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Bioengineering

국소 콜라겐 구조와 죽상경화반 섬유조직의 기계적 특성 사이의 상관관계를 연구하는 방법

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 4, 1,3, 1,2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

Summary

우리는 이질적인 구조적 및 기계적 죽상경화성 플라크 특성을 연구하기 위해 기계 이미징 파이프라인을 개발했습니다. 이 파이프라인은 콜라겐 섬유 배향의 국소 우세 각도와 분산, 파열 거동 및 섬유질 플라크 조직의 변형 지문의 상관 관계를 가능하게 합니다.

Abstract

관상 동맥 및 경동맥의 죽상 경화성 플라크의 파열은 치명적인 심혈관 사건의 주요 원인입니다. 그러나 이질적이고 콜라겐이 많은 플라크 조직의 파열 역학과 이것이 조직의 섬유 구조와 어떻게 관련되어 있는지는 아직 알려져 있지 않습니다. 플라크 역학을 연구하기 위한 기존 파이프라인은 조직의 구조적 균질성을 가정하여 플라크 조직의 총체적인 기계적 특성만을 얻는 것으로 제한됩니다. 그러나, 섬유질 플라크 조직은 구조적으로 이질적이며, 틀림없이 주로 콜라겐 섬유 구조의 국부적 변이로 인한 것입니다.

여기에 설명된 기계 이미징 파이프라인은 이질적인 구조적 및 기계적 플라크 특성을 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 파이프라인에서 조직의 국소 콜라겐 구조는 2차 고조파 생성(SHG)이 있는 다광자 현미경(MPM)을 사용하여 특성화되고 조직의 실패 거동은 디지털 이미지 상관관계(DIC) 분석을 사용하는 단축 인장 테스트 조건에서 특성화됩니다. 이 실험 파이프라인은 콜라겐 섬유 배향의 국소 우세 각도와 분산, 파열 거동 및 섬유질 플라크 조직의 변형 지문의 상관 관계를 가능하게 합니다. 얻은 지식은 죽상경화성 플라크 파열 사건을 더 잘 이해, 예측 및 예방하는 데 중요합니다.

Introduction

종종 경동맥의 죽상동맥경화반 파열에 의해 유발되는 허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인 중 하나입니다1. 그러나 경동맥 죽상동맥경화증 관련 뇌졸중을 예방하기 위한 현재의 외과적 치료 계획 전략에는 플라크 파열 위험 평가가 포함되어 있지 않다2. 이는 주로 플라크캡 두께3 및 지질 코어 크기4와 같은 이전에 제안된 위험 바이오마커가 향후 임상 사건에 대해 차선의 예측 값을 갖는 것으로 나타났기 때문입니다 5,6. 플라크 역학 및 파열 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 플라크 파열 위험 평가를 최적화하고 죽상동맥경화성 플라크의 새로운 위험 마커를 식별하는 데 필요합니다.

플라크 파열은 섬유질이 많은 플라크 조직이 혈압에 의해 가해지는 기계적 부하를 견디지 못하고 구조적 완전성을 잃는 국소적인 기계적 사건이다7. 그럼에도 불구하고, 플라크 파열 사건의 역학과 기본 미세 구조와의 연관성은 잘 이해되지 않고 있습니다8. 플라크 조직 파괴를 특징으로 하는 소수의 실험적 연구는 조직의 구조적 균질성을 가정하여 파생된 9,10,11,12,13개의 보고된 총 기계적 파열 특성(즉 , 극한 인장 파괴 변형률 및 강도)을 특징으로 합니다. 그러나, 섬유상 플라크 조직은 구조적으로 이질적이며, 틀림없이 주로 콜라겐 섬유 구조의 국부적 변이에 기인한다(14). 또한, 플라크 조직의 기계적 고장 특성과 콜라겐 구조 사이의 연관성은 Johnston et al.의 최근 연구에서만 조사되었습니다. 저자들은 우세한 섬유 방향에서 플라크 간 차이를 보였고 주로 원주 섬유 배향을 가진 섬유질 플라크 캡 샘플에 대해 더 높은 극한 응력과 더 낮은 극한 변형을 보고했습니다15. 그러나 이 연구는 또한 총체적인 기계적 및 구조적 특성에 국한되었습니다.

국소 콜라겐 구조와 섬유질 플라크 조직의 국소 기계적 특성에 대한 필수 정보를 밝히기 위해 현재 연구에서 우리는 기계 이미징 파이프라인을 개발했습니다. 이 생체 외 파이프라인을 사용하면 국소 콜라겐 섬유 방향 및 분산뿐만 아니라 국소 파열 변형률의 정량화가 가능합니다. 파이프라인에는 플라크 조직의 콜라겐 섬유를 이미지화하기 위한 SHG를 사용한 MPM 이미징과 조직의 파열 특성을 정량화하기 위한 DIC 및 단축 인장 테스트가 포함됩니다.

다광자 현미경-초고조파 생성(MPM-SHG)은 생체 조직에서 콜라겐을 연구하는 데 널리 사용되는 기술이 되었다16. 이 기술은 조직학(histology)17, 확산 텐서 이미징(diffusion tensor imaging, DTI)14 및 소각 광 산란(small-angle light scattering)15과 같은 다른 콜라겐 이미징 기술에 비해 많은 장점이 있습니다. 첫째, MPM-SHG 이미징은 비파괴적이므로 기계적 테스트18과 결합하는 것이 이상적입니다. 둘째, SHG 신호는 콜라겐에 특이적이므로 조직의 염색이 필요하지 않습니다. 긴 여기 파장(근적외선)으로 인해, 투과 깊이는 다른 현미경 기술보다 크다16. SHG 이미징으로 달성한 고해상도(μm 수준)는 개별 섬유의 시각화도 가능하게 합니다. 이는 콜라겐 섬유의 수, 콜라겐 섬유의 배향, 분포의 국소 정량화와 같은 많은 가능성을 제공한다19.

