Summary
Heterojen yapısal ve mekanik aterosklerotik plak özelliklerini incelemek için bir mekano-görüntüleme boru hattı geliştirdik. Bu boru hattı, lokal baskın açının korelasyonunu ve kollajen lifi oryantasyonunun dağılımını, kopma davranışını ve fibröz plak dokusunun gerinim parmak izlerini sağlar.
Abstract
Koroner ve karotis arterlerde aterosklerotik plakların rüptürü ölümcül kardiyovasküler olayların başlıca nedenidir. Bununla birlikte, heterojen, yüksek kollajenöz plak dokusunun rüptür mekaniği ve bunun dokunun fibröz yapısı ile nasıl ilişkili olduğu henüz bilinmemektedir. Plak mekaniğini incelemek için mevcut boru hatları, dokunun yapısal homojenliği varsayımına dayanarak, plak dokusunun yalnızca brüt mekanik özelliklerini elde etmekle sınırlıdır. Bununla birlikte, fibröz plak dokusu, muhtemelen esas olarak kollajen lifi mimarisindeki lokal varyasyondan dolayı yapısal olarak heterojendir.
Burada tarif edilen mekano-görüntüleme boru hattı, heterojen yapısal ve mekanik plak özelliklerini incelemek için geliştirilmiştir. Bu boru hattında, dokunun yerel kollajen mimarisi, ikinci harmonik nesil (SHG) ile çoklu foton mikroskobu (MPM) kullanılarak karakterize edilir ve dokunun arıza davranışı, dijital görüntü korelasyonu (DIC) analizi kullanılarak tek eksenli çekme testi koşulları altında karakterize edilir. Bu deneysel boru hattı, lokal baskın açının ve kollajen lifi oryantasyonunun dağılımının, yırtılma davranışının ve fibröz plak dokusunun gerinim parmak izlerinin korelasyonunu sağlar. Elde edilen bilgi, aterosklerotik plak rüptürü olaylarını daha iyi anlamak, tahmin etmek ve önlemek için anahtardır.
Introduction
Sıklıkla karotis arterlerde aterosklerotik plak rüptürü ile tetiklenen iskemik inme, tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biridir1. Bununla birlikte, karotis ateroskleroza bağlı inmeyi önlemek için mevcut cerrahi tedavi planlama stratejileri plak rüptürü risk değerlendirmesini içermemektedir2. Bunun temel nedeni, plak kapağı kalınlığı3 ve lipit çekirdek boyutu4 gibi daha önce önerilen risk biyobelirteçlerinin, gelecekteki klinik olaylar için suboptimal prediktif değere sahip olduğunun gösterilmesidir 5,6. Plak rüptürü risk değerlendirmesini optimize etmek ve aterosklerotik plakların yeni risk belirteçlerini tanımlamak için plak mekaniğinin ve rüptür mekanizmalarının daha iyi anlaşılması gerekmektedir.
Plak rüptürü, yüksek fibröz plak dokusunun kan basıncı tarafından uygulanan mekanik yüke dayanamadığı ve yapısal bütünlüğünü kaybettiği lokal mekanik bir olaydır7. Buna rağmen, plak kopması olayının mekaniği ve altta yatan mikroyapı ile bağlantısı tam olarak anlaşılamamıştır8. Plak dokusu yetmezliğini karakterize eden az sayıdaki deneysel çalışma, 9,10,11,12,13 brüt mekanik kopma özellikleri (yani , nihai çekme başarısızlığı gerinimi ve mukavemeti) bildirilmiştir. dokunun yapısal homojenliği varsayımı. Bununla birlikte, fibröz plak dokusu yapısal olarak heterojendir, muhtemelen esas olarak kollajen lifi mimarisindeki lokal varyasyona bağlıdır14. Ayrıca, plak dokusu mekanik arıza özellikleri ile kollajen mimarisi arasındaki bağlantı sadece Johnston ve ark. tarafından yapılan yeni bir çalışmada araştırılmıştır. Yazarlar, baskın lif oryantasyonunda bir interplaque farkı gösterdiler ve ağırlıklı olarak çevresel lif oryantasyonuna sahip fibröz plak kapağı örnekleri için daha yüksek nihai gerilmeler ve daha düşük nihai suşlar bildirdiler15. Bununla birlikte, çalışma aynı zamanda brüt mekanik ve yapısal özelliklerle de sınırlıydı.
Fibröz plak dokusunun lokal kollajen mimarisi ve lokal mekanik özellikleri hakkında temel bilgilere ışık tutmak için, bu çalışmada bir mekano-görüntüleme boru hattı geliştirdik. Bu ex vivo boru hattı, yerel kollajen lifi yönünün ve dispersiyonunun yanı sıra yerel kopma suşunun ölçülmesini sağlar. Boru hattı, plak dokusundaki kollajen liflerini görüntülemek için SHG ile MPM görüntülemenin yanı sıra dokunun yırtılma özelliklerini ölçmek için DIC ve tek eksenli çekme testini içerir.
Multifoton mikroskopi-ikinci-harmonik jenerasyon (MPM-SHG), biyolojik dokularda kollajen incelemek için popüler bir teknik haline gelmiştir16. Tekniğin histoloji17, difüzyon tensör görüntüleme (DTI)14 ve küçük açılı ışık saçılması (SALS)15 gibi diğer kollajen görüntüleme tekniklerine kıyasla birçok avantajı vardır. İlk olarak, MPM-SHG görüntüleme tahribatsızdır, bu da mekanik test18 ile birleştirmeyi ideal kılar. İkincisi, SHG sinyali kollajen için spesifiktir ve bu nedenle dokunun boyanmasına gerek yoktur. Uzun uyarma dalga boyları nedeniyle (kızılötesine yakın), penetrasyon derinliği diğer mikroskopi tekniklerinden daha büyüktür16. SHG görüntüleme ile elde edilen yüksek çözünürlük (μm seviyesi), tek tek liflerin görselleştirilmesine de olanak tanır. Bu, kollajen liflerinin sayısının yerel olarak ölçülmesi, kollajen lifi oryantasyonu ve dağılım19 gibi birçok olasılık sunar.
Mekanik test ile birlikte dijital görüntü korelasyonu (DIC), biyolojik dokuların yerel mekanik özelliklerini elde etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir20. DIC ile, doku yüzeyine uygulanan lekelerin yer değiştirmesi, mekanik test sırasında elde edilen yüksek hızlı kamera görüntüleri karşılaştırılarak izlenir20. Bu görüntü son işleme yöntemi, numune20'nin tam alan yüzey suşlarını tahmin etmek için kullanılır ve ayrıca doku21'in yırtılma davranışını incelemek için de kullanılabilir.
Protocol
Bu yazıda açıklanan tüm yöntemler Rotterdam'daki Erasmus Tıp Merkezi'ndeki Etik Araştırma Komitesi tarafından onaylanmıştır; plak örneği toplanmadan önce hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Protokolün iş akış şeması Şekil 1'de verilmiştir.
