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Bioengineering

Méthode pour étudier la corrélation entre la structure locale du collagène et les propriétés mécaniques du tissu fibreux de la plaque athéroscléreuse

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 4, 1,3, 1,2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

Summary

Nous avons développé un pipeline de mécano-imagerie pour étudier les propriétés structurelles et mécaniques hétérogènes des plaques athérosclérotiques. Ce pipeline permet de corréler l’angle prédominant local et la dispersion de l’orientation des fibres de collagène, le comportement de rupture et les empreintes digitales de déformation du tissu fibreux de la plaque.

Abstract

La rupture des plaques d’athérosclérose dans les artères coronaires et carotides est la principale cause d’événements cardiovasculaires mortels. Cependant, la mécanique de rupture du tissu de plaque hétérogène et hautement collagène, et comment cela est lié à la structure fibreuse du tissu, ne sont pas encore connus. Les pipelines existants pour étudier la mécanique de la plaque se limitent à obtenir uniquement les caractéristiques mécaniques brutes du tissu de la plaque, basées sur l’hypothèse d’une homogénéité structurelle du tissu. Cependant, le tissu de la plaque fibreuse est structurellement hétérogène, sans doute principalement en raison de la variation locale de l’architecture de la fibre de collagène.

Le pipeline de mécano-imagerie décrit ici a été développé pour étudier les propriétés structurelles et mécaniques hétérogènes de la plaque. Dans ce pipeline, l’architecture locale du collagène du tissu est caractérisée à l’aide de la microscopie multiphotonique (MPM) avec génération de seconde harmonique (SHG), et le comportement de défaillance du tissu est caractérisé dans des conditions de test de traction uniaxiale à l’aide d’une analyse de corrélation d’images numériques (DIC). Ce pipeline expérimental permet de corréler l’angle prédominant local et la dispersion de l’orientation des fibres de collagène, le comportement de rupture et les empreintes digitales de déformation du tissu fibreux de la plaque. Les connaissances acquises sont essentielles pour mieux comprendre, prédire et prévenir les événements de rupture de plaque d’athérosclérose.

Introduction

L’AVC ischémique, souvent déclenché par la rupture de la plaque d’athérosclérose dans les artères carotides, est l’une des principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde1. Cependant, les stratégies actuelles de planification du traitement chirurgical pour prévenir l’AVC lié à l’athérosclérose carotidienne ne comprennent pas l’évaluation du risque de rupture en plaque2. Cela s’explique principalement par le fait que les biomarqueurs de risque suggérés précédemment, tels que l’épaisseur3 du bouchon de plaque et la taille du noyau lipidique4, se sont révélés avoir une valeur prédictive sous-optimale pour les événements cliniques futurs 5,6. Une meilleure compréhension de la mécanique des plaques et des mécanismes de rupture est nécessaire pour optimiser l’évaluation du risque de rupture des plaques et identifier de nouveaux marqueurs de risque des plaques d’athérosclérose.

La rupture de plaque est un événement mécanique local où le tissu de plaque hautement fibreux ne résiste pas à la charge mécanique exercée sur lui par la pression artérielle et perd son intégrité structurelle7. Malgré cela, la mécanique de l’événement de rupture de plaque et son lien avec la microstructure sous-jacente sont mal compris8. Les quelques études expérimentales qui ont caractérisé la rupture du tissu plaquentaire présentent 9,10,11,12,13 propriétés de rupture mécanique macroscopique (c.-à-d. la déformation et la résistance ultimes de la rupture de traction), dérivées de l’hypothèse d’une homogénéité structurelle du tissu. Cependant, le tissu fibreux de la plaque est structurellement hétérogène, sans doute principalement en raison de la variation locale de l’architecture de la fibre de collagène14. De plus, le lien entre les caractéristiques de défaillance mécanique du tissu de la plaque et l’architecture du collagène n’a été étudié que dans une étude récente de Johnston et al. Les auteurs ont montré une différence entre les plaques dans l’orientation prédominante des fibres et ont signalé des contraintes ultimes plus élevées et des déformations ultimes plus faibles pour les échantillons de capuchon de plaque fibreuse avec une orientation principalement circonférentielledes fibres 15. Cependant, l’étude était également limitée aux propriétés mécaniques et structurelles brutes.

Pour faire la lumière sur les informations essentielles sur l’architecture locale du collagène et les propriétés mécaniques locales du tissu fibreux de la plaque, nous avons développé dans la présente étude un pipeline de mécano-imagerie. Ce pipeline ex vivo permet de quantifier la direction et la dispersion locales des fibres de collagène, ainsi que la déformation de rupture locale. Le pipeline implique l’imagerie MPM avec SHG pour imager les fibres de collagène dans le tissu de la plaque, ainsi que des tests de traction DIC et uniaxiaux pour quantifier les caractéristiques de rupture du tissu.

La microscopie multiphotonique-seconde génération harmonique (MPM-SHG) est devenue une technique populaire pour étudier le collagène dans les tissus biologiques16. La technique présente de nombreux avantages par rapport à d’autres techniques d’imagerie du collagène, telles que l’histologie17, l’imagerie du tenseur de diffusion (DTI)14 et la diffusion de la lumière aux petits angles (SALS)15. Tout d’abord, l’imagerie MPM-SHG est non destructive, ce qui la rend idéale à combiner avec des tests mécaniques18. Deuxièmement, le signal SHG est spécifique au collagène, et donc aucune coloration du tissu n’est nécessaire. En raison des longues longueurs d’onde d’excitation (proche infrarouge), la profondeur de pénétration est supérieure à celle des autres techniques de microscopie16. La haute résolution (niveau μm) obtenue avec l’imagerie SHG permet également de visualiser des fibres individuelles. Cela offre de nombreuses possibilités, telles que la quantification locale du nombre de fibres de collagène, l’orientation des fibres de collagène et la distribution19.

La corrélation d’images numériques (DIC) combinée à des tests mécaniques est une méthode largement utilisée pour obtenir des propriétés mécaniques locales des tissus biologiques20. Avec le CIVD, le déplacement des mouchetures appliquées sur la surface du tissu est suivi en comparant les images de caméras à grande vitesse acquises lors des essais mécaniques20. Cette méthode de post-traitement d’image est utilisée pour estimer les déformations de surface en plein champ de l’échantillon20 et peut également être utilisée pour étudier le comportement de rupture du tissu21.

Protocol

Toutes les méthodes décrites dans ce document ont été approuvées par le comité de recherche éthique du centre médical Erasmus de Rotterdam; Le consentement éclairé des patients a été obtenu avant le prélèvement de l’échantillon de plaque. Un diagramme de flux de travail du protocole est présenté à la figure 1.

