Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

केनोरहाब्डिस एलिगेंस जर्मलाइन के भीतर सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स की सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64363
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3, 1
1Cell Biology and Biophysics, European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University, Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

Summary

सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी अर्धसूत्रीविभाजन में सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स के भीतर घटकों के संगठन में एक विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। यहां, हम केनोरहाब्डिस एलिगेंस सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स के व्यक्तिगत प्रोटीन को हल करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, समरूप गुणसूत्रों को अपने सही अलगाव की अनुमति देने के लिए एक दूसरे को पहचानना और पालन करना चाहिए। होमोलोगस क्रोमोसोम की बातचीत को सुरक्षित करने वाली प्रमुख घटनाओं में से एक मियोटिक प्रोफ़ेज़ I में सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स (एससी) की असेंबली है। भले ही विभिन्न प्रजातियों के बीच एससी के भीतर प्रोटीन घटकों के बीच बहुत कम अनुक्रम होमोलॉजी है, लेकिन एससी की सामान्य संरचना को विकास के दौरान अत्यधिक संरक्षित किया गया है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में, एससी एक त्रिपक्षीय, सीढ़ी जैसी संरचना के रूप में दिखाई देता है जो पार्श्व तत्वों या अक्षों, अनुप्रस्थ फिलामेंट्स और एक केंद्रीय तत्व से बना होता है।

हालांकि, एससी की आणविक संरचना को निर्धारित करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा परिसर के भीतर व्यक्तिगत घटकों के स्थानीयकरण की सटीक पहचान करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परिसर के भीतर व्यक्तिगत प्रोटीन घटकों की पहचान के लिए अनुमति देती है। हालांकि, चूंकि एससी केवल ~ 100 एनएम चौड़ा है, इसलिए इसकी उपसंरचना को विवर्तन-सीमित पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, एससी के आणविक वास्तुकला का निर्धारण करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों जैसे संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), उत्तेजित-उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी, या एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) की आवश्यकता होती है।

एससी के भीतर व्यक्तिगत घटकों की संरचना और बातचीत को बनाए रखने के लिए, एक ऐसे वातावरण में परिसर का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है जो रोगाणु कोशिकाओं में अपने मूल वातावरण के करीब है। इसलिए, हम एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजिंग प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं जो एसएमएलएम और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के साथ बरकरार, एक्सट्रूडेड केनोरहाब्डिस एलिगेंस जर्मलाइन ऊतक में एससी की उप-संरचना के अध्ययन को सक्षम बनाता है। ऊतक को सीधे कवरस्लिप में ठीक करने से इमेजिंग के दौरान नमूनों की गति कम हो जाती है और इसके जैविक संदर्भ में एससी की उपसंरचना की कल्पना करने के लिए आवश्यक उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए नमूने में विचलन को कम किया जाता है।

Introduction

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान गुणसूत्रों की संख्या को आधा करना यौन प्रजनन करने वाले जीवों में स्वस्थ संतान पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है। क्रोमोसोम संख्या में इस कमी को प्राप्त करने के लिए, होमोलोगस क्रोमोसोम को अर्धसूत्रीविभाजन I के दौरान जोड़ा और अलग करना चाहिए। समरूप गुणसूत्रों के सटीक अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए, रोगाणु कोशिकाएं एक विस्तारित प्रोफ़ेज़ I से गुजरती हैं, जिसके दौरान होमोलोग्स1 के बीच भौतिक लिंक उत्पन्न करने के लिए समरूप गुणसूत्र जोड़ी, सिनैप्स और पुनर्संयोजन करते हैं। एससी केंद्रीय संरचना के रूप में उभरा है जो मियोटिक प्रोफ़ेज़2 के माध्यम से सही प्रगति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है।

एससी एक जटिल है जिसकी सामान्य संरचना विकासवादी रूप से संरक्षित है, भले ही इसके प्रोटीन घटकों के बीच बहुत कम होमोलॉजी हो। एससी को पहली बार इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में एक त्रिपक्षीय, सीढ़ी जैसी संरचना के रूप में पहचाना गया था जिसमें दो पार्श्व तत्व या अक्ष, अनुप्रस्थ फिलामेंट्स द्वारा गठित एक केंद्रीय क्षेत्र और एक केंद्रीय तत्व 3,4 शामिल थे। परिसर के भीतर व्यक्तिगत घटकों के संगठन का निर्धारण करना मियोटिक प्रोफ़ेज़ के दौरान एससी की भूमिका की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।

एलिगेंस एससी की संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल है क्योंकि इसके रोगाणुओं में पूरी तरह से इकट्ठे एससी5 के साथ बड़ी संख्या में मियोटिक नाभिक होते हैं। आनुवंशिक और जैव रासायनिक अध्ययनों से पता चला है कि क्रोमोसोम अक्षों का निर्माण तीन अलग-अलग कोहेसिन कॉम्प्लेक्स 6,7 और चार एचओआरएमए डोमेन प्रोटीन द्वारा किया जाता है जिन्हें एचटीपी -1/2/3 और एचआईएम -3 7,8,9,10,11 सी एलिगेंस में कहा जाता है। एससी के मध्य क्षेत्र में, कुंडलित-कॉइल डोमेन युक्त छह प्रोटीनों की पहचान अब तक 12,13,14,15,16,17 की गई है। दो अक्षों के बीच की दूरी को पाटने के लिए, एसवाईपी -1, -5, और -6 सिर-से-सिर तरीके से डिमराइज करते हैं (चित्रा 1), जबकि तीन अतिरिक्त प्रोटीन केंद्रीय तत्व16,17,18,19 में अपनी बातचीत को स्थिर करते हैं।

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान एससी के कई कार्यों को समझने में इन प्रोटीनों के संगठन में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्राप्त करना आवश्यक है। चूंकि एससी के केंद्रीय क्षेत्र की चौड़ाई केवल ~ 100 एनएम है, इसलिए इसकी उपसंरचना को विवर्तन-सीमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। हालांकि, इस आकार की संरचना के भीतर घटकों की कल्पना करना सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। दरअसल, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), विस्तार माइक्रोस्कोपी20, उत्तेजित-उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी 21, और एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) 22,23 प्रजातियों में एससी की आणविक वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरण के रूप में उभरे हैं। 30.

रिज़ॉल्यूशन सीमा को दूर करने के लिए, एसटीईडी माइक्रोस्कोपी एसटीईडी लेजर से डोनट के आकार के बीम के साथ उत्सर्जन प्रकाश के विवर्तन-सीमित स्थान को ओवरले करने पर निर्भर करता है, जो सैद्धांतिक रूप से आणविक आयाम31,32 तक पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन को संकुचित करता है। हालांकि, जैविक नमूनों के भीतर एसटीईडी द्वारा व्यावहारिक रूप से प्राप्त संकल्प xy33 में कुछ दसियों नैनोमीटर की सीमा में रहता है।

जैविक नमूनों में भी उच्च रिज़ॉल्यूशन एसएमएलएम तकनीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। एसएमएलएम समय में स्थानिक रूप से अतिव्यापी फ्लोरोफोरे को अलग करके उप-विवर्तन स्तर पर वस्तुओं को हल करने के लिए विशिष्ट फ्लोरोफोरे के ब्लिंकिंग गुणों का उपयोग करता है। फिर फ्लोरोफोरे के विभिन्न उप-समूहों को पकड़ने के लिए नमूना को बार-बार चित्रित किया जाता है। नमूने के भीतर फ्लोरोफोरेस की स्थिति तब सभी छवियों में प्राप्त संकेतों के लिए पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) को फिट करके निर्धारित की जाती है, जो 15 एनएम23,34 तक संरचनाओं को हल कर सकती है।

एक साथ लिया गया, स्थानीयकृत छवियां सभी फ्लोरोफोरे की स्थिति को एन्कोड करती हैं। एसएमएलएम का संकल्प लेबलिंग घनत्व और फ्लोरोफोरे की ब्लिंकिंग विशेषताओं द्वारा निर्धारित किया जाता है। Nyquist-शैनन मानदंड के अनुसार, उन वस्तुओं को मज़बूती से हल करना असंभव है जो औसत लेबल-टू-लेबल दूरी से दोगुने से कम हैं। इस प्रकार, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए एक उच्च लेबलिंग घनत्व की आवश्यकता होती है। एलिगेंस में एससी के लिए, जीनोम संपादन का उपयोग करके अंतर्जात प्रोटीन की विशिष्ट साइटों से जुड़े एपिटोप टैग का उपयोग करके एक उच्च लेबलिंग घनत्व प्राप्त किया जा सकता है। एपिटोप टैग को तब उच्च समानताओं19,30 के साथ विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके उच्च घनत्व पर दाग दिया जा सकता है। इसी समय, अलग-अलग फ्लोरोफोरे का ऑन-साइकिल इतना छोटा होना चाहिए कि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्थानिक रूप से अतिव्यापी फ्लोरोफोरे को एक ही समय में कैप्चर नहीं किया जाताहै।

