Summary
Dit protocol demonstreert de micro-injectie van lipopolysaccharide in het ventriculaire gebied van de hersenen in een zebravislarvemodel om de resulterende neuro-inflammatoire respons en neurotoxiciteit te bestuderen.
Abstract
Neuro-inflammatie is een belangrijke speler bij verschillende neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekten. Daarom is het van groot belang om alternatieve in vivo neuro-inflammatiemodellen te onderzoeken en te ontwikkelen om de rol van neuro-inflammatie bij neurodegeneratie te begrijpen. In deze studie werd een larvaal zebravismodel van neuro-inflammatie gemedieerd door ventriculaire microinjectie van lipopolysaccharide (LPS) ontwikkeld en gevalideerd. De transgene zebravislijnen elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP en mpo:EGFP werden gebruikt voor real-time kwantificering van de levensvatbaarheid van hersenneuronen door fluorescentie live imaging geïntegreerd met fluorescentie intensiteitsanalyse. Het locomotorische gedrag van zebravislarven werd automatisch vastgelegd met behulp van een videotrackingrecorder. Het gehalte aan stikstofmonoxide (NO) en de mRNA-expressieniveaus van inflammatoire cytokines, waaronder interleukine-6 (IL-6), interleukine-1β (IL-1β) en menselijke tumornecrosefactor α (TNF-α) werden onderzocht om de LPS-geïnduceerde immuunrespons in de larvale zebraviskop te beoordelen. Na 24 uur na de hersenventrikelinjectie van LPS werden verlies van neuronen en locomotiedeficiëntie waargenomen bij zebravislarven. Bovendien verhoogde LPS-geïnduceerde neuro-inflammatie de NO-afgifte en de mRNA-expressie van IL-6, IL-1β en TNF-α in het hoofd van 6 dagen na de bevruchting (dpf) zebravislarven, en resulteerde in de rekrutering van neutrofielen in de hersenen van zebravissen. In deze studie werd injectie van zebravissen met LPS in een concentratie van 2,5-5 mg/ml bij 5 dpf bepaald als de optimale conditie voor deze farmacologische neuro-inflammatietest. Dit protocol presenteert een nieuwe, snelle en efficiënte methodologie voor micro-injectie van LPS in de hersenen om LPS-gemedieerde neuro-inflammatie en neurotoxiciteit in een zebravislarve te induceren, wat nuttig is voor het bestuderen van neuro-inflammatie en ook kan worden gebruikt als een high-throughput in vivo screening assay voor geneesmiddelen.
Introduction
Neuro-inflammatie is beschreven als een cruciale anti-neurogene factor die betrokken is bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS)1. Na pathologische beledigingen kan neuro-inflammatie leiden tot verschillende nadelige gevolgen, waaronder remming van neurogenese en inductie van neuronale celdood 2,3. In het proces dat ten grondslag ligt aan de respons op ontstekingsinductie, worden meerdere inflammatoire cytokines (zoals TNF-α, IL-1β en IL-6) uitgescheiden in de extracellulaire ruimte en fungeren als cruciale componenten in neurondood en de onderdrukking van neurogenese 4,5,6.
Micro-injectie van ontstekingsmediatoren (zoals IL-1β, L-arginine en endotoxinen) in de hersenen kan neuronale celreductie en neuro-inflammatie veroorzaken 7,8,9. Lipopolysaccharide (LPS, figuur 1), een pathogeen endotoxine dat aanwezig is in de celwand van Gram-negatieve bacteriën, kan neuro-inflammatie induceren, neurodegeneratie verergeren en neurogenese bij dieren verminderen10. LPS-injectie rechtstreeks in het CZS van de muizenhersenen verhoogde niveaus van stikstofmonoxide, pro-inflammatoire cytokines en andere regulatoren11. Bovendien kan stereotaxische injectie van LPS in de lokale hersenomgeving overmatige productie van neurotoxische moleculen induceren, wat resulteert in een verminderde neuronale functie en de daaropvolgende ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten 10,12,13,14,15. Op het gebied van de neurowetenschappen zijn live en tijdsverloop microscopische waarnemingen van cellulaire en biologische processen in levende organismen cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan pathogenese en farmacologische werking16. Live beeldvorming van muismodellen van neuro-inflammatie en neurotoxiciteit wordt echter fundamenteel beperkt door de beperkte optische penetratiediepte van microscopie, die functionele beeldvorming en live observatie van ontwikkelingsprocessen uitsluit 17,18,19. Daarom is de ontwikkeling van alternatieve neuro-inflammatiemodellen van groot belang om de studie van pathologische ontwikkeling en het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neuro-inflammatie en neurodegeneratie door live beeldvorming te vergemakkelijken.