1. Prélèvement de tissus, imagerie par microtomodensitométrie (μCT) et préparation d’échantillons d’essai

  1. Collecte et entreposage de tissus
    1. Prélever des échantillons frais de plaque d’athérosclérose carotidienne humaine provenant de patients consentants ayant subi une chirurgie d’endartériectomie carotidienne.
      REMARQUE: Les échantillons de plaque prélevés lors de cette chirurgie sont constitués de la couche intima malade de l’artère carotide, y compris l’accumulation de graisse (le pool lipidique) et les calcifications22.
    2. Enlever les restes de sang à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) et sécher l’échantillon avec un tampon de gaze.
    3. Placer l’échantillon dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pince à épiler. Congeler le tissu en plaçant le tube dans de l’azote liquide pendant 10 min.
    4. Après la congélation, conserver l’échantillon dans un congélateur à -80 °C jusqu’au jour de l’imagerie μCT.
      REMARQUE: La congélation instantanée minimise la formation de cristaux, entraînant des dommages microstructuraux dans les tissus. Une étude antérieure sur le tissu aortique porcin a montré que la congélation instantanée et le stockage à -80 °C n’avaient pas d’influence significative sur les propriétés mécaniques du tissu23.
  2. imagerie μCT
    1. Le jour de l’imagerie μCT, retirez l’échantillon de plaque du tube de 15 mL. Si le tissu adhère au tube, remplissez le tube avec du PBS à température ambiante. Laissez le tissu dans le PBS jusqu’à ce que l’échantillon puisse être retiré du tube.
    2. Sécher soigneusement l’échantillon de plaque avec du papier de soie.
    3. Allumez le système μCT en appuyant sur le bouton vert . Appuyez sur l’échauffement dans le logiciel CT en bas de l’écran et attendez 15 minutes.
    4. Placez manuellement un filtre à rayons X de Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm dans le système μCT.
    5. Sélectionnez le dossier dans lequel les images doivent être stockées.
    6. Choisissez les paramètres dans le panneau de gauche. Utilisez les listes déroulantes pour sélectionner un temps de balayage de 4 min, une résolution de 172 μm, une tension de 90 kV, un ampérage de 88 mA, un champ de vision de 86 mm et une rotation de 360°.
    7. Ouvrez la porte de l’appareil. Retirez la plate-forme manuellement.
    8. Placez le parafilm sur la plate-forme et placez l’échantillon sur la plate-forme (vers l’extrême extrême de la plate-forme).
    9. Placez manuellement la plate-forme dans l’appareil et fermez la porte.
    10. Activez le mode live (icône en forme d’œil ). Déplacez la plate-forme avec les flèches dans l’appareil pour centrer l’échantillon dans le champ de vision.
    11. Lancez l’imagerie (icône en bas au milieu). Une fois l’imagerie terminée, appuyez sur l’icône de la porte en bas (sous le bouton d’abandon ).
    12. Après la scintigraphie μCT, congeler à nouveau l’échantillon de plaque comme décrit à l’étape 1.1.3. Conservez-le à -80 °C jusqu’au jour de l’imagerie par microscopie multiphotonique et des essais mécaniques.
    13. Ouvrez les fichiers DICOM acquis de l’imagerie μCT dans le logiciel open source 3D Slicer24.
    14. Accédez à l’éditeur de segments . Sélectionnez Créer une segmentation | le volume à analyser en tant que volume maître.
    15. Cliquez sur Ajouter pour ajouter un segment. Appuyez sur son nom et sa couleur pour modifier ces paramètres.
    16. Pour définir les segments, cliquez sur effets | seuil dans la partie inférieure de la fenêtre. Utilisez cet outil de seuil pour différencier les régions tissulaires calcifiées (>450 HU) et non calcifiées (<450 HU). Une fois le seuil sélectionné, appuyez sur Appliquer dans la partie inférieure.
    17. Appuyez sur Afficher 3D (juste à droite de Ajouter) pour visualiser la segmentation dans la vue 3D. S’il y a des zones de la segmentation qui ne sont pas souhaitées, supprimez-les avec l’effet ciseaux.
    18. Modifiez l’opacité des segments dans le module de segmentation en cliquant sur le nom de la segmentation souhaitée.
      REMARQUE: Si possible, l’imagerie μCT et l’examen des images μCT peuvent être effectués le même jour que le reste du protocole. Dans ce cas, ignorez l’étape 1.2.12. Cependant, tenez compte du fait que les étapes suivantes de ce protocole prennent également beaucoup de temps et doivent être effectuées le même jour. Après un peu de pratique, et avec les paramètres et les tissus décrits, l’imagerie μCT devrait prendre ~45 min, l’examen des images μCT ~ 15 min, la préparation de l’échantillon d’essai d’un seul échantillon d’essai ~ 1 h, la microscopie ~ 4 h et l’essai de traction uniaxial ~ 2 h.
  3. Préparation de l’échantillon d’essai
    1. Le jour de l’imagerie du collagène et des tests mécaniques, décongeler la plaque par immersion dans le PBS à température ambiante pendant environ 10 min.
    2. Ouvrez la construction 3D de la plaque créée aux étapes 1.2.13-1.2.18 dans le logiciel de découpe 3D.
    3. Utilisez les repères naturels du tissu de la plaque pour identifier quelles parties de la reconstruction 3D correspondent à l’échantillon réel de plaque. Identifiez quelle zone de la reconstruction 3D ne contient pas de calcifications et identifiez visuellement cette zone dans la plaque réelle.
    4. Coupez la plaque ouverte le long de l’axe longitudinal de l’artère à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler. Si une coupure est déjà présente à la suite de la chirurgie, commencez par cette coupure pour une utilisation optimale du tissu. Si l’échantillon n’a pas de forme tubulaire et qu’il est difficile de définir la direction longitudinale, exclure l’échantillon de l’essai.
    5. Découpez des échantillons d’analyse rectangulaires des échantillons de plaque. Assurez-vous que les échantillons d’essai sont aussi grands que possible tout en évitant les régions tissulaires contenant des déchirures ou des calcifications. Soyez prudent lors de cette coupe, car une petite déchirure ou fissure au bord de l’éprouvette peut entraîner la propagation de fissures à partir de la fissure existante pendant l’essai de traction.
    6. Assurez-vous que les échantillons d’essai ont un rapport largeur/longueur (WL) de <1 dans la longueur de la jauge une fois montés dans l’essai de traction. Si les échantillons satisfont à cette exigence, ils conviennent aux essais de traction appropriés en termes de conditions limites25.
      REMARQUE : La plage dans les dimensions de l’échantillon peut être grande. Les échantillons testés par les auteurs avaient une longueur de jauge comprise entre 3,4 et 12,9 mm et une largeur comprise entre 1,6 et 6,4 mm.

