Summary
Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.
Abstract
A micróglia são as células imunes residentes de origem mielóide que mantêm a homeostase no microambiente cerebral e tornaram-se um jogador-chave em múltiplas doenças neurológicas. Estudar a micróglia humana na saúde e na doença representa um desafio devido ao suprimento extremamente limitado de células humanas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de indivíduos humanos podem ser usadas para contornar essa barreira. Aqui, é demonstrado como diferenciar iPSCs humanas em células semelhantes à micróglia (iMGs) para experimentação in vitro . Esses iMGs exibem as propriedades esperadas e fisiológicas da micróglia, incluindo morfologia semelhante à microglia, expressão de marcadores adequados e fagocitose ativa. Além disso, é fornecida documentação para isolar e marcar substratos de sinaptossomos derivados de neurônios motores inferiores derivados de iPSC humanos (i3LMNs). Um ensaio de imagem longitudinal de células vivas é usado para monitorar o engolfamento de sinaptossomos humanos marcados com um corante sensível ao pH, permitindo investigações da capacidade fagocítica do iMG. Os protocolos aqui descritos são amplamente aplicáveis a diferentes campos que estão investigando a biologia da micróglia humana e a contribuição da micróglia para a doença.
Introduction
As microglias são as células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel crucial no desenvolvimento do SNC. A micróglia também é importante no cérebro adulto para manter a homeostase e responder ativamente a processos de trauma e doença. Evidências cumulativas mostram que a micróglia é um dos principais contribuintes para a patogênese de múltiplas doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas 1,2. Embora o conhecimento atual sobre a biologia microglial tenha sido predominantemente derivado de modelos de camundongos, estudos recentes têm elucidado diferenças importantes entre a micróglia murina e humana, ressaltando a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para estudar a genética e as funções biológicas da micróglia humana 3,4. O isolamento da micróglia do tecido primário dissecado pode modificar severamente as propriedades da micróglia5, potencialmente confundindo os resultados adquiridos com essas células. O objetivo geral deste método é diferenciar as iPSCs humanas em iMGs, fornecendo assim um sistema de cultura celular para estudar a micróglia humana sob condições basais. Além disso, um ensaio de fagocitose usando um sistema de modelo totalmente humano é incluído aqui como um meio de estudar a funcionalidade dos iMGs, tanto como uma medida de controle de qualidade quanto para avaliar a disfunção de iMG no contexto da doença.
Múltiplos protocolos para diferenciação da micróglia a partir de iPSCs têm surgido recentemente na literatura 6,7,8,9,10. As desvantagens potenciais de alguns protocolos incluem períodos prolongados ou longos de diferenciação, a adição de múltiplos fatores de crescimento e/ou procedimentos experimentais complexos 6,9,10. Aqui, demonstra-se um método de diferenciação "user-friendly" que recapitula aspectos da ontogenia da micróglia por meio da diferenciação de iPSCs em células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)7,11. Os PMPs são gerados conforme descrito anteriormente, com algumas otimizações aqui apresentadas12. Os PMPs imitam macrófagos derivados de saco vitelino independentes de MYB, que dão origem à micróglia durante o desenvolvimento embrionário, invadindo o cérebro antes do fechamento da barreira hematoencefálica13. Para diferenciar terminalmente PMPs em iMGs, utilizamos um método de monocultura rápido e simplificado baseado em protocolos de Haenseler et al. e Brownjohn et al., com algumas modificações para gerar um método eficiente de diferenciação de micróglias no qual os iMGs expressam robustamente marcadores enriquecidos com microglia 7,8. Este método de diferenciação pode ser reproduzido em laboratórios com experiência na cultura de iPSCs e com objetivos de pesquisa com o objetivo de estudar a biologia da micróglia usando um sistema de modelo humano.
A micróglia derivada da iPSC representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar as funções canônicas microgliais, incluindo a fagocitose. As micróglias são os fagócitos profissionais do cérebro e do SNC, onde limpam detritos celulares, proteínas agregadas e mielina degradada14. A micróglia também atua no remodelamento sináptico por engolfamento de sinapses e na defesa contra infecções externas por meio da fagocitose de patógenos15,16. Neste protocolo, a fagocitose por iMGs é avaliada usando sinaptossomos humanos como material para engolfamento de iMG. Para este fim, uma descrição para isolar sinaptossomos derivados de i3LMNs humanos é descrita. Os sinaptossomos humanos derivados de LMN i3são marcados com um corante sensível ao pH que permite a quantificação de sinaptossomos localizados dentro de compartimentos ácidos durante o processamento e degradação de fagossomos in vitro. Um ensaio de fagocitose usando microscopia de células vivas é mostrado para monitorar o processo dinâmico de engolfamento da micróglia em tempo real. Este ensaio funcional estabelece uma base para investigar possíveis defeitos na fagocitose microglial na saúde e na doença usando um sistema humano completo.
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Protocol
NOTA: Todos os reagentes utilizados neste protocolo devem ser estéreis, e todas as etapas devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança sob condições estéreis. Todas as linhas iPSC, bem como os meios de manutenção e diferenciação, estão descritos na Tabela de Materiais. O método de diferenciação da micróglia ilustrado a seguir baseia-se em protocolos publicados anteriormente7,8,12 com novas modificações aqui descritas.
1. Diferenciação da micróglia
NOTA: Uma visão geral do protocolo é resumida na Figura 1.
- Cultura induzida de células-tronco pluripotentes (iPSC)
NOTA: Mais detalhes descrevendo as técnicas de cultura de iPSC podem ser encontrados em outros lugares17.- Descongelamento e manutenção
- Preparar o meio iPSC, alíquota do meio e armazenar a -20 °C por até 6 meses. Descongele as alíquotas durante a noite a 4 °C e utilize-as até 1 semana. Deixar o meio à temperatura ambiente durante, pelo menos, 1 h antes da utilização.