1. Doku toplama, mikrobilgisayarlı tomografi (μBT) görüntüleme ve test numunesi hazırlama
- Doku toplama ve depolama
- Karotis endarterektomi ameliyatı geçiren rıza gösteren hastalardan taze insan karotis aterosklerotik plak örnekleri toplayın.
NOT: Bu ameliyattan alınan plak örnekleri, yağ birikimi (lipit havuzu) ve kalsifikasyonlar dahil olmak üzere karotis arterin hastalıklı intima tabakasından oluşur22. - Fosfat tamponlu salin (1x PBS) kullanarak kan kalıntılarını çıkarın ve numuneyi bir gazlı bezle kurulayın.
- Numuneyi cımbız kullanarak 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Tüpü 10 dakika boyunca sıvı azot içine yerleştirerek dokuyu çıtçıtlayın.
- Çıtçıtla dondurulduktan sonra, numuneyi μCT görüntüleme gününe kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
NOT: Ani dondurma, kristal oluşumunu en aza indirerek dokuda mikroyapısal hasara yol açar. Domuz aort dokusu üzerinde yapılan önceki bir çalışma, -80 ° C'de ani dondurma ve depolamanın dokunun mekanik özellikleri üzerinde anlamlı bir etkisi olmadığını göstermiştir23.
- Karotis endarterektomi ameliyatı geçiren rıza gösteren hastalardan taze insan karotis aterosklerotik plak örnekleri toplayın.
- μBT görüntüleme
- μBT görüntüleme gününde, plak örneğini 15 mL tüpten çıkarın. Doku tüpe yapışırsa, tüpü oda sıcaklığında PBS ile doldurun. Numune tüpten çıkarılana kadar dokuyu PBS'de bırakın.
- Plak örneğini kağıt mendille iyice kurulayın.
- Yeşil düğmeye basarak μCT sistemini açın. Ekranın altındaki CT yazılımında ısınmaya basın ve 15 dakika bekleyin.
- μCT sistemine manuel olarak Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm'lik bir X-ışını filtresi yerleştirin.
- Görüntülerin depolanacağı klasörü seçin.
- Sol paneldeki parametreleri seçin. 4 dakikalık bir tarama süresi, 172 μm çözünürlük, 90 kV voltaj, 88 mA amper, 86 mm görüş alanı ve 360° dönüş seçmek için açılır listeleri kullanın.
- Cihazın kapısını açın. Platformu manuel olarak dışarı çekin.
- Parafilmi platforma koyun ve örneği platforma yerleştirin (platformun daha uç noktasına doğru).
- Platformu manuel olarak cihaza yerleştirin ve kapıyı kapatın.
- Canlı modu etkinleştirin (göz simgesi). Örneği FOV'da ortalamak için platformu cihazdaki oklarla hareket ettirin.
- Görüntülemeye başlayın (alt-ortadaki simge). Görüntüleme tamamlandığında, alttaki kapı simgesine basın ( iptal düğmesinin altında).
- μCT taramasından sonra, plak örneğini adım 1.1.3'te açıklandığı gibi tekrar dondurun. Multifoton mikroskopi görüntüleme ve mekanik test gününe kadar -80 ° C'de saklayın.
- μCT görüntülemenin edinilen DICOM dosyalarını açık kaynaklı 3D Slicer yazılımı24'te açın.
- Segment düzenleyicisi'ne gidin. Yeni bir segmentasyon oluştur | ana hacim olarak analiz edilecek hacim'i seçin.
- Bir segment eklemek için Ekle'yi tıklayın. Bu parametreleri değiştirmek için adına ve rengine basın.
- Segmentleri tanımlamak için, pencerenin alt kısmındaki efektler | eşik'i tıklayın. Kalsifiye (>450 HU) ve kalsifiye olmayan (<450 HU) doku bölgeleri arasında ayrım yapmak için bu eşik aracını kullanın. Eşik seçildikten sonra, alt kısımdaki Uygula düğmesine basın.
- Segmentasyonu 3B görünümde görselleştirmek için 3B Göster'e ( Ekle'nin hemen sağında) basın. Segmentasyonun istenmeyen alanları varsa, bunları makas etkisiyle çıkarın.
- İstenilen segmentasyonun adına tıklayarak segmentasyon modülündeki segmentlerin opaklığını değiştirin.
NOT: Mümkünse, μBT görüntüleme ve μBT görüntülerinin gözden geçirilmesi, protokolün geri kalanıyla aynı gün gerçekleştirilebilir. Bu durumda, adım 1.2.12'yi atlayın. Ancak, bu protokolün sonraki adımlarının da zaman alıcı olduğunu ve aynı gün yapılması gerektiğini unutmayın. Bazı uygulamalardan sonra ve tarif edilen ayarlar ve doku ile, μBT görüntüleme ~ 45 dakika sürmeli, μBT görüntülerinin gözden geçirilmesi ~ 15 dakika, tek bir test örneğinin test numunesi hazırlığı ~ 1 saat, mikroskopi ~ 4 saat ve tek eksenli çekme testi ~ 2 saat sürmelidir.
- Test numunesi hazırlama
- Kollajen görüntüleme ve mekanik test gününde, plağı yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS'ye batırarak çözün.
- 3D dilimleyici yazılımında 1.2.13-1.2.18 adımlarında oluşturulan plakanın 3D yapısını açın.
- 3B rekonstrüksiyonun hangi bölümlerinin gerçek plak örneğine karşılık geldiğini belirlemek için plak dokusunun doğal işaretlerini kullanın. 3D rekonstrüksiyonun hangi alanının kalsifikasyon içermediğini belirleyin ve bu alanı gerçek plakta görsel olarak tanımlayın.
- Plak, cerrahi makas ve cımbız kullanarak arterin uzunlamasına ekseni boyunca açın. Ameliyattan zaten bir kesik varsa, dokunun optimal kullanımı için bu kesimden başlayın. Numunenin boru şeklinde bir şekli yoksa ve uzunlamasına yönü tanımlamak zorsa, numuneyi testten hariç tutun.
- Plak örneklerinden dikdörtgen test örneklerini kesin. Test numunelerinin mümkün olduğunca büyük olduğundan emin olun, gözyaşı veya kireçlenme içeren doku bölgelerinden kaçının. Bu kesim sırasında dikkatli olun, çünkü test numunesinin kenarındaki küçük bir yırtılma veya çatlak, çekme testi sırasında mevcut çatlaktan çatlak yayılımına neden olabilir.
- Test numunelerinin, çekme test cihazına monte edildikten sonra gösterge uzunluğunda <1 genişlik-uzunluk (WL) oranına sahip olduğundan emin olun. Numuneler bu gereksinimi karşılıyorsa, sınır koşulları açısından uygun çekme testleri için uygundur25.
NOT: Numune boyutlarındaki aralık büyük olabilir. Yazarların test ettiği örnekler, 3.4 ila 12.9 mm arasında değişen bir gösterge uzunluğuna ve 1.6 ila 6.4 mm arasında değişen bir genişliğe sahipti.