2. Imagerie par microscopie multiphotonique

  1. Préparatifs
    1. Avant le jour de l’imagerie du collagène et des essais mécaniques, diviser 40 g d’une base d’élastomère de silicone sur deux tubes de 50 ml et ajouter 2 g de l’agent de durcissement à chaque tube (rapport de 1:10) à l’aide d’une pipette Pasteur. Mélangez les deux composants avec la pipette.
    2. Centrifuger les tubes pendant 1 min à 700 × g pour éliminer autant de bulles d’air que possible.
    3. Remplissez une boîte de Petri (10 cm de diamètre) avec une fine couche (environ 0,5-1 cm) de silicium et incuber dans l’étuve à 65 °C pendant 3 h ou placez-la à température ambiante pendant 48 h.
    4. Prélever un échantillon de plaque et fixer ses deux extrémités au silicium en épinglant des aiguilles dans le tissu (Figure 2A). Assurez-vous que le côté luminal de l’échantillon est orienté vers le haut. Insérez les aiguilles dans la région de l’échantillon qui seront dans les pinces du dispositif d’essai de traction pendant l’essai mécanique.
    5. Mettez des lunettes de sécurité. Utilisez un cutter latéral pour raccourcir les aiguilles afin qu’elles dépassent à moins de quelques millimètres au-dessus de la surface de l’échantillon, afin d’éviter qu’elles n’endommagent l’objectif du microscope. Remplissez la boîte de Petri avec du PBS jusqu’à ce que l’échantillon soit immergé.
  2. Configuration de la microscopie
    1. Assurez-vous qu’un objectif approprié est monté sur le microscope multiphotonique. Utilisez un objectif optimisé pour transmettre la lumière infrarouge, avec un grossissement de 20x.
    2. Démarrez le système de microscope. Ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope.
    3. Lorsque vous êtes invité à initialiser la table d’imagerie, assurez-vous que le bras du condensateur du microscope est repoussé et que l’objectif est à la position la plus basse.
    4. Activez le laser multiphotonique.
    5. Placez la boîte de Petri contenant l’échantillon d’essai sous l’objectif, comme dans la figure 3. Assurez-vous de ne pas placer l’objectif au-dessus de l’échantillon car les réglages laser doivent encore être optimisés. Sinon, la puissance élevée possible de la lumière laser peut endommager les tissus.
    6. Assurez-vous que l’objectif est légèrement immergé dans PBS. Utilisez une pipette pour ajouter du PBS supplémentaire si nécessaire.
    7. Réglez la longueur d’onde lumineuse sur 880 nm.
      REMARQUE: Cette longueur d’onde est choisie parce que le filtre d’émission SHG dans le système à deux photons utilisé a une longueur d’onde centrale d’environ 440 nm. Pour d’autres microscopes, une longueur d’onde différente pourrait être plus applicable.
  3. Balayage par tuiles et sélection des emplacements de création d’images
    1. Éteignez le laser multiphotonique et activez le mode champ clair du microscope. Ensuite, activez le mode d’analyse en direct .
    2. Placez la scène de telle sorte que l’objectif soit situé au-dessus de l’échantillon et mettez la surface de l’échantillon au point. Désactivez le mode d’analyse en direct .
    3. Sous l’onglet acquisition , dans le deuxième panneau, modifiez le facteur de zoom à 1 en faisant glisser la barre souhaitée.
      REMARQUE: Ce facteur de zoom, ainsi que le facteur d’agrandissement de l’objectif (20x), déterminent la taille de l’image capturée (739 μm x 739 μm).
    4. Sous l’onglet acquisition , dans le deuxième panneau, modifiez la vitesse de numérisation à 400 Hz, la moyenne des lignes à 1 et la résolution à 128 x 128 pixels par image (taille de pixel de ~5,8 μm x 5,8 μm) à l’aide des listes déroulantes.
    5. Sous l’onglet acquisition , dans le premier panneau, cliquez sur le symbole de motif raster et attendez qu’un panneau de numérisation de tuiles apparaisse.
    6. Activez le mode d’analyse en direct . Déplacez l’objectif vers un coin de l’échantillon à l’aide des boutons du panneau dynamique et cliquez sur le symbole de position de marque dans le panneau de balayage de mosaïques. Répétez cette opération pour chaque coin de l’échantillon. Si cette opération est effectuée correctement, une grille avec toutes les vignettes sélectionnées pour l’imagerie apparaîtra en orange.
    7. Désactivez la fonction d’assemblage automatique .
    8. Cliquez sur Démarrer dans le coin inférieur droit de l’écran pour créer une analyse par mosaïque de l’ensemble de la surface de l’échantillon afin d’obtenir une vue d’ensemble de la géométrie de l’échantillon.
      REMARQUE: Sur la base des paramètres décrits, des tissus et du système de microscope, l’acquisition d’un balayage de tuiles de toute la surface de l’échantillon prend ~ 10 min.
    9. Après le balayage des carreaux, observez les coordonnées x et y du coin supérieur gauche de chaque carreau dans le panneau de balayage des carreaux, affichés automatiquement par le logiciel du système de microscopie. Notez ces coordonnées dans une feuille de calcul.
    10. Dans le logiciel de microscope, dans le panneau de balayage de tuiles, observez le nombre de tuiles dans les directions x et y dans la boîte appelée scanfield. Notez la taille de l’analyse par vignette dans la feuille de calcul. Calculez les coordonnées des autres tuiles en additionnant/soustrayant la taille de la tuile (739 μm).
      REMARQUE: Ces coordonnées sont nécessaires pour identifier l’emplacement exact des tuiles à numériser avec l’imagerie SHG. Si la durée totale de l’imagerie n’est pas un problème, toutes les vignettes peuvent être imagées sans sauter de vignette.
    11. Dans le scan de tuiles, sélectionnez les tuiles à imager avec l’imagerie SHG. Pour cette sélection, évitez les carreaux qui seront dans les pinces et laissez un carreau entre chaque carreau sélectionné dans le sens longitudinal et circonférentiel, comme illustré à la figure 2B.
  4. Visualisation du collagène : imagerie SHG
    1. Éteignez les lumières dans la pièce et couvrez l’étage du microscope avec un tissu occultant afin qu’aucune lumière de la pièce n’atteigne le détecteur.
      REMARQUE: Minimiser la lumière atteignant les détecteurs diminuera le bruit lors de l’acquisition de l’image.
    2. Allumez le laser multiphoton (MP).
    3. Sélectionnez le détecteur de détection non numérisée (NDD) équipé d’un filtre passe-bande 430-450 nm.
    4. Identifiez l’emplacement des vignettes à imager à l’aide des informations acquises à l’étape 2.3.10. Renseignez les coordonnées dans les cases désignées et cliquez sur Entrée, afin que l’objectif se déplace vers la vignette de droite. Activez le mode d’analyse en direct.
      REMARQUE: Avec d’autres microscopes ou des versions plus récentes du logiciel d’exploitation, le déplacement vers des emplacements dans le balayage de tuiles peut être effectué automatiquement. Dans ce cas, il n’est pas nécessaire de noter les coordonnées x et y de chaque tuile (étape 2.3.10) et de remplir les coordonnées dans le logiciel d’exploitation (étape 2.4.4).
    5. Augmentez la puissance laser MP en utilisant le curseur dans le panneau supérieur sous les paramètres de trajectoire du faisceau pour obtenir la puissance laser la plus élevée possible sans blanchiment important. Ensuite, réglez le gain du détecteur pour obtenir des images lumineuses, mais sans pixels saturés, en utilisant le bouton du panneau intelligent ou en cliquant sur le nom du détecteur sous Paramètres de trajectoire du faisceau | canaux supplémentaires. Les valeurs typiques pour le gain du détecteur sont comprises entre 500 et 800 V.
    6. Utilisez le bouton de position z sur le panneau intelligent pour régler le plan de mise au point.
    7. Déplacez-vous vers le haut de l’échantillon et définissez les positions du haut de la pile z en cliquant sur la pointe de flèche dans le panneau z-stack (sous l’onglet acquisition | 3ème panneau).
    8. Ensuite, concentrez-vous sur l’échantillon jusqu’à ce que le signal SHG ne soit plus détecté - c’est la fin de la pile. Encore une fois, cliquez sur la pointe de flèche dans le panneau z-stack pour définir cette position. Lorsque vous avez terminé, désactivez le mode d’analyse en direct .
      REMARQUE: Le tissu peut ne pas être entièrement plat. Par conséquent, la surface de l’échantillon de différentes régions du tissu peut avoir des positions légèrement différentes dans la direction z.
    9. Sous l’onglet acquisition, dans le deuxième panneau, maintenez la vitesse de numérisation à 400 Hz, définissez la moyenne des lignes sur 2 et la résolution sur 512 x 512 pixels par image (taille de pixel de ~1,4 μm x 1,4 μm) à l’aide des listes déroulantes. Activez le bouton de numérisation X bidirectionnel.
    10. Cliquez sur la taille z-step dans le panneau z-stack et remplissez une taille z-step de 3 μm dans la boîte. Cliquez sur Démarrer dans le coin inférieur droit de l’écran pour créer une z-stack. Lorsque vous avez terminé, veillez à enregistrer les coordonnées de la vignette dans le nom de fichier ou à attribuer à chaque vignette son propre numéro (comme illustré à la figure 2B).
      REMARQUE: Sur la base des paramètres décrits, du tissu et du système de microscope, l’acquisition d’une pile z d’une seule tuile prend ~ 10-15 min. Les étapes de préparation (étapes 2.4.4-2.4.10) sont incluses dans cette estimation de temps.

