ وزن / وزن التريكائين).
- تذوب محلول 2٪ أغاروز في ddH2O باستخدام الميكروويف. صب الأغاروز المنصهر في طبق بلاستيكي. يمكن تخزين الطبق البلاستيكي المطلي بالأغاروز بنسبة 2٪ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
- استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل اليرقات المخدرة إلى وسط الطبق البلاستيكي المطلي بالأغاروز بنسبة 2٪. قم بتوجيه اليرقات المركبة بحيث يكون جانب الدماغ لأعلى للوصول إلى الإبرة.
4. حقن البطين الدماغي
- اضبط تكبير المجهر بحيث يتم عرض بنية البطين الدماغي لسمك الزرد بوضوح في مجال الرؤية (الشكل 2 ب).
- ضع الإبرة بعناية فوق نسيج الدماغ (الشكل 2 ج).
- ثقب جلد دماغ الزرد بطرف الإبرة ببطء باستخدام micromanipulator.
- اضغط على دواسة القدم لإخراج 1 nL من 1x PBS أو تركيزات مختلفة من LPS (1.0 و 2.5 و 5.0 مجم / مل) (انظر جدول المواد). يتم عرض صور حقن البطين الناجحة التي تم فيها حقن البطين الدماغي ب 1 nL من صبغة إيفانز الزرقاء بنسبة 1٪ (مخففة في PBS) كمثال (الشكل 2D). نقل اليرقات لتنظيف وسط E3 مباشرة بعد الحقن. بعد 24 ساعة ، اجمع اليرقات للتصوير المجهري ، والفحص السلوكي للقاطرة ، وتحديد المؤشرات الأخرى.
5. التصوير
- تحضير محلول أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ في وسط E3 وتسخينه في الميكروويف لتشكيل سائل صاف.
- استخدم ماصة نقل بلاستيكية نظيفة لنقل اليرقات إلى شريحة زجاجية وإزالة أكبر قدر ممكن من الماء.
- استخدم ماصة نقل بلاستيكية لإضافة قطرة من 1.5٪ من الأغاروز منخفض الذوبان إلى اليرقات.
ملاحظة: قم بتبريد الأغاروز منخفض الذوبان في الماصة لفترة من الوقت قبل إضافته حتى لا تجرح اليرقات. - استخدم إبرة حقنة سعة 1 مل لتوجيه اليرقات. انتظر حتى يبرد الأغاروز ويتصلب قبل بدء التصوير.
- مراقبة وتصوير منطقة الخلايا العصبية في الدماغ كله من Tg (ETvmat2: EGFP) و Tg (elavl3: mCherry) الزرد ، وكذلك تجنيد العدلات في دماغ الزرد Tg (mpo: EGFP) تحت مجهر ستيريو مضان (انظر جدول المواد).
ملاحظة: إعدادات المجهر الفلوري المستخدمة للتصوير موضحة أدناه. Tg (ETvmat2: EGFP) دماغ الزرد (الطول الموجي للإثارة: 450-490 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 500-550 نانومتر ، التكبير البصري: 100x) ؛ Tg (elavl3: mCherry) دماغ الزرد (الطول الموجي للإثارة: 541-551 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 590 نانومتر ، التكبير البصري: 100x) ؛ Tg (mpo: EFGP) دماغ الزرد (الطول الموجي للإثارة: 450-490 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 500-550 نانومتر ، التكبير البصري: 63x). - قياس وتحليل شدة التألق وطول منطقة الخلايا العصبية Ra في Tg (ETvmat2: EGFP) الزرد وشدة التألق للخلايا العصبية في دماغ الزرد Tg (elavl3: mCherry) باستخدام برنامج ImageJ. عد يدويا العدلات في منطقة الدماغ من الزرد Tg (mpo: EFGP).
6. تحديد علامات التعبير الجيني
- في 24 ساعة بعد حقن البطين الدماغي LPS ، تابع تحديد علامات التعبير الجيني. للقيام بذلك ، تخدير يرقات الزرد بنسبة 0.02٪ تريكايين (كما هو مذكور في الخطوة 3.2).
- استخدم حقنتين سعة 1 مل لفصل أجزاء الرأس من اليرقات (40 يرقة لكل مجموعة) بدون مناطق كيس العين والصفار (الشكل 2E).