Zebravis (Danio rerio) is naar voren gekomen als een veelbelovend model om neuro-inflammatie en neurodegeneratie te bestuderen vanwege zijn evolutionair geconserveerde aangeboren immuunsysteem, optische transparantie, grote embryokoppelingsgrootte, genetische tractie en geschiktheid voor in vivo beeldvorming 19,20,21,22,23 . Eerdere protocollen hebben ofwel lps rechtstreeks geïnjecteerd in de dooier en achterhersenentrik van larvale zebravissen zonder mechanistische beoordeling, of eenvoudig LPS toegevoegd aan viswater (kweekmedium) om een dodelijke systemische immuunrespons te induceren 24,25,26,27. Hierin hebben we een protocol ontwikkeld voor micro-injectie van LPS in de hersenventrikels, om een aangeboren immuunrespons of neurotoxiciteit te activeren in de 5 dagen na de bevruchting (dpf) zebravislarven. Deze respons wordt aangetoond door neuronaal celverlies, bewegingsvermogenstekort, verhoogde afgifte van stikstofmonoxide, activering van inflammatoire genexpressie en rekrutering van neutrofielen in de hersenen van zebravissen 24 uur na injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB wild-type zebravis en transgene zebravislijnen elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP en mpo:EGFP werden verkregen van het Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS). Ethische goedkeuring (UMARE-030-2017) voor de dierproeven werd verleend door de Animal Research Ethics Committee, University of Macau, en het protocol volgt de richtlijnen voor institutionele dierverzorging.
1. Zebravis embryo en larvale veehouderij
- Genereer zebravisembryo's (200-300 embryo's per paring) door natuurlijke paarsgewijze paring zoals eerder gemeld28.
- Bereid eierwater (E3) middelgrote bouillon (60×) door 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2·2H 2 O en 9,78 g MgCl 2·6H2 O inddH2O op te lossen tot een eindvolume van 2 L en stel de pH in op 7,2 met NaOHen HCl. Om de bedrijfsconcentratie van het E3-medium (1×) te bereiden, verdunt u de bouillon 60 maal in ddH2O. Bewaren bij 28,5 °C wanneer deze niet in gebruik is.
- Gebruik een plastic transferpipet om de zebravisembryo's over te brengen naar een schaal met E3-medium. Kweek de embryo's bij 28,5 °C in een couveuse en volg hun ontwikkeling en gezondheid. Verwijder dode embryo's en vervang onreine E3 medium door vers medium per dag.
- Gebruik voor zebravisbeeldvormingsexperimenten een plastic transferpipet om 0-2 uur na de bevruchting (hpf) embryo's (ongeveer 200 eieren) te verzamelen in ongeveer 15 ml 1× E3-medium dat 0,003% N-fenylthiourea (PTU) bevat.
OPMERKING: PTU kan de vorming van melanoforen remmen tijdens embryogenese29. Behandeling van embryo's met PTU tijdens embryogenese kan de signaaldetectie in microscopie of expressie van fluorescentie verbeteren30. - Onderhoud de zebravisembryo's onder de bovenstaande omstandigheden totdat embryo's het gewenste ontwikkelingslarvestadium bereiken.
2. Voorbereiden op micro-injectie
- Bereid u voor op de injectie door glazen haarvaten te trekken met behulp van een micropipettetrekker (zie Materiaaltabel), volgens het vijfstappenprotocol voor het trekken van glazen capillaire buisjes (tabel 1).
- Open de punt van de naald (dunne glazen haarvaten [3,5 inch] met gloeidraad, OD 1,14 mm) onder een hoek met behulp van een tang (figuur 2A).