3. Essais mécaniques

  1. Préparation de la configuration d’essai de traction uniaxiale
    1. Préparez la configuration de l’essai de traction horizontale (Figure 4) à l’emploi, en suivant les instructions de l’essai de traction (par exemple, allumer le logiciel, fixer des pinces, fixer le capteur de pesage).
    2. Pour réduire au minimum le glissement de l’échantillon d’essai, fixer du ruban de mousse double face (figure 4A, B-2) aux faces intérieures des pinces de l’essayeur de traction et du papier de verre à la face interne du ruban de mousse. Finalement, le papier de verre sera en contact avec l’échantillon d’essai.
    3. Placer le bain chauffant (figure 4A,B-3) en position. Remplissez le bain chauffant avec du PBS jusqu’au niveau de la face inférieure des pinces, afin qu’il n’atteigne pas encore le papier de verre.
    4. Allumez la source d’alimentation du bain chauffant et réglez la température à environ 37 °C.
    5. Montez la caméra haute vitesse au-dessus du système d’essai de traction (Figure 4A-4), par exemple à l’aide d’un support de laboratoire, et montez un objectif d’une distance focale de 50 mm sur la caméra à l’aide d’une rallonge.
    6. Assurez-vous que les pinces sont nettes et que le champ de vision est suffisamment grand pour enregistrer l’échantillon pendant toute la procédure d’étirement (largeur de champ de vision : ± la largeur de l’échantillon ; Longueur du champ de vision : ± 2x la longueur de l’échantillon).
    7. Montez le système d’éclairage (figure 4A-5) au-dessus du système d’essai de traction, par exemple à l’aide d’un support de laboratoire. Allumez le système d’éclairage et réglez l’intensité et l’emplacement de la lumière de sorte qu’il n’y ait pas de reflets sur la surface PBS à observer sur l’image de la caméra.
    8. Ajustez le temps d’exposition et le gain de l’appareil photo pour obtenir des images claires.
    9. Réglez le logiciel d’acquisition d’images pour capturer à 30 images / s à une résolution de 5,2 MP.
      REMARQUE: Cette fréquence d’images élevée est nécessaire pour effectuer l’analyse DIC ultérieure et étudier le comportement de rupture.
    10. Régler la vitesse de déplacement de l’une des pinces de telle sorte que la vitesse globale de déformation technique pendant les essais mécaniques soit similaire à la vitesse de déformation physiologique in vivo du tissu
      (5 %/s pour le tissu plaqueur26).
  2. Génération de motif de moucheture
    REMARQUE : Ce protocole de modèle de moucheture est basé sur des travaux antérieurs de Walsh et al.27.
    1. Sécher l’échantillon en le tamponnant légèrement avec du papier de soie.
    2. Mettez le colorant de tissu noir dans le seau prévu de l’aérographe.
    3. Connectez l’aérographe au compresseur. Allumez le compresseur de l’aérographe et réglez la pression à 25 PSI.
    4. Essayez de créer un motif de moucheture optimal sur le papier avant de pulvériser sur le tissu. Pulvériser plusieurs fois jusqu’à ce qu’un rapport noir/blanc de 50 :5028 soit atteint. Déplacez l’aiguille de l’aérographe d’avant en arrière pour ajuster la rugosité du motif de moucheture jusqu’à ce que la taille d’une moucheture soit similaire à la taille de 3-5 pixels de la caméra haute vitesse29.
      REMARQUE: Le motif de moucheture sera utilisé à deux fins différentes. Tout d’abord, le déplacement de ces mouchetures est mesuré en comparant les images de caméras à grande vitesse acquises lors d’essais mécaniques (DIC, étape 4.2). Deuxièmement, ce motif de moucheture est utilisé pour identifier l’emplacement de rupture sur l’image de l’état non déformé de l’échantillon (étape 4.3.1).
    5. Tenez l’aérographe à environ 30 cm de l’échantillon d’essai et vaporisez sur la surface luminale.
    6. Laisser le colorant adhérer à l’échantillon pendant 1 min à température ambiante avant de plonger l’échantillon dans du PBS.
  3. Essai de traction uniaxial
    1. Placer l’échantillon dans les pinces de l’essayeur de traction, la direction circonférentielle des échantillons étant alignée sur la direction d’étirement de la traction et le côté luminal de l’échantillon tourné vers le haut. Assurez-vous que la longueur initiale de la jauge est réglée de telle sorte que le rapport WL des bandes soit <1.
    2. Serrez les vis des poignées en appliquant un couple de 20 cNm à l’aide d’un tournevis couple. Faites-le progressivement en appliquant un petit couple à chaque vis avant d’appliquer le couple final.
    3. Inspectez visuellement si l’échantillon contient des déchirures qui pourraient influencer les tests.
    4. Introduire plus de PBS dans le bain chauffant jusqu’à ce que l’échantillon soit immergé et attendre que la température du PBS atteigne à nouveau 37 °C.
    5. Acquérir une image d’étalonnage avec la caméra haute vitesse, dans laquelle l’échantillon de test et une règle sont inclus comme référence. Assurez-vous que la règle est à la même distance de l’objectif de la caméra que la surface luminale de l’échantillon.
    6. Tare le capteur de pesage et commencer à enregistrer les mesures globales de force et de déplacement à partir du capteur de pesage et de l’actionneur de l’essai de traction.
    7. Redresser l’échantillon en appliquant un préétirement de 0,05 N pour éliminer le mou dans l’échantillon. Effectuer 10 cycles de préconditionnement jusqu’à 10% de déformation en fonction de la mesure de la longueur de la jauge par l’actionneur après l’application du préétirement.
    8. Démarrez l’essai de traction uniaxial jusqu’à rupture complète de l’échantillon, tout en enregistrant une vidéo de la déformation de l’échantillon avec la caméra haute vitesse. Après une défaillance tissulaire, arrêtez d’enregistrer les mesures globales de force et de déplacement.
      REMARQUE: Certains testeurs de traction commerciaux peuvent effectuer automatiquement les étapes 3.3.6-3.3.9. Le protocole actuel décrit les étapes manuelles à suivre si cette option automatique n’est pas incluse dans l’essai de traction utilisé.
    9. Retirer l’échantillon d’essai du dispositif d’essai de traction et le jeter de manière appropriée.
    10. Lors du test de l’échantillon suivant, replacez le papier de verre et le ruban de mousse sur les pinces.