इन दो आवश्यकताओं के कारण, एससी जैसे बड़े मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में छवियों की इमेजिंग की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार कई घंटे लग सकते हैं। लंबे इमेजिंग समय का दोष यह है कि नमूने चरण के आंदोलन या नमूना बफर के भीतर छोटी धाराओं के कारण बह जाते हैं; यहां तक कि 10 एनएम के क्रम में छोटे आंदोलन एनएम रिज़ॉल्यूशन पर हानिकारक हैं और इसके लिए ठीक किया जाना चाहिए। हालांकि, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बहाव सुधार विधियांक्रमिक रूप से चित्रित दो चैनलों की छवियों को सटीक रूप से ओवरले करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं हैं। यह समस्याग्रस्त है क्योंकि जैविक प्रश्न अक्सर एक ही नमूने के भीतर कई लक्ष्यों का सटीक पता लगाने और स्थानीयकरण के लिए पूछते हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, अनुपातमीट्रिक इमेजिंग जैसे तरीके विकसित किए गए हैं। रेशियोमेट्रिक इमेजिंग अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ कई फ्लोरोफोरे की एक साथ इमेजिंग की अनुमति देता है, जिसमें वर्णक्रमीय रूप सेअलग-अलग चैनलों में तीव्रता के अनुपात के आधार पर प्रत्येक पता लगाए गए सिग्नल को उसके संबंधित फ्लोरोफोरे में बाद में असाइनमेंट किया जाता है।

इसके अतिरिक्त, एससी जैसे मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के संगठन का अध्ययन करने से त्रि-आयामी (3 डी) जानकारी की आवश्यकता होती है। तीन आयामों (3 डी-एसएमएलएम) में सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, उत्सर्जित प्रकाश के ऑप्टिकल पथ में एक बेलनाकार लेंस शामिल किया जाता है जो फोकल प्लेन से इसकी दूरी के आधार पर फ्लोरोफोरे के पीएसएफ के आकार को विकृत करता है। इसलिए, जेड-प्लेन में फ्लोरोफोरे की सटीक स्थिति को इसके उत्सर्जन संकेत35,39 के आकार का विश्लेषण करके विस्तारित किया जा सकता है। एसएमएलएम में इन प्रगति के संयोजन से एससी सहित मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के 3 डी संगठन की इमेजिंग की अनुमति मिलती है।

Protocol

1. समाधान और कवरलिप्स की तैयारी

नोट: सभी सामग्रियों और अभिकर्मकों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों की संरचना के लिए तालिका 1 देखें।

  1. पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवरलिप्स
    1. 0.01% (w/v) पॉली-एल-लाइसिन तैयार करें ( तालिका 1 देखें)।
    2. 10-30 मिनट के लिए इथेनॉल में एक सटीक कवरस्लिप (24 मिमी व्यास; 0.17 ± 0.005 मिमी, नंबर 1.5) धोएं। इथेनॉल को हटाने के लिए कवरस्लिप को डीडीएच2ओ के साथ कुल्ला करें, और कवरस्लिप को कमरे के तापमान पर सूखने के लिए छोड़ दें।
    3. प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करके कवरस्लिप को साफ करता है।
      नोट: प्लाज्मा सफाई कवरस्लिप की हाइड्रोफिलिसिटी को बढ़ाती है और निम्नलिखित चरणों की सुविधा प्रदान करती है। यदि प्लाज्मा क्लीनर उपलब्ध नहीं है, तो इस चरण को छोड़ा जा सकता है, हालांकि इसके लिए पॉली-एल-लाइसिन समाधान की मात्रा और / या एकाग्रता को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस संशोधन का परीक्षण नहीं किया गया है.
    4. कवरस्लिप पर 0.01% (डब्ल्यू / वी) पॉली-एल-लाइसिन की एक बूंद (120 μL) रखें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन बाद, डीडीएच2ओ में कवरस्लिप को धो लें और कमरे के तापमान पर सुखाएं। 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एफ (एबी') 2 टुकड़े फ्लोरोसेंट कार्बनिक रंगों के साथ संयुग्मित
    1. पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित क्रम में जोड़ें: पीबीएस में 0.6-0.7 मिलीग्राम /एमएल एफ (एबी') 2 टुकड़ा का 10 μL, 0.1 M NaHCO 3 (pH8.3 ) का 1 μL और DMSO में 1 mM सक्सिनिमिडिल (NHS) एस्टर रिएक्टिव फ्लोरोफोरे का 1 μL (F(ab') 2: डाई ~ 1: 17 है)। ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
    2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. निर्माता के विनिर्देशों का पालन करते हुए एक डिसाल्टिंग कॉलम (7के एमडब्ल्यूसीओ) का उपयोग करके शेष मुक्त प्रतिक्रियाशील डाई से एफ (एबी') 2 टुकड़े को अलग करें। कॉलम के संतुलन और लेबल एफ (एबी') 2 टुकड़े के क्षालन के लिए 1x PBS का उपयोग करें।
    4. लेबल F(ab')2 टुकड़े को 4 °C पर 3 महीने तक स्टोर करें।
      नोट: 3 महीने से अधिक के भंडारण समय का परीक्षण नहीं किया गया है।

2. विच्छेदन और निर्धारण

नोट: सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए इष्टतम नमूने प्राप्त करने के लिए विच्छेदन और निर्धारण प्रक्रियाओं को पहले से अनुशंसित प्रक्रियाओं16,40 से संशोधित किया गया है।

  1. विच्छेदन
    1. एलिगेंस कीड़े (इस अध्ययन के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए) को कवरस्लिप (22 मिमी x 22 मिमी, नंबर 1) पर ईबीटीटी (0.2% नॉनियोनिक डिटर्जेंट के साथ1x अंडा बफर 41, तालिका 1) की 30 μL की बूंद में चुनें। आसान हेरफेर के लिए कवर स्लिप को ग्लास स्लाइड पर रखें। ईबीटीटी के 30 μL के साथ कई बार ऊपर और नीचे पाइप करके धोएं। कवरस्लिप पर 30 μL ड्रॉप छोड़ने के लिए घोल के 30 μL निकालें।
      नोट: कीड़े को प्लास्टिक युक्तियों से चिपकने से रोकने के लिए सभी समाधानों में छोटी मात्रा में नॉनियोनिक डिटर्जेंट जोड़ा जाना चाहिए जिसमें कीड़े को पाइप किया जाता है।
    2. गोनैड को बाहर निकालने के लिए कीड़े के सिर और / या पूंछ को काटने के लिए स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें (चित्रा 2 ए)।
  2. ग्रस्तता
    1. विच्छेदित कीड़े की बूंद में फिक्सेटिव घोल (तालिका 1) का 30 μL पाइप करें और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप करें।
      नोट: कुछ बार ऊपर और नीचे पाइपिंग से अधिक गोनाड जारी करने में मदद मिल सकती है।
    2. फिक्सेटिव समाधान जोड़ने के बाद ठीक 1 मिनट के लिए ठीक करें।
    3. कीड़े को टीबीएसटी से भरे पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करके निर्धारण को रोकें (तालिका 1)। कीड़े को जितना संभव हो उतना कम मात्रा में स्थानांतरित करें (~ 15 μL)।
    4. पीसीआर ट्यूब को मिनी बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज (2,000 × ग्राम, 10 एस) पर घुमाएं। सतह पर तैरने वाला निकालें और 2x को 200 μL TBST से धो लें।
    5. 5-10 मिनट के लिए पीबीएसटी (तालिका 1) के 200 μL से धो लें। विच्छेदित नमूनों को बर्फ पर रखते समय चार नमूनों के लिए चरण 2.1.1 से 2.2.5 दोहराएं।
      नोट: यदि चार से अधिक नमूनों को संसाधित किया जाता है, तो प्रत्येक चार नमूनों के बाद चरण 2.2.6 से 2.2.7 के साथ आगे बढ़ें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि नमूना निर्धारण सभी नमूनों में सुसंगत रहे।
    6. एक मिनी बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज (2,000 × ग्राम, 10 एस) पर विच्छेदित नमूनों को स्पिन करें, पीबीएसटी को हटा दें, और ठंडा मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) के 50-100 μL जोड़ें।
      चेतावनी: मेथनॉल विषाक्त है। सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और साँस लेने से बचें।
    7. ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं और नमूनों को मेथनॉल में 30-60 सेकंड के लिए छोड़ दें। नमूने को पीबीएसटी के 200 μL में 2x धोएं।
      नोट: यदि चार से अधिक नमूनों को संसाधित किया जाता है, तो शेष नमूनों के विच्छेदन के साथ आगे बढ़ें (चरण 2.1.1 से 2.2.7)।
    8. नमूने को पीबीएसटी के 200 μL के साथ तीसरी बार धोएं।