- Vul de naald met 0,1 ml minerale olie om ervoor te zorgen dat er geen bubbels zijn.
- Verwijder de schroefdop van de stalen naald van het microinjectieapparaat. Lijn het glazen naaldgat uit met de stalen naald en draai vervolgens de schroefdop vast. Monteer het geladen naaldmicro-injectieapparaat in een micromanipulator (zie Materiaaltabel).
- Pas de positie van het microinjectieapparaat aan, zodat de micromanipulator het apparaat flexibel onder de microscoop kan verplaatsen. Ontlaad een bepaald volume paraffineolie om de stalen naald in de capillaire glazen buis te laten komen.
- Laat de injectieoplossing (zoals 1× PBS of 5 mg/ml LPS) op een glazen schuif gesteriliseerd met 70% ethanol vallen en stel het microinjectieapparaat zo in dat de punt in de vloeistofdruppel wordt ingebracht. Laad ~2 μL injectie-oplossing in de naald.
- Stel de micromanipulator (fijnafstellingsinstellingen van omhoog, omlaag, links en rechts) zo in dat de naaldpunt van het microinjectieapparaat zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt als de larven bij hoge vergroting (figuur 2B).
3. Zebravis monteren voor micro-injecties
OPMERKING: Zebravis hersenontwikkeling vindt plaats binnen 3 dpf en rijpt op 5 dpf met een goed ontwikkeld centraal zenuwstelsel31,32. Daarom zijn 5 dpf-larven al geschikt voor het bestuderen van LPS-gemedieerde neuronale schade en gedrags- en ontstekingsreacties.
- Injecteer de zebravislarven binnen ongeveer 30 minuten na het bereiken van het stadium van interesse, om de consistentie van de injectietiming te behouden.
- Om de zebravislarven te verdoven, combineert u tricaine met schoon aquariumwater (eindconcentratie van 0,02% w / v tricaine).
- Smelt een oplossing van 2% agarose in ddH2O met behulp van een magnetron. Giet de gesmolten agarose in een plastic schaal. De 2% agarose-gecoate plastic schaal kan maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
- Gebruik een plastic transferpipet om verdoofde larven naar het midden van de 2% agarose-gecoate plastic schaal te transporteren. Oriënteer de gemonteerde larven met de hersenkant naar boven voor toegang tot de naald.
4. Injecteren van de hersenkamer
- Pas de vergroting van de microscoop aan zodat de hersenventrikelstructuur van zebravissen duidelijk wordt weergegeven in het gezichtsveld (figuur 2B).
- Plaats de naald voorzichtig boven het hersentectum (figuur 2C).
- Prik de huid van de hersenen van de zebravis met de naaldpunt langzaam door met behulp van de micromanipulator.
- Druk op het voetpedaal om 1 nL 1x PBS of verschillende concentraties LPS (1,0, 2,5 en 5,0 mg/ml) uit te werpen (zie materiaaltabel). Succesvolle ventrikelinjectiebeelden waarbij hersenventrikel werd geïnjecteerd met 1 nL van 1% Evans blauwe kleurstof (verdund in PBS) worden als voorbeeld getoond (figuur 2D). Breng de larven onmiddellijk na de injectie over naar het schone E3-medium. Verzamel na 24 uur de larven voor microscopische beeldvorming, locomotiefgedragstest en bepaling van andere indicatoren.
5. Beeldvorming
- Bereid 1,5% low-melt agarose-oplossing in E3-medium en verwarm het in een magnetron om een heldere vloeistof te vormen.
- Gebruik een schone plastic transferpipet om de larven naar een glazen glijbaan te transporteren en verwijder zoveel mogelijk water.
- Gebruik een plastic transferpipet om een druppel van 1,5% low-melt agarose aan de larven toe te voegen.
OPMERKING: Koel de low-melt agarose in de pipet een tijdje voordat u deze toevoegt om de larven niet te verwonden. - Gebruik een naald van een spuit van 1 ml om de larven te oriënteren. Wacht tot de agarose afkoelt en stolt voordat u begint met beeldvorming.