- استخراج الحمض النووي الريبي من أجزاء رأس اليرقات.
- لاستخراج الحمض النووي الريبي ، قم بتجانس جزء الرأس مع 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد) باستخدام مطحنة الأنسجة (انظر جدول المواد) بسرعة دوران تبلغ 11000 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان.
- إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة الكلوروفورم الأيزوبروبانول. للقيام بذلك ، أضف 40 ميكرولتر كلوروفورم ، وهز الأنابيب بقوة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد (حوالي 100 ميكرولتر) وإضافة 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول. احتضان لمدة 10 دقائق ثم أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
- أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ لغسل حبيبات الحمض النووي الريبي. دوامة العينات لفترة وجيزة ثم الطرد المركزي في 7500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسل حبيبات الحمض النووي الريبي مرة أخرى.
- جفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة 5-10 دقائق ، ثم أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase لإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي. تحقق من نقاء (نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر و 280 نانومتر) وسلامة الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير (انظر جدول المواد).
- توليف cDNA من الحمض النووي الريبي المستخرج في الخطوة 6.3 ، باستخدام النسخ العكسي مع البادئات العشوائية (انظر جدول المواد).
- أضف 1 ميكرولتر من البادئات العشوائية ، و 1 ميكرولتر من dNTPs ، و 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، والماء المقطر (الحجم الكلي إلى 12 ميكرولتر) إلى أنبوب خال من النيوكلياز. سخني الخليط إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تبرد بسرعة على الثلج.
- أضف 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 4 ميكرولتر من 5× المخزن المؤقت للشريط الأول ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي M-MLV (الحجم الكلي: 20 ميكرولتر) إلى الأنبوب. امزج الأنبوب برفق واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. قم بتعطيل التفاعل عن طريق التسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي على نظام qPCR (انظر جدول المواد) باستخدام مجموعة RT-qPCR المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) لتحديد التعبير عن الجينات المستهدفة (IL-1β و IL-6 و TNF-α). احتوى خليط التفاعل (20 ميكرولتر) على 10 ميكرولتر من SYBR الأخضر ، و 0.4 ميكرولتر من صبغة ROX المرجعية ، و 0.8 ميكرولتر لكل من البادئات الأمامية والخلفية ، و 6 ميكرولتر من ddH 2 O ، و2ميكرولتر من قالب cDNA (1 ميكروغرام). قم بإجراء تضخيم PCR في ظل الظروف: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 34 ثانية ، وبمرحلة تفكك 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
- تطبيع مستويات mRNA للجينات المستهدفة إلى مستويات جين التدبير المنزلي ، عامل الاستطالة 1 α (Ef1α). احسب مستويات التعبير لكل جين مستهدف بالطريقة 2−ΔΔCT33. يتم وصف تسلسل التمهيدي لكل جين في الجدول 2.
- لتحديد أكسيد النيتريك ، قم بتجانس جزء الرأس (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 6.2) في 100 ميكرولتر من PBS البارد باستخدام مطحنة الأنسجة. قم بالطرد المركزي لنظام PBS الناتج وتعليق جزء الرأس عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المحللات وقم بإجراء فحص تركيز النتريت34 باستخدام مجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
7. الفحص السلوكي لقاطرة الزرد
- في 24 ساعة بعد حقن البطين الدماغي LPS ، انقل يرقات الزرد إلى آبار صفيحة مجهرية مربعة من 96 بئرا بشكل فردي. أضف 300 ميكرولتر من وسط E3 إلى كل بئر ثم احتضن اليرقات لمدة 4 ساعات لتتأقلم مع لوحة الاختبار.
- انقل الصفيحة الدقيقة المحملة باليرقات إلى صندوق تتبع الزرد (انظر جدول المواد). قم بتشغيل مصدر الضوء ثم احتضان اليرقات في صندوق الاختبار لمدة 30 دقيقة للتأقلم مع البيئة.
- مراقبة وتسجيل سلوك الزرد باستخدام نظام تتبع الفيديو الآلي. سجل 12 جلسة (5 دقائق لكل منها ، إجمالي 1 ساعة) لكل زرك. حدد المسافة الإجمالية (تتكون من مسافات غير نشطة وصغيرة وكبيرة) على أنها المسافة (بالملليمتر) التي تحركت فيها كل سمكة خلال فترة تتبع مدتها 60 دقيقة.