- Revestir os poços de uma placa de 6 poços adicionando 1 mL de 10 μg/mL de laminina 521 diluída em DPBS contendo cálcio e magnésio18. Manter as placas numa incubadora a 37 °C e a 5% de CO 2 durante, pelo menos,2 h ou, de preferência, durante a noite. Uma vez diluída, conservar a laminina a 4 °C durante 3 meses.
- Preparar a solução-mãe do inibidor da roquinase de 10 mM Y27632 (inibidor de ROCK) diluindo em água estéril. Faça alíquotas de uso único da solução inibidora de ROCK e armazene-as a -20 °C por até 1 ano.
- Preparar EDTA 0,5 mM diluindo a solução-mãe de EDTA 0,5 M em DPBS.
- Para descongelar um frasco para injetáveis de iPSCs congeladas, coloque o frasco para injetáveis em banho-maria a 37 °C até que esteja praticamente descongelado. Transfira imediatamente o conteúdo do frasco para injetáveis para um tubo cónico de 15 ml contendo 4 ml de meio iPSC. Centrífuga a 500 × g durante 1 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células adicionando 1 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM lentamente contra a parede do tubo para evitar a perturbação das colônias.
- Adicionar 1,5 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM a cada um dos poços revestidos e transferir as colônias ressuspensas gota a gota para os poços que contêm o meio.
NOTA: Use de 5 a 7 gotas da etapa 1.1.1.6 para manutenção da cultura, mas ajuste a densidade de semeadura ideal para cada linha iPSC. - Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para frente. Colocar as células numa incubadora a 37 °C e a 5% de CO2. No dia seguinte, substitua completamente o meio adicionando meio iPSC fresco sem inibidor de ROCK.
- Para manutenção, troque o meio todos os dias até que as células atinjam 80% de confluência.
NOTA: As células podem ser mantidas sem alterar o meio por 2 dias se o meio iPSC usado permitir um horário de alimentação flexível. É aconselhável limitar isso a uma vez por passagem e somente se as células forem menos de 50% confluentes.
- Dividir
- Aspirar o meio e lavar as células com 1 mL de DPBS (sem cálcio e magnésio).
- Para desalojar as células, adicione 1 mL de EDTA 0,5 mM e incube por 2-3 min à temperatura ambiente até que as bordas das colônias celulares se levantem da superfície do poço. Lave as células novamente com DPBS e adicione 1 mL de meio iPSC.
- Dissociar as colônias de células, raspando-as suavemente usando um elevador de células. Raspe cada área do poço apenas uma vez para evitar perturbar as colônias.
NOTA: Métodos alternativos para desalojar as colônias do poço podem ser encontrados em outros lugares17. - Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, colete as células e transfira-as gota a gota em uma proporção de 1:6 (células para meio) em poços pré-revestidos (como mencionado na etapa 1.1.1.2) contendo 1,5 mL de meio iPSC.
- Descongelamento e manutenção
- Diferenciação de iPSC para células semelhantes à micróglia (iMGs)
NOTA: As pequenas moléculas e os fatores de crescimento são dissolvidos em albumina sérica bovina a 0,1% filtrada por estéril, em DPBS, até uma concentração de estoque 1.000x maior que a concentração final. Recomenda-se diferenciar iPSCs em iMGs durante as primeiras passagens. Recomenda-se a cariotipagem de rotina das linhas de iPSC.- Preparar a solução de revestimento padrão
- Descongelar a solução-mãe de um reagente de revestimento de matriz extracelular no gelo a 4 °C durante a noite.
- Pré-arrefecer tubos de microcentrífuga e pontas de pipeta de filtro a 4 °C.
- Aliquota 250 μL do reagente de revestimento da matriz extracelular concentrada em cada tubo e coloque imediatamente no gelo. Conservar as alíquotas a -20 °C.
- Para preparar a solução de revestimento, descongelar uma das alíquotas do reagente de revestimento da matriz extracelular no gelo a 4 °C durante a noite.
- Adicione 50 mL de DMEM-F12 gelado otimizado para o crescimento de células-tronco pluripotentes embrionárias humanas e induzidas (referidas como DMEM-F12) a um tubo cônico pré-resfriado e mantenha-o no gelo.
- Resfrie uma ponta de pipeta de 1 mL pipetando DMEM-F12 gelado para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, use imediatamente a ponta da pipeta para transferir 250 μL do reagente de revestimento da matriz extracelular para o tubo cônico contendo o meio DMEM-F12.
NOTA: A solução de revestimento padrão pode ser armazenada por 2 semanas a 4 °C.
- Formação do corpo embrionário (EB)
- Prepare o meio EB que pode ser mantido a 4 °C por até 4 dias.
- Uma vez que as iPSCs tenham atingido 80% de confluência, dissociar as colônias lavando com 1 mL de DPBS e adicionando 1 mL de um reagente de dissociação por 2 min a 37 °C. Desaloje as colônias usando um elevador de células raspando várias vezes para criar uma suspensão de célula única. Colete as células e transfira tudo para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de DPBS.
- Centrifugar as células a 500 × g por 1 min, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio EB. Tomar 10 μL de células e diluir 1:1 com azul de tripano. Conte as células com um hemacitômetro e, com base na contagem de células, dilua o estoque celular até uma diluição final de 10.000 células por 100 μL. Para células de chapeamento, adicione 100 μL das células diluídas por poço em uma placa de baixa aderência, de fundo redondo, de 96 poços.
NOTA: Geralmente, 48 poços da placa de 96 poços podem ser obtidos de cada poço 80% confluente de iPSCs. - Centrifugar a placa a 125 × g durante 3 min e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante 4 dias. Realize uma mudança de meio meio meio médio no dia 2 usando uma pipeta multicanal e coletando suavemente 50 μL de meio antigo e, em seguida, adicionando de volta 50 μL de meio EB fresco.
NOTA: No dia 4, as iPSCs formarão estruturas celulares esféricas denominadas EBs, conforme descrito na seção de resultados. O processo de diferenciação do EB pode ser estendido até 7 dias, se necessário.