- Observeer en fotografeer het neurongebied in de hele hersenen van Tg (ETvmat2: EGFP) en Tg (elavl3: mCherry) zebravissen, evenals de rekrutering van neutrofielen in de hersenen van Tg (mpo: EGFP) zebravissen onder een fluorescentie stereomicroscoop (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Fluorescentiemicroscoopinstellingen die worden gebruikt voor beeldvorming worden hieronder weergegeven. Tg (ETvmat2: EGFP) zebravis hersenen (excitatie golflengte: 450-490 nm, emissie golflengte: 500-550 nm, visuele vergroting: 100x); Tg(elavl3:mCherry) zebravis hersenen (excitatie golflengte: 541-551 nm, emissie golflengte: 590 nm, visuele vergroting: 100x); Tg(mpo:EFGP) zebravis hersenen (excitatie golflengte: 450-490 nm, emissie golflengte: 500-550 nm, visuele vergroting: 63x). - Meet en analyseer de fluorescentie-intensiteit en -lengte van het Ra-neurongebied in Tg (ETvmat2: EGFP) zebravissen en de fluorescentie-intensiteit van Tg (elavl3: mCherry) zebravishersenneuronen met behulp van ImageJ-software. Tel handmatig de neutrofielen in het hersengebied van Tg (mpo: EFGP) zebravissen.
6. Bepaling van genexpressiemarkers
- Ga 24 uur na LPS-hersenventrikelinjectie verder met de bepaling van genexpressiemarkers. Verdoof hiervoor zebravislarven met 0,02% tricaïne (zoals vermeld in stap 3.2).
- Gebruik twee spuiten van 1 ml om de kopgedeelten van de larven (40 larven per groep) te scheiden zonder de oog- en dooierzakgebieden (figuur 2E).
- Extraheer RNA uit de larvale kopgedeelten.
- Homogeniseer voor RNA-extractie het kopgedeelte met 200 μL RNA-extractiereagens (zie Materiaaltabel) met behulp van een weefselslijper (zie Materiaaltabel) bij een rotatiesnelheid van 11.000 tpm gedurende 5 s.
- Voer RNA-extractie uit met behulp van de chloroform-isopropanol-methode. Voeg hiervoor 40 μL chloroform toe, schud de buizen krachtig en incubeer ze bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Breng de waterige fase over in een verse buis (ongeveer 100 μL) en voeg 100 μL isopropanol toe. Incubeer gedurende 10 minuten en centrifugeer vervolgens bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
- Voeg 200 μL 75% ethanol toe om de RNA-pellet te wassen. Vortex de monsters kort en centrifugeer vervolgens bij 7500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en was de RNA-pellet opnieuw.
- Droog de RNA-pellet gedurende 5-10 minuten aan de lucht en voeg vervolgens 30 μL RNase-vrij water toe om de RNA-pellet op te lossen. Controleer de zuiverheid (absorptieverhouding bij 260 nm en 280 nm) en de integriteit van RNA met behulp van een microvolumespectrofotometer (zie Materiaaltabel).
- Synthetiseer cDNA uit het RNA dat in stap 6.3 is geëxtraheerd, met behulp van reverse transcriptase met willekeurige primers (zie Materiaaltabel).
- Voeg 1 μL willekeurige primers, 1 μL dNTPs, 1 μg RNA en gedestilleerd water (totaal volume tot 12 μL) toe aan een nucleasevrije buis. Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten tot 65 °C en koel snel af op ijs.
- Voeg 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNase-remmer, 4 μL 5× eerstestrengbuffer en 1 μL M-MLV reverse transcriptase (totaal volume: 20 μL) toe aan de buis. Meng voorzichtig en incubeer de buis bij 25 °C gedurende 2 min, gevolgd door 42 °C gedurende 50 minuten. Activeer de reactie door gedurende 15 minuten op 70 °C te verwarmen.
- Voer real-time PCR uit op een qPCR-systeem (zie Tabel van materialen) met behulp van een in de handel verkrijgbare RT-qPCR-kit (zie Tabel van materialen) om de expressie van de doelgenen (IL-1β, IL-6 en TNF-α) te bepalen. Het reactiemengsel (20 μL) bevatte 10 μL SYBR groen, 0,4 μL ROX referentiekleurstof, 0,8 μL elk van de voor- en achteruit primers, 6 μL ddH2O en 2 μL template cDNA (1 μg). Voer PCR-versterking uit onder de omstandigheden: 95 °C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 34 s, en met een dissociatiefase van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 60 s en 95 °C gedurende 15 s.