2. Multifoton mikroskopi görüntüleme
- Hazırlık
- Kollajen görüntüleme ve mekanik test gününden önce, 40 g silikon elastomer bazını iki 50 mL tüp üzerine bölün ve bir Pasteur pipet kullanarak her tüpe 2 g kürleme maddesi ekleyin (1:10 oranı). İki bileşeni pipetle karıştırın.
- Mümkün olduğunca çok sayıda hava kabarcığını gidermek için tüpleri 700 × g'da 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Bir Petri kabını (10 cm çapında) ince bir silikon tabakası (yaklaşık 0,5-1 cm) ile doldurun ve fırında 65 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin veya 48 saat boyunca oda sıcaklığına yerleştirin.
- Bir plak testi örneği alın ve dokudaki iğneleri sabitleyerek her iki ucunu silikona sabitleyin (Şekil 2A). Numunenin ışıklı tarafının yukarı baktığından emin olun. İğneler, mekanik test sırasında çekme test cihazının kelepçelerinde olacak numunenin bölgesine yerleştirin.
- Güvenlik gözlükleri takın. İğneleri, mikroskop hedefine zarar vermelerini önlemek için numune yüzeyinin birkaç milimetreden daha az üzerinde yapışacak şekilde kısaltmak için bir yan kesici kullanın. Petri kabını, numune suya batırılana kadar PBS ile doldurun.
- Mikroskopi kurulumu
- Çok foton mikroskobuna uygun bir hedefin monte edildiğinden emin olun. 20x büyütme ile kızılötesi ışığı iletmek için optimize edilmiş bir hedef kullanın.
- Mikroskop sistemini başlatın. Mikroskobun işletim yazılımını açın.
- Görüntüleme tablosunu başlatmanız istendiğinde, mikroskop kondenser kolunun geriye doğru itildiğinden ve hedefin en düşük konumda olduğundan emin olun.
- Multifoton lazeri etkinleştirin.
- Petri kabını, içinde test örneği bulunan ve Şekil 3'te olduğu gibi hedefin altına koyun. Lazer ayarlarının hala optimize edilmesi gerektiğinden, hedefi henüz numunenin üzerine yerleştirmediğinizden emin olun. Aksi takdirde, lazer ışığının olası yüksek gücü dokuya zarar verebilir.
- Hedefin PBS'ye biraz daldırıldığından emin olun. Gerekirse fazladan PBS eklemek için pipet kullanın.
- Işık dalga boyunu 880 nm olarak ayarlayın.
NOT: Bu dalga boyu seçilmiştir, çünkü kullanılan iki foton sistemindeki SHG emisyon filtresi yaklaşık 440 nm merkez dalga boyuna sahiptir. Diğer mikroskoplar için, farklı bir dalga boyu daha uygulanabilir olabilir.
- Karo taraması ve görüntüleme konumlarının seçimi
- Multifoton lazeri kapatın ve mikroskopun parlak alan modunu etkinleştirin. Ardından, canlı tarama modunu açın.
- Aşamayı, hedef numunenin üzerinde yer alacak şekilde konumlandırın ve numune yüzeyini odaklayın. Canlı tarama modunu kapatın.
- Edinme sekmesinin altında, ikinci panelde, amaçlanan çubuğu kaydırarak yakınlaştırma faktörünü 1 olarak değiştirin.
NOT: Bu yakınlaştırma faktörü, hedefin büyütme faktörü (20x) ile birlikte, yakalanan görüntünün boyutunu (739 μm x 739 μm) belirler. - Edinme sekmesinin altında, ikinci panelde, açılır listeleri kullanarak tarama hızını 400 Hz, satır ortalamasını 1 ve çözünürlüğü görüntü başına 128 x 128 piksel (piksel boyutu ~5,8 μm x 5,8 μm) olarak değiştirin.
- Edinme sekmesinin altında, ilk panelde, raster desen sembolünü tıklatın ve bir karo tarama panelinin görünmesini bekleyin.
- Canlı tarama modunu açın. Akıllı paneldeki düğmeleri kullanarak hedefi numunenin bir köşesine taşıyın ve kutucuk tarama panelindeki işaret konumu sembolünü tıklatın. Bunu numunenin her köşesi için tekrarlayın. Doğru şekilde gerçekleştirilirse, görüntüleme için seçilen tüm kutucukları içeren bir ızgara turuncu renkte görünür.
- Otomatik dikiş işlevini kapatın.
- Numune geometrisine genel bir bakış elde etmek üzere tüm numune yüzeyinin karo taramasını oluşturmak için ekranın sağ alt köşesindeki Başlat'ı tıklatın.
NOT: Açıklanan ayarlara, dokuya ve mikroskop sistemine bağlı olarak, tüm numune yüzeyinin karo taramasının alınması ~ 10 dakika sürer. - Karo taramasından sonra, mikroskopi sisteminin yazılımı tarafından otomatik olarak gösterilen karo tarama panelindeki her bir karoların sol üst köşesinin x ve y koordinatlarını gözlemleyin. Bu koordinatları bir e-tabloda not edin.
- Mikroskop yazılımında, karo tarama panelinde, scanfield adı verilen kutudaki x ve y yönlerindeki karo sayısını gözlemleyin. E-tablodaki kutucuk taramasının boyutuna dikkat edin. Döşemenin boyutunu (739 μm) ekleyerek/çıkararak diğer karoların koordinatlarını hesaplayın.
NOT: Bu koordinatlar, SHG görüntüleme ile taranacak karoların tam yerini belirlemek için gereklidir. Toplam görüntüleme süresi bir endişe değilse, tüm karolar herhangi bir karo atlanmadan görüntülenebilir. - Kutucuk taramasından, SHG görüntüleme ile görüntülenecek kutucukları seçin. Bu seçim için, kelepçelerde olacak karolardan kaçının ve Şekil 2B'de gösterildiği gibi, seçilen her karo arasında hem uzunlamasına hem de çevresel yönde bir karo bırakın.
- Kollajen görselleştirme: SHG görüntüleme
- Odadaki ışıkları kapatın ve mikroskop aşamasını karartma kumaşıyla örtün, ayrıca odadan gelen ışık dedektöre ulaşmaz.
NOT: Dedektörlere ulaşan ışığı en aza indirmek, görüntü yakalama sırasında gürültüyü azaltacaktır. - Çoklu foton (MP) lazeri açın.
- 430-450 nm bant geçişi filtresiyle donatılmış taranmamış algılama (NDD) dedektörünü seçin.
- Adım 2.3.10'da edinilen bilgileri kullanarak görüntülenecek kutucukların konumunu belirleyin. Belirlenen kutulardaki koordinatları doldurun ve enter tuşuna tıklayın, böylece hedef sağ kutucuğa taşınır. Canlı tarama modunu açın.