3. एंटीबॉडी ऊष्मायन

  1. अवरुद्ध
    1. कमरे के तापमान पर 45-60 मिनट के लिए 1x ब्लॉकिंग समाधान (तालिका 1) में नमूने ब्लॉक करें।
      नोट: इनक्यूबेशन समय कमरे के तापमान पर 30 मिनट से लेकर 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों तक हो सकता है (परीक्षण 3 दिनों तक किया गया था)।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान
    1. 1x ब्लॉकिंग सॉल्यूशन में काम करने वाले समाधानों (एसएमएलएम के लिए 1: 250 और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी नमूनों के लिए 1: 1,000) के लिए एंटी-एचटीपी -3 (चिकन42) और एंटी-एचए (माउस) एंटीबॉडी (या पसंद के एंटीबॉडी) को पतला करें।
      नोट: एसएमएलएम नमूनों को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी एसटीईडी नमूनों की तुलना में अधिक केंद्रित होते हैं क्योंकि एसएमएलएम माइक्रोस्कोपी के लिए उच्च लेबलिंग घनत्व की सिफारिश की जाती है।
    2. नमूनों को एक मिनी बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज (2,000 × ग्राम, 10 एस) पर घुमाएं, ब्लॉकिंग बफर को हटा दें, और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 30-50 μL जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (पसंदीदा) या कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेशन बाद, पीबीएसटी के साथ 3 x 5-15 मिनट धो लें।
  3. फ्लोरोसेंट डाई से संयुग्मित एफ (एबी') 2 टुकड़ों का कार्यशील समाधान
    1. 1x ब्लॉकिंग समाधान में लेबल F(ab')2 टुकड़ों (चरण 1.2.4) को कार्यशील समाधानों (SMLM के लिए 1:100 और STED माइक्रोस्कोपी नमूने के लिए 1:1,000) में पतला करें।
      नोट: दोनों सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के लिए, पहले रिपोर्ट किए गए फ्लोरोफोरे जोड़े का उपयोग किया गया था, अर्थात् एसएमएलएम के लिए एलेक्साफ्लोर 647/ सीएफ 680 और एसटीईडी के लिए एलेक्साफ्लोर 594 / एलेक्साफ्लोर 647 और स्टार 645 पी का उपयोग एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनस को लक्षित करने के लिए एंटी-माउस (फैब') 2 टुकड़ों को लेबल करने के लिए किया गया था, और एचटीपी -3 को लक्षित करने के लिए सीएफ 680 / एलेक्साफ्लोर 594-लेबल एंटी-चिकन (फैब') 2 टुकड़े।
    2. नमूनों को एक मिनी बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज (2,000 × ग्राम, 10 एस) पर घुमाएं, पीबीएसटी को हटा दें, और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 30-50 μL जोड़ें। कमरे के तापमान (पसंदीदा) पर 30 मिनट से 2 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पीबीएसटी के साथ 3 x 5-15 मिनट धो लें।

4. कवरस्लिप पर बढ़ते नमूने

  1. पोस्टफिक्सेशन
    नोट: चरण 4.1.1-4.2.1 के माध्यम से व्यक्तिगत रूप से नमूने संसाधित करें।
    1. दाग वाले नमूनों को नीचे घुमाएं और सुपरनैटेंट को हटा दें। PBST0.2 का 50 μL जोड़ें और दाग वाले कीड़े को 22 मिमी x 22 मिमी नंबर 1 कवरस्लिप पर स्थानांतरित करें।
      नोट: कीड़े को कवरस्लिप का पालन करने से रोकने के लिए इस चरण के लिए 0.2% नॉनियोनिक डिटर्जेंट (तालिका 1) के साथ ताजा पीबीएसटी0.2 का उपयोग करें।
    2. पॉली-एल-लाइसिन कवरस्लिप पर पोस्टफिक्सेटिव समाधान का पाइप 5.7-6.3 μL।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पॉली-एल-लाइसिन कवरलिप्स को पहले कमरे के तापमान पर लाया जाना चाहिए।
    3. एक ही मात्रा (5.7-6.3 μL) में विच्छेदित कीड़े को पाइपेट करें और पॉली-एल-लाइसिन कवरस्लिप (चित्रा 2 बी) पर फिक्सेटिव की बूंद में स्थानांतरित करें।
      नोट: इस और निम्नलिखित चरण में, पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवरस्लिप के केंद्र में विच्छेदित ऊतक को बनाए रखना बहुत महत्वपूर्ण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि यहां उपयोग किए जाने वाले कस्टम-निर्मित एसएमएलएम माइक्रोस्कोप को फिट करने के लिए कस्टम धारक में नमूने बढ़ाना (चरण 5.1, चित्रा 2 बी देखें)।
    4. नमूने को एक छोटे कवरस्लिप (12 मिमी व्यास, चित्रा 2 बी) के साथ कवर करें। फ़िल्टर पेपर के एक छोटे टुकड़े का उपयोग करके अतिरिक्त तरल निकालें (चित्रा 2 बी)। एक अंधेरे कक्ष में 3-5 मिनट के लिए ठीक करें।
  2. "फ्रीज-क्रैकिंग"
    1. नमूनों को सूखी बर्फ में एल्यूमीनियम ब्लॉक पर रखकर फ्रीज करें (चित्रा 2 बी)।
      नोट: एल्यूमीनियम ब्लॉक को उस पर नमूने रखने से पहले सूखी बर्फ में अच्छी तरह से ठंडा किया जाना चाहिए। शेष नमूनों के पोस्टफिक्सेशन के साथ आगे बढ़ें (चरण 4.1.1 से 4.2.1)। नमूना को अगले चरण (4.2.2) से पहले कम से कम 20 मिनट या 1 घंटे तक सूखी बर्फ पर होना चाहिए।
    2. रेजर (चित्रा 2 बी) का उपयोग करके छोटे कवरस्लिप को हटा दें।
      नोट: एसटीईडी के लिए, चरण 5.2.1 पर आगे बढ़ें। SMLM के लिए, चरण 4.2.3 के साथ जारी रखें।
    3. कवरस्लिप को लगभग 10 सेकंड के लिए बर्फ-ठंडा पीबीएस (पसंदीदा) या -20 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल युक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डुबोएं।
      नोट: तापमान इस कदम के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कारक है। इसलिए, पीबीएस का उपयोग करें जो ताजा पिघलाया जाता है या बर्फ / इथेनॉल स्नान में रखा जाता है।
    4. कवरस्लिप को पीबीएसटी बफर से भरे छह-वेल प्लेट के कुएं में रखें। कुओं से पीबीएसटी निकालें और ताजा पीबीएस जोड़ें। नमूने को पीबीएस में 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
      नोट: नमूनों को नुकसान पहुंचाने और अलग करने से बचने के लिए पीबीएस को कुएं के किनारे पर पाइप करें।
    5. ताजा पीबीएस के साथ धो लें और नमूने को इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
      नोट: नमूने 2 सप्ताह तक स्थिर होते हैं, लेकिन सबसे अच्छे परिणाम प्राप्त होते हैं यदि नमूने 2 दिनों के भीतर चित्रित किए जाते हैं।
    6. इमेजिंग से पहले, स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत बढ़ते नमूने की गुणवत्ता का आकलन करें।
      नोट: सफलतापूर्वक माउंटेड जर्मलाइन ्स को कवरस्लिप के सापेक्ष कोई समझदार आंदोलन के साथ स्थिर रूप से जोड़ा जाता है। खराब रूप से संलग्न रोगाणु बफर समाधान में फ्लैप करेंगे।