- Normaliseer de mRNA-niveaus van de doelgenen naar die van een huishoudgen, rekfactor 1 α (Ef1α). Bereken de expressieniveaus voor elk doelgen met behulp van de 2−ΔΔCT-methode33. De primersequenties van elk gen worden beschreven in tabel 2.
- Homogeniseer voor de bepaling van stikstofmonoxide het hoofdgedeelte (verkregen in stap 6.2) in 100 μL koud PBS met behulp van een weefselslijper. Centrifugeer de resulterende PBS- en hoofdgedeeltesuspensie bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Verzamel de lysaten en voer nitrietconcentratietest34 uit met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie materiaaltabel).
7. Zebravis locomotief gedragstest
- Breng na 24 uur na LPS-hersenventrikelinjectie de zebravislarven individueel over naar de putten van een vierkante microplaat met 96 putten. Voeg 300 μL E3-medium toe aan elke put en incubeer vervolgens de larven gedurende 4 uur om aan de testplaat te acclimatiseren.
- Breng de met larven geladen microplaat over naar de volgdoos van zebravissen (zie Materiaaltabel). Schakel de lichtbron in en incubeer de larven vervolgens gedurende 30 minuten in de testbox om de omgeving te acclimatiseren.
- Monitor en registreer het gedrag van de zebravis met behulp van een geautomatiseerd videovolgsysteem. Noteer 12 sessies (elk 5 min, totaal 1 uur) voor elke zebravis. Definieer de totale afstand (bestaat uit inactieve, kleine en grote afstanden) als de afstand (in mm) die elke vis heeft verplaatst tijdens een volgperiode van 60 minuten.
8. Statistische analyse
- Statistische analyses uitvoeren met behulp van standaard analysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Voer statistische analyse uit van verschillen tussen twee groepen met behulp van gewone eenrichtings-ANOVA. Bereken de correlatiecoëfficiënt van Pearson om de sterkte van correlaties te beoordelen. P < 0,05 werd in alle analyses als significant beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven workflow presenteert een nieuwe, snelle en efficiënte methodologie voor het induceren van LPS-gemedieerde neuro-inflammatie en neurotoxiciteit bij zebravislarven. In dit beschreven protocol werden 5 dpf zebravissen geïnjecteerd met LPS (figuur 1) in hersenventrikels met behulp van een micro-injector (figuur 2A-C). Succesvolle injectie in de hersenkamer werd geverifieerd met behulp van 1% Evans blauwe vlek (figuur 2D). De kop van de zebravis werd gescheiden van zijn ogen en lichaam met behulp van spuiten (figuur 2E) om elke invloed van inflammatoire cytokine-expressie en stikstofmonoxideafgifte in het lichaam van de zebravis op de bepaling van neuro-inflammatie en neurotoxiciteit in de hersenen uit te sluiten.
Hetzelfde volume PBS (als LPS) werd geïnjecteerd in het ventriculaire gebied van de hersenen van de zebravis als een schijnbediening. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de controle- en schijngroepen in de neuronen, met name uit de voorste groep raphekernen (Ra) (figuur 3A-C), fluorescentie geïntegreerde dichtheid van de hersenneuronen (figuur 3D, E), de totale bewegingsafstand van de zebravis (figuur 4A, B), NO-productie en mRNA-expressie van pro-inflammatoire cytokines (TNF-α, IL-6 en IL-1β) (figuur 4A-D) en rekrutering van neutrofielen in het larvale zebravisbrein (figuur 6A,B). Deze resultaten toonden aan dat een goede micro-injectie geen neurotoxiciteit en neuro-inflammatie veroorzaakt bij zebravissen.