- Geração de precursores primitivos de macrófagos (PMPs)
- Prepare o meio base PMP, filtro estéril, e armazene-o a 4 °C por até 1 mês.
- Revestir os poços de uma placa de 6 poços adicionando 1 mL de solução de revestimento Matrigel gelada e incubar a 37 °C e 5% de CO 2 por pelo menos2 h ou de preferência durante a noite.
- No dia 4 de diferenciação do EB, transfira os EBs para os poços revestidos de Matrigel coletando os EBs com pontas de pipeta de 1 mL (usando uma pipeta). Pipeta para cima e para baixo uma ou duas vezes para desalojar os EBs do poço. Segure a placa de 6 poços em um ângulo inclinado para permitir que os EBs se estabeleçam na borda do poço.
NOTA: Nove ou dez EBs podem ser banhados por poço revestido. - Uma vez que todos os EBs tenham se estabilizado, pipete suavemente e remova o meio antigo usando uma ponta de pipeta de 1 mL, mantendo os EBs na borda do poço. Adicione 3 mL de PMP em meio completo recém-preparado a cada poço. Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para frente. Colocar a placa na incubadora a 37 °C e a 5% de CO2.
- Não perturbe a placa por 7 dias para permitir que os EBs se fixem ao fundo do poço. Após esse tempo, execute uma mudança de meio médio usando o meio completo PMP.
NOTA: Neste ponto, a maioria dos EBs deve ser anexada à placa. Quaisquer EBs flutuantes podem ser removidos. - Após 5-7 dias, inspecione os EBs sob um microscópio de campo de luz com ampliação de 4x para garantir que eles estejam presos ao fundo dos poços. Alterar o suporte descrito no ponto 1.2.3.5. No dia 21, realizar uma troca completa do meio com 3 mL de meio completo de PMP.
NOTA: Progenitores mieloides flutuando no meio podem ser evidentes neste ponto. Essas células devem ser descartadas durante a mudança do meio. - No dia 28, procure células redondas referidas como PMPs no sobrenadante e colete o meio contendo os PMPs usando uma pipeta de 10 mL e pipettor automático. Tome cuidado para não atrapalhar os EBs. Transferir os PMPs e o meio para um tubo cónico de 15 ml e proceder conforme descrito no passo 1.2.4.
NOTA: Normalmente, PMPs da mesma linha iPSC podem ser coletados de cinco poços de uma placa de 6 poços e agrupados em um único tubo cônico de 15 mL. - Adicione 3 mL de meio completo de PMP fresco para manutenção adicional dos EBs. À medida que os PMPs emergem continuamente dos EBs por mais de 3 meses, colete-os a cada 4-7 dias (não permita que o meio mude de cor para um tom amarelo), conforme descrito nas etapas 1.2.3.7 e 1.2.3.8.
NOTA: Embora os PMPs possam ser coletados por vários meses, eles podem mudar seu fenótipo ao longo do tempo.
- Diferenciação para iMGs
- Preparar o meio base iMG (Tabela de Materiais), filtrar estérilmente e armazená-lo a 4 °C durante até 3 semanas.
- Uma vez que os PMPs tenham sido coletados em um tubo cônico de 15 mL, centrifuga-os a 200 × g por 4 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as PMPs usando 1-2 mL de meio basal iMG. Conte as células usando um hemocitômetro tomando uma pequena alíquota e diluindo 1:1 com azul de tripano.
NOTA: 0,5-1,5 × 106 PMPs são normalmente obtidos a cada semana, dependendo da linha iPSC e da idade da cultura EB. - Centrifugar o resto das células novamente a 200 × g durante 4 min. Diluir os PMPs até à concentração desejada de modo a que as células sejam chapeadas a uma densidade de ~105/cm2 em placas tratadas com cultura celular utilizando meio iMG completo acabado de preparar. Realize uma mudança de meio meio meio usando o meio completo iMG recém-preparado a cada 3-4 dias ao longo de 10-12 dias para permitir a diferenciação terminal.
NOTA: Neste ponto, as células devem adquirir morfologia semelhante à da micróglia. Para confirmar o comprometimento das PMPs com o destino da micróglia, a análise de imunofluorescência é realizada para corroborar a expressão de marcadores enriquecidos com microglia, como o receptor purinérgico P2RY12 e a proteína transmembrana 119 (TMEM119)9. - Para preservar a saúde e viabilidade celular, realizar todos os experimentos entre os dias 10 a 12 de diferenciação de iMG.
- Preparar a solução de revestimento padrão
2. Ensaio de fagocitose utilizando sinaptossomos humanos derivados de neurônios motores
- Diferenciação mediada pelo fator de transcrição de neurônios motores inferiores derivados de iPSC (i3LMNs)
NOTA: Uma linha WTC11 com inserção estável do do fator de transcrição induzível hNIL contendo os fatores de transcrição neurogenina-2 (NGN2), ilhota-1 (ISL1) e LIM homeobox 3 (LHX3) no locus de porto seguro CLYBL foi usada para o processo de diferenciação, conforme descrito anteriormente.17. A linha iPSC foi mantida conforme descrito na etapa 1.1.1, mas com as condições de revestimento descritas na etapa 1.2.1. Qualquer reagente de revestimento de matriz extracelular pode ser usado para cultivar iPSCs que serão usadas para diferenciação neuronal, uma vez que a laminina 521 não é necessária. Todos os meios são equilibrados à temperatura ambiente por pelo menos 1 h antes do uso.- Revestir as placas de 10 cm com 5 ml de solução-padrão de revestimento, conforme descrito na etapa 1.2.1.
NOTA: Aqui, foram utilizados pratos de 3-4 10 cm por diferenciação. - Preparar o meio Base de Indução, filtro estéril, e guardá-lo a 4 °C durante um período máximo de 3 semanas.