NOT: Diğer mikroskoplarla veya işletim yazılımının daha yeni sürümleriyle, karo taraması içindeki konumlara taşıma otomatik olarak yapılabilir. Bu durumda, her bir kutucuğun x ve y koordinatlarını not etmek (adım 2.3.10) ve işletim yazılımındaki koordinatları doldurmak (adım 2.4.4) gerekli değildir. - Önemli ölçüde ağartma olmadan mümkün olan en yüksek lazer gücünü elde etmek için ışın yolu ayarlarının altındaki üst paneldeki kaydırıcıyı kullanarak MP lazer gücünü artırın. Ardından, akıllı paneldeki düğmeyi kullanarak veya ışın yolu ayarları | ek kanallar altındaki dedektörün adına tıklayarak doygun pikseller olmadan parlak görüntüler elde etmek için dedektör kazancını ayarlayın. Dedektör kazancı için tipik değerler 500 ila 800 V arasındadır.
- Netleme düzlemini ayarlamak için akıllı paneldeki z konumu düğmesini kullanın.
- Numunenin en üstüne gidin ve z-stack panelindeki ok ucuna tıklayarak z-stack'in üst kısmının konumlarını ayarlayın ( edinme sekmesi | 3. panelin altında).
- Ardından, SHG sinyali artık algılanmayana kadar numuneye odaklanın - bu yığının sonudur. Yine, bu konumu ayarlamak için z-stack panelindeki ok ucuna tıklayın. İşiniz bittiğinde, canlı tarama modunu kapatın.
NOT: Doku tamamen düz olmayabilir. Bu nedenle, doku içindeki farklı bölgelerin numune yüzeyi, z yönünde biraz farklı konumlara sahip olabilir. - Alma sekmesinin altında, ikinci panelde, açılır listeleri kullanarak tarama hızını 400 Hz'de tutun, satır ortalamasını 2 olarak ve çözünürlüğü görüntü başına 512 x 512 piksel (piksel boyutu ~1,4 μm x 1,4 μm) olarak ayarlayın. Çift yönlü X tarama düğmesini açın.
- Z-stack panelinde z-step boyutuna tıklayın ve kutuya 3 μm'lik bir z-step boyutunu doldurun. Bir z-yığını oluşturmak için ekranın sağ alt köşesindeki başlat'ı tıklayın. İşiniz bittiğinde, kutucuğun koordinatlarını dosya adına kaydettiğinizden veya her kutucuğa kendi numarasını verdiğinizden emin olun (Şekil 2B'de olduğu gibi).
NOT: Açıklanan ayarlara, dokuya ve mikroskop sistemine bağlı olarak, tek bir karodan oluşan bir z-yığınının elde edilmesi ~ 10-15 dakika sürer. Hazırlık adımları (adım 2.4.4-2.4.10) bu zaman tahminine dahil edilmiştir.
- Odadaki ışıkları kapatın ve mikroskop aşamasını karartma kumaşıyla örtün, ayrıca odadan gelen ışık dedektöre ulaşmaz.
3. Mekanik test
- Tek eksenli çekme testi kurulumunun hazırlanması
- Yatay çekme testi kurulumunu (Şekil 4) çekme test cihazının talimatlarını izleyerek kullanıma hazır hale getirin (örneğin, yazılımı açın, kelepçeleri takın, yük hücresini takın).
- Test numunesinin kaymasını en aza indirmek için, çekme test cihazının kelepçelerinin iç yüzlerine iki taraflı köpük bant (Şekil 4A, B-2) ve köpük bandın iç tarafına zımpara kağıdı takın. Sonunda, zımpara kağıdı test numunesi ile temas halinde olacaktır.
- Isıtma banyosunu (Şekil 4A,B-3) yerine yerleştirin. Isıtma banyosunu kelepçelerin alt yüzünün seviyesine kadar PBS ile doldurun, böylece henüz zımpara kağıdına ulaşmaz.
- Isıtma banyosunun güç kaynağını açın ve sıcaklığı yaklaşık 37 ° C'ye ayarlayın.
- Örneğin, bir laboratuvar standı kullanarak yüksek hızlı kamerayı çekme test sisteminin üzerine monte edin (Şekil 4A-4) ve bir uzatma halkası aracılığıyla fotoğraf makinesine 50 mm odak uzaklığına sahip bir lens takın.
- Kelepçelerin odakta olduğundan ve görüş alanının tüm germe prosedürü boyunca numuneyi kaydedecek kadar büyük olduğundan emin olun (FOV genişliği: numune genişliğini ±; FOV uzunluğu: ± örnek uzunluğunun 2 katı).
- Aydınlatma sistemini (Şekil 4A-5) çekme test sisteminin üstüne, örneğin bir laboratuvar standı kullanarak monte edin. Aydınlatma sistemini açın ve PBS yüzeyinde kamera görüntüsünde gözlemlenecek yansımalar olmayacak şekilde ışık yoğunluğunu ve konumunu ayarlayın.
- Net görüntüler elde etmek için kameranın pozlama süresini ve kazancını ayarlayın.
- Görüntü alma yazılımını, 30 MP çözünürlükte 5,2 kare / sn hızında çekim yapacak şekilde ayarlayın.
NOT: Bu yüksek kare hızı, sonraki DIC analizini gerçekleştirmek ve kopma davranışını incelemek için gereklidir. - Kelepçelerden birinin yer değiştirme hızını, mekanik test sırasında küresel mühendislik gerinim hızının, dokunun in vivo fizyolojik gerilme hızına benzer olacak şekilde ayarlayın
(Plak dokusu için %5/sn26).
- Benek deseninin oluşturulması
NOT: Bu benek örüntüsü protokolü, Walsh ve ark.27 tarafından yapılan önceki çalışmalara dayanmaktadır.- Numuneyi kağıt mendille hafifçe delerek kurulayın.
- Siyah doku boyasını airbrush'ın amaçlanan kovasına koyun.
- Airbrush'ı kompresöre bağlayın. Airbrush kompresörü açın ve basıncı 25 PSI olarak ayarlayın.
- Mendile püskürtmeden önce kağıt üzerinde en uygun benek deseni oluşturmayı deneyin. 50:5028 siyah/beyaz oranı karşılanana kadar birkaç kez püskürtün. Benek deseninin pürüzlülüğünü, benek boyutu yüksek hızlı kamera29'un 3-5 piksel boyutuna benzer olana kadar ayarlamak için airbrush'ın iğnesini ileri geri hareket ettirin.
NOT: Benekli desen iki farklı amaç için kullanılacaktır. İlk olarak, bu lekelerin yer değiştirmesi, mekanik test sırasında elde edilen yüksek hızlı kamera görüntüleri karşılaştırılarak ölçülür (DIC, adım 4.2). İkincisi, bu benek deseni, numunenin deforme olmamış durumunun görüntüsündeki yırtılma yerini tanımlamak için kullanılır (adım 4.3.1). - Airbrush'ı test numunesinden yaklaşık 30 cm uzakta tutun ve aydınlatma yüzeyine püskürtün.
- Numuneyi PBS'ye batırmadan önce boyanın oda sıcaklığında 1 dakika boyunca numuneye yapışmasını bekleyin.
- Tek eksenli çekme testi
- Numuneyi, çekme test cihazının kelepçelerine, numunelerin çevresel yönü çekme germe yönü ve numunenin aydınlık tarafı yukarı bakacak şekilde hizalanmış şekilde yerleştirin. İlk gösterge uzunluğunun, şeritlerin WL oranı <1 olacak şekilde ayarlandığından emin olun.