Na behandeling gedurende 24 uur veroorzaakte hersenventrikelinjectie van LPS neurotoxiciteit bij zebravissen. LPS (1-5 mg/ml) veroorzaakte een significant verlies van Ra-neuronen in de hersenen van Tg (ETvmat2:GFP) larvale zebravissen in vergelijking met de controle- en schijngroepen (figuur 3A-C). De transgene lijn elav13:mCherry zebravis schetst de neuronale cellen met het nucleaire rode fluorescerende eiwit35. Zoals te zien is in figuur 3D, E, leidde 2,5-5 mg / ml LPS tot significante veranderingen in de fluorescentie-geïntegreerde dichtheid van de hersenneuronen in deze larvale zebravislijn. De 1 mg/ml LPS-injectiegroep vertoonde echter geen effect op de fluorescentie-geïntegreerde dichtheid van de hersenneuronen in vergelijking met de controle- en schijngroepen. Verder veroorzaakte 5 mg/ml LPS een voortbewegingsdeficiëntie (figuur 4A) en verminderde de totale bewegingsafstand van zebravissen gedurende een volgperiode van 60 minuten (figuur 4B). De resultaten toonden aan dat 1-2,5 mg / ml LPS verlies van neuronen kon veroorzaken, maar geen significante locomotiedeficiëntie.
Bovendien kan hersenventrikelinjectie van LPS ook de ontstekingsreactie in de hersenen van zebravissen activeren. NO-productie (figuur 5A) en mRNA-expressie van pro-inflammatoire cytokines (TNF-α, IL-6 en IL-1β) (figuur 5B-D) in de kop van zebravislarven waren verhoogd bij 2,5-5 mg/ml LPS-behandeling in vergelijking met de expressie in de controle- en schijngroepen. Na 1-5 mg/ml LPS-injectie werd de rekrutering van neutrofielen in de hersenen van larvale zebravissen waargenomen (figuur 6A), wat resulteerde in een significante toename van het aantal neutrofielen in het hersengebied van de Tg(mpo:EGFP) zebravis (figuur 6B).
| Stap | Bedrijfstijd (sec) | Warmteniveau | Actie |
| T1 | L> | H80-89 | P1L005 |
| T2 | 1.6-3 | H00 | |
| T3 | L> | H00 | P2L001c |
| T4 | 3 | H00 | KOEL |
| T5 | 0 | H00 |
Tabel 1: Vijfstappenprotocol voor het trekken van glazen capillaire buisjes.
| Naam primer | Volgorde | |
| IL-1β vooruit | 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3' | |
| IL-1β achteruit | 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3' | |
| IL-6 vooruit | 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3' | |
| IL-6 achteruit | 5'-TCTTTCCCTCTTTTCCTCCTG-3' | |
| TNF-α vooruit | 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3' | |
| TNF-α achterzijde | 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3' | |
| Ef1α vooruit | 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3' | |
| Ef1α achteruit | 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3' | |
Tabel 2: Primers die in real time qPCR worden gebruikt.
Figuur 1: Algemene structuur van lipopolysaccharide (LPS). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Micro-injectie-opstelling, lichaamshouding en positie van zebravissen, en scheiding van het hoofdgedeelte. (A) Glazen naaldselectie: gebruik een pincet om de punt van een vooraf getrokken naald onder de microscoop te snijden, om een naald te verkrijgen met een vergelijkbare opening als weergegeven in de figuur. (B) Pas de brandpuntsafstand van de microscoop aan, zodat het ventriculaire gebied van zebravislarven kan worden waargenomen bij hoge vergroting (omlijnd in zwart). Lichtblauwe cirkels geven de injectieplaats aan. (C) De gemonteerde larven moeten worden georiënteerd met de hersenzijde naar boven voor toegang tot de naald (hersentectum aangegeven door een rode cirkel). (D) Demonstratie van succesvolle ventriculaire injectie met Evans blauw in de hersenen van zebravislarven. (E) Zebraviskopgedeelte zonder oog- en dooierzakgebieden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Hersenventrikelinjectie van LPS ablaat neuronen na 24 uur in zebravislarven. (A) (Top) Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van vmat2:GFP-zebravis na behandeling met verschillende concentraties LPS (rode haakjes duiden op raphe-kernen [Ra] neuronen; schaalbalk = 265,2 μm). (Onder) Ra