- Prepare o meio neurónio, filtro estéril, e guarde-o a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
- Prepare o tampão de borato misturando ácido bórico 100 mM, tetraborato de sódio 25 mM e cloreto de sódio 75 mM em água estéril. Ajuste o pH para 8,5 e filtre-o estéril.
- Uma vez que as iPSCs tenham atingido 80% de confluência, lave as células com DPBS e desaloje as colônias adicionando 0,5 mM de EDTA.
NOTA: Dois poços são geralmente suficientes para cada prato de 10 cm. - Incubar as células por 4-5 min à temperatura ambiente. Retire o EDTA e adicione 3 mL de DMEM/F12 com HEPES a cada poço.
- Raspe as células usando um elevador de células e use uma pipeta de 10 mL para remover as células do fundo do poço, pipetando suavemente para cima e para baixo 2-3x.
- Recolher as células num tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 × g durante 3 min.
- Ressuspender as células em 3 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM e contá-las usando um hemacitômetro.
- Placa 1,5 × 106 iPSCs em um prato pré-revestido de 10 cm com 12 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM.
- No dia seguinte, retire o meio e lave as células com DPBS. Adicionar 12 mL de meio de Indução Completa recém-preparado para induzir a expressão dos fatores de transcrição.
- No dia 2, revestir pratos de 10 cm com 5 mL de solução de revestimento de neurônios preparados com volumes iguais de 0,1 mg/mL de poli-D-lisina e 1 mg/mL de poli-L-ornitina diluída em tampão borato. Incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.
- No dia 3, lave os pratos revestidos com água estéril 3x, aspirar a água completamente e deixe os pratos secarem inclinando os pratos e deixando-os parcialmente descobertos dentro de um armário de biossegurança por pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
- Uma vez que os pratos tenham secado completamente, revesti-los com 6 mL de meio de Indução Completa suplementado com 15 μg/mL de laminina e 40 μM de BrdU por pelo menos 1 h a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: O tratamento com BrdU é recomendado para eliminar as células mitoticamente ativas e, assim, aumentar a pureza das culturas neuronais. Os efeitos do BrdU na saúde neuronal são mínimos. - Tratar as células diferenciadoras com 3 mL de reagente de dissociação por prato de 10 cm e incubar por 3-4 min à temperatura ambiente.
- Adicione 6 mL de DPBS na placa sem remover o reagente de dissociação e pipete as células em solução para cima e para baixo 4-5x com uma pipeta de 10 mL para dissociar as células.
- Recolher a suspensão celular e passá-la através de um filtro celular de 40 μm para um tubo cónico de 50 ml. Adicionar 1 mL de meio de base de indução para enxaguar o filtro.
- Centrifugar as células a 300 × g durante 5 min. Aspirar o meio e ressuspender as células em 3 mL de meio de Indução Completa contendo 40 μM de BrdU.
- Conte as células com um hemocitômetro. Placa de aproximadamente 2,5 × 10 6 células por prato de 10 cm em pratos pré-revestidos, diluindo as células em6 mL de meio de indução completa contendo 40 μM de BrdU sem remover a solução de revestimento adicionada na etapa 2.1.14.
- No dia 4, aspirar o meio, lavar as células 1x com DPBS e adicionar meio de indução completa fresco contendo 40 μM BrdU.
- No dia 6, aspirar o meio, lavar as células 1x com DPBS e adicionar o meio Neuron suplementado com 1 μg/mL de laminina.
- No dia 9, troque 1/3do meio, substituindo-o por um meio Neuron fresco suplementado com 1 μg/mL de laminina.
- Mantenha i 3 LMNs por mais 25 dias, realizando meias mudanças de meio com meio Neuron meio suplementado com 1 μg/mL fresco de laminina a cada3-4dias.
NOTA: Neste momento, i3LMNs devem apresentar uma morfologia neuronal com processos longos. Os neurônios também tendem a formar aglomerados ou aglomerados de células. Uma descrição mais detalhada de como validar a diferenciação de i3LMNs pode ser encontrada em outro lugar17.
- Revestir as placas de 10 cm com 5 ml de solução-padrão de revestimento, conforme descrito na etapa 1.2.1.
- Purificação e rotulagem de sinaptossomas
NOTA: Mantenha condições estéreis e execute todas as etapas dentro de um gabinete de biossegurança.- Lave i3 LMNs duas vezes com DPBS.
- Adicione 2 mL de reagente de lise celular gelada para isolamento de sinaptossomos, incube no gelo por 2 minutos e raspe firmemente os neurônios.
- Transfira o lisado para múltiplos microtubos de 2 mL (~1,5 mL de lisado por tubo) e centrifugar a 1.200 × g por 10 min a 4 °C.
NOTA: Mantenha os tubos no gelo durante todo este procedimento. - Recolher o sobrenadante (eliminar o pellet) e centrifugar a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. Salve e ressuspenda o pellet contendo os sinaptossomos com um volume semelhante (como o lisado original) de 5% de DMSO em DPBS.
NOTA: Os sinaptossomos podem ser imediatamente marcados com um fluoróforo ou armazenados a -80 °C para utilização futura. - Realizar um ensaio proteico de ácido bicinchonínico (BCA) para todos os tubos para avaliar o rendimento total de proteína na preparação dos sinaptossomas.
NOTA: Outros ensaios para medir a concentração de proteína podem ser usados. O rendimento proteico total obtido a partir de diferentes preparações foi incluído na Tabela 1 como referência. Recomenda-se a realização de análise de western blot da preparação dos sinaptossomos para confirmar a presença de proteínas pré-sinápticas e pós-sinápticas. Aqui, o marcador pré-sináptico, sinaptofisina (SYP), e o marcador pós-sináptico, proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD95) foram escolhidos para análise de western blotting, conforme descrito anteriormente19. - Prepare uma solução de bicarbonato de sódio 100 mM em água, ajuste o pH para 8,5 e filtre estéril.