8. التحليل الإحصائي
- إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج التحليل القياسي (انظر جدول المواد).
- إجراء تحليل إحصائي للاختلافات بين مجموعتين باستخدام ANOVA العادي أحادي الاتجاه. احسب معامل ارتباط بيرسون لإيجاد قوة الارتباطات. واعتبر P < 0.05 معنويا في جميع التحليلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقدم سير العمل الموصوف هنا منهجية جديدة وسريعة وفعالة لإحداث التهاب عصبي بوساطة LPS والسمية العصبية في يرقات الزرد. في هذا البروتوكول الموصوف ، تم حقن 5 أسماك الزرد dpf مع LPS (الشكل 1) في بطينات الدماغ باستخدام حاقن دقيق (الشكل 2A-C). تم التحقق من الحقن الناجح في موقع بطين الدماغ باستخدام 1٪ صبغة إيفانز الزرقاء (الشكل 2D). تم فصل رأس الزرد عن عينيه وجسمه باستخدام المحاقن (الشكل 2E) لاستبعاد أي تأثير لتعبير السيتوكين الالتهابي وإطلاق أكسيد النيتريك في جسم الزرد على تحديد الالتهاب العصبي والسمية العصبية في الدماغ.
تم حقن نفس الحجم من PBS (مثل LPS) في منطقة البطين الدماغي لسمك الزرد كعنصر تحكم يعمل بالخداع. لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات الضابطة والمجموعات التي تعمل بالخداع في الخلايا العصبية على وجه الخصوص من المجموعة الأمامية من نوى الرافي (Ra) (الشكل 3A-C) ، والكثافة المتكاملة الفلورية للخلايا العصبية في الدماغ (الشكل 3D ، E) ، والمسافة الإجمالية لحركة الزرد (الشكل 4 أ ، ب) ، وعدم إنتاج وتعبير الحمض النووي الريبي المرسال للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات (TNF-α ، IL-6 ، و IL-1β) (الشكل 4A-D) ، وتجنيد العدلات في دماغ الزرد اليرقية (الشكل 6A ، B). أظهرت هذه النتائج أن الحقن المجهري المناسب لا يسبب أي سمية عصبية والتهاب عصبي في الزرد.
بعد العلاج لمدة 24 ساعة ، تسبب حقن البطين الدماغي في LPS في السمية العصبية في الزرد. تسبب LPS (1-5 مجم / مل) في فقدان كبير للخلايا العصبية Ra في دماغ Tg (ETvmat2: GFP) الزرد اليرقية مقارنة بمجموعات التحكم والوهمية (الشكل 3A-C). يحدد الخط المعدل وراثيا elav13: mCherry zebrafish الخلايا العصبية ببروتين الفلورسنت الأحمر النووي35. كما هو موضح في الشكل 3D ، E ، أدى 2.5-5 مجم / مل LPS إلى تغييرات كبيرة في الكثافة المتكاملة الفلورية للخلايا العصبية في الدماغ في خط الزرد اليرقاتي. ومع ذلك ، لم تظهر مجموعة حقن LPS 1 مجم / مل أي تأثير على الكثافة المتكاملة الفلورية للخلايا العصبية في الدماغ مقارنة بالمجموعات الضابطة والوهمية. علاوة على ذلك ، تسبب 5 مجم / مل LPS في نقص الحركة (الشكل 4 أ) وقلل من المسافة الإجمالية لحركة الزرد خلال فترة تتبع مدتها 60 دقيقة (الشكل 4 ب). أظهرت النتائج أن 1-2.5 مجم / مل LPS يمكن أن يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية ولكن لا يوجد نقص كبير في الحركة.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لحقن البطين الدماغي من LPS أيضا تنشيط الاستجابة الالتهابية في دماغ الزرد. لم يتم زيادة الإنتاج (الشكل 5 أ) وتعبير mRNA للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات (TNF-α و IL-6 و IL-1β) (الشكل 5B-D) في رأس يرقات الزرد عند معالجة LPS 2.5-5 مجم / مل مقارنة بالتعبير في مجموعات التحكم والوهم. بعد حقن 1-5 ملغم / مل LPS ، لوحظ تجنيد العدلات في دماغ الزرد اليرقات (الشكل 6A) ، مما أدى إلى زيادة كبيرة في عدد العدلات في منطقة دماغ الزرد Tg (mpo: EGFP) (الشكل 6B).