neuronale regio werd vergroot om de morfologische visualisatie te verbeteren. (B,C) Gemiddelde fluorescentie-intensiteit en lengte van het Ra-neurongebied in vmat2: GFP-zebravislarven. (D,E) Representatieve morfologie (schaalbalk = 265,2 μm) en gemiddelde fluorescentie-intensiteit van Tg(elavl3:mCherry) zebravis hersenneuronen. Gegevens worden uitgedrukt als een percentage van de controlegroep. *P < 0,05 en **P < 0,01 versus controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hersenventrikelinjectie van LPS induceert locomotiedeficiëntie na 24 uur bij zebravislarven. (A) Representatieve patronen van zebravisbewegingssporen. In de digitale trackingkaart wordt beweging met hoge snelheid weergegeven door rode lijnen (> 6,6 mm / s); beweging bij gemiddelde snelheid wordt weergegeven door groene lijnen (3,3−6,6 mm/s); beweging bij lage snelheid wordt weergegeven door zwarte lijnen (< 3,3 mm/s). (B) Kwantitatieve analyse van de gemiddelde totale afstand die de zebravis in 60 min. *P < 0,05 ten opzichte van de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Hersenventrikelinjectie van LPS verhoogt pro-inflammatoire mediatoren. (A) Stikstofmonoxide niveaus werden gemeten met behulp van Griess reagens. (B-D) De genexpressieniveaus van interleukine-6 (IL-6), interleukine-1β (IL-1β) en tumornecrosefactor-α (TNF-α) in de zebraviskop werden onderzocht door qPCR. *P < 0,05 en **P < 0,01 versus controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: LPS hersenventrikelmicroinjectie leidt tot de rekrutering van neutrofielen in de hersenen van zebravissen na 24 h. (A) Migratie van neutrofielen (gebied binnen de rode cirkel) in de kop van larven na LPS-hersenventrikelinjectie (schaalbalk = 851,1 μm). (B) Het aantal neutrofielen in larvenkoppen na LPS-hersenventrikelinjectie. *P < 0,05 en **P < 0,01 versus controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Onbewerkte gegevens Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een toenemende hoeveelheid epidemiologische en experimentele gegevens impliceert chronische bacteriële en virale infecties als mogelijke risicofactoren voor neurodegeneratieve ziekten36. De infectie veroorzaakt de activering van ontstekingsprocessen en immuunresponsen van de gastheer37. Zelfs als de reactie fungeert als een verdedigingsmechanisme, is overactiveerde ontsteking schadelijk voor neurogenese en staat de ontstekingsomgeving de overleving van pasgeboren neuronen niet toe38. Als gevolg hiervan veroorzaakt het schade aan neuronale functies en levensvatbaarheid van de gastheer. Studies tonen aan dat ontsteking een belangrijke rol speelt in de pathofysiologie van neurodegeneratie39.
Als een vaak bestudeerd pathogeen endotoxine is LPS betrokken bij de remming van neurogenese en neurodegeneratie. LPS-activering van ontstekingsprocessen schaadt de neurogenese aanzienlijk, gedeeltelijk door de productie van NO, TNF-α, IL-6 en IL-1β40. Een groeiend aantal bewijzen toont aan dat LPS gedragstekorten en neuronaal verlies veroorzaakt en de progressie van neurogenese beïnvloedt wanneer het centraal wordt geïnjecteerd in neurodegeneratieve knaagdiermodellen10,38. Zebravismodellen zijn op grote schaal gebruikt als alternatieve experimentele modellen om immuunresponsen41 te bestuderen en nieuwe ontstekingsremmende geneesmiddelen te screenen. Het aangeboren en adaptieve immuunsysteem van zebravissen is vergelijkbaar met dat van zoogdieren42. Bovendien hebben sommige studies verschillende inflammatoire cytokines en receptoren geïdentificeerd die aanwezig zijn in zoogdieren in de zebravis CNS43. Eerdere studies suggereren dat het onderdompelen van zebravisembryo's / larven in LPS of het injecteren van LPS in de dooier van zebravislarven de immuunrespons kan induceren en pro-inflammatoire factoren geassocieerd met ontsteking kan verhogen44,45. Het specifieke effect van LPS op het zenuwweefsel van zebravissen en op de inductie van neuro-inflammatie is echter nog niet bekend.