- Solubilizar 1 mg de pó liofilizado do corante sensível ao pH utilizado em 150 μL de DMSO. Fazer alíquotas de utilização única e armazená-las a -80 °C.
- Centrifugar os sinaptossomos a 15.000 × g durante 5 min a 4 °C.
- Diluir até 1 mg de sinaptossomas em 100 μL de solução de bicarbonato de sódio a 100 mM.
- Para rotular os sinaptossomos, adicione 1 μL do corante sensível ao pH reconstituído por 1 mg de sinaptossomos e cubra a reação com folha de alumínio para evitar a exposição à luz. Agitar à temperatura ambiente durante 2 h utilizando um agitador de tubos.
- Adicionar 1 mL de DPBS ao tubo e centrifugar os sinaptossomos marcados a 15.000 × g por 5 min a 4 °C.
- Remova o sobrenadante e execute quatro lavagens adicionais, conforme descrito na etapa 2.2.11.
- Após a lavagem final e o spin, retirar o sobrenadante o máximo possível sem perturbar o pellet e ressuspender os sinaptossomos marcados com DMSO a 5% em DPBS em volume para a concentração desejada (0,7 μg/μL aqui utilizado). Preparar alíquotas de utilização única e conservar a -80 °C. Certifique-se de evitar a exposição à luz aos sinaptossomos rotulados.
- Ensaio de fagocitose de células vivas
- A placa 20-30 × 10 4 PMPs em placas de 96 poços em 100 μL de meio completo iMG e seguir o processo de diferenciação por 10 dias, conforme indicado na etapa 1.2.4.
- No dia do ensaio, preparar a solução de coloração nuclear adicionando 1 gota de uma coloração nuclear para células vivas em 2 mL de meio basal iMG.
- Remover 40 μL de meio por poço da placa de 96 poços e adicionar 10 μL da solução de coloração nuclear usando uma pipeta multicanal. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO 2 durante2 h.
- Descongele os sinaptossomos rotulados no gelo e sonicate suavemente usando um sonicator de água por 1 min. Transfira imediatamente os sinaptossomos de volta ao gelo. Diluir os sinaptossomos marcados em meio completo iMG na proporção de 1 μL de sinaptossomos por 50 μL de meio.
NOTA: A concentração de sinaptossomo é dependente do ensaio e pode exigir otimização. Para manter uma porcentagem relativamente baixa (ou seja, 0,1% ou menos) de DMSO no meio, é aconselhável não adicionar mais de 2 μL de sinaptossomos por poço. - Como controle negativo, pré-tratar alguns dos poços com citocalasina D para inibir a polimerização da actina e, portanto, a fagocitose. Preparar uma solução de 60 μM de citocalasina D em meio iMG completo. Adicionar 10 μL desta solução a cada alvéolo para uma concentração final de 10 μM e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante 30 min.
- Retire a placa da incubadora e incube a 10 °C durante 10 min. Manter a placa sobre gelo e adicionar 50 μL de meio contendo sinaptossomas preparados conforme descrito na etapa 2.3.4.
- Centrifugar a placa a 270 × g durante 3 min a 10 °C e manter a placa sobre gelo até à aquisição por imagem.
- Aquisição e análise de imagens
- Insira a placa em um leitor de imagens de células vivas e selecione os poços a serem analisados.
- Selecione uma lente objetiva de 20x .
- Ajuste o foco, a intensidade do diodo emissor de luz (LED), o tempo de integração e o ganho dos canais de campo brilhante e azul (4',6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI]). A fluorescência dos sinaptossomos deve ser insignificante no momento inicial. Para se concentrar no canal vermelho (RFP), use o canal de campo brilhante como referência. O tempo e o ganho de integração podem variar entre os experimentos; use estas configurações iniciais para o canal vermelho: LED: 4, tempo de integração: 250 e ganho: 5.
- Selecione o número de telhas individuais a serem adquiridas em uma montagem por poço (adquira 16 telhas no centro do poço, imaginando assim aproximadamente 5% da área total do poço). Ajuste a temperatura para 37 °C e o intervalo de tempo desejado para a geração de imagens.
NOTA: As imagens foram adquiridas a cada 1 - 2 h por até 16 h neste estudo. - Abra o software de análise.
- Abra o experimento que contém as imagens. Clique no ícone Redução de dados.
- No menu, escolha Costura de imagem em Processamento de imagens para criar uma imagem completa a partir dos blocos individuais 4 x 4 na montagem com os parâmetros descritos na Tabela 2.
- Depois que as imagens costuradas forem criadas, defina um limite de intensidade usando os canais DAPI e RFP para essas imagens. Abra uma imagem e clique em Analisar; em Análise, selecione Análise Celular e, em Canal de Detecção, escolha uma imagem costurada nos canais DAPI ou RFP. Vá para a guia Máscara e Contagem Primária e estabeleça um valor limite e valores de tamanho de objeto que selecionem corretamente os núcleos da célula no canal DAPI ou o sinal de sinaptossomo no canal RFP. Repita o processo com imagens diferentes até que os parâmetros que podem ser aplicados a todo o experimento sejam otimizados.
NOTA: Os valores sugeridos podem ser encontrados na Tabela 2. - Para contar o número de núcleos, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise de Imagem, selecione Análise Celular. Vá para a guia Máscara e Contagem Primária e, em Canal, selecione as imagens costuradas DAPI e use os parâmetros descritos na Tabela 2.
- Vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Contagem de Células. Para obter a área do sinal do sinaptossomo, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise, selecione Análise Celular.
- Vá para a guia Máscara e Contagem Primária e, em Canal, selecione Imagens costuradas por RFP e use os parâmetros detalhados na Tabela 2.
- Vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Área de Soma de Objetos. Na guia Redução de Dados , clique em OK e permita que o software analise todas as imagens adquiridas.