- Tork tornavidası kullanarak 20 cNm'lik bir tork uygulayarak çenelerin vidalarını sıkın. Son torku uygulamadan önce her vidaya küçük bir tork uygulayarak bunu kademeli olarak yapın.
- Numunenin testleri etkileyebilecek herhangi bir yırtılma içerip içermediğini görsel olarak inceleyin.
- Numune suya batırılana kadar ısıtma banyosuna daha fazla PBS sürün ve PBS'nin sıcaklığı tekrar 37 ° C'ye ulaşana kadar bekleyin.
- Test numunesinin ve cetvelin referans olarak dahil edildiği yüksek hızlı kamera ile bir kalibrasyon görüntüsü elde edin. Cetvelin, kamera hedefinden numunenin ışık yüzeyi ile aynı mesafede olduğundan emin olun.
- Yük hücresini darmadağın ve yük hücresinden ve çekme test cihazının aktüatöründen global kuvvet ve yer değiştirme ölçümlerini kaydetmeye başlayın.
- Numunedeki gevşeklikten kurtulmak için 0,05 N'lik bir ön germe uygulayarak numuneyi düzeltin. Ön gerilme uygulamasından sonra aktüatör tarafından yapılan gösterge uzunluğu ölçümüne bağlı olarak %10'a kadar gerinimde 10 döngü ön koşullandırma gerçekleştirin.
- Yüksek hızlı kamera ile numune deformasyonunun bir videosunu kaydederken, numunenin tamamen arızalanmasına kadar tek eksenli çekme testini başlatın. Doku yetmezliğinden sonra, küresel kuvvet ve yer değiştirme ölçümlerini kaydetmeyi bırakın.
NOT: Bazı ticari çekme test cihazları 3.3.6-3.3.9 adımlarını otomatik olarak gerçekleştirebilir. Geçerli protokol, bu otomatik seçeneğin kullanılmakta olan çekme test cihazına dahil edilmemesi durumunda atılacak manuel adımları açıklar. - Test numunesini çekme testi cihazından çıkarın ve uygun şekilde atın.
- Bir sonraki numuneyi test ederken, kelepçelerdeki zımpara kağıdını ve köpük bandı değiştirin.
4. Veri analizi
- Kollajen organizasyon analizi
- MPM sırasında SHG ile elde edilen z-yığınlarını ImageJ'de açın ve her z-yığını için maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIP) oluşturun.
- Fayanslarda bulunan tek tek kollajen liflerinin oryantasyon açısını ölçmek için her MIP'yi açık kaynaklı MATLAB tabanlı FOA (Fiber Oryantasyon Analizi) aracı30 ile analiz edin. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Ölçekler : [3 4 5] veya [2 4 6], kap çapına bağlı olarak ve Damar eşiği: SHG sinyalinin yoğunluğuna bağlı olarak 0,999, 0,9995 veya 0,9999.
NOT: Bu aracın nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla ayrıntı yazılımın kılavuzu31'de bulunabilir. - Gauss dağılımını açı dağılımı histogramına sığdırmak için başka bir açık kaynaklı MATLAB tabanlı araç olan FibLab32'yi kullanın.
NOT: Bu aracın nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla ayrıntı yazılımın el kitabı32'de bulunabilir. - FibLab kullanılarak elde edilen Gauss dağılım grafiğinden, MATLAB'ın çalışma alanından aşağıdaki yapısal parametreleri çıkarın: dağılımın modu olan baskın fiber açısı (μ p), fiber açı dağılımının standart sapması (σp) ve anizotropik fraksiyon (Pani = 1 − Piso).
NOT: İzotropik fraksiyon, Gauss dağılımında taban çizgisinin altındaki alandır, anizotropik fraksiyon ise bu taban çizgisi33'ün üstündeki tepe alanını içerir. Hem σp hem de Pani , liflerin karo bölgesindeki oryantasyonunun dağılımı hakkında bilgi sağlar. - Görsel inceleme için, yönlendirilmiş çizgiler kullanarak pμçizin ve renkli haritalar kullanarak p ve Paniσ.
- Dijital görüntü analizi ve kopma analizi
- Kopma başlatmanın gerçekleştiği çerçeveyi tanımlamak için kamera görüntüleri üzerinde görsel inceleme yapın. Bu çerçevede, kopma yerini görsel olarak tanımlayın.
- Mekanik testlerin başlangıcında kopma yerinde olası herhangi bir çatlak veya yırtılmayı tanımlamak için kamera görüntüleri üzerinde görsel inceleme yapın. Böyle bir yırtılma varsa, numuneyi analizden çıkarın.
- DIC analizini açık kaynaklı, MATLAB tabanlı yazılım Ncorr (v1.2)34 ile gerçekleştirin. Ncorr kılavuzu35'teki adımları izleyin.
- DIC için yüksek hızlı kamera ile çekme testi sırasında kaydedilen kamera görüntülerini kullanın. Referans görüntü olarak arızaya kadar son germe işleminden önceki son kareyi (ön koşullandırmadan sonra) seçin. Geçerli görüntüler için, son germenin başlangıcından kopma başlatmanın gerçekleştiği çerçeveden önceki son kareye kadar tüm görüntüleri seçin.
- Örnek yüzeyini ilgilenilen bölge (ROI) olarak seçin. Kelepçelere yakın (yaklaşık 1 mm) alanları hariç tutun, çünkü bu alanlardaki gerinimler kavramalardan oldukça etkilenecektir.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak DIC analizi gerçekleştirin: Alt küme yarıçapı: 30 piksel; Alt küme aralığı: üç piksel; Yineleme kesme: 50; Fark vektörü kesiminin normu: 10-5; Gerinim yarıçapı: 5; Otomatik yayılım, adım #: 5.
- Ncorr ile DIC analizinden, ROI'nin Green-Lagrange (veya Eulerian suşu) dağılımlarını elde edin. Bu gerinim dağılımlarını, kopmadan önceki son karede tüm plak numune yüzeyinin ortalama Green-Lagrange gerinimini hesaplamak için kullanın. Kopma konumundaki Green-Lagrange gerinimini hesaplayın.
- Kopma yerindeki yapısal ve mekanik verilerin ilişkilendirilmesi
- Test numunesindeki doğal işaretleri ve test numunesi üzerinde uygulanan lekeleri kullanarak, referans görüntüdeki (adım 4.2.3.1) kopma yerini (adım 4.2.1'de tanımlanmıştır) tanımlayın.
- Test örneğindeki doğal yer işaretlerini kullanarak, karo taramasındaki kopma konumunu belirlemek için referans görüntünün ve karo taramasının (adım 2.3) bir bindirmesini yapın. Kopmanın gerçekleştiği MPM-SHG kutucuğunu tanımlayın. Kopma, MPM-SHG ile taranan bir karoda değilse, kopma konumuna en yakın döşemeyi tanımlayın. Kopmanın meydana geldiği karoda bulunan yapısal parametreleri elde edin.