Hoewel knaagdiermodellen veel voordelen hebben ten opzichte van andere diermodellen, zijn hun beperkingen in termen van real-time in vivo beeldvorming en medicijnscreening duidelijk. In vivo beeldvorming wordt veel gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel en pathologische hersenveranderingen als een krachtig en niet-invasief hulpmiddel46,47. Vanwege de optische transparantie van zebravisembryo's en larven zijn ze zeer geschikt voor live beeldvormingsexperimenten van hersenobservatie48,49. Met name de kleine omvang van zebravissen en hun vermogen om duizenden embryo's te produceren, betekenen dat high-throughput geneesmiddelenscreening kan worden uitgevoerd met zebravisembryo's of larven50,51. Bovendien kunnen robotmicro-injecties met ontwikkelingen in wetenschap en technologie nauwkeurig en effectief worden afgeleverd en worden gebruikt om grote hoeveelheden embryo's of larven te injecteren52,53. De toepassing van het microrobotische injectiesysteem op neuronaal onderzoek, voor tijdige injectie van materialen in grote aantallen embryo's of larven, zal grootschalige screening van biomoleculen en medicijnverbindingen vergemakkelijken.
In deze studie werden zebravissen met 5 dpf geïnjecteerd met LPS in een concentratie van 2,5-5 mg / ml; dit werd bepaald als de optimale conditie voor de ontwikkeling van neuro-inflammatiemodellen. Voor zover wij weten is deze methodiek niet beschreven in de literatuur. Bijgevolg was hersenventrikelmicro-injectie van LPS in zebravislarven in staat om verlies van neuronen en locomotiedeficiëntie te veroorzaken. Bovendien toonden onze resultaten aan dat LPS-geïnduceerde neuro-inflammatie de niveaus van pro-inflammatoire mediatoren zoals NO, TNF-α, IL-6 en IL-1β verhoogt en leidt tot de rekrutering van neutrofielen in de larvale zebravishersenen na 24 uur na injectie. In andere diermodellen kan LPS-injectie ook de ontwikkeling van ontstekingen bevorderen en neuropathologische veranderingen in de hersenen veroorzaken 13,54. De resultaten van deze studie bevorderen ons begrip van neuro-inflammatoire paden. Bij deze methode moet worden opgemerkt dat de opening van naalden voor micro-injectie niet te groot mag zijn om hersenbeschadiging veroorzaakt door mechanische werking te voorkomen, en dat een redelijke hoeveelheid kracht moet worden uitgeoefend om te voorkomen dat de larven worden beschadigd. Bovendien is het belangrijk om het hoofd te scheiden van de ogen en het lichaam van zebravissen voor de bepaling van ontstekingsfactoren en stikstofmonoxide, omdat dit zal helpen bij het verkrijgen van directionele resultaten die specifiek de neuro-inflammatie weerspiegelen die wordt geïnduceerd door LPS-hersenventrikelinjectie.
Een klein nadeel van deze methode is dat, vanwege de kleine omvang van zebravislarven, de hoeveelheden biomoleculen zoals totaal mRNA verkregen door homogenisatie en extractie lager zijn dan die van het muismodel. Zebravissen kunnen echter vaak paaien met enkele honderden eieren per week. Het verhogen van het aantal zebravislarven dat in elke groep wordt gebruikt, kan voldoende hoeveelheden geëxtraheerde biomoleculen opleveren voor verschillende biochemische testen. Kortom, deze methode induceert neurotoxiciteit en een immuunrespons in de larvale zebravishersenen. Door de transparantie van zebravissen kunnen veranderingen in de larvale levende zebravishersenen beter worden begrepen via in vivo beeldvorming. De hier beschreven techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het snel en efficiënt evalueren van mogelijke anti-neuro-inflammatoire geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Science and Technology Development Fund (FDCT) van Macao SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 en 0016/2019/AKP), Onderzoekscommissie, Universiteit van Macau (MYRG2020-00183-ICMS en CPG2022-00023-ICMS) en National Natural Science Foundation of China (nr. 81803398).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al.
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O.
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J.
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