- Exporte os valores de Área de Soma de Objetos e Contagem de Células para cada ponto de tempo. Divida a Área de Soma do Objeto pela Contagem de Células para calcular a área normalizada por ponto de tempo. Se comparar vários tratamentos ou genótipos, calcule o índice de fagocitose usando a equação (1):
(1) - Salve os resultados e integre os dados.
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Representative Results
Para gerar iMGs utilizando esse protocolo, é importante começar com iPSCs indiferenciadas que apresentem morfologia de colônia compacta com bordas bem definidas (Figura 2A). As iPSCs dissociadas mantidas conforme descrito na seção de formação de EB formarão agregados esféricos, denominados EBs, que crescerão em tamanho até o dia 4 de diferenciação (Figura 2B). Uma vez que os EBs são coletados e banhados nas condições apropriadas para a geração de PMP, eles se ligam às placas revestidas de Matrigel, e uma camada de células se espalhará e circundará os agregados esféricos (Figura 2C). EBs insalubres se desprenderão da placa e devem ser eliminados. Do dia 14 ao 21 da geração de PMP, tipos de células potencialmente diferentes podem surgir e flutuarão no meio; essas células devem ser descartadas durante as mudanças de mídia12. No dia 28, células redondas com uma grande relação citoplasma-núcleo aparecerão em suspensão (Figura 2D), denominadas PMPs. Essas células são produzidas continuamente e podem ser colhidas semanalmente durante as mudanças de meio por até 3 meses. O número de PMPs colhidos a cada semana varia e depende da linhagem iPSC e da idade da cultura; o rendimento geralmente diminui com o tempo. Recomenda-se fortemente a cultura de iPSCs em placas revestidas com laminina 521 em vez de Matrigel, pois o rendimento de PMP é maior quando as iPSCs são mantidas nas condições anteriores, conforme relatado anteriormente e neste estudo (Figura 2E)18.
Após os PMPs terem sido expostos ao meio iMG por 10-12 dias, as células adquirem uma morfologia semelhante à microglia, com um citoplasma pequeno e a presença de processos alongados (Figura 3A). Para verificar a identidade da micróglia, foi realizada coloração por imunofluorescência com anticorpos contra o marcador mielóide molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (IBA1) e os marcadores purificados com microglia receptor purinérgico P2RY12 e proteína transmembrana 119 (TMEM119), conforme descrito anteriormente20 (ver também a Tabela de Materiais). Tipicamente, >95% das células expressam IBA1 e aproximadamente 90% das células expressam P2RY12 e TMEM119 (Figura 3B).
Para avaliar a capacidade fagocítica dos iMGs, foram utilizados i3sinaptossomos humanos derivados de LMN marcados com um corante sensível ao pH. Para verificar se a preparação dos sinaptossomos retém propriedades estruturais canônicas, o enriquecimento do marcador pré-sináptico, sinaptofisina (SYP), e o marcador pós-sináptico, proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD95)19 foram confirmados pela análise de Western blot (Figura 4) realizada conforme descrito antes de20 (ver também a Tabela de Materiais ). Sinaptossomos marcados com um corante sensível ao pH tornam-se fluorescentes após serem engolidos por iMGs e uma vez que estão localizados dentro de compartimentos intracelulares ácidos (ou seja, pH baixo).
No momento inicial, o sinal fluorescente vermelho foi mínimo, pois a maioria dos sinaptossomos ainda não estava fagocitada. Após 30 min, um sinal fluorescente vermelho foi detectado e aumentou ainda mais ao longo do tempo. Às 10 h, o sinal fluorescente vermelho era robusto, pois a maioria dos sinaptossomos havia sido engolida e localizada em compartimentos intracelulares ácidos através do processo de fagocitose (Figura 5A). A citocalasina D é um inibidor da polimerização da actina amplamente utilizado para bloquear a fagocitose. Como esperado, observamos uma forte redução do sinal fluorescente vermelho em iMGs tratados com citocalasina D, indicando que o sinal detectado resulta de eventos fagocíticos. Observamos também que os iMGs apresentam alterações na morfologia após 10 h de fagocitose que não foram detectadas nos iMGs tratados com citocalasina D, possivelmente devido à falta de remodelamento da actina nos iMGs tratados com citocalasina D. Alterações na morfologia da micróglia geralmente estão associadas ao status de ativação2.
Usando o método de quantificação automatizada descrito, medimos a área total do sinal vermelho em cada ponto de tempo e normalizamos para o número de células obtido pela contagem dos núcleos. Os resultados indicam que a área de sinaptossomos engolidos aumentou com o tempo até que um platô foi atingido às 16 h. Como esperado, a área de sinal vermelho das células tratadas com citocalasina D não aumentou com o tempo, uma vez que a fagocitose foi inibida (Figura 5B). Juntos, esses resultados indicam que os iMGs são capazes de fagocitar material relevante para doenças cerebrais e são adequados para estudos funcionais.