| درج | وقت التشغيل (ثانية) | مستوى الحرارة | فعل |
| ت1 | L> | إتش80-89 | P1L005 |
| تي 2 | 1.6-3 | إتش00 | |
| تي 3 | L> | إتش00 | P2L001c |
| تي 4 | 3 | إتش00 | برد |
| تي 5 | 0 | إتش00 |
الجدول 1: بروتوكول من خمس خطوات لسحب الأنبوب الشعري الزجاجي.
| اسم التمهيدي | تسلسل | |
| IL-1β إلى الأمام | 5'-كاتجكاجكجكتاكا-3' | |
| IL-1β عكس | 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3' | |
| IL-6 إلى الأمام | 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3' | |
| IL-6 عكس | 5'-TCTTTCTCTCTTTTCCCTG-3' | |
| TNF-α إلى الأمام | 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3' | |
| TNF-α عكس | 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3' | |
| Ef1α إلى الأمام | 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3' | |
| عكس Ef1α | 5'-AGGGCATCAAGAAGAGATAGTACCG-3' | |
الجدول 2: الاشعال المستخدمة في الوقت الحقيقي qPCR.
الشكل 1: الهيكل العام لعديد السكاريد الشحمي (LPS). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: إعداد الحقن المجهري ، ووضعية الجسم وموضع الزرد ، وفصل جزء الرأس. (أ) اختيار إبرة الزجاج: استخدم ملقطا لقطع طرف إبرة مسحوبة مسبقا تحت المجهر ، للحصول على إبرة ذات فتحة مماثلة كما هو موضح في الشكل. (ب) اضبط البعد البؤري للمجهر بحيث يمكن ملاحظة منطقة البطين الدماغي ليرقات الزرد عند التكبير العالي (المحدد باللون الأسود). تشير الدوائر الزرقاء الفاتحة إلى موقع الحقن. (ج) يجب توجيه اليرقات المركبة بحيث يكون جانب الدماغ لأعلى للوصول إلى الإبرة (يشار إلى نسيج الدماغ بدائرة حمراء). (د) عرض لنجاح حقن البطين بالأزرق إيفانز في دماغ يرقات الزرد. (ه) جزء رأس الزرد بدون مناطق كيس العين والصفار. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: حقن البطين الدماغي من LPS يزيل الخلايا العصبية بعد 24 ساعة في يرقات الزرد. (أ) (أعلى) صور مجهرية مضان تمثيلية ل vmat2: GFP الزرد بعد العلاج بتركيزات مختلفة من LPS (تشير الأقواس الحمراء إلى نوى الرافي [Ra] الخلايا العصبية ؛ شريط المقياس = 265.2 ميكرومتر). (أسفل) تم توسيع منطقة Ra العصبية لتحسين التصور المورفولوجي. (ب، ج) متوسط شدة التألق وطول منطقة الخلايا العصبية Ra في vmat2: يرقات الزرد GFP. (د، ه) مورفولوجيا تمثيلية (شريط مقياس = 265.2 ميكرومتر) ومتوسط شدة مضان Tg (elavl3: mCherry) الخلايا العصبية في دماغ الزرد. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من المجموعة الضابطة. *P < 0.05 و**P < 0.01 مقابل المجموعة الضابطة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: يؤدي حقن البطين الدماغي ل LPS إلى نقص الحركة بعد 24 ساعة في يرقات الزرد . (أ) أنماط تمثيلية لآثار حركة الزرد. في خريطة التتبع الرقمية ، يتم تمثيل الحركة عالية السرعة بخطوط حمراء (> 6.6 مم / ثانية) ؛ يتم تصوير الحركة متوسطة السرعة بخطوط خضراء (3.3-6.6 مم / ثانية) ؛ يتم تصوير الحركة