5. इमेजिंग

  1. एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी
    नोट: छवियों को ईएमबीएल इमेजिंग सेंटर में एक कस्टम-निर्मित एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जिसे एक कस्टम बॉडी के आसपास बनाया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था38,43, में निर्दिष्ट अद्वितीय विशेषताओं के साथ सामग्री की तालिका; https://www.embl.org/about/info/imaging-centre का संदर्भ लें
    1. 3 डी मोती अंशांकन प्राप्त करना
      1. 38,44 के रूप में वर्णित 100 एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एक सटीक कवरस्लिप (24 मिमी व्यास; 0.17 ± 0.005 मिमी, नंबर 1.5) तैयार करें।
      2. चरण 5.1.1.1 से अंशांकन नमूना एक नमूना धारक पर रखें।
      3. स्वच्छ 100x/1.5 तेल उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें और माइक्रोस्कोप पर अंशांकन नमूना माउंट करें।
      4. माइक्रोमैनेजर 245,46 के भीतर, अंशांकन नमूने में 15-20 पद निर्दिष्ट करें।
      5. ईएमयू प्लगइन विंडो47 के भीतर, चरण 5.1.1.5 से प्रत्येक पद के लिए जेड-स्टैक छवि का अधिग्रहण सेट करें।
        नोट: यहां, एक यौगिक बेलनाकार लेंस 3 डी इमेजिंग के लिए आवश्यक अस्थिरता प्रदान करता है, और 10 एनएम की वृद्धि के साथ -1 μm से 1 μm के बीच की सीमा में फैले प्रत्येक स्थिति के लिए 201 z-स्लाइस प्राप्त किए गए थे। प्रत्येक जेड-स्लाइस के लिए25 एमएस के लिए 2 किलोवाट / सेमी 2 640 एनएम लेजर रोशनी का उपयोग किया गया था।
      6. एक समान ऑप्टिकल पथ के माध्यम से 100 एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों की जेड-स्टैक छवियों को प्राप्त करें जिसका उपयोग चरण 5.1.11 में नमूना छवियों को प्राप्त करने के लिए किया जाएगा।
      7. सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण मंच (एसएमएपी48) का उपयोग करके, प्रयोगात्मक बिंदु प्रसार फ़ंक्शन (पीएसएफ) का एक सीस्पलाइन मॉडल उत्पन्न करें जिसका उपयोग चरण 5.1.13 में 3 डी-एसएमएलएम डेटा को फिट करने के लिए किया जाएगा।
    2. नमूना धारक तैयार करें। यहां उपयोग किए जाने वाले कस्टम-निर्मित धारक के लिए जो इमेजिंग कक्ष (चित्रा 2 बी) बनाने के लिए चुंबकीय अंगूठी का उपयोग करता है, पैराफिल्म के साथ चुंबकीय अंगूठी लपेटें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अवतल अवसाद गुहा के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग स्लाइड धारकों के साथ माइक्रोस्कोप के लिए नमूने माउंट करने के लिए किया जा सकता है।
    3. इमेजिंग बफर44 का 1 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    4. चरण 4.2.6 से एक कवरलिप लें और इसे कस्टम-निर्मित धारक में रखें। पैराफिल्म-लपेटे चुंबकीय रिंग (चरण 5.1.2) के साथ धारक में कवरस्लिप को ठीक करें।
    5. नमूने के शीर्ष पर चुंबकीय अंगूठी द्वारा बनाए गए कक्ष में इमेजिंग बफर (चरण 5.1.3) को धीरे से पाइप करें (चित्रा 2 बी)। पैराफिल्म के एक टुकड़े के साथ कक्ष को सील करें।
    6. नमूने को माउंट करने के लिए, स्वच्छ 100x / 1.5 तेल उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें। विसर्जन तेल में किसी भी हवा को पेश किए बिना, माइक्रोस्कोप चरण पर माउंटेड नमूना (चरण 5.1.5) के साथ नमूना धारक को धीरे से रखें।
      नोट: माइक्रोस्कोप पर नमूना रखने से पहले, ऊतक और 70% इथेनॉल के साथ कवरस्लिप के निचले हिस्से को साफ करें।
    7. माइक्रोमैनेजर 245,46 के भीतर ईएमयू प्लगइन विंडो47 का उपयोग करके, पीजो चरण को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि क्वाड्रंट फोटोडायोड (क्यूपीडी) पर फोकस लॉक लेजर से सिग्नल का पता नहीं चल जाता।
      नोट: इमेजिंग समय में एक निश्चित फोकस बनाए रखने के लिए, फोकस लॉकिंग को कवरस्लिप से निकट-अवरक्त फाइबर-युग्मित लेजर के कुल आंतरिक प्रतिबिंब और बाद में क्वाड्रंट फोटोडायोड (क्यूपीडी) पर ऊंचाई संवेदनशील पहचान द्वारा प्राप्त किया जाता है। क्यूपीडी सिग्नल ने उद्देश्य लेंस पीजो माउंट का बंद लूप नियंत्रण प्रदान किया।
    8. विसर्जन तेल में हवा के बुलबुले की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए कम शक्ति (यानी, 1-5%) पर 640 एनएम उत्तेजना लेजर के साथ एक बैक फोकल प्लेन छवि प्राप्त करें।
      नोट: यदि हवा के बुलबुले का पता चलता है तो चरण से नमूना निकालें। कवरस्लिप और उद्देश्य के निचले हिस्से को साफ करें और चरण 5.1.6-5.1.8 दोहराएं। अन्यथा, ईएमयू सॉफ्टवेयर 47 के भीतर फोकस लॉक करने के लिए आगेबढ़ें।
    9. ब्राइटफील्ड रोशनी का उपयोग करके गोनैड ऊतक का स्थानीयकरण करें। कम तीव्रता वाले 640 एनएम रोशनी का उपयोग करते हुए, ऊतक के उस खंड पर ध्यान केंद्रित करें जिसमें कई एससी स्ट्रेच होते हैं।
      नोट: उन संरचनाओं पर ध्यान केंद्रित न करें जो कवरस्लिप से 2 μm से अधिक हैं। नमूने का पता लगाने के लिए उच्च लेजर शक्ति का उपयोग न करें, क्योंकि यह कुछ फ्लोरोफोरे को समय से पहले पलक झपकने की स्थिति में बदल सकता है। यहां, 1,000 पर पल्स सेट के साथ राइजिंग मोड में 1 किलोवाट / सेमी2 का उपयोग किया गया था।
    10. ~ 30 सेकंड के लिए उच्च विकिरण (27 किलोवाट/ सेमी 2) पर 640 एनएम रोशनी के साथ नमूने को उजागर करने के लिए आगे बढ़ें जब तक कि उचित ब्लिंकिंग दर हासिल नहीं हो जाती (पूरक वीडियो 1)।
    11. माइक्रोमैनेजर 245,46 में बहुआयामी अधिग्रहण उपकरण का उपयोग करके 20 एमएस एक्सपोजर समय के साथ 200,000 फ्रेम प्राप्त करें।
    12. इस बीच, वांछित ब्लिंकिंग दर को बनाए रखने के लिए ईएमयू प्लगइन38,47 के सक्रियण विकल्प का उपयोग करके यूवी सक्रियण सेट करें।
      नोट: 10,000 तक अधिकतम पल्स लंबाई सेट के साथ बढ़ते मोड में 3 किलोवाट / सेमी2 विकिरण पर यूवी लेजर का उपयोग करें।
    13. SMLM छवि पुनर्निर्माण और पोस्टप्रोसेसिंग करें।
      नोट: कच्चे एसएमएलएम डेटा से छवियों का पुनर्निर्माण करने के लिए, प्रकाशित विधियों को देखें। यहां प्रस्तुत डेटा को एसएमएपी48,49 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया गया था। एसएमएपी48 सॉफ्टवेयर में सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि पुनर्निर्माण, चैनल असाइनमेंट, बहाव सुधार, और खराब स्थानीयकरण परिशुद्धता और अधिकतम संभावना फ़िल्टर के साथ स्थानीयकरण की फ़िल्टरिंग की गई थी।
  2. उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण माइक्रोस्कोपी
    नोट: छवियों को ईएमबीएल इमेजिंग सेंटर (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre) में एक सफेद प्रकाश लेजर, 775 एनएम स्पंदित एसटीईडी लेजर और फाल्कन एफलुरेसेंस एलइफटाइम आईएमएजिंग मॉड्यूल (सामग्री की तालिका) से लैस एकीकृत एसटीईडी माइक्रोस्कोपिक सिस्टम पर प्राप्त किया गया था।
    1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंटिंग माध्यम (सामग्री की तालिका) की 20 μL की बूंद रखें। चरण 4.2.2 से एक कवरस्लिप लें और नमूने को धीरे से बढ़ते माध्यम (चित्रा 2 बी) के सामने स्लाइड पर रखें।
      नोट: बढ़ते माध्यम के भीतर एयर पॉकेट पेश करने से बचें।
    2. बढ़ते माध्यम को रातोंरात ठीक होने दें।
      नोट: अगले दिन नमूने की छवि बनाएं या इमेजिंग तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. नमूना माउंट करने के लिए, चरण 5.2.2 से नमूने के कवरस्लिप पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें। 100x/1.40 तेल उद्देश्य का उपयोग करके नमूने को माइक्रोस्कोप चरण पर धीरे से रखें।
    4. नमूने पर ध्यान केंद्रित करें और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग करके रोगाणु ऊतक का पता लगाएं।
    5. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, रुचि के क्षेत्र को निर्दिष्ट करें जिसके लिए TauSTED छवि का अधिग्रहण किया जाएगा।
    6. नमूने में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर को उत्तेजित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उत्तेजना लेजर और उनकी उपयुक्त शक्ति का चयन करें।
      नोट: यहां, 4% शक्ति पर 580 एनएम लेजर का उपयोग एलेक्साफ्लोर 594-संयुग्मित एफ (एबी') 2 द्वितीयक एंटीबॉडी टुकड़ों को चित्रित करने के लिए किया गया था, और स्टार 635 पी-संयुग्मित एफ (एबी)2 टुकड़ों की छवि बनाने के लिए 3% शक्ति पर 635 एनएम का उपयोग किया गया था।
    7. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, एक उपयुक्त एसटीईडी रिक्तीकरण लेजर शक्ति का चयन करें और छवि का पता लगाने के लिए सेट करें।
      नोट: यहां, 775 एनएम एसटीईडी रिक्तीकरण लेजर शक्ति को 40% पर सेट किया गया था। डिटेक्टर का उपयोग फोटॉन का पता लगाने के लिए 10 के लाभ मूल्य के साथ गिनती मोड में किया गया था, जिसमें 100 हर्ट्ज की स्कैन दर और 17 एनएम के पिक्सेल आकार पर था। टॉस्टेड अधिग्रहण के लिए चार-लाइन संचय का उपयोग किया गया था।