Figura 1: Esquema do protocolo para diferenciar iPSCs em células semelhantes à microglia. No dia 0, uma vez que as iPSCs tenham atingido 80% de confluência, as colônias são dissociadas em células únicas e cultivadas em meio EB para induzir a formação de EB. No dia 4, os EBs são coletados e banhados em meio PMP para induzir a geração de PMP. Após 28 dias, os PMPs são coletados e diferenciados terminalmente em iMGs usando o meio iMG. Os PMPs podem ser coletados semanalmente por até 3 meses. Abreviaturas: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; iMGs = células semelhantes à micróglia; EB = corpo embrionário; PMP = precursor primitivo de macrófagos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia celular avaliada por microscopia óptica nos estágios de diferenciação de iPSCs para PMPs. (A) iPSCs mantidas em meio iPSC até 80% de confluência. (B) Corpo embrionário após 4 dias de diferenciação em meio EB. (C) EBs fixados a placas revestidas e (D) PMPs emergentes em suspensão de EBs após 28 dias de cultura em meio PMP. (E) Número de PMPs coletados de ~48 EBs na semana 1 (após 28 dias de diferenciação de PMP) e na semana 12. Os gráficos de barras mostram a média de seis diferenciações independentes (pontos de dados) de duas linhas iPSC diferentes. As estatísticas foram obtidas por ANOVA two-way e teste de comparações múltiplas de Šídák. Barras de escala = 1.000 μm (A), 400 μm (B-D). Abreviaturas: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; iMGs = células semelhantes à micróglia; EB = corpo embrionário; PMP = precursor primitivo de macrófagos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os iMGs diferenciados por este protocolo apresentam características de micróglia de boa-fé após 10 dias de diferenciação terminal. (A) Imagem representativa de campo brilhante de iMGs apresentando morfologia semelhante à microglia. Barra de escala= 400 μm. (B) Imagens representativas de imunofluorescência de iMGs expressando os marcadores mielóides/microglia IBA1, P2RY12 e TMEM119. Barras de escala= 400 μm (A), 50 μm (B). Abreviaturas: iMGs = células semelhantes à micróglia; IBA1 = molécula 1 do adaptador de ligação ao cálcio ionizado; P2RY12 = receptor purinérgico P2RY12; TMEM119 = proteína transmembrana 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: i3Sinaptossomos humanos derivados de LMN expressaram marcadores sinápticos por análise de western blot. Análise representativa de western blot de uma preparação de sinaptossomo humano derivada de i3LMN após 28 dias de cultura sondada com o marcador pós-sináptico, PSD95, o marcador pré-sináptico, SYP e β-tubulina. Abreviaturas: i3LMN = neurônios motores inferiores derivados de iPSC; PSD95 = proteína de densidade pós-sináptica 95; SYP = sinaptofisina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ensaio de fagocitose de iMGs usando sinaptossomos humanos marcados com um corante sensível ao pH e monitorados por imagens longitudinais de células vivas . (A) Montagens representativas de campo brilhante e fluorescência de iMGs com coloração nuclear (canal azul) expostas a sinaptossomos humanos marcados (canal vermelho) com e sem tratamento com citoD nos pontos de tempo indicados. As montagens foram criadas pelo processamento pós-aquisição de 16 telhas adquiridas a 20x. Barras de escala= 400 μm. (B) Quantificação da área do sinal fluorescente do sinaptossomo normalizada para o número celular. Os pontos de dados indicam a média ± MEV de três replicações técnicas. Cada curva mostra a quantificação de duas diferenciações independentes (iMGs 1 e 2) de uma linha de iPSC com e sem tratamento citoD. Abreviaturas: iMGs = células semelhantes à micróglia; cytoD = citocalasina D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número de pratos de 10 cm de DIF28 i3LMN | Proteína total (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tabela 1: Rendimento total de proteínas após isolamento de sinaptossomos de neurônios motores inferiores derivados de iPSC aos 28 dias de diferenciação. Quantidade total de proteína obtida de quatro diferenciações independentes após a extração dos sinaptossomos. Diferentes números de placas de 10 cm contendo i3LMN foram colhidos em cada diferenciação. O rendimento proteico foi medido pelo ensaio proteico de BCA. Abreviaturas: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; i3LMN = neurônios motores inferiores derivados de iPSC; DIF28 = 28 dias de diferenciação; BCA = ácido bicinchonínico.
| Parâmetros | Valor |
| Canal de cadastro | Campo brilhante, DAPI e RFP |
| Método de fusão | Mistura linear |
| Recortar imagem costurada para remover retângulos pretos nas bordas | Verificado |
| Imagem final de downsize | Verificado |
| Parâmetros | Valor |
| Limiar | Determinado pelo usuário |
| Fundo | Escuro |
| Dividir objetos que tocam | Verificado |
| Preencha buracos nas máscaras | Verificado |
| Tamanho mínimo do objeto | 7 μm |
| Tamanho máximo do objeto | 30 μm |
| Incluir objetos de borda primária | Verificado |
| Analise a imagem inteira | Verificado |
| Parâmetros | Valor |
| Limiar | Determinado pelo usuário |
| Fundo | Escuro |
| Dividir objetos que tocam | Verificado |
| Preencha buracos nas máscaras | Verificado |
| Tamanho mínimo do objeto | 5 μm |
| Tamanho máximo do objeto | 100 μm |
| Incluir objetos de borda primária | Verificado |
| Analise a imagem inteira | Verificado |
Tabela 2: Parâmetros utilizados para aquisição de imagens e análise dos dados. Parâmetros sugeridos a serem considerados para aquisição de imagens durante o ensaio de fagocitose e para análise das imagens adquiridas são listados.
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Discussion
O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método eficiente para obter células semelhantes a micróglias derivadas de iPSC em ~6-8 semanas com alta pureza e em um rendimento suficiente para realizar experimentos de imunofluorescência e outros ensaios que requerem um maior número de células. Este protocolo produziu até 1 × 106 iMGs em 1 semana, o que permite a extração de proteínas e RNA e análises a jusante correspondentes (por exemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espectrometria de massa). Dito isto, uma limitação deste protocolo é que o rendimento dos iMGs pode restringir certas aplicações. Modificações adicionais podem ser implementadas para acumular PMPs de diferentes semanas e manter uma cultura homogênea em suspensão até que progenitores suficientes sejam coletados para prosseguir com o processo de diferenciação de uma só vez18. Alternativamente, a diferenciação de EBs pode ser ampliada usando placas de cultura de células de área mais alta para aumentar a produção de PMPs.
Recomenda-se o uso de iPSCs cultivadas em placas revestidas com laminina 521 para iniciar o processo de diferenciação. Outros reagentes de revestimento podem reduzir o número de PMPs produzidos posteriormente no processo18. Da mesma forma, o revestimento das placas para adesão de EB durante a geração de PMP melhora a fixação de EB, prolongando assim a vida útil da cultura. A cultura de EB foi mantida por até 4 meses, momento em que vários EBs se desprendem e morrem. No entanto, outros pesquisadores relatam a cultura de EBs por até 1 ano12. Em nossas mãos, os iMGs gerados a partir de culturas EB de 3 meses de idade mantêm propriedades funcionais semelhantes às iMGs diferenciadas de culturas jovens; culturas com mais de 3 meses não foram utilizadas para experimentação funcional.