منخفضة السرعة بخطوط سوداء (< 3.3 مم / ثانية). (ب) التحليل الكمي لمتوسط المسافة الكلية التي قطعها الزرد في 60 دقيقة. * P < 0.05 مقابل المجموعة الضابطة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: يزيد حقن البطين الدماغي من LPS من الوسطاء المؤيدين للالتهابات. (أ) تم قياس مستويات أكسيد النيتريك باستخدام كاشف جريس. (ب - د) تم فحص مستويات التعبير الجيني ل interleukin-6 (IL-6) و interleukin-1β (IL-1β) وعامل نخر الورم α (TNF-α) في رأس الزرد بواسطة qPCR. *P < 0.05 و**P < 0.01 مقابل المجموعة الضابطة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: يؤدي الحقن المجهري البطيني الدماغي LPS إلى تجنيد العدلات في دماغ الزرد بعد 24 ساعة . (أ) هجرة العدلات (المنطقة داخل الدائرة الحمراء) إلى رأس اليرقات بعد حقن البطين الدماغي LPS (شريط المقياس = 851.1 ميكرومتر). ب: عدد العدلات في رؤوس اليرقات بعد حقن البطين الدماغي LPS. *P < 0.05 و**P < 0.01 مقابل المجموعة الضابطة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: البيانات الأولية الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشير كمية متزايدة من البيانات الوبائية والتجريبية إلى تورط الالتهابات البكتيرية والفيروسية المزمنة كعوامل خطر محتملة للأمراض التنكسية العصبية36. تؤدي العدوى إلى تنشيط العمليات الالتهابية والاستجابات المناعية للمضيف37. حتى لو كانت الاستجابة بمثابة آلية دفاعية ، فإن الالتهاب المفرط يضر بتكوين الخلايا العصبية ، ولا تسمح البيئة الالتهابية ببقاء الخلايا العصبية حديثي الولادة38. نتيجة لذلك ، فإنه يتسبب في تلف وظائف الخلايا العصبية المضيفة وصلاحيتها. تشير الدراسات إلى أن الالتهاب يلعب دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية للتنكس العصبي39.
باعتباره ذيما داخليا مسببا للأمراض تمت دراسته بشكل متكرر ، فقد تورط LPS في تثبيط تكوين الخلايا العصبية والتنكس العصبي. تنشيط LPS للعمليات الالتهابية يضعف بشكل كبير تكوين الخلايا العصبية ، جزئيا من خلال إنتاج NO و TNF-α و IL-6 و IL-1β40. توضح مجموعة متزايدة من الأدلة أن LPS يسبب عجزا في السلوك وفقدان الخلايا العصبية ، ويؤثر على تطور تكوين الخلايا العصبية عند حقنه مركزيا في نماذج القوارض التنكسية العصبية10,38. تم استخدام نماذج الزرد على نطاق واسع كنماذج تجريبية بديلة لدراسة الاستجابات المناعية41 وفحص الأدوية الجديدة المضادة للالتهابات. تتشابه أجهزة المناعة الفطرية والتكيفية لسمك الزرد مع تلك الموجودة في الثدييات42. علاوة على ذلك ، حددت بعض الدراسات العديد من السيتوكينات والمستقبلات الالتهابية الموجودة في الثدييات في الزرد CNS43. تشير الدراسات السابقة إلى أن غمر أجنة / يرقات الزرد في LPS أو حقن LPS في صفار يرقات الزرد يمكن أن يحفز الاستجابة المناعية ويزيد من العوامل المؤيدة للالتهابات المرتبطة بالالتهاب44,45. ومع ذلك ، فإن التأثير المحدد ل LPS على الأنسجة العصبية الزرد ، وعلى تحريض الالتهاب العصبي ، غير معروف بعد.