Representative Results

एसएमएलएम द्वारा सी एलिगेंस जर्मलाइन ऊतक के भीतर एससी की छवि बनाने के लिए, हमने क्रोमोसोम अक्षों के एक घटक एचटीपी -3 और अनुप्रस्थ फिलामेंट एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनस को स्थानीयकृत करने के लिए 2-रंग अनुपातमेट्रिक 3 डी-एसएमएलएम का उपयोग किया है। एलिगेंस के एससी के भीतर दोनों प्रोटीनों का स्थान पहले अन्य अध्ययनों16,30 द्वारा निर्धारित किया गया था।

मोटे जैविक नमूनों में निहित प्रकाश प्रकीर्णन और ऑप्टिकल विपथन को कम करने के लिए, हमने मियोटिक नाभिक के सबसे निचले-सबसे जेड-सेक्शन की छवि बनाई जिसमें एससी (चित्रा 3, पीली रेखाएं) होते हैं। प्रत्येक अधिग्रहित छवि के लिए, इमेजिंग विमान की पीजो चरण स्थिति को पीजो चरण की स्थिति के सापेक्ष चिह्नित किया गया था जब उद्देश्य कवरस्लिप पर केंद्रित था। इसने कवरस्लिप से पीजो दूरी की गणना की अनुमति दी। सफलतापूर्वक लगाए गए नमूने कवरस्लिप के करीब स्थिर रूप से जुड़े होते हैं और गोनाड आकार को बनाए रखते हैं (यानी, ऊतक को पोस्टफिक्सेशन चरण के दौरान दो कवरलिप्स के बीच कुचल नहीं दिया जाता है)। नमूना माउंटिंग की गुणवत्ता का मूल्यांकन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत आसानी से किया जा सकता है क्योंकि अच्छी तरह से संलग्न गोनैड समाधान में कोई आंदोलन नहीं दिखाते हैं (चरण 4.2.6)। फिर भी, बढ़ती प्रक्रिया की स्टोकेस्टिकिटी के कारण, गोनैड ऊतक को जरूरी नहीं कि कवरस्लिप पर पूरी तरह से सपाट रखा जाए। इसलिए, एससी युक्त नाभिक का निचला तल एक ही गोनैड के भीतर कवरस्लिप के सापेक्ष अलग-अलग दूरी पर पाया जा सकता है।

यह समझाने के लिए कि ऊतक के कवरस्लिप से लगाव के आधार पर रिज़ॉल्यूशन कैसे बदलता है, हमने कवरस्लिप के लिए अलग-अलग पीजो दूरी पर छवियां प्राप्त कीं। एक व्यक्तिगत छवि की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, फूरियर रिंग सहसंबंध (एफआरसी) वक्र50,51 की गणना की गई थी और एसएमएपी सॉफ्टवेयर48 के भीतर एफआरसी रिज़ॉल्यूशन प्लगइन का उपयोग करके रिज़ॉल्यूशन निर्धारित किया गया था। कवरस्लिप में अलग-अलग दूरी पर ली गई दो अलग-अलग 3 डी-एसएमएलएम छवियों से निकाले गए दो प्रतिनिधि नाभिक चित्र 4 में प्रदर्शित किए गए हैं। कवरस्लिप के करीब स्थित एससी में, क्रोमोसोम अक्षों और एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनस: एचए को सभी तीन आयामों में अच्छी तरह से हल किया जाता है (चित्रा 4 ए, कवरस्लिप से 0.8 μm)। किसी दी गई दूरी से अलग दो संरचनाओं को हल करने के लिए, प्राप्त एफआरसी रिज़ॉल्यूशन आम तौर पर अक्षीय रिज़ॉल्यूशन में इस दूरी के आधे से छोटा होना चाहिए।

समान संरचनाओं को पार्श्व रूप से अलग करने के लिए, यहां तक कि छोटे एफआरसी रिज़ॉल्यूशन मानों को भी प्राप्त करने की आवश्यकता है। दरअसल, कवरस्लिप के करीब स्थित नमूनों में, एफआरसी रिज़ॉल्यूशन एलेक्साफ्लोर 647 चैनल के लिए 38 एनएम और सीएफ 680 चैनल के लिए 34 एनएम है, और इस प्रकार एसवाईपी -5 16 के सी-टर्मिनी के बीच 84 एनएम की अपेक्षित दूरी सेकाफी नीचे है। इसलिए यह संकल्प एससी के संगठन को न केवल फ्रंटल में बल्कि पार्श्व दृश्यों में भी आसानी से हल करता है (चित्रा 4 बी आई, ii)। इसके विपरीत, प्रकाश प्रकीर्णन और गोलाकार विपथन के कारण कवरस्लिप से 5 μ मीटर की दूरी पर स्थित एससी में रिज़ॉल्यूशन बिगड़ जाता है (चित्रा 4 बी)। इस दूरी पर एफआरसी रिज़ॉल्यूशन 47 एनएम (एलेक्साफ्लोर 647) और 41 एनएम (सीएफ 680) तक गिर जाता है, जो एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनी को पूरी तरह से हल नहीं कर सकता है। चूंकि ऑप्टिकल विपथन पार्श्व रिज़ॉल्यूशन को अक्षीय रिज़ॉल्यूशन की तुलना में अधिक गंभीर रूप से खराब करते हैं, इसलिए एचटीपी -3 और एसवाईपी -5 बैंड अब कवरस्लिप से 5 μ मीटर की दूरी पर स्थित नमूनों में पार्श्व दृश्य के क्रॉस-सेक्शन में स्पष्ट रूप से हल नहीं होते हैं (चित्रा 4 बी ii)। कवरस्लिप से अलग-अलग पीजो दूरी पर प्राप्त छवियों के एफआरसी रिज़ॉल्यूशन की तुलना करने से पता चला कि छवि ऊतक कवरस्लिप से 2 μm से आगे नहीं होना चाहिए (चित्रा 5)। यह परिणाम पोस्टफिक्सेशन चरण के सही निष्पादन के महत्व पर प्रकाश डालता है, जिसके दौरान ऊतक को कवरस्लिप के पॉली-एल-लाइसिन कोटिंग से सफलतापूर्वक क्रॉसलिंक किया जाना चाहिए।

एक अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक के साथ प्राप्त करने योग्य रिज़ॉल्यूशन का प्रदर्शन करने के लिए, हमने ताऊएसटीईडी माइक्रोस्कोपी के साथ निश्चित बरकरार जर्मलाइन ऊतक में एससी को भी चित्रित किया। चित्रा 6 ए इस अध्ययन के भीतर प्राप्त उच्चतम और निम्नतम रिज़ॉल्यूशन के साथ टॉस्टेड छवियों को दिखाता है जैसा कि फ्रंटल व्यू (चित्रा 6 बी) में एससी के लाइन प्रोफाइल से अनुमान लगाया गया है। दोनों नाभिकों में, हम क्रोमोसोम अक्षों में एचटीपी -3 के दो स्थानीयकरण बैंड और मध्य क्षेत्र में एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनी को हल कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके टाउस्टेड में प्राप्त संकल्प 84 एनएम से नीचे है। इष्टतम परिस्थितियों (चित्रा 6 ए, शीर्ष) के तहत, हम सी-टर्मिनी को एससी के थोड़े झुके हुए दृश्यों में हल कर सकते हैं जो केवल 50 एनएम (चित्रा 6 ए, पीला आयत और 6 सी) से अलग थे।