기계적 테스트와 결합된 디지털 이미지 상관관계(DIC)는 생물학적 조직(20)의 국소적인 기계적 특성을 얻기 위해 널리 사용되는 방법이다. DIC를 이용하면, 조직 표면에 적용된 스페클의 변위는 기계적 테스트(20) 동안 획득된 고속 카메라 이미지를 비교함으로써 추적된다. 이 이미지 후처리 방법은 시편(20 )의 전장 표면 변형을 추정하는 데 사용되며 조직(21)의 파열 거동을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

Protocol

이 논문에 설명된 모든 방법은 로테르담에 있는 에라스무스 의료 센터의 윤리 연구 위원회의 승인을 받았습니다. 플라크 표본 수집 전에 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 프로토콜의 워크플로 차트는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 조직 수집, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 이미징 및 테스트 샘플 준비

  1. 조직 수집 및 보관
    1. 경동맥 내막 절제술을 받은 동의한 환자로부터 신선한 인간 경동맥 죽상경화반 표본을 수집합니다.
      참고: 이 수술에서 채취한 플라크 샘플은 지방(지질 풀)의 축적과 석회화를 포함하여 경동맥의 병든 내막층으로 구성됩니다22.
    2. 인산염 완충 식염수(1x PBS)를 사용하여 혈액 잔여물을 제거하고 거즈 패드로 검체를 건조시킵니다.
    3. 핀셋을 사용하여 표본을 15mL 튜브에 넣습니다. 튜브를 액체 질소에 10분 동안 넣어 조직을 급속 동결합니다.
    4. 급속 동결 후, μCT 이미징 당일까지 샘플을 -80°C 냉동고에 보관한다.
      알림: 스냅 동결은 결정 형성을 최소화하여 조직의 미세 구조적 손상을 유발합니다. 돼지 대동맥 조직에 대한 이전 연구에서는 급속 냉동 및 -80°C에서의 보관이 조직의 기계적 특성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다23.
  2. μCT 이미징
    1. μCT 이미징 당일 15mL 튜브에서 플라크 검체를 꺼냅니다. 조직이 튜브에 달라붙으면 실온에서 튜브에 PBS를 채웁니다. 샘플을 튜브에서 꺼낼 수 있을 때까지 조직을 PBS에 그대로 두십시오.
    2. 티슈 페이퍼로 플라크 표본을 완전히 건조시킵니다.
    3. 녹색 버튼을 눌러 μCT 시스템을 켭니다. 화면 하단의 CT 소프트웨어에서 워밍업을 누르고 15분 동안 기다립니다.
    4. Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm의 X선 필터를 μCT 시스템에 수동으로 배치합니다.
    5. 이미지를 저장할 폴더를 선택합니다.
    6. 왼쪽 패널에서 매개 변수를 선택합니다. 드롭다운 목록을 사용하여 스캔 시간 4분, 분해능 172μm, 전압 90kV, 암페어 88mA, 시야각 86mm, 회전 360°를 선택합니다.
    7. 장치의 도어를 엽니다. 플랫폼을 수동으로 당겨 빼냅니다.
    8. 플랫폼에 파라필름을 놓고 샘플을 플랫폼에 놓습니다(플랫폼의 더 극단을 향해).
    9. 수동으로 플랫폼을 장치에 놓고 도어를 닫습니다.
    10. 라이브 모드(눈 아이콘)를 활성화합니다. 장치의 화살표가 있는 플랫폼을 이동하여 샘플을 FOV의 중앙에 배치합니다.
    11. 이미징을 시작합니다(하단 중앙의 아이콘). 이미징이 완료되면 하단의 도어 아이콘(중단 버튼 아래)을 누릅니다.
    12. μCT 스캔 후 1.1.3 단계에 설명된 대로 플라크 표본을 다시 스냅 동결합니다. 다광자 현미경 이미징 및 기계적 테스트 당일까지 -80 °C에서 보관하십시오.
    13. μCT 이미징의 획득된 DICOM 파일을 오픈 소스 3D 슬라이서 소프트웨어(24)에서 엽니다.
    14. 세그먼트 편집기로 이동합니다. create a new segmentation | the volume to be analyze as a master volume을 선택합니다.
    15. Add(추가)를 클릭하여 세그먼트를 추가합니다. 이름과 색상을 눌러 이 매개변수를 변경합니다.
    16. 세그먼트를 정의하려면 창 하단에 있는 effects | threshold를 클릭합니다. 이 임계값 도구를 사용하여 석회화된(>450 HU) 조직 영역과 석회화되지 않은(<450 HU) 조직 영역을 구별합니다. 임계값이 선택되면 하단의 적용을 누릅니다.
    17. Show 3D(추가 바로 오른쪽)를 눌러 3D 보기에서 분할을 시각화합니다. 원하지 않는 분할 영역이 있으면 가위 효과로 제거하십시오.
    18. 원하는 세그멘테이션의 이름을 클릭하여 세그멘테이션 모듈에서 세그먼트의 불투명도를 변경합니다.
      참고: 가능하면 μCT 이미징 및 검토는 나머지 프로토콜과 같은 날에 수행할 수 있습니다. 이 경우 1.2.12단계를 건너뜁니다. 그러나 이 프로토콜의 후속 단계도 시간이 많이 걸리고 같은 날에 수행해야 한다는 점을 고려하십시오. 몇 가지 연습 후 설명된 설정 및 조직을 사용하여 μCT 이미징은 ~45분이 소요되어야 하며, μCT 이미지 검토는 ~15분, 단일 테스트 샘플의 테스트 샘플 준비 ~1시간, 현미경 ~4시간, 단축 인장 테스트 ~2시간.
  3. 테스트 샘플 준비
    1. 콜라겐 이미징 및 기계적 테스트 당일, 실온에서 약 10분 동안 PBS에 담가 플라크를 해동합니다.
    2. 3D 슬라이서 소프트웨어에서 1.2.13-1.2.18단계에서 만든 플라크의 3D 구성을 엽니다.
    3. 플라크 조직의 자연적 랜드마크를 사용하여 3D 재구성의 어느 부분이 실제 플라크 샘플과 일치하는지 식별합니다. 3D 재구성의 어느 영역에 석회화가 포함되지 않았는지 식별하고 실제 플라크에서 이 영역을 시각적으로 식별합니다.
    4. 수술 용 가위와 핀셋을 사용하여 동맥의 세로축을 따라 플라크를 자릅니다. 수술로 인한 절상이 이미 있는 경우 조직을 최적으로 사용하기 위해 이 절개부터 시작하십시오. 샘플이 관 모양이 아니고 세로 방향을 정의하기 어려운 경우 샘플이 테스트에서 제외됩니다.
    5. 플라크 표본에서 직사각형 테스트 샘플을 잘라냅니다. 테스트 샘플이 찢어지거나 석회화가 포함된 조직 영역을 피하면서 가능한 한 큰지 확인하십시오. 인장 시험 중 시험편 가장자리의 작은 찢어짐이나 균열로 인해 기존 균열에서 균열이 전파될 수 있으므로 이 절단 중에 주의하십시오.
    6. 시험 샘플이 인장 시험기에 장착된 후 표점 거리의 너비 대 길이(WL) 비율이 <1인지 확인하십시오. 샘플이 이 요건을 충족하면, 경계 조건(25)의 관점에서 적절한 인장 시험에 적합하다.
      참고: 샘플 치수의 범위는 클 수 있습니다. 저자가 테스트한 샘플의 표점 거리는 3.4mm에서 12.9mm 사이이고 너비는 1.6mm에서 6.4mm 사이였습니다.