Para otimizar o estágio final de diferenciação da micróglia em relação aos protocolos originais descritos acima 7,8, incluímos 100 ng/mL de interleucina (IL)-34,7 5 ng/mL de fator de estimulação de colônia 1 (M-CSF)10 e 50 ng/mL de fator de crescimento transformador-beta (TGF-β) no meio iMG. A IL-34 e o M-CSF estimulam as vias dependentes do receptor do LCR1 que são cruciais para manter o destino e a sobrevivência da micróglia8, enquanto o TGF-β suporta a homeostase da micróglia 9, promovendo assim um ambiente mais fisiológico para o compromisso do PMP com o destinoda micróglia. Vale ressaltar que todo o processo de diferenciação aqui descrito é realizado em condições livres de soro, o que evita possíveis efeitos do soro no comportamento do iMG e alterações em aplicações a jusante. Para experimentação funcional com iMGs, recomenda-se a realização de experimentos entre 10 e 12 dias de diferenciação terminal. Os iMGs foram cultivados por até 14 dias com uma modesta redução da viabilidade celular, após o que a saúde celular é significativamente comprometida.
Como uma das funções canônicas da micróglia é a fagocitose, um ensaio para investigar a atividade fagocítica in vitro foi incluído neste protocolo. Para desenvolver um sistema baseado em células humanas, foram utilizados sinaptossomos derivados de LMNs humanos i3. A qualidade do preparo dos sinaptossomos foi avaliada pela análise de western blot dos marcadores sinápticos neste estudo. Além disso, outras propriedades estruturais e funcionais da preparação dos sinaptossomos podem ser investigadas por microscopia eletrônica ou imunocoloração antes do ensaio de fagocitose. O protocolo descrito aqui para obter sinaptossomos humanos depende fortemente de i3LMNs, que produzem um número relativamente alto de neurônios. No entanto, os rendimentos neuronais provavelmente serão menores ao usar outros métodos de diferenciação (ou seja, protocolos que exigem coquetéis de pequenas moléculas). Notavelmente, o ensaio de fagocitose pode ser realizado com vários outros substratos, como sinaptossomos derivados do cérebro de camundongos, proteínas agregadas ou células mortas, todos os quais podem ser marcados com corantes sensíveis ao pH para monitorar a fagocitose de maneira semelhante. Propõe-se o uso de corantes sensíveis ao pH porque o sinal fluorescente é emitido principalmente quando os sinaptossomos estão localizados dentro de compartimentos ácidos durante o processamento e degradação dos lisossomos21. Esta propriedade reduz o sinal de fundo dos sinaptossomos fora das células e facilita o uso de métodos automatizados de quantificação. Além disso, os corantes sensíveis ao pH permitem a detecção de eventos de fagocitose verdadeira, em oposição à aderência do substrato ou à ancoragem na membrana celular.
Enquanto aqui é sugerido o uso de ~ 35 μg de sinaptossomos por poço, a quantidade específica de sinaptossomos humanos e outros substratos deve ser otimizada, pois as condições ideais dependem da linha iPSC e das condições experimentais. Uma gama ideal de sinaptossomos deve resultar em uma dose-resposta no ensaio de fagocitose. O excesso de sinaptossomos pode saturar o sistema, dificultando a detecção de diferenças significativas em função do genótipo ou do grupo de tratamento. Muito pouco material resultará em um sinal de saída fraco no ensaio. Por esta razão, é aconselhável testar múltiplas concentrações de cada substrato para estabelecer um ensaio de trabalho. Além disso, é importante manter a % de DMSO dentro de uma faixa segura para preservar a saúde celular.
Nesse protocolo, a fagocitose foi monitorada por meio de um sistema de imagem de células vivas (Tabela de Materiais), pois fornece informações cinéticas sobre a capacidade de engolfamento das células. Microscópios e sistemas de imagem que podem suportar imagens de células vivas e manter temperatura, umidade e concentrações de CO2 estáveis também são adequados para este ensaio. Todos os experimentos de fagocitose aqui descritos foram fotografados a 37 °C com 85%-95% de umidade e 5% de CO2. Outros métodos de detecção, como imagens de células fixas ou citometria de fluxo, também podem ser usados para avaliar a fagocitose usando os mesmos materiais e protocolos de cultura celular (até e incluindo a geração de iMGs e sintossomos marcados) quando a imagem de células vivas não é viável ou desejada. Da mesma forma, outros softwares de código aberto podem ser utilizados para análise de dados, como ImageJ ou CellProfiler; este último permitirá uma análise automatizada comparável ao software aqui utilizado.
Em resumo, a implementação de um protocolo robusto para diferenciar células semelhantes à micróglia de iPSCs humanas é ilustrada, superando assim o recurso limitado da microglia humana. A micróglia diferenciada pode ser usada para uma variedade de aplicações no estudo de doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas. Além disso, um ensaio de fagocitose totalmente "humanizado" está incluído, o que ajudará ainda mais o estudo da função e disfunção da micróglia no contexto do desenvolvimento humano e da doença.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Michael Ward por fornecer a linha WTC11 hNIL iPSC para diferenciação de neurônios motores e aos Jackson Laboratories por fornecer a linha KOLF2.1J WT clone B03 iPSC usada para diferenciação de micróglias. Também agradecemos a Dorothy Schafer por seu apoio durante a implementação dos protocolos, Anthony Giampetruzzi e John Landers por sua ajuda com o sistema de imagem de células vivas, bem como Hayden Gadd por suas contribuições técnicas durante as revisões e Jonathan Jung por sua colaboração neste estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience da UMASS Chan Medical School e pelo Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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