على الرغم من أن نماذج القوارض لها العديد من المزايا مقارنة بالنماذج الحيوانية الأخرى ، إلا أن قيودها من حيث التصوير في الوقت الفعلي في الجسم الحي وفحص الأدوية واضحة. يستخدم التصوير في الجسم الحي على نطاق واسع للتحقيق في الآليات الكامنة وراء تطور الجهاز العصبي والتغيرات المرضية في الدماغ كأداة قوية وغير جراحية46,47. نظرا للشفافية البصرية لأجنة ويرقات الزرد ، فهي مناسبة تماما لتجارب التصوير الحية لمراقبة الدماغ48,49. على وجه الخصوص ، فإن صغر حجم أسماك الزرد ، وقدرتها على إنتاج الآلاف من الأجنة ، يعني أنه يمكن إجراء فحص دوائي عالي الإنتاجية باستخدام أجنة الزرد أو اليرقات50,51. علاوة على ذلك ، مع التطورات في العلوم والتكنولوجيا ، يمكن توصيل الحقن المجهرية الروبوتية بدقة وفعالية ، ويمكن استخدامها لحقن كميات كبيرة من الأجنة أو اليرقات52,53. إن تطبيق نظام الحقن الآلي الدقيق على أبحاث الخلايا العصبية ، لحقن المواد في الوقت المناسب في أعداد كبيرة من الأجنة أو اليرقات ، سيسهل الفحص على نطاق واسع للجزيئات الحيوية ومركبات الأدوية.
في هذه الدراسة ، تم حقن الزرد عند 5 dpf مع LPS بتركيز 2.5-5 ملغ / مل. تم تحديد هذا على أنه الشرط الأمثل لتطوير نموذج الالتهاب العصبي. على حد علمنا ، لم يتم وصف هذه المنهجية في الأدبيات. وبالتالي ، كان الحقن المجهري البطيني الدماغي ل LPS في يرقات الزرد قادرا على التسبب في فقدان الخلايا العصبية ونقص الحركة. علاوة على ذلك ، أظهرت نتائجنا أن الالتهاب العصبي الناجم عن LPS يزيد من مستويات الوسطاء المؤيدين للالتهابات مثل NO و TNF-α و IL-6 و IL-1β ، ويؤدي إلى تجنيد العدلات في دماغ الزرد اليرقية في 24 ساعة بعد الحقن. في النماذج الحيوانية الأخرى ، يمكن أن يعزز حقن LPS أيضا تطور الالتهاب ويسبب تغيرات عصبية مرضية في الدماغ13,54. تعزز نتائج هذه الدراسة فهمنا لمسارات الالتهاب العصبي. في هذه الطريقة ، تجدر الإشارة إلى أن فتح الإبر للحقن المجهري يجب ألا يكون كبيرا جدا لتجنب تلف الدماغ الناجم عن التشغيل الميكانيكي ، ويجب تطبيق قدر معقول من القوة لتجنب إتلاف اليرقات. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم فصل الرأس عن عيني وجسم الزرد لتحديد العوامل الالتهابية وأكسيد النيتريك ، لأن هذا سيساعد في الحصول على نتائج اتجاهية تعكس على وجه التحديد الالتهاب العصبي الناجم عن حقن البطين الدماغي LPS.
عيب طفيف في هذه الطريقة هو أنه نظرا لصغر حجم يرقات الزرد ، فإن كميات الجزيئات الحيوية مثل إجمالي mRNA التي تم الحصول عليها عن طريق التجانس والاستخراج أقل من تلك الموجودة في نموذج الفأر. ومع ذلك ، فإن الزرد قادر على التفريخ بشكل متكرر مع عدة مئات من البيض كل أسبوع. يمكن أن توفر زيادة عدد يرقات الزرد المستخدمة في كل مجموعة كميات كافية من الجزيئات الحيوية المستخرجة لفحوصات كيميائية حيوية مختلفة. في الختام ، تحفز هذه الطريقة السمية العصبية والاستجابة المناعية في دماغ الزرد اليرقات. نظرا لشفافية الزرد ، يمكن فهم التغيرات في دماغ الزرد الحي بشكل أفضل من خلال التصوير في الجسم الحي . التقنية الموصوفة هنا هي أداة ممتازة لتقييم الأدوية المضادة للالتهابات العصبية المحتملة بسرعة وكفاءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.
Acknowledgments
ودعمت هذه الدراسة بمنح مقدمة من صندوق تنمية العلم والتكنولوجيا (FDCT) التابع لمنطقة ماكاو الإدارية الخاصة (المرجع رقم. FDCT0058/2019/A1 and 0016/2019/AKP)، ولجنة البحوث، جامعة ماكاو (MYRG2020-00183-ICMS and CPG2022-00023-ICMS)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81803398).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al.
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O.
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J.
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