2. 다광자 현미경 이미징

  1. 준비
    1. 콜라겐 이미징 및 기계적 테스트 전에 실리콘 엘라스토머 베이스 40g을 두 개의 50mL 튜브에 나누고 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 튜브에 경화제 2g을 추가합니다(1:10 비율). 피펫으로 두 구성 요소를 혼합하십시오.
    2. 튜브를 700 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 가능한 한 많은 기포를 제거합니다.
    3. 페트리 접시(직경 10cm)에 얇은 실리콘층(약 0.5-1cm)을 채우고 65°C의 오븐에서 3시간 동안 배양하거나 실온에서 48시간 동안 두십시오.
    4. 플라크 테스트 샘플을 채취하여 조직에 바늘을 고정하여 양쪽 끝을 실리콘에 고정합니다(그림 2A). s의 내강 면이 s를 확인하십시오.amp르가 위쪽을 향하고 있습니다. 기계적 시험 중 인장 시험 장치의 클램프에 들어갈 샘플 영역에 바늘을 삽입합니다.
    5. 보안경을 착용하십시오. 측면 커터를 사용하여 바늘이 샘플 표면에서 몇 밀리미터 미만으로 튀어나오도록 줄여 현미경 대물렌즈가 손상되지 않도록 합니다. 샘플이 잠길 때까지 페트리 접시에 PBS를 채웁니다.
  2. 현미경 설정
    1. 다광자 현미경에 적절한 대물렌즈가 장착되어 있는지 확인하십시오. 적외선을 투과하도록 최적화된 대물렌즈를 20x 배율로 사용합니다.
    2. 현미경 시스템을 시작합니다. 현미경의 작동 소프트웨어를 엽니다.
    3. 이미징 테이블을 초기화하라는 메시지가 표시되면 현미경 콘덴서 암이 뒤로 밀려 있고 대물렌즈가 가장 낮은 위치에 있는지 확인합니다.
    4. 다광자 레이저를 활성화합니다.
    5. 그림 3과 같이 테스트 샘플이 들어 있는 페트리 접시를 대물렌즈 아래에 놓습니다. 대물렌즈를 s에 올려놓지 마십시오.amp레이저 설정을 여전히 최적화해야 하므로 아직. 그렇지 않으면 레이저 광의 높은 출력으로 인해 조직이 손상 될 수 있습니다.
    6. 대물렌즈가 PBS에 약간 잠겨 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 피펫을 사용하여 추가 PBS를 추가합니다.
    7. 빛의 파장을 880nm로 설정합니다.
      알림: 이 파장은 사용된 이광자 시스템의 SHG 방출 필터가 약 440nm의 중심 파장을 갖기 때문에 선택됩니다. 다른 현미경의 경우 다른 파장이 더 적합할 수 있습니다.
  3. 타일 스캔 및 이미징 위치 선택
    1. 다광자 레이저를 끄고 현미경의 명시야 모드를 활성화합니다. 그런 다음 라이브 스캔 모드를 켭니다.
    2. 대물렌즈가 샘플 위에 위치하도록 스테이지를 배치하고 샘플 표면에 초점을 맞춥니다. 라이브 스캔 모드를 끕니다.
    3. 획득 탭 아래의 두 번째 패널에서 원하는 막대를 밀어 확대/축소 비율을 1로 변경합니다.
      참고: 이 줌 배율은 대물렌즈의 배율(20x)과 함께 캡처된 이미지의 크기(739μm x 739μm)를 결정합니다.
    4. 획득 탭의 두 번째 패널에서 드롭다운 목록을 사용하여 스캔 속도를 400Hz로, 라인 평균을 1로, 해상도를 이미지당 128 x 128픽셀(픽셀 크기 ~5.8μm x 5.8μm)로 변경합니다.
    5. 획득 탭의 첫 번째 패널에서 래스터 패턴 기호를 클릭하고 타일 스캔 패널이 나타날 때까지 기다립니다.
    6. 라이브 스캔 모드를 켭니다. 스마트 패널의 손잡이를 사용하여 대물렌즈를 샘플의 모서리로 이동하고 타일 스캔 패널에서 마크 위치 기호를 클릭합니다. 샘플의 각 모서리에 대해 이 작업을 반복합니다. 올바르게 수행되면 이미징을 위해 선택한 모든 타일이 있는 그리드가 주황색으로 나타납니다.
    7. 자동 스티칭 기능을 끕니다.
    8. 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 전체 샘플 표면의 타일 스캔을 생성하여 샘플 형상의 개요를 가져옵니다.
      참고: 설명된 설정, 조직 및 현미경 시스템에 따라 전체 샘플 표면의 타일 스캔을 획득하는 데 ~10분이 걸립니다.
    9. 타일 스캔 후 현미경 시스템의 소프트웨어에 의해 자동으로 표시되는 타일 스캔 패널에서 각 타일의 왼쪽 상단 모서리의 x 및 y 좌표를 관찰합니다. 스프레드시트에 이러한 좌표를 기록해 둡니다.
    10. 현미경 소프트웨어의 타일 스캔 패널에서 scanfield라는 상자의 x 및 y 방향에 있는 타일 수를 관찰합니다. 스프레드시트에서 타일 스캔의 크기를 확인합니다. 타일의 크기(739μm)를 더하거나 빼서 다른 타일의 좌표를 계산합니다.
      참고: 이 좌표는 SHG 이미징으로 스캔할 타일의 정확한 위치를 식별하는 데 필요합니다. 전체 이미징 시간이 문제가 되지 않는 경우 타일을 건너뛰지 않고 모든 타일을 이미지화할 수 있습니다.
    11. 타일 스캔에서 SHG 이미징으로 이미지화할 타일을 선택합니다. 이 선택의 경우 cl에 있는 타일을 피하십시오.amps를 선택하고 그림 2B와 같이 세로 방향과 원주 방향 모두에서 선택한 각 타일 사이에 하나의 타일을 남겨 둡니다.
  4. 콜라겐 시각화: SHG 이미징
    1. 방의 조명을 끄고 현미경을 덮으십시오.tage는 방의 빛이 감지기에 도달하지 않도록 암막 천으로 덮습니다.
      알림: 감지기에 도달하는 빛을 최소화하면 이미지 획득 중 노이즈가 줄어듭니다.
    2. 다광자(MP) 레이저를 켭니다.
    3. 430-450nm 대역 통과 필터가 장착된 NDD(Non-Descanned Detection) 검출기를 선택합니다.
    4. 2.3.10 단계에서 획득한 정보를 사용하여 이미지화할 타일의 위치를 식별합니다. 지정된 상자에 좌표 를 입력하고 Enter 키를 클릭하면 목표가 오른쪽 타일로 이동합니다. 라이브 스캔 모드를 켭니다.
      참고: 다른 현미경 또는 최신 버전의 운영 소프트웨어를 사용하면 타일 스캔 내의 위치로 자동으로 이동할 수 있습니다. 이 경우, 각 타일의 x- 및 y- 좌표를 기록하고(단계 2.3.10) 운영 소프트웨어에서 좌표를 채울 필요가 없다(단계 2.4.4).
    5. 빔 경로 설정 아래의 상단 패널에 있는 슬라이더를 사용하여 MP 레이저 출력을 높이면 상당한 표백 없이 가능한 최고의 레이저 출력을 얻을 수 있습니다. 그런 다음 스마트 패널의 노브를 사용하거나 빔 경로 설정 | 추가 채널에서 감지기 이름을 클릭하여 포화 픽셀이 없는 밝은 이미지를 얻기 위해 감지기 게인을 조정합니다. 검출기 이득의 일반적인 값은 500V에서 800V 사이입니다.
    6. 스마트 패널의 z 위치 노브를 사용하여 초점 평면을 조정합니다.
    7. 샘플의 상단으로 이동하고 z-스택 패널(획득 탭 | 3번째 패널 아래)에서 화살촉을 클릭하여 z-스택 상단의 위치를 설정합니다.
    8. 그런 다음 SHG 신호가 더 이상 감지되지 않을 때까지 샘플에 초점을 맞춥니다. 다시 z-스택 패널에서 화살촉을 클릭하여 이 위치를 설정합니다. 완료되면 라이브 스캔 모드를 끕니다.
      참고: 조직이 완전히 평평하지 않을 수 있습니다. 그러므로, 조직 내의 상이한 영역의 샘플 표면은 z 방향에서 약간 상이한 위치를 가질 수 있다.
    9. 획득 탭의 두 번째 패널에서 드롭다운 목록을 사용하여 스캔 속도를 400Hz로 유지하고, 라인 평균을 2로 설정하고, 해상도를 이미지당 512 x 512픽셀(픽셀 크기 ~1.4μm x 1.4μm)로 설정합니다. 양방향 X 스캐닝 버튼을 켭니다.
    10. z-스택 패널에서 z-스텝 크기를 클릭하고 상자에 3μm의 z-스텝 크기를 입력합니다. 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 z-스택을 만듭니다. 완료되면 타일의 좌표를 파일 이름에 저장하거나 각 타일에 고유한 번호를 지정해야 합니다(그림 2B 참조).
      참고: 설명된 설정, 조직 및 현미경 시스템을 기반으로 단일 타일의 z-스택을 획득하는 데 ~10-15분이 걸립니다. 준비 단계(단계 2.4.4-2.4.10)는 이 예상 시간 내에 포함됩니다.