Figure 1
चित्रा 1: केनोरहाब्डिस एलिगेंस में सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स के संगठन का योजनाबद्ध। कार्टून में सी एलिगेंस में एससी की एक सरलीकृत संरचना को दिखाया गया है जो दो समरूप गुणसूत्रों (ग्रे) को पुल करता है। संरचना को ललाट, पार्श्व और पार-अनुभागीय दृश्यों में दिखाया गया है। क्रोमोसोम अक्षों को लाल सलाखों के रूप में प्रदर्शित किया जाता है जबकि अनुप्रस्थ फिलामेंट्स को सियान में दिखाया जाता है। ट्रांसवर्स फिलामेंट प्रोटीन (एसवाईपी -1, 5, 6 में सी एलिगेंस) दो अक्षों के बीच की दूरी को पाटने के लिए मध्य क्षेत्र में सिर-से-सिर तरीके (सियान बॉल-स्टिक ग्राफिक्स) में उन्मुख होते हैं। अक्षों और अनुप्रस्थ फिलामेंट्स के सी-टर्मिनी के बीच अपेक्षित दूरी इंगित की जाती है। संक्षिप्त नाम: एससी = सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: अध्ययन में प्रयुक्त नमूना तैयारी का चित्रण। (A) युवा C. एलिगेंस वयस्कों को उनके सिर या पूंछ (हरी, डैश्ड लाइनें) पर विच्छेदित किया जाता है और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किया जाता है। (बी) विधि के अलग-अलग चरणों को ग्राफिक्स के साथ इंगित किया जाता है जो ग्रे तीर से जुड़े होते हैं। संक्षेप: एसटीईडी = उत्तेजित-उत्सर्जन की कमी; एसएमएलएम = एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ऊतक अनुभाग का स्थान जिसे एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है। एलिगेंस गोनाड पर्वत की एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल छवि का एमआईपी। ऊतक को एचटीपी -3 और एसवाईपी -5 (एसवाईपी -5: एचए) के सी-टर्मिनस के लिए दाग दिया गया था, और संयुक्त संकेत ग्रे में दिखाया गया है। पूरे गोनैड की छवि बनाने के लिए ग्रिड / कलेक्शन स्टिचिंग फिजी प्लगइन52 का उपयोग करके व्यक्तिगत कॉन्फोकल छवियों को सिला गया था। इनसेट एससी युक्त सबसे निचले जेड-प्लेन का एक xy दृश्य दिखाता है। इस विमान का स्थानीयकरण गोनाड (पीली रेखाओं) की एमआईपी छवि में एक आयत द्वारा इंगित ऊतक खंड के ऑर्थोगोनल दृश्यों में दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षिप्तीकरण: एमआईपी = अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण; एससी = सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एचटीपी -3 की एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनी । (ए, बी) बाएं: एसएमएलएम छवियां एचटीपी -3 (लाल) और एसवाईपी -5 के सी-टर्मिनस (एसवाईपी -5:: एचए, सियान) (स्केल बार = 1 μm) के लिए दाग वाले पैचिटेन नाभिक दिखाती हैं। केंद्र: रुचि के क्षेत्रों की ज़ूम-इन छवियां जो ए और बी में इंगित की गई हैं, प्रत्येक छवि के नीचे प्रदर्शित संबंधित क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों के साथ (i, ii; स्केल बार = 100 एनएम)। जूम-इन छवियों के भीतर एससी के हिस्सों को वाई-अक्ष के समानांतर गुणसूत्र अक्षों को उन्मुख करने के लिए घुमाया जाता है। दाएँ: एससी के भीतर रुचि के प्रोटीन के स्थानीयकरण का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व जो आकृति के केंद्र में प्रदर्शित ज़ूम-इन क्षेत्रों में एससी के अभिविन्यास को चित्रित करता है। संक्षेप: एसएमएलएम = एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी; एससी = सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स। SMLM छवियों के पुनर्निर्माण के लिए कच्चा डेटा BioStudies डेटाबेस60 (परिग्रहण आईडी: S-BIAD504) के माध्यम से उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी छवियों का फूरियर रिंग सहसंबंध संकल्प कवरस्लिप के विमान से चित्रित जेड-प्लेन की दूरी पर निर्भर करता है। रंगीन रेखाएं कवरस्लिप से अलग-अलग दूरी (जैसा कि रंग पट्टी द्वारा चित्रित) पर प्राप्त छवियों के एफआरसी वक्र दिखाती हैं। एफआरसी संकल्प निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली 1/7 सीमा को एक काली क्षैतिज रेखा द्वारा इंगित किया जाता है। इनसेट कवरस्लिप से पीजो दूरी पर एफआरसी रिज़ॉल्यूशन की निर्भरता दिखाते हैं। प्लॉटिंग एक कस्टम-लिखित आर स्क्रिप्ट (संस्करण 4.1.2, पूरक फ़ाइल 1) द्वारा की गई थी जिसमें मूल वक्रों को "ggplot2" पैकेज से कार्यों के साथ चिकना किया गया था। संक्षिप्तीकरण: एफआरसी = फूरियर रिंग सहसंबंध; एसएमएलएम = एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी; एससी = सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स। एफआरसी कर्व्स और एसएमएलएम डेटा के लिए डेटा बायोस्टडीज डेटाबेस60 (परिग्रहण आईडी: एस-बीआईएडी 504) के माध्यम से उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिदीप्ति जीवनकाल-आधारित जानकारी (TauSTED) द्वारा बढ़ाए गए उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण माइक्रोस्कोपी HTP-3 और SYP-5 के C-टर्मिनस दोनों के लिए दो स्थानीयकरण बैंड को हल करता है। (ए) दो प्रतिनिधि टॉस्टेड छवियों में एचटीपी -3 (लाल) और एसवाईपी -5 (एसवाईपी -5: एचए, सियान) के सी-टर्मिनस के लिए उच्च (शीर्ष) और निचले (नीचे) संरचनात्मक परिभाषा (स्केल बार = 1 μm) के साथ पैचिटेन नाभिक दिखाई देते हैं। आयताकार उन क्षेत्रों को चिह्नित करते हैं जिनमें SYP-5 का हल किया गया C-termini (सफेद) और SC का थोड़ा झुका हुआ दृश्य (पीला) होता है। (B, C) HTP-3 (लाल) का वितरण और SYP-5 (cyan) सिग्नल का C-टर्मिनस TauSTED द्वारा हल किया जाता है। रुचि के क्षेत्रों की लाइन प्रोफाइल जिसमें फ्रंटल (बी) या थोड़ा झुका हुआ (सी) दृश्यों में एससी होता है, को अधिकतम मान तक सामान्यीकृत तीव्रता के साथ पूर्ण रेखाओं के रूप में दिखाया जाता है। लाइन प्रोफाइल फिजी इमेजजे का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। बी में डैश्ड लाइनें प्रत्येक प्रोटीन के लिए औसत डेटा दिखाती हैं। C में मोटी सियान रेखा SYP-5 के C-termini के बीच सबसे कम हल की गई दूरी के साथ लाइन प्रोफ़ाइल से मेल खाती है। विशिष्ट प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के बीच की दूरी निर्धारित करने के लिए, लाइन प्रोफाइल (एन = 9 (बी), एन = 7 (सी)) को कस्टम-लिखित आर स्क्रिप्ट (संस्करण 4.1.2, पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करके डबल गॉसियन के साथ फिट किया गया था। मानक विचलन (बी) ± औसत दूरी और बोल्ड (सी) में हाइलाइट किए गए न्यूनतम मूल्य वाली सीमा क्रमशः प्रत्येक ग्राफ के शीर्ष पर इंगित की गई है। संक्षेप: एसटीईडी = उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण माइक्रोस्कोपी; एससी = सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स। प्लॉटकिए गए लाइन प्रोफाइल की प्रदर्शित छवियां और डेटा बिंदु बायोस्टडीज डेटाबेस60 (परिग्रहण आईडी: एस-बीआईएडी 504) के माध्यम से उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर और समाधानों की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण। उचित दर पर फ़्लोरोफोरेस को पलक झपकाते हुए वीडियो (50 फ्रेम दिखाए गए हैं, स्केल बार = 5 μm, 20 ms / कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: डेटा विश्लेषण स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एससी का सीढ़ी जैसा संगठन, जो सही पुनर्संयोजन और समरूप गुणसूत्रों के अलगाव के लिए आवश्यक है, पहली बार लगभग 70 साल पहले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3,4 में देखा गया था। जबकि एससी के समग्र संगठन को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में आसानी से हल किया जाता है, इस परिसर के भीतर व्यक्तिगत घटकों के स्थानीयकरण के लिए अधिक लक्षित दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। केवल ~ 100 एनएम की चौड़ाई के साथ, एससी की उपसंरचना को पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी सिनैप्टोनमल कॉम्प्लेक्स 16,19,24,25,26,27,28,29,30 की संरचना और कार्य पर नई खोजों के लिए एक प्रमुख चालक बन गया है। इस शोध को सुविधाजनक बनाने के लिए, हमने एक बढ़ती प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है जो एसएमएलएम और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के साथ सी एलिगेंस गोनैड ऊतक के भीतर एससी की वास्तुकला का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