4. Analyse des données

  1. Analyse de l’organisation du collagène
    1. Ouvrez les z-stacks obtenus pendant MPM avec SHG dans ImageJ et créez des projections d’intensité maximale (MIP) de chaque z-stack.
    2. Analysez chaque MIP avec l’outil open source FOA (Fiber Orientation Analysis)30 basé sur MATLAB pour mesurer l’angle d’orientation des fibres de collagène individuelles présentes dans les tuiles. Utilisez les paramètres suivants : Échelles : [3 4 5] ou [2 4 6], selon le diamètre du navire, et Seuil de vaisseau : 0,999, 0,9995 ou 0,9999, selon l’intensité du signal SHG.
      REMARQUE: Plus de détails sur la façon d’utiliser cet outil peuvent être trouvés dans le manueldu logiciel 31.
    3. Utilisez un autre outil open source basé sur MATLAB, FibLab32, pour ajuster une distribution gaussienne à l’histogramme de distribution d’angles.
      REMARQUE: Plus de détails sur la façon d’utiliser cet outil peuvent être trouvés dans le manueldu logiciel 32.
    4. À partir du diagramme de distribution gaussienne obtenu à l’aide de FibLab, extrayez les paramètres structurels suivants de l’espace de travail de MATLAB : l’angle prédominant de la fibre (μ p), qui est le mode de distribution, l’écart type (σp) de la distribution de l’angle de fibre et la fraction anisotrope (Pani = 1 − Piso).
      NOTE: La fraction isotrope est l’aire sous la ligne de base dans la distribution gaussienne, tandis que la fraction anisotrope contient l’aire du pic au-dessus de cette ligne de base33. Les σ p etp ani fournissent des informations sur la dispersion de l’orientation des fibres dans la région des carreaux.
    5. Pour l’inspection visuelle, tracez μ p à l’aide de lignes orientées et σp et Panià l’aide de cartes de couleurs.
  2. Analyse d’images numériques et analyse de rupture
    1. Effectuez une inspection visuelle sur les images de la caméra pour identifier le cadre dans lequel se produit le déclenchement de la rupture. Sur ce cadre, identifiez visuellement l’emplacement de la rupture.
    2. Effectuer une inspection visuelle sur les images de la caméra pour identifier toute fissure ou déchirure éventuelle à l’emplacement de la rupture au début des essais mécaniques. Si une telle déchirure est présente, exclure l’échantillon de l’analyse.
    3. Effectuez l’analyse DIC avec le logiciel open source basé sur MATLAB Ncorr (v1.2)34. Suivez les étapes du manuel Ncorr35.
      1. Utilisez les images de la caméra enregistrées pendant l’essai de traction avec la caméra haute vitesse pour DIC. Sélectionnez la dernière image avant l’étirement final jusqu’à la défaillance (après préconditionnement) comme image de référence. Pour les images actuelles, sélectionnez toutes les images depuis le début de l’étirement final jusqu’à la dernière image avant l’image dans laquelle l’initiation de la rupture s’est produite.
      2. Sélectionnez la surface de l’échantillon comme région d’intérêt (ROI). Exclure les zones proches (environ 1 mm) des pinces, car les contraintes dans ces zones seront fortement influencées par les poignées.
      3. Effectuez l’analyse DIC à l’aide des paramètres suivants : Rayon du sous-ensemble : 30 pixels ; Espacement des sous-ensembles: trois pixels; Seuil d’itération : 50; Norme du seuil du vecteur de différence: 10-5; Rayon de déformation: 5; Propagation automatique, étape#: 5.
      4. À partir de l’analyse DIC avec Ncorr, obtenir les distributions de Green-Lagrange (ou souche eulérienne) du ROI. Utilisez ces distributions de déformation pour calculer la déformation moyenne de Green-Lagrange de toute la surface de l’échantillon de plaque à la dernière image avant la rupture. Calculer la déformation Green-Lagrange à l’emplacement de rupture.
  3. Corrélation des données structurelles et mécaniques à l’emplacement de la rupture
    1. À l’aide des repères naturels de l’échantillon d’essai et des mouchetures appliquées sur l’échantillon d’essai, identifier l’emplacement de la rupture (identifié à l’étape 4.2.1) sur l’image de référence (étape 4.2.3.1).
    2. À l’aide des repères naturels de l’échantillon d’essai, effectuez une superposition de l’image de référence et du balayage des tuiles (étape 2.3) pour identifier l’emplacement de rupture sur le balayage des carreaux. Identifiez la vignette MPM-SHG à l’endroit où la rupture s’est produite. Si la rupture ne se trouve pas dans une vignette numérisée avec le MPM-SHG, identifiez la vignette la plus proche de l’emplacement de rupture. Obtenez les paramètres structuraux trouvés au niveau de la tuile où la rupture s’est produite.

Representative Results

Prélèvement de tissus et préparation d’échantillons d’analyse
La collecte de tissus produit des échantillons de tissus fibreux de plaque qui peuvent être disséqués en échantillons d’essai individuels pour l’imagerie structurelle et les essais de traction uniaxiaux. Idéalement, un échantillon de tissu fibreux prélevé contient des zones avec peu ou pas de déchirures (figure 5A) et des macrocalcifications (figure 5B). Un excès de ces déchirures et calcifications (figure 5C) peut conduire à des échantillons de plaque qui ne répondent pas à l’exigence de dimension d’échantillon mentionnée précédemment de WL 1.

Imagerie par microscopie multiphotonique
L’imagerie SHG et le post-traitement d’image fournissent des MIP à partir de chaque mosaïque imagée (Figure 6A,B). Un post-traitement ultérieur par détection de fibres (Figure 6C) donne des histogrammes d’orientation des fibres (Figure 6D) à partir desquels les paramètres structurels du collagène peuvent être extraits (Figure 6E). En outre, des cartes de couleurs montrant les paramètres structurels locaux du collagène sur l’ensemble de l’échantillon de plaque peuvent être obtenues pour une analyse visuelle (Figure 6F, G). Pour l’échantillon d’essai représentatif de la figure 6, on constate une grande variation intra-échantillon des paramètres structuraux du collagène (moyenne ± écart-type de μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0,49 ± 0,14, si la direction circonférentielle est définie comme 0°). Cette variation intra-échantillon souligne l’importance d’obtenir des paramètres structurels locaux au lieu de supposer une homogénéité.

Essais mécaniques
Comportement à la rupture
La caméra haute vitesse fournit des images du comportement de déformation et de rupture des échantillons de plaque pendant les essais mécaniques (Figure 7). À partir de ces images, l’emplacement de l’initiation de la rupture et le chemin de propagation de la rupture peuvent être identifiés. Les résultats d’identification de la rupture sont sous-optimaux si des bulles ou des reflets sont présents dans les images de la caméra, ou si la rupture se propage trop rapidement pour être capturée par la fréquence d’images choisie.

Modèles de déformation locale
L’analyse de corrélation d’images numériques sur les enregistrements de caméra acquis lors de l’essai de traction uniaxial fournit les cartes de déformation tissulaire locale, telles que les cartes de déformation de Green-Lagrange illustrées à la figure 8. Ces cartes montrent les trois composantes de déformation (εxx, εxy et εyy) au niveau de la trame avant l’initiation de la rupture. À partir de ces cartes de déformation, les souches moyennes dans une région d’intérêt et la déformation locale à un endroit, tel que l’emplacement de la rupture, peuvent être extraites.

Pour l’échantillon représentatif de la figure 8, les données sur les souches locales montrent une grande variation intra-échantillon. Pour l’échantillon d’essai représentatif de la figure 8, une grande variation intra-échantillon des souches locales est constatée (les intervalles des souches observées sont les suivants: εxx = -0,30-0,17; εxy = -0,13-0,20; εyy = 0-0,40). Cela souligne l’importance d’obtenir des données locales au lieu de valeurs moyennes brutes obtenues avec l’hypothèse d’homogénéité tissulaire.

Corrélation des informations sur les tissus mécaniques et structurels
Les résultats mentionnés ci-dessus permettent d’associer la déformation locale et le comportement de rupture du tissu à l’architecture du collagène. Une fois que l’emplacement de la rupture est identifié sur les enregistrements de la caméra (figure 9A), il peut être mis en correspondance avec l’image de la caméra de référence (figure 9B) et avec le balayage des tuiles de microscopie (figure 9C). Cela fournit la tuile MPM-SHG où la rupture s’est produite et les paramètres structurels trouvés à cette tuile (Figure 9D). Les paramètres structuraux trouvés dans la tuile où la rupture s’est produite dans un échantillon représentatif, illustré à la figure 9, sont μ p = 28°, σp = 19° et Pani = 0,6. La même procédure peut également être appliquée aux emplacements tissulaires non rompus. Il est important de noter que la cartographie de l’emplacement de rupture sur l’image de référence à partir du cadre de rupture peut être difficile en cas de mauvais motif de mouchetures et de repères naturels peu clairs. En outre, si les repères naturels du tissu ne sont pas suffisamment clairs, le co-enregistrement de la superposition de balayage des tuiles et des images de la caméra haute vitesse peut être difficile.

Figure 1
Figure 1 : Organigramme du flux de travail du protocole expérimental présenté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Sélection des carreaux pour l’imagerie SHG à partir du balayage des carreaux. (A) Échantillon d’essai épinglé dans du silicium. (B) Balayage par carreaux de l’échantillon d’essai obtenu par microscopie à fond clair. Les vignettes sélectionnées pour l’imagerie SHG sont marquées par des carrés bleus. (C) Projection d’intensité maximale du MPM avec SHG. Barre d’échelle = 140 μm (C). Abréviations : SHG = génération de seconde harmonique; MPM = microscopie multiphotonique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Échantillon de plaque placé sous l’objectif du microscope multiphotonique. L’emplacement de l’échantillon de plaque est assuré par une boîte de Petri tamponnée au phosphate et remplie de solution saline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Essai de traction uniaxial conçu sur mesure avec ses différents composants indiqués . (A) Vue d’ensemble du système. Notez que les inserts de papier de verre dans les pinces sont visibles car seules les pinces inférieures sont attachées. (B) Image agrandie des pinces de l’essai de traction avec l’éprouvette prête pour l’essai. Abréviations : PVC = chlorure de polyvinyle; LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats du prélèvement de tissus et de la préparation des échantillons à partir d’échantillons représentatifs. (A) Échantillon de plaque fraîche et intacte, prélevé sur des patients consentants ayant subi une chirurgie d’endartériectomie carotidienne. (B) Reconstruction 3D à partir d’un scanner μCT. Le tissu calcifié est représenté en bleu clair et non calcifié en rouge. Un échantillon optimal sans tissu calcifié a pu être obtenu à partir de la zone située entre les lignes bleues. (C) Reconstruction 3D à partir du scanner μCT montrant une plaque sous-optimale avec un excès de tissu calcifié. Barre d’échelle = 3 mm. Abréviation : μCT = micro-tomodensitométrie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Résultats MPM-SHG d’un échantillon représentatif. (A) Vue d’ensemble de l’analyse des tuiles; Les vignettes sélectionnées pour l’imagerie sont affichées en bleu. (B) MIP de différentes tuiles. (C) Détection de fibre par l’outil FOA à partir d’une tuile sélectionnée # 1. (D) Histogramme d’orientation des fibres à partir d’une tuile sélectionnée. (E) Histogramme d’orientation des fibres + ajustement gaussien, à partir duquel les paramètres structurels du collagène peuvent être extraits d’une tuile sélectionnée. (F) Représentation des μ p (ligne noire d’orientation) et σp (couleur de fond) sur l’ensemble de l’échantillon de plaque. (G) Représentation des μp (orientation ligne noire) et Pani (couleur de fond) sur l’ensemble de l’échantillon de plaque. Barres d’échelle = 140 μm (B,C). Abréviations : MPM-SHG = microscopie multiphotonique-seconde génération harmonique; PIM = projections d’intensité maximale; FOA = analyse de l’orientation des fibres; μp = angle prédominant de la fibre; Pani = fraction anisotrope; σp = écart type de la distribution des angles des fibres; Piso = fraction isotrope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Début et propagation de la rupture dans un échantillon de tissu de plaque au cours de la procédure d’essai de traction.1) État préétiré, tissu intact. 2) Premier cadre d’initiation de rupture dans lequel la rupture est observée. Le lieu d’initiation de la rupture est marqué d’un carré rouge. 3) et 4) Propagation de la rupture. 5) Rupture complète de l’échantillon de plaque. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Profils de déformation Green-Lagrange d’un échantillon représentatif (εxx, εxy et εyy) à la base de sondage avant rupture, obtenus par analyse DIC. La moyenne et l’écart-type sur l’ensemble de la plaque sont indiqués, ainsi que la déformation au lieu de rupture. Abréviations : DIC = corrélation d’images numériques; εxx = déformation longitudinale; εxy = cisaillement; εyy = déformation de traction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Image superposée de l’emplacement de la rupture (carré rouge) sur les images. (A) Image de caméra haute vitesse, où la rupture est identifiée (cadre de rupture). (B) Image de caméra à grande vitesse, où seul un préétirement est appliqué (cadre de référence). (C) L’image de balayage de tuiles obtenue par microscopie. (D) Une carte codée par couleur montrant les paramètres structurels locaux du collagène sur différentes tuiles. Les μp (ligne noire d’orientation) et Pani (couleur de fond) sur l’ensemble de l’échantillon de plaque sont présentés. Abréviations : μp = angle prédominant de la fibre; Pani = fraction anisotrope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La présente étude s’est concentrée sur le développement d’un pipeline de mécano-imagerie pour étudier la corrélation entre l’orientation et la dispersion locales du collagène, les propriétés mécaniques locales et le comportement de rupture du tissu de la plaque athéroscléreuse fibreuse. Le protocole décrit ici est novateur pour plusieurs raisons. Tout d’abord, c’est la première fois que la corrélation d’images numériques est appliquée pour mesurer la déformation locale du tissu fibreux de la plaque sous charge mécanique. Deuxièmement, ce protocole fournit les informations nécessaires pour analyser l’association entre le modèle de déformation locale et l’architecture locale du collagène du tissu de la plaque fibreuse. L’importance de l’évaluation locale est soulignée à la fois par les données de souche et les données sur le collagène présentées dans la section des résultats, qui montrent la nature hétérogène du tissu. Par conséquent, l’utilisation de techniques permettant une évaluation locale, telles que celles utilisées dans ce protocole, est recommandée pour les études futures des propriétés des plaques fibreuses.

La préparation des échantillons d’essai fait partie des étapes critiques de ce protocole. Les plaques carotidiennes sont principalement des tissus collagènes; Cependant, ils peuvent contenir des calcifications qui sont considérées comme affectant le comportement mécanique global de la plaque36,37. Comme l’étude se concentre sur la composante fibreuse de la plaque, les calcifications sont évitées dans les échantillons d’essai en utilisant l’imagerie μCT38. Si la μCT n’est pas disponible, d’autres techniques d’imagerie telles que l’IRM ou l’OCT39 peuvent être envisagées pour détecter les régions calcifiées de la plaque. L’obtention d’échantillons de test de tissus fibreux exempts de calcifications et d’une taille suffisamment grande pour être exploitable pour les essais mécaniques peut être une tâche difficile pour les plaques fortement calcifiées ou contenant des calcifications dispersées. Une autre tâche difficile dans le protocole est de générer un motif de moucheture optimal pour la corrélation d’images numériques. Le DIC optimal nécessite un rapport noir/blanc de 50:5028 et des mouchetures de la taille de trois à cinq pixels29 pour assurer une qualité appropriée. Le non-respect de ces exigences peut entraîner des mesures de déformation locales inexactes. Enfin, la cartographie de l’emplacement de la rupture avec les images SHG peut être difficile si les repères naturels d’un tissu ne sont pas clairs. Pour de tels échantillons, l’application de plusieurs marqueurs fiduciaires sur le tissu avant l’imagerie sera utile.

La technique MPM-SHG utilisée dans le protocole actuel est supérieure à de nombreuses autres techniques d’imagerie du collagène, car il s’agit d’une technique à haute résolution et non destructive avec une profondeur de pénétration relativement grande. Pourtant, la profondeur de pénétration (<400 μm) du MPM-SHG pose une limitation, car elle ne permet pas d’imager toute l’épaisseur des échantillons d’essai, qui variait entre 0,5 et 2 mm. Dans une étude récente avec l’imagerie par résonance magnétique du tenseur de diffusion (IRM-DT), nous avons démontré que l’orientation prédominante des fibres dans les parties profondes du tissu plaquentaire peut être différente de celle des parties luminales plus superficielles du tissu14. Par conséquent, d’autres études sont justifiées pour étudier l’architecture locale du collagène dans les parties profondes des échantillons de tissus fibreux épais et sa relation avec la mécanique tissulaire locale. À cette fin, l’imagerie du domaine de fréquence spatiale polarisée (pSFDI) peut être utilisée. Cette technique d’imagerie optique récemment mise au point aurait le potentiel de mesurer l’orientation des fibres jusqu’à 0,8 mm de profondeur dans les feuillets de la valve mitrale12. Le pSFDI offre également une acquisition rapide, ce qui pourrait également faciliter la visualisation de toute la zone d’échantillonnage au lieu d’une sélection de tuiles, comme c’est le cas dans le protocole actuel. Une autre limite du protocole actuel est que seule la déformation de surface a pu être identifiée. Dans les études futures, la DIC40 multi-vues assistée par miroir ou la corrélation numérique de volume (DVC)41 peuvent être incluses dans ce protocole pour obtenir des informations supplémentaires sur les souches volumétriques souterraines.

Le protocole expérimental actuel peut être étendu ou modifié de plusieurs façons pour obtenir des informations supplémentaires sur la mécanique de rupture de la plaque et sa relation avec la microstructure sous-jacente. Premièrement, le protocole actuel comprend des essais de traction uniaxiaux dans le sens circonférentiel. Ce type d’essai mécanique a été choisi car la plaque subit principalement un étirement de traction dans le sens circonférentiel in vivo. Pour une caractérisation mécanique plus complète, ce protocole peut être étendu pour inclure des essais de gonflage, des essais biaxiaux ou des essais de traction uniaxiaux dans le sens longitudinal. Deuxièmement, le protocole actuel se concentre uniquement sur l’obtention de souches locales par DIC. Cependant, une vue plus complète du comportement mécanique de la plaque peut être acquise en incluant également l’analyse des contraintes locales dans le protocole, mais cela nécessite une caractérisation de la rigidité locale. Bien que cela soit actuellement difficile, cela peut être réalisé par des techniques de calcul telles que la méthode inverse des éléments finis 42,43 et la méthode des champs virtuels44. Outre l’adaptation expérimentale, certaines étapes de post-traitement supplémentaires peuvent également être ajoutées au protocole actuel. Tout d’abord, au lieu d’identifier uniquement l’emplacement de la rupture, le chemin de propagation de la fissure peut être identifié via les images obtenues par caméra haute vitesse. Cette voie de propagation peut être corrélée à des paramètres structurels et mécaniques locaux. Deuxièmement, l’emplacement de l’initiation de la rupture a été identifié visuellement dans le protocole décrit. Une étude antérieure sur des tissus non biologiques a utilisé des discontinuités dans les mesures de déformation DIC pour détecter la rupture45. L’application d’une telle détection automatisée de rupture sur les tissus de la plaque peut éventuellement améliorer la précision de la détection de rupture. Enfin, un grand avantage de MPM-SHG par rapport à d’autres techniques d’imagerie du collagène est qu’il visualise les fibres de collagène individuelles. Par conséquent, les données obtenues via ce protocole peuvent également être utilisées pour étudier d’autres caractéristiques locales du collagène, telles que la teneur en collagène.

Ce protocole peut être utilisé pour mieux comprendre les caractéristiques locales du tissu fibreux, le composant qui échoue mécaniquement lors de la rupture de la plaque in vivo. Cette information est nécessaire pour établir de nouveaux marqueurs d’imagerie structurale et fonctionnelle qui prédisent la rupture de la plaque chez les patients. Ces nouveaux marqueurs sont nécessaires, car il a été démontré que les biomarqueurs de risque précédemment suggérés ont une valeur prédictive sous-optimale pour les événements cliniques futurs 5,6. À l’avenir, l’OCT et la ps-OCT pourront éventuellement identifier et quantifier le tissu fibreux dans le système artériel46,47,48. En outre, la souche était considérée comme un marqueur de substitution pour la composition de la plaque locale49. Ainsi, les mesures de déformation in vivo 49 pourraient potentiellement aider à l’identification de la stabilité de la plaque chez les patients. Cependant, il faut être prudent avec la traduction directe des résultats obtenus en rupture de plaque in vivo. Premièrement, le tissu fibreux de la plaque subit une charge plus complexe in vivo que la charge de traction unidirectionnelle utilisée dans ce protocole. Deuxièmement, les plaques d’athérosclérose sont des structures à plusieurs composants; Les distributions in vivo des contraintes et des déformations dans le tissu fibreux de la plaque peuvent être affectées par la présence et l’emplacement des autres composants de la plaque, tels que les calcifications37.

Ce pipeline de mécano-imagerie peut également être utilisé pour étudier d’autres tissus collagènes. Les tests mécaniques globaux et l’imagerie structurelle du collagène sont déjà largement utilisés pour les tissus biologiques. Cependant, l’évaluation locale des propriétés de pré-défaillance et de défaillance, ainsi que l’architecture du collagène, sont essentielles pour une caractérisation mécanique précise des tissus fibreux hétérogènes. Nous prévoyons que la structure de ce nouveau protocole permettra de mieux comprendre l’interaction entre la microstructure et la mécanique de plusieurs tissus biologiques.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par une subvention NWO-Vidi (18360).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm extension ring Thorlabs Inc. CML10
15 mL tube VWR 525-0150
20x APO water immersion objective Leica 507701
3D Slicer software N/A Version 4.11
50 mL tubes VWR 525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm Conrad 4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating Thorlabs
Black tissue dye Polysciences inc 24113-2
Camera lens, focal length 50 mm Thorlabs Inc. MVL50M1
Camera stand VWR 241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser Coherent
Compressor + air hose JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62, 4016138577198
Excel Microsoft Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm Pattex
Heating bath N/A Custom made
High-speed camera + imaging software Pixelink-Navitar Inc. PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) N/A
Image J National Institute of Health N/A
LAS-AF Leica Version 2.3 Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II Leica Microscope used for SHG imaging
Lighting system AMZ instruments LED-60TB Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB MathWorks Version R2021A
MATLAB-based FibLab software Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based Ncorr software Georgia Institute of Technology Version 1.2
Needles Emerald BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter) VWR BRND452000
Parafilm VWR 291-1214
Pasteur Pipettes VWR ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm PerkinElmer CLS149276
Ruler Fine Science Tools 1800030
Sandpaper (P180) Conrad 4.00932E+12
Side cutter Conrad 4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184) VWR 634165S
Tensile tester + software + clamps N/A Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver Garant, Hoffman group 659906

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References

  1. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
  2. Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
  3. Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
  4. Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
  5. SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
  6. Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
  7. Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
  8. Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
  9. Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
  10. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
  11. Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
  12. Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
  13. Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
  14. Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
  15. Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
  16. Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
  17. Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
  18. Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
  19. Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
  20. Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
  21. Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
  22. Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
  23. Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
  24. Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
  25. Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
  26. Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
  27. Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
  28. Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
  29. Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
  30. Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
  31. Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
  32. FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
  33. van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  34. Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
  35. NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
  36. Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
  37. Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
  38. Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
  39. Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
  40. Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
  41. Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
  42. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
  43. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
  44. vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
  45. Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
  46. Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
  47. Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
  48. Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
  49. Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

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Bioengineering numéro 189
Méthode pour étudier la corrélation entre la structure locale du collagène et les propriétés mécaniques du tissu fibreux de la plaque athéroscléreuse
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Crielaard, H., Guvenir Torun, S.,… More

Crielaard, H., Guvenir Torun, S., Wissing, T. B., de Miguel Muñoz, P., Kremers, G. J., Gijsen, F. J. H., Van Der Heiden, K., Akyildiz, A. C. A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue. J. Vis. Exp. (189), e64334, doi:10.3791/64334 (2022).

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