3. 기계적 테스트

  1. 단축 인장 시험 셋업 준비
    1. 수평 인장 시험 설정(그림 4)을 인장 시험기 지침(예: 소프트웨어 켜기, 클램프 부착, 로드셀 부착)에 따라 사용할 준비를 합니다.
    2. 시험 샘플의 미끄러짐을 최소화하려면 양면 폼 테이프(그림 4A,B-2)를 인장 시험기 클램프의 내부 면에 부착하고 사포를 폼 테이프 내부에 부착합니다. 결국 사포는 테스트 샘플과 접촉하게 됩니다.
    3. 가열 수조(그림 4A,B-3)를 제자리에 놓습니다. 가열 수조를 클램프의 바닥면 높이까지 PBS로 채워 아직 사포에 닿지 않도록합니다.
    4. 가열 수조의 전원을 켜고 온도를 약 37°C로 설정합니다.
    5. 예를 들어 인장 시험 시스템(그림 4A-4) 위에 고속 카메라를 장착하고, 예를 들어 실험실 스탠드를 사용하여 초점 거리가 50mm인 렌즈를 연장 링을 통해 카메라에 장착합니다.
    6. 클램프에 초점이 맞춰져 있고 시야가 전체 스트레칭 절차(FOV 너비: ± 샘플 너비 동안 샘플을 기록할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오. FOV 길이: ± 샘플 길이의 2배).
    7. 조명 시스템(그림 4A-5)을 인장 시험 시스템 위에 장착합니다(예: 실험실 스탠드를 사용). 조명 시스템을 켜고 조명 강도와 위치를 조정하여 카메라 이미지에서 관찰할 PBS 표면에 반사가 없도록 합니다.
    8. 카메라의 노출 시간과 게인을 조정하여 선명한 이미지를 얻으십시오.
    9. 이미지 획득 소프트웨어가 5.2 MP의 해상도에서 30 frames/s로 캡처하도록 설정합니다.
      참고: 이 높은 프레임 속도는 후속 DIC 분석을 수행하고 파열 동작을 연구하는 데 필요합니다.
    10. 기계적 테스트 중 전체 엔지니어링 변형률이 조직의 생체 내 생리학적 변형률과 유사하도록 클램프 중 하나의 변위 속도를 설정합니다
      (플라크 조직26의 경우 5%/s).
  2. 스페클 패턴 생성
    참고: 이 스페클 패턴 프로토콜은 Walsh et al.27의 이전 작업을 기반으로 합니다.
    1. 티슈 페이퍼로 가볍게 두드려 샘플을 건조시킵니다.
    2. 에어브러시의 의도한 양동이에 검은색 티슈 염료를 넣습니다.
    3. 에어브러시를 압축기에 연결합니다. 에어브러시 압축기를 켜고 압력을 25PSI로 설정합니다.
    4. 티슈에 뿌리기 전에 종이에 최적의 얼룩 패턴을 만들어 보십시오. 흑백 비율 50:5028이 충족될 때까지 몇 번 분사합니다. 스페클의 크기가 고속 카메라(29)의 3-5 픽셀의 크기와 유사해질 때까지 스페클 패턴의 거칠기를 조정하기 위해 에어브러시의 바늘을 앞뒤로 움직인다.
      알림: 스페클 패턴은 두 가지 다른 용도로 사용됩니다. 먼저, 이러한 스페클의 변위는 기계적 테스트 (DIC, 단계 4.2) 동안 획득 한 고속 카메라 이미지를 비교하여 측정됩니다. 둘째, 이 스페클 패턴은 샘플의 변형되지 않은 상태의 이미지에서 파열 위치를 식별하는 데 사용됩니다(단계 4.3.1).
    5. 에어브러시를 테스트 샘플에서 약 30cm 떨어진 곳에 잡고 내강 표면에 뿌립니다.
    6. PBS에 샘플을 담그기 전에 실온에서 1분 동안 염료를 샘플에 결합시킵니다.
  3. 단축 인장 시험
    1. 샘플을 인장 시험기의 클램프에 넣고 샘플의 원주 방향이 인장 스트레칭 방향과 정렬되고 샘플의 내강 면이 위쪽을 향하도록 합니다. 스트립의 WL 비율이 <1이 되도록 초기 표점 거리가 설정되어 있는지 확인하십시오.
    2. 토크 드라이버를 사용하여 20cNm의 토크를 가하여 그립의 나사를 조입니다. 최종 토크를 적용하기 전에 각 나사에 작은 토크를 적용하여 점진적으로 수행하십시오.
    3. 샘플에 테스트에 영향을 줄 수 있는 눈물이 포함되어 있는지 육안으로 검사합니다.
    4. 샘플이 잠길 때까지 가열 수조에 더 많은 PBS를 도입하고 PBS의 온도가 다시 37°C에 도달할 때까지 기다립니다.
    5. 고속 카메라로 보정 이미지를 획득하며, 여기에는 테스트 샘플과 눈금자가 참조로 포함되어 있습니다. 눈금자가 카메라 대물렌즈에서 샘플의 내강 표면과 같은 거리에 있는지 확인합니다.
    6. 로드셀의 무게를 측정하고 로드셀과 인장 시험기의 액추에이터에서 전체 힘 및 변위 측정값을 기록하기 시작합니다.
    7. 샘플의 느슨함을 제거하기 위해 0.05N의 프리스트레치를 적용하여 샘플을 곧게 펴십시오. 프리스트레치 적용 후 액추에이터의 게이지 거리 측정을 기준으로 최대 10% 변형률까지 10주기의 사전 컨디셔닝을 수행합니다.
    8. 샘플이 완전히 파손될 때까지 단축 인장 시험을 시작하고 고속 카메라로 샘플 변형 비디오를 녹화합니다. 조직 파괴 후 전체 힘 및 변위 측정 기록을 중지하십시오.
      참고: 일부 상업용 인장 시험기는 3.3.6-3.3.9단계를 자동으로 수행할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 이 자동 옵션이 사용 중인 인장 시험기에 포함되지 않은 경우 수행해야 하는 수동 단계를 설명합니다.
    9. 인장 시험 장치에서 시험 샘플을 제거하고 적절하게 폐기하십시오.
    10. 다음 샘플을 테스트할 때 클램프의 사포와 폼 테이프를 교체하십시오.