Representative Results
Doku toplama ve test numunesi hazırlama
Doku koleksiyonu, yapısal görüntüleme ve tek eksenli çekme testi için ayrı test örneklerine diseke edilebilen plak fibröz doku örnekleri verir. İdeal olarak, toplanan bir fibröz doku örneği, çok az veya hiç gözyaşı olmayan alanlar (Şekil 5A) ve makrokalsifikasyonlar (Şekil 5B) içerir. Bu yırtılmaların ve kalsifikasyonların fazlalığı (Şekil 5C), WL 1'in daha önce bahsedilen numune boyutu gereksinimini karşılamayan plak örneklerine yol açabilir.
Multifoton mikroskopi görüntüleme
SHG görüntüleme ve görüntü son işleme, görüntülenen her karodan MIP'ler sağlar (Şekil 6A, B). Fiber tespiti ile daha sonraki işlemler (Şekil 6C), kollajen yapısal parametrelerinin çıkarılabileceği fiber oryantasyon histogramlarını (Şekil 6D) verir (Şekil 6E). Ayrıca görsel analiz için plak örneğinin tamamında lokal yapısal kollajen parametrelerini gösteren renk haritaları elde edilebilir (Şekil 6F,G). Şekil 6'daki temsili test örneği için, yapısal kollajen parametrelerinde büyük bir örneklem içi varyasyon bulunmuştur (ortalama ± SD μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0.49 ± çevresel yön 0° olarak tanımlanırsa, 0.14). Bu örneklem içi varyasyon, homojenliği varsaymak yerine yerel yapısal parametrelerin elde edilmesinin önemini vurgulamaktadır.
Mekanik testler
Yırtılma davranışı
Yüksek hızlı kamera, mekanik test sırasında plak örneklerinin deformasyon ve yırtılma davranışının görüntülerini sağlar (Şekil 7). Bu görüntülerden rüptür başlatma yeri ve rüptür yayılım yolu belirlenebilir. Kamera görüntülerinde kabarcıklar veya yansımalar varsa veya kopma seçilen kare hızıyla yakalanamayacak kadar hızlı yayılıyorsa, kopma tanımlama sonuçları en uygun değildir.
Yerel gerinim desenleri
Tek eksenli çekme testi sırasında elde edilen kamera kayıtları üzerindeki dijital görüntü korelasyon analizi, Şekil 8'de gösterilen Green-Lagrange gerinim haritaları gibi yerel doku deformasyon haritalarını sağlar. Bu haritalar, kopma başlamadan önce çerçevede üç gerinim bileşenini (εxx, εxy ve εyy) görüntüler. Bu gerinim haritalarından, ilgili bir bölgedeki ortalama suşlar ve kopma yeri gibi bir noktadaki yerel gerinim çıkarılabilir.
Şekil 8'deki temsili örnek için, yerel gerinim verileri büyük bir örneklem içi varyasyon göstermektedir. Şekil 8'deki temsili test örneği için, yerel suşlarda büyük bir örneklem içi varyasyon bulunmuştur (gözlemlenen suşların aralıkları aşağıdaki gibidir: εxx = -0.30-0.17; εxy = -0.13-0,20; εyy = 0-0.40). Bu, doku homojenliği varsayımıyla elde edilen brüt, ortalama değerler yerine yerel verilerin elde edilmesinin önemini vurgulamaktadır.
Mekanik ve yapısal doku bilgilerinin ilişkilendirilmesi
Yukarıda belirtilen sonuçlar, dokunun lokal deformasyon ve rüptür davranışının kollajen mimarisi ile ilişkilendirilmesini sağlar. Kamera kayıtlarında kopma yeri belirlendikten sonra (Şekil 9A), referans kamera görüntüsüne (Şekil 9B) ve mikroskopi karo taramasına (Şekil 9C) geri eşlenebilir. Bu, kopmanın gerçekleştiği MPM-SHG karosunu ve bu karoda bulunan yapısal parametreleri sağlar (Şekil 9D). Şekil 9'da gösterilen temsili bir örnekte kopmanın meydana geldiği karoda bulunan yapısal parametreler μ p = 28°, σp = 19° ve Pani = 0.6'dır. Aynı prosedür yırtılmamış doku yerlerine de uygulanabilir. Referans görüntüdeki kopma yerinin kopma çerçevesinden eşlenmesinin, zayıf bir benek deseni ve belirsiz doğal yer işaretleri durumunda zor olabileceğini belirtmek önemlidir. Ek olarak, dokunun doğal işaretleri yeterince net değilse, karo tarama kaplamasının ve yüksek hızlı kamera görüntülerinin birlikte kaydedilmesi zor olabilir.
Şekil 1: Sunulan deneysel protokolün iş akışı şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Karo taramasından SHG görüntüleme için karo seçimi . (A) Silikona sabitlenmiş test örneği. (B) Parlak alan mikroskobu ile elde edilen test numunesinin karo taraması. SHG görüntüleme için seçilen kutucuklar mavi karelerle işaretlenir. (C) MPM'nin SHG ile maksimum yoğunluk projeksiyonu. Ölçek çubuğu = 140 μm (C). Kısaltmalar: SHG = ikinci harmonik nesil; MPM = çoklu foton mikroskopisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Multifoton mikroskobunun amacı altına yerleştirilen plak örneği. Plak örneğinin yeri, fosfat tamponlu salin dolu bir Petri kabı ile sabitlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı bileşenleri belirtilmiş özel olarak tasarlanmış tek eksenli çekme test cihazı . (A) Sisteme genel bakış. Kelepçelerdeki zımpara kağıdı eklerinin, yalnızca alt kelepçeler takılı olduğu için görülebildiğini unutmayın. (B) Test numunesi test için hazır olan çekme test cihazının kelepçelerinin yakınlaştırılmış görüntüsü. Kısaltmalar: PVC = polivinil klorür; LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temsili örneklerden doku toplama ve numune hazırlama sonuçları . (A) Karotis endarterektomi ameliyatı geçiren rıza gösteren hastalardan alınan taze ve sağlam plak örneği. (B) μCT taramasından 3D rekonstrüksiyon. Kalsifiye doku açık mavi renkte gösterilir ve kalsifiye edilmemiş kırmızı renktedir. Mavi çizgiler arasındaki alandan kalsifiye doku içermeyen optimal bir örnek elde edilebilir. (C) μCT taramasından 3D rekonstrüksiyon, fazla kalsifiye doku içeren yetersiz bir plak gösterir. Ölçek çubuğu = 3 mm. Kısaltma: μBT = mikrobilgisayarlı tomografi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: MPM-SHG temsili bir örneklemden elde edilen sonuçlar. (A) Karo taramasına genel bakış; görüntüleme için seçilen kutucuklar mavi renkle gösterilir. (B) Çeşitli karolardan MIP'ler. (C) Seçilen bir karodan (# 1) FOA aracı tarafından fiber algılama. (D) Seçilen bir karodan fiber oryantasyon histogramı. (E) Seçilen bir karodan kollajen yapısal