एसएमएलएम इमेजिंग में रिज़ॉल्यूशन को अनुकूलित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम सीधे जर्मलाइन ऊतक को पॉली-एल-लाइसिन लेपित कवरस्लिप (चरण 4) से क्रॉस-लिंक करना है। कवरस्लिप के लिए ऊतक का सहसंयोजक लगाव नमूने के भीतर आंदोलनों को कम करने के लिए आवश्यक है जिसके परिणामस्वरूप बड़े बहाव होंगे और एसएमएलएम के लिए लंबे समय तक इमेजिंग असंभव हो जाएगी। इसके अतिरिक्त, यहां तक कि एक उप-मानक लगाव जो एससी युक्त नाभिक को कवरस्लिप से दूरी पर छोड़ देता है, गोलाकार विपथन के परिणामस्वरूप प्राप्त करने योग्य रिज़ॉल्यूशन में एक महत्वपूर्ण गिरावट की ओर जाता है (चित्रा 4)। वैकल्पिक रूप से यहां उपयोग किए जाने वाले सहसंयोजक लगाव के लिए, सना हुआ जर्मलाइन ऊतक इमेजिंग बफर19,30 की एक छोटी बूंद में दो सील कवरलिप्स के बीच भी स्थिर किया जा सकता है। हालांकि, यह स्थिरीकरण विधि यहां अनुकूलित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले 1 एमएल से नमूने में इमेजिंग बफर की मात्रा को केवल कुछ μL तक गंभीर रूप से कम कर देती है, जिसके परिणामस्वरूप इमेजिंग बफर का अम्लीकरण होगा और उस समय को गंभीर रूप से कम कर देगा जिसके लिए नमूने को38,53,54 इमेज किया जा सकता है।

एसएमएलएम और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए लंबे अधिग्रहण समय रासायनिक रूप से निश्चित नमूनों की इमेजिंग के लिए इन विधियों के उपयोग को सीमित करते हैं। यहां, पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण यह सुनिश्चित करता है कि नमूना तैयार करने और इमेजिंग के दौरान एससी की संरचना संरक्षित है। हालांकि, बरकरार ऊतक के भीतर एससी की छवि बनाने के लिए यहां बरती गई सावधानियों के बावजूद, निर्धारण के बाद एससी की परिणामी संरचना आवश्यक रूप से एक जीवित जीव के भीतर अपनी मूल स्थिति में संरचना के समान नहीं है। इसके अलावा, चूंकि निश्चित एससी की एक एकल छवि जैविक संरचना के एकल "स्नैपशॉट" का प्रतिनिधित्व करती है, इसलिए यह दृष्टिकोण विवो में मूल संरचना की गतिशीलता के लिए अंधा रहता है।

हालांकि, मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं की गतिशीलता और परिवर्तनशीलता पर जानकारी न केवल एक बल्कि कई "स्नैपशॉट" प्राप्त करके भी प्राप्त की जा सकती है। हालांकि यह दृष्टिकोण पचीटेन19 के दौरान एससी की संरचना में परिवर्तन को हल कर सकता है, ऐसे कई कारक हैं जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए एकल नमूने से प्राप्त की जा सकने वाली छवियों की संख्या को सीमित करते हैं। सबसे पहले, छवि अधिग्रहण के दौरान उपयोग की जाने वाली उच्च लेजर शक्तियां फ्लोरोफोरेस के स्थायी विरंजन का कारण बनती हैं और रुचि के आसन्न क्षेत्रों या कई जेड-विमानों की इमेजिंग को रोकती हैं, जिससे एक नमूने से प्राप्त की जा सकने वाली छवियों की संख्या में काफी कमी आती है। दूसरा, इस विधि द्वारा तैयार कवरस्लिप पर नमूना / ऊतक घनत्व कम है, जो एकल कवरस्लिप से प्राप्त की जा सकने वाली छवियों की संख्या को काफी सीमित करता है। कम नमूना घनत्व स्वचालित छवि अधिग्रहण पाइपलाइनों के उपयोग को भी प्रतिबंधित करता है जो अन्य जैविक प्रश्नों 34,55,56,57,58,59 पर प्रकाश डालने में मदद करता है। हालांकि, नमूना घनत्व को एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा थोड़ा बढ़ाया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को एक उच्च लेबलिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है जो एसएमएलएम35 में इष्टतम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। जबकि पिछले प्रोटोकॉल सहसंयोजक रूप से इम्यूनोस्टेनिंग16 से पहले ऊतक को कवरस्लिप से जोड़ते हैं, यह नया प्रोटोकॉल ऊतक को कवरस्लिप से केवल तभी जोड़ता है जब नमूने समाधान में दाग होते हैं। यह संशोधन इम्यूनोलेबलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी को सभी तरफ से ऊतक तक स्वतंत्र रूप से पहुंचने की अनुमति देता है, जबकि कवरस्लिप के लिए ऊतक का सहसंयोजक लगाव एंटीबॉडी को कवरस्लिप के निकटतम नाभिक तक पहुंचने से रोक सकता है, जिससे लेबलिंग की डिग्री कम हो जाती है। साथ में, यहां वर्णित संशोधन 40-50 एनएम (एफआरसी रिज़ॉल्यूशन) 16 से 30-40 एनएम (इस प्रोटोकॉल) तक रिज़ॉल्यूशन में सुधार करते हैं।