4. 데이터 분석

  1. 콜라겐 조직 분석
    1. ImageJ에서 SHG를 사용하여 MPM 중에 얻은 z-스택을 열고 각 z-스택의 최대 강도 투영(MIP)을 만듭니다.
    2. 오픈 소스 MATLAB 기반의 FOA(Fiber Orientation Analysis) 도구(30 )로 각 MIP를 분석하여 타일 내에 존재하는 개별 콜라겐 섬유의 배향각을 측정한다. 다음 매개 변수를 사용하십시오 : 스케일 : [3 4 5] 또는 [2 4 6], 용기 직경에 따라 및 혈관 임계 값 : 0.999, 0.9995 또는 0.9999, SHG 신호의 강도에 따라.
      참고: 이 도구를 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 소프트웨어 설명서31에서 찾을 수 있습니다.
    3. 또 다른 오픈 소스 MATLAB 기반 툴인 FibLab32를 사용하여 가우스 분포를 각도 분포 히스토그램에 피팅합니다.
      참고: 이 도구를 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 소프트웨어 설명서32에서 찾을 수 있습니다.
    4. FibLab을 사용하여 얻은 가우스 분포도에서 MATLAB의 작업 공간에서 분포 모드인 우세한 섬유 각도(μ p), 섬유 각도 분포의 표준 편차(σp) 및 이방성 분율(Pani = 1 − Piso)을 추출합니다.
      참고: 등방성 분획은 가우스 분포에서 기준선 아래의 면적인 반면, 이방성 분율은 기준선33 위의 피크 면적을 포함합니다. σ p 및p ani 는 모두 타일 영역에서 섬유 배향의 분산에 대한 정보를 제공합니다.
    5. 육안 검사를 위해 방향선(oriented lines)을 사용하여 p μ플로팅하고 색상 맵을 사용하여 p와 Pani를 σ.
  2. 디지털 이미지 분석 및 파열 분석
    1. 파열이 시작되는 프레임을 식별하기 위해 카메라 이미지에 대한 육안 검사를 수행합니다. 이 프레임에서 파열 위치를 시각적으로 식별하십시오.
    2. 카메라 이미지에 대한 육안 검사를 수행하여 기계적 테스트 시작 시 파열 위치에서 최종 균열 또는 찢어짐을 식별합니다. 이러한 눈물이 있으면 샘플을 분석에서 제외하십시오.
    3. 오픈 소스 MATLAB 기반 소프트웨어 Ncorr(v1.2)34를 사용하여 DIC 분석을 수행합니다. Ncorr 매뉴얼35의 단계를 따르십시오.
      1. 인장 시험 중에 촬영한 카메라 이미지를 DIC용 고속 카메라로 사용하십시오. 실패 시까지(사전 컨디셔닝 후) 최종 스트레칭 전의 마지막 프레임을 참조 이미지로 선택합니다. 현재 이미지의 경우 최종 스트레칭 시작부터 파열 시작이 발생한 프레임 앞의 마지막 프레임까지 모든 이미지를 선택합니다.
      2. 시료 표면을 관심 영역(ROI)으로 선택합니다. 클램프에 가까운 영역(약 1mm)은 제외합니다.amps, 이 영역의 변형은 그립의 영향을 많이 받기 때문입니다.
      3. 다음 매개 변수를 사용하여 DIC 분석을 수행합니다. 하위 집합 반경: 30픽셀; 하위 집합 간격: 3픽셀; 반복 컷오프: 50; 차이 벡터 컷오프의 표준: 10-5; 변형 반경 : 5; 자동 전파, step#: 5.
      4. Ncorr을 사용한 DIC 분석에서 ROI의 그린-라그랑주(또는 오일러 변형률) 분포를 얻습니다. 이러한 변형률 분포를 사용하여 파열 전 마지막 프레임에서 전체 플라크 샘플 표면의 평균 그린-라그랑주 변형을 계산합니다. 파열 위치에서 그린-라그랑주 변형률을 계산합니다.
  3. 파열 위치의 구조적 및 기계적 데이터 상관 관계
    1. 테스트 샘플의 자연 랜드마크와 테스트 샘플에 적용된 스페클을 사용하여 참조 이미지에서 파열 위치(4.2.1단계에서 식별됨)를 식별합니다(단계 4.2.3.1).
    2. 테스트 샘플의 자연 랜드마크를 사용하여 참조 이미지와 타일 스캔(2.3단계)을 오버레이하여 타일 스캔에서 파열 위치를 식별합니다. 파열이 발생한 MPM-SHG 타일을 식별합니다. MPM-SHG로 스캔한 타일에 파열이 없는 경우 파열 위치에 가장 가까운 타일을 식별합니다. 파열이 발생한 타일에서 발견된 구조적 매개변수를 구합니다.

Representative Results

조직 수집 및 테스트 샘플 준비
조직 수집은 구조 이미징 및 단축 인장 테스트를 위해 개별 테스트 샘플로 해부할 수 있는 플라크 섬유 조직 표본을 생성합니다. 이상적으로, 수집된 섬유 조직 샘플에는 눈물이 거의 또는 전혀 없는 영역(그림 5A)과 거대 석회화(그림 5B)가 포함됩니다. 이러한 과도한 눈물과 석회화(그림 5C)는 앞서 언급한 WL 1의 샘플 치수 요구 사항을 충족하지 않는 플라크 샘플로 이어질 수 있습니다.

다광자 현미경 이미징
SHG 이미징 및 이미지 후처리는 이미지화된 각 타일에서 MIP를 제공합니다(그림 6A,B). 섬유 검출(그림 6C)에 의한 추가 후처리는 콜라겐 구조 매개변수를 추출할 수 있는 섬유 배향 히스토그램(그림 6D)을 산출합니다(그림 6E). 또한 시각적 분석을 위해 전체 플라크 샘플에 걸쳐 국소 구조적 콜라겐 매개변수를 보여주는 컬러 맵을 얻을 수 있습니다(그림 6F, G). 그림 6의 대표적인 테스트 샘플의 경우 구조적 콜라겐 매개변수의 큰 샘플 내 변동이 발견됩니다(μ p = -34° ± 32°의 평균 ± SD; σp = 21° ± 4°; Pani = 0.49 ± 0.14, 원주 방향이 0°로 정의된 경우). 이 샘플 내 변동은 균질성을 가정하는 대신 국소 구조 매개변수를 얻는 것의 중요성을 강조합니다.

기계적 테스트
파열 동작
고속 카메라는 기계적 테스트 중 플라크 샘플의 변형 및 파열 거동에 대한 이미지를 제공합니다(그림 7). 이러한 이미지에서 파열 개시 위치와 파열 전파 경로를 식별할 수 있습니다. 파열 식별 결과는 카메라 이미지에 기포 또는 반사가 존재하거나 파열이 너무 빠르게 전파되어 선택한 프레임 속도로 캡처할 수 없는 경우 최적이 아닙니다.

국소 변형 패턴
단축 인장 시험 중에 획득한 카메라 기록에 대한 디지털 이미지 상관 분석은 그림 8에 표시된 Green-Lagrange 변형 맵과 같은 국소 조직 변형 맵을 제공합니다. 이 맵은 파열이 시작되기 전에 프레임에서 세 가지 변형 성분(εxx, εxy 및 εyy)을 표시합니다. 이러한 변형 맵으로부터, 관심 영역에서의 평균 변형률 및 파열 위치와 같은 지점에서의 국소 변형률이 추출될 수 있다.

그림 8의 대표 샘플의 경우, 국소 변형률 데이터는 큰 샘플 내 변동을 보여줍니다. 그림 8의 대표적인 시험 샘플의 경우, 국소 균주에서 큰 샘플 내 변동이 발견됩니다 (관찰 된 균주의 범위는 다음과 같습니다 : εxx = -0.30-0.17; εxy = -0.13-0,20; εyy = 0-0.40). 이것은 조직 균질성을 가정하여 얻은 총체적인 평균값 대신 지역 데이터를 얻는 것의 중요성을 강조합니다.

기계적 및 구조적 조직 정보의 상관 관계
상기 언급된 결과는 조직의 국소 변형 및 파열 거동을 콜라겐 구조에 회상시킬 수 있게 한다. 파열 위치가 카메라 녹화(그림 9A)에서 식별되면 참조 카메라 이미지(그림 9B) 및 현미경 타일 스캔(그림 9C)에 다시 매핑할 수 있습니다. 이는 파열이 발생한 MPM-SHG 타일과 이 타일에서 발견된 구조적 매개변수를 제공합니다(그림 9D). 그림 9에 표시된 대표 샘플에서 파열이 발생한 타일에서 발견되는 구조 매개변수는μ p = 28°, σp = 19° 및 Pani = 0.6입니다. 파열되지 않은 조직 위치에도 동일한 절차를 적용할 수 있습니다. 파열 프레임의 참조 이미지에서 파열 위치를 매핑하는 것은 스페클 패턴이 좋지 않고 자연 랜드마크가 불분명한 경우 어려울 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 조직의 자연적 랜드마크가 충분히 명확하지 않은 경우, 타일 스캔 오버레이 및 고속 카메라 이미지의 공동 등록이 어려울 수 있다.

Figure 1
그림 1: 제시된 실험 프로토콜의 워크플로 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 타일 스캔에서 SHG 이미징을 위한 타일 선택 . (A) 테스트 샘플은 실리콘에 고정되어 있습니다. (B) 명시야 현미경으로 얻은 테스트 샘플의 타일 스캔. SHG 이미징을 위해 선택한 타일은 파란색 사각형으로 표시됩니다. (C) SHG를 사용한 MPM의 최대 강도 투영. 스케일 바 = 140 μm (C). 약어: SHG = 2차 고조파 생성; MPM = 다광자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 다광자 현미경의 대물렌즈 아래에 놓인 플라크 샘플. 플라크 샘플의 위치는 인산염 완충 식염수로 채워진 페트리 접시에 의해 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 맞춤형으로 설계된 단축 인장 시험기(다양한 구성품 표시). (A) 시스템의 전체 개요. 클램프의 사포 인서트는 하단 클램프만 부착되어 있으므로 볼 수 있습니다. (B) 시험 준비가 된 시험편이 있는 인장 시험기의 클램프 확대 이미지. 약어: PVC = 폴리염화비닐; LED = 발광 다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 대표 샘플의 조직 수집 및 샘플 준비 결과 . (A) 경동맥 내막 절제술을 받은 동의한 환자로부터 채취한 신선하고 온전한 플라크 샘플. (B) μCT 스캔에서 3D 재구성. 석회화된 조직은 연한 파란색으로 표시되고 석회화되지 않은 조직은 빨간색으로 표시됩니다. 석회화된 조직이 없는 최적의 샘플은 파란색 선 사이의 영역에서 얻을 수 있습니다. (C) μCT 스캔에서 석회화된 조직이 과다한 최적이 아닌 플라크를 보여주는 3D 재구성. 스케일 바 = 3mm. 약어: μCT = 미세 컴퓨터 단층 촬영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: MPM-SHG는 대표 샘플의 결과입니다. (A) 타일 스캔 개요; 이미징을 위해 선택한 타일은 파란색으로 표시됩니다. (B) 다양한 타일의 MIP. (C) 선택한 타일에서 FOA 도구에 의한 섬유 감지. (D) 선택한 타일의 섬유 배향 히스토그램. (E) 섬유 배향 히스토그램 + 가우시안 핏(Gaussian fit), 이로부터 콜라겐 구조 파라미터가 선택된 타일로부터 추출될 수 있다. (F) 전체 플라크 샘플에 걸쳐 μ p(배향 검정선) 및 σp(배경색)의 표현. (G) 전체 플라크 샘플에 걸쳐 μp(배향 검정선) 및p ani(배경색)의 표현. 스케일 바 = 140 μm (B,C). 약어: MPM-SHG = 다광자 현미경-2차 고조파 생성; MIPs = 최대 강도 예측; FOA = 섬유 배향 분석; μp = 우세한 섬유 각도; P ani = 이방성 분획; σp = 섬유 각도 분포의 표준 편차; Piso = 등방성 분획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 인장 시험 절차 중 플라크 조직 샘플에서 파열 시작 및 전파.1) 미리 늘어난 상태, 손상되지 않은 조직. 2) 파열 개시 - 파열이 관찰되는 첫 번째 프레임. 파열 개시 위치는 빨간색 사각형으로 표시됩니다. 3 ) 및 4) 파열 전파. 5) 플라크 샘플의 완전한 파열. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 파열 전 프레임에서 대표 샘플(εxx, εxy 및 εyy)의 Green-Lagrange 변형 패턴, DIC 분석으로 얻은 것. 전체 플라크에 대한 평균 및 표준 편차가 파열 위치의 변형률과 함께 제공됩니다. 약어: DIC = 디지털 이미지 상관관계; εxx = 세로 변형률; εxy = 전단; εyy = 인장 변형률. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: 이미지에 파열 위치(빨간색 사각형)의 오버레이 이미지. (A) 파열이 식별되는 고속 카메라 이미지(파열 프레임). (B) 프리스트레치만 적용된 고속 카메라 이미지(참조 프레임). (C) 현미경을 통해 얻은 타일 스캔 이미지. (D) 다양한 타일에서 국소 콜라겐 구조 파라미터를 보여주는 색상으로 구분된 지도. 전체 플라크 샘플에 걸쳐μ p(배향 검정선) 및p ani(배경색)가 제시된다. 약어: μp = 우세한 섬유 각도; Pani = 이방성 분획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

현재 연구는 섬유성 죽상경화성 플라크 조직의 국소 콜라겐 방향과 분산, 국소 기계적 특성 및 파열 거동 사이의 상관관계를 연구하기 위한 기계 이미징 파이프라인 개발에 중점을 두었습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 몇 가지 이유로 혁신적이다. 첫째, 기계적 하중 하에서 섬유상 플라크 조직의 국소 변형을 측정하기 위해 디지털 이미지 상관관계가 적용된 것은 이번이 처음입니다. 둘째, 이 프로토콜은 국소 변형 패턴과 섬유성 플라크 조직의 국소 콜라겐 구조 사이의 연관성을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다. 국소 평가의 중요성은 조직의 이질적인 특성을 보여주는 결과 섹션에 제시된 균주 데이터와 콜라겐 데이터 모두에 의해 강조됩니다. 따라서 이 프로토콜에서 사용되는 것과 같은 국소 평가를 가능하게 하는 기술의 사용은 섬유질 플라크 특성에 대한 향후 연구에 권장됩니다.

테스트 샘플 준비는 이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나입니다. 경동맥 플라크는 주로 콜라겐 조직입니다. 그러나, 이들은 전체 플라크 기계적 거동에 영향을 미치는 것으로 간주되는 석회화를 함유할 수 있다36,37. 이 연구는 플라크의 섬유 조직 구성 요소에 초점을 맞추기 때문에 μCT 이미징38을 사용하여 테스트 샘플에서 석회화를 피할 수 있습니다. μCT를 사용할 수 없는 경우 플라크의 석회화된 영역을 감지하기 위해 MRI 또는 OCT39와 같은 다른 이미징 기술을 고려할 수 있습니다. 석회화가 없고 기계적 검사에 사용할 수 있을 만큼 충분히 큰 섬유질 조직 검사 샘플을 얻는 것은 심하게 석회화되거나 분산된 석회화를 포함하는 플라크에 대해 어려운 작업일 수 있습니다. 프로토콜의 또 다른 과제는 디지털 이미지 상관관계를 위한 최적의 스페클 패턴을 생성하는 것입니다. 최적의 DIC는 50:5028의 흑백 비율이 필요하며, 적절한 품질을 보장하기 위해 3-5픽셀(29)의 스페클 사이즈를 필요로 한다. 이러한 요구 사항을 충족하지 못하면 부정확한 국부 변형률 측정이 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 조직의 자연적 랜드마크가 명확하지 않은 경우 파열 위치를 SHG 이미지에 매핑하는 것이 어려울 수 있습니다. 이러한 샘플의 경우 이미징 전에 조직에 여러 기준 마커를 적용하는 것이 도움이 될 것입니다.

현재 프로토콜에 사용되는 MPM-SHG 기술은 상대적으로 침투 깊이가 큰 고해상도 및 비파괴 기술이기 때문에 다른 많은 콜라겐 이미징 기술보다 우수합니다. 그러나 MPM-SHG의 침투 깊이(<400μm)는 0.5mm에서 2mm 사이의 테스트 샘플의 전체 두께를 이미징할 수 없기 때문에 한계가 있습니다. 확산 텐서 자기 공명 영상(diffusion tensor magnetic resonance imaging, DT-MRI)을 이용한 최근 연구에서, 우리는 플라크 조직의 더 깊은 부분에서의 우세한 섬유 배향이 조직의 보다 표면적인 내강 부분에서의 배향과 다를 수 있음을 입증하였다14. 따라서 두꺼운 섬유질 플라크 조직 샘플의 더 깊은 부분에서 국소 콜라겐 구조와 국소 조직 역학과의 관계를 조사하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 이를 위해 편광 공간 주파수 영역 이미징(pSFDI)을 활용할 수 있습니다. 최근에 개발된 이 광학 이미징 기술은 승모판막 첨판에서 0.8mm 깊이의 섬유 배향을 측정할 수 있는 잠재력이 있는 것으로 보고되었다12. 또한 pSFDI는 빠른 획득을 제공하므로 현재 프로토콜의 경우처럼 타일을 선택하는 대신 전체 샘플 영역을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 현재 프로토콜의 또 다른 한계는 표면 변형만 식별할 수 있다는 것입니다. 향후 연구에서, 미러 어시스트 멀티뷰 DIC40 또는 디지털 체적 상관관계(DVC)41 가 체적, 지하 변형에 대한 추가 정보를 얻기 위해 이 프로토콜에 포함될 수 있다.

현재의 실험 프로토콜은 플라크 파열 역학 및 기본 미세 구조와의 관계에 대한 추가 정보를 얻기 위해 여러 가지 방법으로 추가로 확장되거나 수정될 수 있습니다. 첫째, 현재 프로토콜에는 원주 방향의 단축 인장 시험이 포함됩니다. 이러한 유형의 기계적 테스트는 플라크가 생체 내에서 주로 원주 방향으로 인장 스트레칭을 경험하기 때문에 선택되었습니다. 보다 포괄적인 기계적 특성화를 위해 이 프로토콜을 추가로 확장하여 팽창 테스트, 이축 테스트 또는 길이 방향의 단축 인장 테스트를 통합할 수 있습니다. 둘째, 현재 프로토콜은 DIC를 통해 국소 균주를 얻는 데에만 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 플라크 기계적 거동에 대한 보다 완전한 관점은 프로토콜에 국소 응력 분석을 포함함으로써 얻을 수 있지만 이를 위해서는 국소 강성의 특성화가 필요합니다. 현재로서는 도전적이지만, 이것은 역유한요소법(42,43) 및 가상필드법(44)과 같은 계산 기술에 의해 달성될 수 있다. 실험적 적응 외에도 몇 가지 추가 후처리 단계를 현재 프로토콜에 추가할 수도 있습니다. 첫째, 파열 위치만 식별하는 것이 아니라 획득한 고속 카메라 영상을 통해 균열 전파 경로를 식별할 수 있습니다. 이 전파 경로는 국부적 구조적 및 기계적 파라미터와 상관될 수 있습니다. 둘째, 파열 개시 위치는 설명된 프로토콜에서 시각적으로 확인되었습니다. 비생물학적 조직에 대한 이전 연구에서는 파열45를 감지하기 위해 DIC 변형률 측정의 불연속성을 사용했습니다. 이러한 자동 파열 감지를 플라크 조직에 적용하면 파열 감지의 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 마지막으로, 다른 콜라겐 이미징 기술에 비해 MPM-SHG의 가장 큰 장점은 개별 콜라겐 섬유를 시각화한다는 것입니다. 따라서 이 프로토콜을 통해 얻은 데이터는 콜라겐 함량과 같은 추가 국소 콜라겐 특성을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 생체 내에서 플라크 파열에서 기계적으로 실패하는 구성 요소인 섬유성 플라크 조직의 국소 특성에 대한 더 나은 이해를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이 정보는 환자의 플라크 파열을 예측하는 새로운 구조적 및 기능적 이미징 마커를 설정하는 데 필요합니다. 이전에 제안된 위험 바이오마커가 향후 임상 사건에 대해 차선의 예측 가치를 갖는 것으로 나타났기 때문에 이러한 새로운 마커가 필요합니다 5,6. 미래에, OCT 및 ps-OCT는 동맥계에서 섬유 조직을 확인하고 정량화할 수 있다(46,47,48). 또한, 균주는 국소 플라크 조성물49에 대한 대리 마커로 간주되었다. 따라서, 생체내 변형률 측정치(49)는 잠재적으로 환자에서 플라크 안정성의 식별에 도움이 될 수 있다. 그러나 얻은 결과를 생체 내 플라크 파열로 직접 번역하는 데는 주의해야 합니다. 첫째, 섬유상 플라크 조직은 이 프로토콜에서 사용되는 단방향 인장 하중보다 생체 내에서 더 복잡한 하중을 경험합니다. 둘째, 죽상동맥경화반은 다성분 구조입니다. 섬유상 플라크 조직 내의 생체내 스트레스 및 변형률 분포는 석회화와 같은 다른 플라크 성분의 존재 및 위치에 의해 영향을 받을 수 있다(37).

이 기계 이미징 파이프라인은 다른 콜라겐 조직을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 콜라겐의 글로벌 기계적 테스트 및 구조 이미징은 이미 생물학적 조직에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 콜라겐 구조뿐만 아니라 사전 고장 및 고장 특성에 대한 국소 평가는 이질적인 섬유 조직의 정확한 기계적 특성화에 중요합니다. 우리는 이 새로운 프로토콜의 구조가 여러 생물학적 조직의 미세 구조와 역학 사이의 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공할 것으로 기대합니다.

Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 NWO-Vidi 보조금(18360)으로 자금을 지원받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm extension ring Thorlabs Inc. CML10
15 mL tube VWR 525-0150
20x APO water immersion objective Leica 507701
3D Slicer software N/A Version 4.11
50 mL tubes VWR 525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm Conrad 4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating Thorlabs
Black tissue dye Polysciences inc 24113-2
Camera lens, focal length 50 mm Thorlabs Inc. MVL50M1
Camera stand VWR 241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser Coherent
Compressor + air hose JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62, 4016138577198
Excel Microsoft Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm Pattex
Heating bath N/A Custom made
High-speed camera + imaging software Pixelink-Navitar Inc. PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) N/A
Image J National Institute of Health N/A
LAS-AF Leica Version 2.3 Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II Leica Microscope used for SHG imaging
Lighting system AMZ instruments LED-60TB Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB MathWorks Version R2021A
MATLAB-based FibLab software Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based Ncorr software Georgia Institute of Technology Version 1.2
Needles Emerald BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter) VWR BRND452000
Parafilm VWR 291-1214
Pasteur Pipettes VWR ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm PerkinElmer CLS149276
Ruler Fine Science Tools 1800030
Sandpaper (P180) Conrad 4.00932E+12
Side cutter Conrad 4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184) VWR 634165S
Tensile tester + software + clamps N/A Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver Garant, Hoffman group 659906

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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생명 공학 문제 189
국소 콜라겐 구조와 죽상경화반 섬유조직의 기계적 특성 사이의 상관관계를 연구하는 방법
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Crielaard, H., Guvenir Torun, S.,… More

Crielaard, H., Guvenir Torun, S., Wissing, T. B., de Miguel Muñoz, P., Kremers, G. J., Gijsen, F. J. H., Van Der Heiden, K., Akyildiz, A. C. A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue. J. Vis. Exp. (189), e64334, doi:10.3791/64334 (2022).

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