parametrelerinin çıkarılabileceği fiber oryantasyon histogramı + Gauss uyumu. (F) Tüm plak örneği boyunca p (oryantasyon siyah çizgisi) ve μp (arka plan rengi) σ temsili. (G) Tüm plak örneği boyunca p (oryantasyon siyah çizgisi) veP ani (arka plan rengi) μ temsili. Ölçek çubukları = 140 μm (B,C). Kısaltmalar: MPM-SHG = multifoton mikroskopi-ikinci-harmonik nesil; MIP'ler = maksimum yoğunluk projeksiyonları; FOA = fiber oryantasyon analizi; μp = baskın lif açısı; Pani = anizotropik fraksiyon; σp = fiber açı dağılımının standart sapması; Piso = izotropik fraksiyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Çekme testi prosedürü sırasında bir plak dokusu örneğinde yırtılma başlangıcı ve yayılımı.1) Önceden gerilmiş durum, sağlam doku. 2) Kopma başlangıcı-kopmanın gözlendiği ilk çerçeve. Kopma başlatma konumu kırmızı bir kare ile işaretlenmiştir. 3 ) ve 4) Kopma yayılımı. 5) Plak örneğinin tamamen yırtılması. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: DIC analizi ile elde edilen yırtılmadan önceki çerçevede temsili bir numunenin (εxx, εxy ve εyy) Green-Lagrange gerinim paternleri. Tüm plak üzerindeki ortalama ve standart sapma, rüptür yerindeki gerinim ile birlikte verilir. Kısaltmalar: DIC = dijital görüntü korelasyonu; εxx = boyuna gerinim; εxy = makas; εyy = çekme gerinimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Görüntülerde kopma yerinin (kırmızı kare) bindirme görüntüsü. (A) Kopmanın tanımlandığı yüksek hızlı kamera görüntüsü (kopma çerçevesi). (B) Yalnızca ön germenin uygulandığı yüksek hızlı kamera görüntüsü (referans karesi). (C) Mikroskopi ile elde edilen karo tarama görüntüsü. (D) Çeşitli karolardaki yerel kollajen yapısal parametrelerini gösteren renk kodlu bir harita. Tüm plak örneği boyunca μp (oryantasyon siyah çizgisi) ve Pani (arka plan rengi) sunulmuştur. Kısaltmalar: μp = baskın fiber açı; Pani = anizotropik fraksiyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu çalışma, fibröz aterosklerotik plak dokusunun lokal kollajen oryantasyonu ve dispersiyonu, lokal mekanik özellikleri ve rüptür davranışı arasındaki korelasyonu incelemek için bir mekano-görüntüleme boru hattı geliştirmeye odaklanmıştır. Burada açıklanan protokol çeşitli nedenlerden dolayı yenilikçidir. İlk olarak, mekanik yükleme altında fibröz plak dokusunun lokal deformasyonunu ölçmek için dijital görüntü korelasyonu ilk kez uygulanmıştır. İkincisi, bu protokol fibröz plak dokusunun lokal deformasyon paterni ile lokal kollajen mimarisi arasındaki ilişkiyi analiz etmek için gerekli bilgileri sağlar. Lokal değerlendirmenin önemi, hem suş verileri hem de sonuçlar bölümünde sunulan ve dokunun heterojen doğasını gösteren kollajen verileri ile vurgulanmaktadır. Bu nedenle, bu protokolde kullanılanlar gibi lokal değerlendirmeyi mümkün kılan tekniklerin kullanılması, fibröz plak özelliklerinin gelecekteki çalışmaları için önerilmektedir.
Test numunesi hazırlama bu protokolün kritik adımları arasındadır. Karotis plakları esas olarak kollajenöz dokulardır; Bununla birlikte, genel plak mekanik davranışını etkilediği düşünülen kalsifikasyonlar içerebilirler36,37. Çalışma plağın fibröz doku bileşenine odaklandığından, μBT görüntüleme38 kullanılarak test örneklerinde kalsifikasyonlardan kaçınılmaktadır. μBT mevcut değilse, plaktaki kalsifiye bölgeleri tespit etmek için MRI veya OCT39 gibi diğer görüntüleme teknikleri düşünülebilir. Kalsifikasyon içermeyen ve mekanik test için uygulanabilir kadar büyük bir boyuta sahip fibröz doku testi numunelerinin elde edilmesi, ağır kalsifiye olmuş veya dağınık kalsifikasyonlar içeren plaklar için zor bir görev olabilir. Protokoldeki bir diğer zorlu görev, dijital görüntü korelasyonu için en uygun benek deseni oluşturmaktır. Optimum DIC, 50:5028 siyah/beyaz oranı gerektirir ve uygun kaliteyi sağlamak için üç ila beş piksel29 boyutunda lekeler oluşturur. Bu gereksinimlerin karşılanmaması, yanlış yerel gerinim ölçümlerine neden olabilir. Son olarak, bir dokunun doğal işaretleri net değilse, kopma yerinin SHG görüntüleriyle eşlenmesi zor olabilir. Bu tür örnekler için, görüntülemeden önce dokuya birkaç referans belirtecinin uygulanması yararlı olacaktır.
Mevcut protokolde kullanılan MPM-SHG tekniği, nispeten büyük penetrasyon derinliğine sahip yüksek çözünürlüklü ve tahribatsız bir teknik olduğu için diğer birçok kollajen görüntüleme tekniğinden daha üstündür. Bununla birlikte, MPM-SHG'nin penetrasyon derinliği (<400 μm), test numunelerinin 0,5 ila 2 mm arasında değişen tüm kalınlığının görüntülenmesine izin vermediğinden bir sınırlama getirmektedir. Difüzyon tensörü manyetik rezonans görüntüleme (DT-MRG) ile yapılan yeni bir çalışmada, plak dokusunun daha derin kısımlarındaki baskın lif oryantasyonunun, dokunun daha yüzeysel, luminal kısımlarındakinden farklı olabileceğini gösterdik14. Bu nedenle, kalın fibröz plak doku örneklerinin daha derin kısımlarındaki lokal kollajen mimarisini ve lokal doku mekaniği ile ilişkisini araştırmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Bu amaçla polarize uzamsal frekans etki alanı görüntüleme (pSFDI) kullanılabilir. Son zamanlarda geliştirilen bu optik görüntüleme tekniğinin, mitral kapak broşürlerinde 0,8 mm'ye kadar derin lif oryantasyonunu ölçme potansiyeline sahip olduğu bildirilmiştir12. pSFDI ayrıca, mevcut protokolde olduğu gibi, yalnızca bir dizi karo yerine tüm örnek alanının görselleştirilmesini kolaylaştırabilecek hızlı bir edinme sunar. Mevcut protokolün bir başka sınırlaması, yalnızca yüzey deformasyonunun tanımlanabilmesidir. Gelecekteki çalışmalarda, hacimsel, yüzey altı suşları hakkında ek bilgi edinmek için ayna destekli çoklu görünümlü DIC40 veya dijital hacim korelasyonu (DVC)41 bu protokole dahil edilebilir.
Mevcut deneysel protokol, plak rüptürü mekaniği ve altta yatan mikroyapı ile ilişkisi hakkında ek bilgi edinmek için çeşitli şekillerde daha da genişletilebilir veya değiştirilebilir. İlk olarak, mevcut protokol çevresel yönde tek eksenli çekme testini içerir. Bu tip mekanik testler, plak ağırlıklı olarak in vivo çevresel yönde gerilme yaşadığı için seçildi. Daha kapsamlı mekanik karakterizasyon için, bu protokol uzunlamasına yönde şişirme testi, iki eksenli test veya tek eksenli çekme testini içerecek şekilde daha da genişletilebilir. İkincisi, mevcut protokol sadece DIC yoluyla yerel suşlar elde etmeye odaklanmaktadır. Bununla birlikte, plak mekanik davranışının daha eksiksiz bir görünümü, protokole yerel stres analizinin de dahil edilmesiyle elde edilebilir, ancak bu, yerel sertliğin karakterizasyonunu gerektirir. Şu anda zor olmasına rağmen, bu, ters sonlu elemanlar yöntemi 42,43 ve sanal alanlar yöntemi 44 gibi hesaplama teknikleriyle sağlanabilir. Deneysel adaptasyonun yanı sıra, mevcut protokole bazı ek işlem sonrası adımlar da eklenebilir. İlk olarak, sadece kopma yerini tanımlamak yerine, çatlak yayılma yolu elde edilen yüksek hızlı kamera görüntüleri aracılığıyla tanımlanabilir. Bu yayılma yolu yerel yapısal ve mekanik parametrelerle ilişkilendirilebilir. İkincisi, kopma başlatma yeri, açıklanan protokolde görsel olarak tanımlanmıştır. Biyolojik olmayan dokular üzerine yapılan önceki bir çalışmada, rüptürü tespit etmek için DIC gerinim ölçümlerinde süreksizliklerkullanılmıştır 45. Bu tür otomatik rüptür tespitinin plak dokularına uygulanması, rüptür tespitinin doğruluğunu artırabilir. Son olarak, MPM-SHG'nin diğer kollajen görüntüleme tekniklerine kıyasla büyük bir avantajı, bireysel kollajen liflerini görselleştirmesidir. Bu nedenle, bu protokol aracılığıyla elde edilen veriler, kolajen içeriği gibi ek yerel kolajen özelliklerini araştırmak için de kullanılabilir.
Bu protokol, in vivo plak rüptüründe mekanik olarak başarısız olan bileşen olan fibröz plak dokusunun lokal özelliklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için kullanılabilir. Bu bilgi, hastalarda plak rüptürünü öngören yeni yapısal ve fonksiyonel görüntüleme belirteçlerinin oluşturulması için gereklidir. Bu yeni belirteçler gereklidir, çünkü daha önce önerilen risk biyobelirteçlerinin gelecekteki klinik olaylar için suboptimal prediktif değere sahip olduğu gösterilmiştir 5,6. Gelecekte, OCT ve ps-OCT, arteriyel sistemdeki fibröz dokuyu tanımlayabilir ve ölçebilir46,47,48. Ek olarak, suş lokal plak bileşimi için vekil bir belirteç olarak kabul edildi49. Bu nedenle, in vivo suş ölçümleri49, hastalarda plak stabilitesinin tanımlanmasında potansiyel olarak yardımcı olabilir. Bununla birlikte, elde edilen sonuçların doğrudan in vivo plak rüptürüne çevrilmesine dikkat edilmelidir. İlk olarak, fibröz plak dokusu, bu protokolde kullanılan tek yönlü çekme yükünden in vivo olarak daha karmaşık bir yükleme yaşar. İkincisi, aterosklerotik plaklar çok bileşenli yapılardır; fibröz plak dokusundaki in vivo stres ve gerinim dağılımları, kalsifikasyonlar gibi diğer plak bileşenlerinin varlığından ve yerinden etkilenebilir37.
Bu mekanik görüntüleme boru hattı, diğer kollajenöz dokuları incelemek için de kullanılabilir. Kollajenin küresel mekanik testleri ve yapısal görüntülemesi biyolojik dokular için zaten yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, arıza öncesi ve arıza özelliklerinin yanı sıra kollajen mimarisinin lokal değerlendirmesi, heterojen fibröz dokuların doğru mekanik karakterizasyonu için kritik öneme sahiptir. Bu yeni protokolün yapısının, çeşitli biyolojik dokuların mikroyapısı ve mekaniği arasındaki etkileşim hakkında daha fazla bilgi sağlayacağını tahmin ediyoruz.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma bir NWO-Vidi hibesi (18360) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm extension ring | Thorlabs Inc. | CML10 | |
| 15 mL tube | VWR | 525-0150 | |
| 20x APO water immersion objective | Leica | 507701 | |
| 3D Slicer software | N/A | Version 4.11 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-0156 | |
| Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm | Conrad | 4.01614E+12 | |
| Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating | Thorlabs | ||
| Black tissue dye | Polysciences inc | 24113-2 | |
| Camera lens, focal length 50 mm | Thorlabs Inc. | MVL50M1 | |
| Camera stand | VWR | 241-0093, 241-7311 | |
| Chameleon Ultra multiphoton laser | Coherent | ||
| Compressor + air hose | JUN-AIR, Conrad | B07GB9HC62, 4016138577198 | |
| Excel | Microsoft | Version 2208 | |
| Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm | Pattex | ||
| Heating bath | N/A | Custom made | |
| High-speed camera + imaging software | Pixelink-Navitar Inc. | PL-D725 | |
| Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) | N/A | ||
| Image J | National Institute of Health | N/A | |
| LAS-AF | Leica | Version 2.3 | Imaging software multiphoton microscope |
| LEICA TCS SP5 II | Leica | Microscope used for SHG imaging | |
| Lighting system | AMZ instruments | LED-60TB | Used to obtain clear images with the high-speed camera |
| MATLAB | MathWorks | Version R2021A | |
| MATLAB-based FibLab software | Eindhoven University of Technology | N/A | |
| MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool | Eindhoven University of Technology | N/A | |
| MATLAB-based Ncorr software | Georgia Institute of Technology | Version 1.2 | |
| Needles | Emerald | BDAM302986 | |
| Petri dish (10 cm diameter) | VWR | BRND452000 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | ELKA127-P511-000 | |
| Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm | PerkinElmer | CLS149276 | |
| Ruler | Fine Science Tools | 1800030 | |
| Sandpaper (P180) | Conrad | 4.00932E+12 | |
| Side cutter | Conrad | 4.25084E+12 | |
| Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184) | VWR | 634165S | |
| Tensile tester + software + clamps | N/A | Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.) | |
| Torque screwdriver | Garant, Hoffman group | 659906 |
References
- Libby, P., et al.
- Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
- Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
- Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
- SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
- Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
- Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
- Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
- Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
- Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
- Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
- Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
- Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
- Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
- Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
- Larson, A. M.
- Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
- Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
- Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
- Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
- Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
- Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
- Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
- Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
- Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
- Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
- Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
- Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
- Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A.
- Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
- FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
- van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
- Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
- NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
- Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
- Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
- Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
- Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y.
- Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
- Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
- Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
- Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
- vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
- Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
- Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
- Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
- Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
- Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).