महत्वपूर्ण रूप से, जबकि एसएमएलएम के लिए एक उच्च लेबलिंग घनत्व और एंटीबॉडी की उच्च सांद्रता आवश्यक है, हमने पाया कि कम एंटीबॉडी सांद्रता (चरण 3) का उपयोग करके बेहतर एसटीईडी माइक्रोस्कोपी छवियां प्राप्त की जाती हैं। दसियों नैनोमीटर के संकल्प पर, रुचि के प्रोटीन को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अणुओं का आकार तेजी से महत्वपूर्ण हो जाता है। इसलिए हमने एफ (एबी') 2 टुकड़ों को नियोजित किया जो पूर्ण लंबाई वाले एंटीबॉडी के आकार के आधे हैं। एक छोटे सिग्नल स्रोत के कारण स्थानीय कंट्रास्ट में सुधार, और इसलिए पूर्ण लंबाई वाले द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करने की तुलना में इस संशोधन द्वारा प्राप्त संकल्प ने ताऊएसटीईडी द्वारा मध्य क्षेत्र के भीतर एसवाईपी -5 के दो सी-टर्मिनी के समाधान की अनुमति दी, जो पारंपरिक एसटीईडी द्वारा पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी (16 और डेटा नहीं दिखाया गया) का उपयोग करके हल नहीं किए जाते हैं। एलिगेंसजर्मलाइन में इमेजिंग एससी के लिए यह अनुकूलित प्रोटोकॉल अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान एससी के संरचना-कार्य संबंध की जांच की सुविधा प्रदान करेगा।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम एसएमएलएम इमेजिंग के लिए इमेजिंग बफर साझा करने के लिए जोनास रीस और रीस लैब को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सी एलिगेंस स्ट्रेन के लिए युमी किम और चिकन-एंटी-एचटीपी -3 एंटीबॉडी के लिए एबी एफ डर्नबर्ग को भी धन्यवाद देते हैं। हम ओलंपस आईएक्सप्लोर स्पिन एसआर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने में उनके समर्थन के लिए ईएमबीएल हीडलबर्ग में उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा से मार्को लैम्पे और स्टीफन टेरजुंग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला और ड्यूश फोर्सचुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन - 452616889, एसके) द्वारा समर्थित किया गया था। हम यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला (ईएमबीएल आईसी) में इमेजिंग सेंटर द्वारा प्रदान की गई पहुंच और सेवाओं को स्वीकार करते हैं, जो उदारतापूर्वक बोहरिंगर इंगेलहेम फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.5 oil objective Olympus UPLAPO100XOHR UPLAPO100XOHR
2-mercaptoethylamine (MEA) Sigma-Aldrich 30070-10G Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH  8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C.
Additional 640 nm booster laser Toptica IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS ester ThermoFischer Scientific A37572 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
AlexaFluor 647, NHS ester ThermoFischer Scientific A37573 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
anti-HA Thermo Fisher Scientific 2-2.2.14 Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
anti-HTP-3 a gift from Abby F. Dernburg MacQueen et al., 2005 Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans strain  YKM349 a gift from Yumi Kim Hurlock et al., 2020 syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS ester Biotium 92139 Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Circular cover glass 12 mm No. 1 Menzel-Gläser; VWR 631-0713
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 Carl Roth PK26.1
Cylindrical lenses Thorlabs LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x) Edgar 1995 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Ethanol (absolute for analysis) Merck 64-17-5
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY Jackson Immunoresearch AB_2340347 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch AB_2340761 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick Fisher scientific 7107
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10% Kisker 789265
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155),
50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C.
Imaging buffer base a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose.
Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C.
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant ThermoFischer Scientific P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON Leica N/A The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.  Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.
Longwave channel emission filter AHF Analysentechnik F47-702 700/100 nm bandpass
Methanol (absolute for analysis) Merck 67-56-1
NaHCO3 Sigma-Aldrich/Merck S5761-500G 100 mM NaHCO3, pH 8.3
Near-infrared fiber-coupled laser Toptica IBEAM-SMART-PT-CD Custom Design, 808 nm - 75mW
Objective lens piezo mount (PIFOC ) Physik Instrumente P-726.1.CD 100 µm travel range
Orca Fusion BT sCMOS camera Hamamatsu C15440-20UP
PCR tubes Greiner Bio-One 673283 0.2 mL
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) N/A 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free ThermoFischer Scientific 28906 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.
PlasmaPrep2 plasma cleaner GaLa Instrumente GmbH N/A
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich/Merck P2636-25MG 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C.
Primary dichroic (illumination reflecting) AHF Analysentechnik F73-866S quad bandpass @ 405, 488, 561, 640
Quadnotch filter AHF Analysentechnik F40-072 405/488/561/640 nm
Quadrant photodiode (QPD) Laser Components SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Razor blades Apollo Herkenrath Solinger N/A
Refractive beam shaper AdlOptica PiShaper 6_6_VIS
Roche Blocking Reagent Roche 11096176001 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110911
Scalpel removal box Fisher scientific 10002-50
Secondary dichroic (emission reflecting) AHF Analysentechnik F38-785S 750 nm longpass
Shortpass filter Semrock BSP01-785R-25  750 nm
Shortwave channel emission filter AHF Analysentechnik F37-677  676/37 nm bandpass
Single molecule localization microscope EMBL Imaging Centre Diekmann et al., 2020 with modifications The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera  and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm.
For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking).
A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging.
To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser  from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount.
For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine Toptica iCHROME MLE-LFA-HP Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm
Splitting dichroic AHF Analysentechnik F48-665SG 665 nm long pass
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 Menzel-Gläser; VWR 630-2882
STAR 635P, NHS ester Abberior ST635P-0002-1MG Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB Zeiss N/A
Tetramisole hydrochloride Sigma-Aldrich/Merck T1512-2G 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months.
TetraSpeck Microspheres ThermoFischer Scientific T7279  0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red
Tris Saline Buffer (TBS 10x) N/A 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich/Merck P9416-50ML Kept at room temperature in original packaging.
WormStuff worm pick Kisker 789277
XY microscope stage  Smaract N/A Custom Design
Zeba Micro Spin Desalting Column ThermoFischer Scientific 89877  7K MWCO, 75 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annual Review of Genetics. 33, 603 (1999).
  2. Ur, S. N., Corbett, K. D. Architecture and dynamics of meiotic chromosomes. Annual Review of Genetics. 55, 497-526 (2021).
  3. Fawcett, D. W. The fine structure ot chromosomes in the meiotic prophase of vertebrate spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (4), 403-406 (1956).
  4. Moses, M. J. Chromosomal structures in crayfish spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (2), 215-218 (1956).
  5. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. WormBook. , 433-434 (2017).
  6. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes & Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  7. Severson, A. F., Ling, L., Van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes & Development. 23 (15), 1763-1778 (2009).
  8. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Müller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & Development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  9. Martinez-Perez, E. HTP-1-dependent constraints coordinate homolog pairing and synapsis and promote chiasma formation during C. elegans meiosis. Genes & Development. 19 (22), 2727-2743 (2005).
  10. Couteau, F., Zetka, M. HTP-1 coordinates synaptonemal complex assembly with homolog alignment during meiosis in C. elegans. Genes & Development. 19 (22), 2744-2756 (2005).
  11. Goodyer, W., et al. HTP-3 Links DSB Formation with Homolog Pairing and Crossing Over during C. elegans Meiosis. Developmental Cell. 14 (2), 263-274 (2008).
  12. Colaiácovo, M. P., et al. Synaptonemal complex assembly in C. elegans is dispensable for loading strand-exchange proteins but critical for proper completion of recombination. Developmental Cell. 5 (3), 463-474 (2003).
  13. MacQueen, A. J., Colaiácovo, M. P., McDonald, K., Villeneuve, A. M. Synapsis-dependent and -independent mechanisms stabilize homolog pairing during meiotic prophase in C. elegans. Genes & Development. 16 (18), 2428-2442 (2002).
  14. Smolikov, S., et al. Synapsis-defective mutants reveal a correlation between chromosome conformation and the mode of double-strand break repair during Caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 176 (4), 2027-2033 (2007).
  15. Smolikov, S., Schild-Prüfert, K., Colaiácovo, M. P. A yeast two-hybrid screen for SYP-3 interactors identifies SYP-4, a component required for synaptonemal complex assembly and chiasma formation in Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genetics. 5 (10), 1000669 (2009).
  16. Hurlock, M. E., et al. Identification of novel synaptonemal complex components in C. Elegants. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  17. Zhang, Z., et al. Multivalent weak interactions between assembly units drive synaptonemal complex formation. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  18. Schild-Prüfert, K., et al. Organization of the synaptonemal complex during meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 189 (2), 411-421 (2011).
  19. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. The interaction of crossover formation and the dynamic architecture of the synaptonemal complex during meiosis. bioRxiv. , (2020).
  20. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6621), 543-548 (2015).
  21. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  22. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  23. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  24. Schücker, K., Holm, T., Franke, C., Sauer, M., Benavente, R. Elucidation of synaptonemal complex organization by super-resolution imaging with isotropic resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2029-2033 (2015).
  25. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  26. Zwettler, F. U., et al. Tracking down the molecular architecture of the synaptonemal complex by expansion microscopy. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  27. Yoon, S., Choi, E. H., Kim, J. W., Kim, K. P. Structured illumination microscopy imaging reveals localization of replication protein A between chromosome lateral elements during mammalian meiosis. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-12 (2018).
  28. Prakash, K., et al. Superresolution imaging reveals structurally distinct periodic patterns of chromatin along pachytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14635-14640 (2015).
  29. Xu, H., et al. Molecular organization of mammalian meiotic chromosome axis revealed by expansion STORM microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18423-18428 (2019).
  30. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), 4734-4743 (2017).
  31. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  32. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  33. Jahr, W., Velicky, P., Danzl, J. G. Strategies to maximize performance in STimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy of biological specimens. Methods. 174, 27-41 (2019).
  34. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  35. Xu, K., Shim, S. -H., Zhuang, X. Super-resolution imaging through stochastic switching and localization of single molecules: an overview. Far-Field Optical Nanoscopy. , 27-64 (2013).
  36. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22 (13), 15982 (2014).
  37. Winterflood, C. M., Platonova, E., Albrecht, D., Ewers, H. Dual-color 3D superresolution microscopy by combined spectral-demixing and biplane imaging. Biophysical Journal. 109 (1), 3-6 (2015).
  38. Diekmann, R., et al. Optimizing imaging speed and excitation intensity for single molecule localization microscopy. Nature Methods. 17 (9), 909 (2020).
  39. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  40. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 558, 171-195 (2009).
  41. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  42. MacQueen, A. J., et al. Chromosome sites play dual roles to establish homologous synapsis during meiosis in C. elegans. Cell. 123 (6), 1037-1050 (2005).
  43. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  44. Hoess, P., Mund, M., Reitberger, M., Ries, J. Dual-color and 3D super-resolution microscopy of multi-protein assemblies. Methods in Molecular Biology. 1764, 237-251 (2018).
  45. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer Control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  46. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
  47. Deschamps, J., Ries, J. EMU: reconfigurable graphical user interfaces for Micro-Manager. BMC Bioinformatics. 21 (1), 1-13 (2020).
  48. Ries, J. SMAP: a modular super-resolution microscopy analysis platform for SMLM data. Nature Methods. 17 (9), 870-872 (2020).
  49. Li, Y., et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  50. Nieuwenhuizen, R. P. J., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nature Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  51. Banterle, N., Bui, K. H., Lemke, E. A., Beck, M. Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy. Journal of Structural Biology. 183 (3), 363-367 (2013).
  52. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  53. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  54. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gönczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  55. Mund, M., et al. Superresolution microscopy reveals partial preassembly and subsequent bending of the clathrin coat during endocytosis. bioRxiv. , (2022).
  56. Mund, M., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  57. Sabinina, V. J., et al. Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex. Molecular Biology of the Cell. 32 (17), 1523-1533 (2021).
  58. Cieslinski, K., et al. Nanoscale structural organization and stoichiometry of the budding yeast kinetochore. bioRxiv. , (2021).
  59. Sieben, C., Banterle, N., Douglass, K. M., Gönczy, P., Manley, S. Multicolor single-particle reconstruction of protein complexes. Nature Methods. 15 (10), 777-780 (2018).
  60. Sarkans, U., et al. The BioStudies database—one stop shop for all data supporting a life sciences study. Nucleic Acids Research. 46, (2018).

Tags

एलिगेंस अर्धसूत्रीविभाजन सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण माइक्रोस्कोपी
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> जर्मलाइन के भीतर सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स की सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, … More

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, D., Zimmermann, T., Köhler, S. Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline. J. Vis. Exp. (187), e64363, doi:10.3791/64363 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter