Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Superoppløsningsmikroskopi av det synaptonemale komplekset i Caenorhabditis elegans germline

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64363
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3, 1
1Cell Biology and Biophysics, European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University, Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

Summary

Superoppløsningsmikroskopi kan gi et detaljert innblikk i organiseringen av komponenter i det synaptonemale komplekset i meiose. Her demonstrerer vi en protokoll for å løse individuelle proteiner i Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleks.

Abstract

Under meiose må homologe kromosomer gjenkjenne og holde seg til hverandre for å tillate riktig segregering. En av de viktigste hendelsene som sikrer samspillet mellom homologe kromosomer er samlingen av det synaptonemale komplekset (SC) i meiotisk profase I. Selv om det er lite sekvens homologi mellom proteinkomponenter i SC blant forskjellige arter, har den generelle strukturen til SC blitt svært bevart under evolusjonen. I elektronmikrografier fremstår SC som en tredelt, stigelignende struktur sammensatt av laterale elementer eller akser, tverrgående filamenter og et sentralt element.

Imidlertid er det fortsatt utfordrende å nøyaktig identifisere lokaliseringen av individuelle komponenter i komplekset ved elektronmikroskopi for å bestemme molekylstrukturen til SC. I motsetning til dette tillater fluorescensmikroskopi identifisering av individuelle proteinkomponenter i komplekset. Men siden SC bare er ~ 100 nm bred, kan dens understruktur ikke løses ved diffraksjonsbegrenset konvensjonell fluorescensmikroskopi. Bestemmelse av den molekylære arkitekturen til SC krever således superoppløsningslysmikroskopiteknikker som strukturert belysningsmikroskopi (SIM), STIMULERT utslippsuttømming (STED) mikroskopi eller enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM).

For å opprettholde strukturen og samspillet mellom individuelle komponenter i SC, er det viktig å observere komplekset i et miljø som er nær sitt opprinnelige miljø i kimcellene. Derfor demonstrerer vi en immunhistokjemi- og avbildningsprotokoll som gjør det mulig å studere substrukturen til SC i intakt, ekstrudert Caenorhabditis elegans germline vev med SMLM og STED-mikroskopi. Direkte festing av vevet til dekselet reduserer bevegelsen av prøvene under avbildning og minimerer avvik i prøven for å oppnå den høye oppløsningen som er nødvendig for å visualisere understrukturen til SC i sin biologiske sammenheng.

Introduction

Å redusere antall kromosomer med halvparten under meiose er nøkkelen til å generere sunne avkom i seksuelt reproduserende organismer. For å oppnå denne reduksjonen i kromosomantall, må homologe kromosomer parre og segregere under meiose I. For å sikre nøyaktig segregering av homologe kromosomer, gjennomgår kimceller en utvidet profase I, hvor homologe kromosomer parrer, synapser og rekombinerer for å generere fysiske koblinger mellom homologer1. SC har dukket opp som den sentrale strukturen som er nøkkelen til å regulere riktig progresjon gjennom meiotisk profase2.

SC er et kompleks hvis generelle struktur er evolusjonært bevart, selv om det er lite homologi mellom proteinkomponentene. SC ble først identifisert i elektronmikrografier som en tredelt, stigelignende struktur bestående av to laterale elementer eller akser, en sentral region dannet av tverrgående filamenter og et sentralt element 3,4. Å bestemme organisasjonen av individuelle komponenter i komplekset er nøkkelen til å fremme vår forståelse av SCs rolle under meiotisk profase.

Modellorganismen C. elegans er ideell til å studere strukturen og funksjonen til SC siden dens kimlinjer inneholder et stort antall meiotiske kjerner med fullt montert SCs5. Genetiske og biokjemiske studier har vist at kromosomaksene dannes av tre forskjellige kohesinkomplekser6,7 og fire HORMA-domeneproteiner kalt HTP-1/2/3 og HIM-3 7,8,9,10,11 i C. elegans. I den sentrale regionen av SC har seks proteiner som inneholder spoledomener blitt identifisert til dags dato 12,13,14,15,16,17. For å bygge bro over avstanden mellom de to aksene, dimeriserer SYP-1, -5 og -6 på en head-to-head måte (figur 1), mens tre ekstra proteiner stabiliserer samspillet i det sentrale elementet16,17,18,19.

Å få detaljert innsikt i organiseringen av disse proteinene er avgjørende for å forstå SCs mange funksjoner under meiose. Siden bredden på den sentrale regionen av SC er bare ~ 100 nm, kan dens understruktur ikke løses ved diffraksjonsbegrenset fluorescensmikroskopi. Imidlertid er visualisering av komponenter i en struktur av denne størrelsen lett oppnåelig ved superoppløsningsmikroskopi. Faktisk har strukturert belysningsmikroskopi (SIM), ekspansjonsmikroskopi 20, STIMUTTØMMING (STED) mikroskopi 21 og enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM)22,23 dukket opp som viktige verktøy for å studere den molekylære arkitekturen til SC på tvers av arter 16,24,25,26,27,28,29, 30.

For å overvinne oppløsningsgrensen er STED-mikroskopi avhengig av å overlegge det diffraksjonsbegrensede stedet for utslippslyset med en smultringformet stråle fra STED-laseren, som teoretisk innsnevrer punktspredningsfunksjonen ned til molekylære dimensjoner31,32. Imidlertid forblir oppløsningen som praktisk kan oppnås av STED innen biologiske prøver i området noen få titalls nanometer i xy33.

Enda høyere oppløsning i biologiske prøver kan oppnås med SMLM-teknikker. SMLM utnytter de blinkende egenskapene til spesifikke fluoroforer for å løse objekter på subdiffraksjonsnivå ved å separere romlig overlappende fluoroforer i tide. Prøven blir deretter avbildet gjentatte ganger for å fange forskjellige undergrupper av fluoroforer. Plasseringen av fluoroforene i prøven bestemmes deretter ved å tilpasse punktspredningsfunksjonen (PSF) til de oppnådde signalene på tvers av alle bilder, som kan løse strukturer ned til 15 nm23,34.

Samlet koder de lokaliserte bildene posisjonene til alle fluoroforene. Oppløsningen til SMLM bestemmes av merketettheten og de blinkende egenskapene til fluoroforen. I henhold til Nyquist-Shannon-kriteriet er det umulig å løse objekter som er mindre enn dobbelt så mange som gjennomsnittlig etikett-til-etikett-avstand. Dermed er det nødvendig med en høy merketetthet for høyoppløselig bildebehandling. For SC i C. elegans kan en høy merkingstetthet oppnås ved å bruke epitopkoder festet til bestemte steder av endogene proteiner ved hjelp av genomredigering. Epitopmerkene kan deretter farges med høy tetthet ved bruk av spesifikke monoklonale antistoffer med høy affinitet19,30. Samtidig må syklusen til individuelle fluoroforer være kort nok til å sikre at romlig overlappende fluoroforer ikke fanges opp samtidig35.

På grunn av disse to kravene krever løsning av strukturen til store makromolekylære komplekser som SC å avbilde et tilstrekkelig stort antall bilder, og kan dermed ta flere timer. Fallgruven med lange bildetider er at prøver har en tendens til å drive på grunn av bevegelse av scenen eller små strømmer i prøvebufferen; Selv små bevegelser i størrelsesorden 10 nm er skadelige ved NM-oppløsning og må korrigeres for. Avdriftskorreksjonsmetodene som vanligvis brukes, er imidlertid ikke robuste nok til å nøyaktig legge over bilder av to kanaler som er avbildet sekvensielt36. Dette er problematisk fordi biologiske spørsmål ofte ber om presis deteksjon og lokalisering av flere mål innenfor samme prøve. For å omgå disse problemene har metoder som ratiometrisk avbildning blitt utviklet. Ratiometrisk avbildning muliggjør samtidig avbildning av flere fluoroforer med overlappende eksitasjons- og emisjonsspektra, med en påfølgende tildeling av hvert detektert signal til dets respektive fluorofor basert på forholdet mellom intensiteter i spektralt distinkte kanaler37,38.

I tillegg krever studier av organisering av makromolekylære komplekser som SC tredimensjonal (3D) informasjon. For å oppnå superoppløsning i tre dimensjoner (3D-SMLM), er en sylindrisk linse innlemmet i den optiske banen til det utstrålede lyset som forvrenger formen på PSF av en fluorofor, avhengig av avstanden fra fokalplanet. Derfor kan den nøyaktige posisjonen til en fluorofor i z-planet ekstrapoleres ved å analysere formen på utslippssignalet35,39. Kombinere disse fremskrittene i SMLM muliggjør avbildning av 3D-organisasjonen av makromolekylære komplekser, inkludert SC.

Protocol

1. Fremstilling av løsninger og deksler

MERK: Se materialtabellen for detaljer relatert til alle materialer og reagenser og tabell 1 for sammensetning av løsninger som brukes i denne protokollen.

  1. Poly-L-lysinbelagte deksler
    1. Klargjør 0,01 % (w/v) poly-L-lysin (se tabell 1).
    2. Vask et presisjonsdeksel (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1,5) i etanol i 10-30 minutter. Skyll dekselet med ddH2O for å fjerne etanol, og la dekselet tørke ved romtemperatur.
    3. Plasma rengjør dekselet med en plasmarenser.
      MERK: Plasmarengjøring øker hydrofiliteten til dekselet og letter følgende trinn. Hvis en plasmarenser ikke er tilgjengelig, kan dette trinnet hoppes over, selv om dette kan kreve justering av volumet og / eller konsentrasjonen av poly-L-lysinoppløsningen. Denne modifikasjonen er ikke testet.
    4. Plasser en dråpe (120 μL) på 0,01% (w / v) poly-L-lysin på dekselet. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
    5. Etter inkubering, skyll dekselet i ddH2O og tørk ved romtemperatur. Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.
  2. F(ab')2 fragmenter konjugert med fluorescerende organiske fargestoffer
    1. Legg i følgende rekkefølge til et PCR-rør: 10 μL 0,6-0,7 mg / ml F (ab')2 fragment i PBS, 1 μL 0,1 M NaHCO 3 (pH8,3 ) og 1 μL av 1 mM succinimidyl (NHS) ester reaktiv fluorophore i DMSO (molar forhold på F (ab') 2: fargestoff er ~ 1: 17). Bland godt ved pipettering opp og ned.
    2. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
    3. Skill F(ab')2-fragmentet fra det gjenværende frie reaktive fargestoffet ved hjelp av en avsaltingskolonne (7K MWCO) etter produsentens spesifikasjoner. Bruk 1x PBS for likevekt av kolonnen og eluering av det merkede F(ab')2-fragmentet.
    4. Oppbevar det merkede F(ab')2-fragmentet ved 4 °C i opptil 3 måneder.
      MERK: Lagringstider på mer enn 3 måneder er ikke testet.

2. Disseksjon og fiksering

MERK: Disseksjons- og fikseringsprosedyrene er modifisert fra tidligere anbefalte prosedyrer16,40 for å oppnå optimale prøver for superoppløsningsmikroskopi.

  1. Disseksjon
    1. Plukk aldersmatchede C. elegans-ormer (dyrket ved 20 ° C for denne studien) til en 30 μL dråpe EBTT (1x Eggbuffer41 med 0,2% ikke-ionisk vaskemiddel, tabell 1) på en deksel (22 mm x 22 mm, nr. 1). Plasser dekselet på et glassglass lysbilde for enklere manipulering. Vask med 30 μL EBTT ved pipettering opp og ned flere ganger. Fjern 30 μL av oppløsningen for å etterlate et fall på 30 μL på dekselet.
      MERK: Små mengder ikke-ionisk vaskemiddel må tilsettes alle løsninger der ormer pipetteres for å forhindre at ormene fester seg til plastspissene.
    2. Bruk et skalpellblad til å kutte av hodene og/eller halene på ormene for å ekstrudere gonaden (figur 2A).
  2. Fiksering
    1. Pipet 30 μL fikseringsmiddel (tabell 1) i dråpen av dissekerte ormer og pipet opp og ned for å blande.
      MERK: Pipetting opp og ned et par ganger kan bidra til å frigjøre flere gonader.
    2. Fest i nøyaktig 1 min etter at du har lagt til fikseringsløsningen.
    3. Stopp fikseringen ved å overføre ormene til et PCR-rør fylt med TBST (tabell 1). Overfør ormene i så lite volum som mulig (~ 15 μL).
    4. Spinn ned PCR-røret på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s). Fjern supernatanten og vask 2x med 200 μL TBST hver.
    5. Vask med 200 μL PBST (tabell 1) i 5-10 min. Gjenta trinn 2.1.1 til 2.2.5 for opptil fire prøver mens du holder de dissekerte prøvene på is.
      MERK: Hvis du behandler mer enn fire prøver, fortsetter du med trinn 2.2.6 til 2.2.7 etter hver fjerde prøve for å sikre at prøvefiksering forblir konsistent på tvers av alle prøver.
    6. Spinn de dissekerte prøvene på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s), fjern PBST, og tilsett 50-100 μL kald metanol (-20 ° C).
      FORSIKTIG: Metanol er giftig. Bruk verneutstyr og unngå innånding.
    7. Bland ved pipettering opp og ned og la prøvene ligge i metanol i 30-60 s. Vask prøvene 2x i 200 μL PBST.
      MERK: Hvis du behandler mer enn fire prøver, fortsett med disseksjonen av de resterende prøvene (trinn 2.1.1 til 2.2.7).
    8. Vask prøvene en tredje gang med 200 μL PBST.

3. Antistoff inkubasjoner

  1. Blokkerer
    1. Blokker prøvene i 1x blokkeringsløsning (tabell 1) i 45-60 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Inkubasjonstiden kan variere fra 30 minutter ved romtemperatur til flere dager ved 4 °C (testing ble gjort opptil 3 dager).
  2. Primær antistoff løsning
    1. Fortynn anti-HTP-3 (kylling42) og anti-HA (mus) antistoffer (eller antistoffene du velger) til arbeidsløsningene (1:250 for SMLM og 1:1,000 for STED-mikroskopiprøver) i 1x blokkeringsløsning.
      MERK: Antistoffer som brukes til å merke SMLM-prøver er mer konsentrerte enn for STED-prøver, siden en høyere merketetthet anbefales for SMLM-mikroskopi.
    2. Spinn prøvene på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s), fjern blokkeringsbufferen og tilsett 30-50 μL av den primære antistoffløsningen. Inkuber over natten ved 4 °C (foretrukket) eller i 1-2 timer ved romtemperatur.
    3. Etter inkubering, vask 3 x 5-15 min med PBST.
  3. Arbeidsløsning av F (ab') 2 fragmenter konjugert til fluorescerende fargestoff
    1. Fortynn de merkede F(ab')2-fragmentene (trinn 1.2.4) til arbeidsløsningene (1:100 for SMLM og 1:1 000 for STED-mikroskopiprøver) i 1x-blokkeringsløsning.
      MERK: For begge superoppløsningsteknikkene ble tidligere rapporterte fluoroforpar brukt, nemlig AlexaFluor647 / CF680 for SMLM og AlexaFluor594 / Abberior STAR635P for STED. AlexaFluor647 og STAR645P ble brukt til å merke anti-mus (Fab') 2 fragmenter for å målrette C-terminalen til SYP-5, og CF680 / AlexaFluor594-merket anti-kylling (Fab') 2 fragmenter for å målrette HTP-3.
    2. Spinn prøvene på en mini benchtop sentrifuge (2000 × g, 10 s), fjern PBST, og tilsett 30-50 μL sekundær antistoffløsning. Inkuber i 30 minutter til 2 timer ved romtemperatur (foretrukket) eller over natten ved 4 °C. Vask 3 x 5-15 min med PBST.

4. Montering av prøver på en coverslip

  1. Postfiksering
    MERK: Behandle prøver individuelt gjennom trinn 4.1.1-4.2.1.
    1. Spinn ned de flekkete prøvene og fjern supernatanten. Tilsett 50 μL PBST0,2 og overfør de flekkete ormene til en 22 mm x 22 mm nr. 1 deksel.
      MERK: Bruk ferskt PBST 0,2 med0,2 % ikke-ionisk vaskemiddel (tabell 1) for dette trinnet for å forhindre at ormene fester seg til dekselet.
    2. Pipet 5,7-6,3 μL postfiksativ løsning på en poly-L-lysin coverslip.
      MERK: Poly-L-lysin deksler lagret ved 4 ° C bør bringes til romtemperatur først.
    3. Pipet av de dissekerte ormene i samme volum (5,7-6,3 μL) og overfør til fikseringsmiddeldråpen på poly-L-lysindekselet (figur 2B).
      MERK: I dette og følgende trinn er det svært viktig å beholde det dissekerte vevet i midten av poly-L-lysinbelagt deksel. Dette er spesielt viktig hvis du monterer prøvene i en tilpasset holder for å passe til det spesialbygde SMLM-mikroskopet som brukes her (se trinn 5.1, figur 2B).
    4. Dekk prøven med et lite deksel (12 mm diameter, figur 2B). Fjern overflødig væske med et lite stykke filterpapir (figur 2B). Fest i 3-5 minutter i et mørkt kammer.
  2. "Fryse-sprekker"
    1. Frys prøvene ved å plassere dem på en aluminiumsblokk i tørris (figur 2B).
      MERK: Aluminiumsblokken må være godt avkjølt i tørrisen før prøvene legges på den. Fortsett med postfiksering av de resterende prøvene (trinn 4.1.1 til 4.2.1). Prøven må være på tørris i minst 20 minutter eller opptil 1 time før neste trinn (4.2.2).
    2. Fjern den mindre dekslene med en barberhøvel (figur 2B).
      MERK: For STED går du videre til trinn 5.2.1. For SMLM fortsetter du med trinn 4.2.3.
    3. Dypp dekselet i et 50 ml konisk rør som inneholder iskald PBS (foretrukket) eller -20 ° C metanol i ca. 10 s.
      MERK: Temperatur er en svært viktig faktor for dette trinnet. Bruk derfor PBS som er nytint eller oppbevart i et is / etanolbad.
    4. Plasser dekselet i en brønn på en seksbrønnsplate fylt med PBST-buffer. Fjern PBST fra brønnene og tilsett fersk PBS. La prøvene stå i PBS i 5 min.
      MERK: Pipet PBS på siden av brønnen for å unngå å skade og løsne prøvene.
    5. Vask med fersk PBS og la prøvene stå på 4 °C til avbildning.
      MERK: Prøvene er stabile i opptil 2 uker, men de beste resultatene oppnås hvis prøvene er avbildet innen 2 dager.
    6. Før avbildning, vurder kvaliteten på prøvemonteringen under et stereomikroskop.
      MERK: Vellykket monterte germlines er stabilt festet uten merkbar bevegelse i forhold til coverslip. Dårlig festede kimlinjer vil klaffe i bufferløsningen.

5. Bildebehandling

  1. Lokaliseringsmikroskopi for enkeltmolekyler
    MERK: Bilder ble anskaffet på EMBL Imaging Center ved hjelp av et spesialbygd enkeltmolekyllokaliseringsmikroskop som ble konstruert rundt en tilpasset kropp, som tidligere rapportert38,43, med de unike funksjonene som er angitt i Tabell over materialer; Se https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
    1. Anskaffelse av 3D-perlekalibrering
      1. Forbered en presisjonsdeksel (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1,5) med tilhørende 100 nm fluorescerende perler som beskrevet tidligere38,44.
      2. Plasser kalibreringsprøven fra trinn 5.1.1.1 på en prøveholder.
      3. Tilsett en dråpe nedsenkningsolje på det rene 100x/1,5 oljemålet og monter kalibreringsprøven på mikroskopet.
      4. Innenfor MicroManager 2 45,46, spesifiser15-20 posisjoner i kalibreringsprøven.
      5. I EMU-plugin-vinduet47 setter du opp anskaffelsen av et z-stack-bilde for hver av posisjonene fra trinn 5.1.1.5.
        MERK: Her gir en sammensatt sylindrisk linse astigmatismen som kreves for 3D-bildebehandling, og 201 z-skiver ble anskaffet for hver posisjon som spenner over området mellom -1 μm til 1 μm, med en økning på 10 nm. En 2 kW/cm2 640 nm laserbelysning ble brukt til 25 ms for hver z-skive.
      6. Skaff z-stack-bildene av de 100 nm lysrørende perlene gjennom en identisk optisk bane som skal brukes til å hente eksempelbilder i trinn 5.1.11.
      7. Ved hjelp av superoppløsningsmikroskopianalyseplattformen (SMAP48) genererer du en cspline-modell av den eksperimentelle punktspredningsfunksjonen (PSF) som vil bli brukt til å passe til 3D-SMLM-dataene i trinn 5.1.13.
    2. Klargjør prøveholderen. For den spesialbygde holderen som brukes her som bruker en magnetisk ring for å lage bildekammeret (figur 2B), pakk magnetringen med parafilm.
      MERK: Alternativt kan et mikroskop lysbilde med en konkav depresjon hulrom brukes til å montere prøver for mikroskoper med lysbilde holdere.
    3. Klargjør 1 ml bildebuffer44 (tabell 1).
    4. Ta en coverslip fra trinn 4.2.6 og plasser den i den skreddersydde holderen. Fest dekselet i holderen med den parafilminnpakkede magnetringen (trinn 5.1.2).
    5. Pipet bildebufferen (trinn 5.1.3) forsiktig i kammeret som er opprettet av magnetringen på toppen av prøven (figur 2B). Forsegl kammeret med et stykke parafilm.
    6. For å montere prøven, tilsett en dråpe nedsenkningsolje på det rene 100x / 1,5 oljemålet. Uten å føre luft inn i nedsenkningsoljen, plasser prøveholderen forsiktig med den monterte prøven (trinn 5.1.5) på mikroskoptrinnet.
      MERK: Før du legger prøven på mikroskopet, rengjør bunnen av dekselet med vev og 70% etanol.
    7. Bruk EMU-plugin-vinduet47 i MicroManager 245,46, flytt piezo-scenen til signalet fra fokuslåslaseren oppdages ved kvadrantfotodioden (QPD).
      MERK: For å opprettholde et fast fokus over bildetiden, oppnås fokuslåsing ved total intern refleksjon av en nær-infrarød fiberkoblet laser fra dekselet og påfølgende høydefølsom deteksjon på en kvadrantfotodiode (QPD). QPD-signalet ga lukket sløyfekontroll av objektivlinsens piezo-montering.
    8. Få et bakre fokalplanbilde med en 640 nm eksitasjonslaser med lav effekt (dvs. 1-5%) for å bekrefte fraværet av luftbobler i nedsenkningsoljen.
      MERK: Fjern prøven fra scenen hvis det oppdages en luftboble. Rengjør bunnen av dekselet og målet, og gjenta trinn 5.1.6-5.1.8. Ellers fortsett å låse fokuset i EMU-programvaren47.
    9. Lokaliser gonadvevet ved hjelp av brightfield-belysningen. Bruk en lav intensitet 640 nm belysning, fokuser på den delen av vevet som inneholder mange SC-strekker.
      MERK: Ikke fokuser på strukturer som er mer enn 2 μm fra dekselet. Ikke bruk høyere lasereffekt for å lokalisere prøven, da dette kan gjøre noen fluoroforer til en blinkende tilstand for tidlig. Her ble 1 kW/cm2 brukt i stigende modus med en puls satt til 1000.
    10. Fortsett å eksponere prøven med 640 nm belysning ved høy bestråling (27 kW/cm2) i ~30 s til en passende blinkehastighet er oppnådd (supplerende video 1).
    11. Skaff deg 200 000 bilder med en eksponeringstid på 20 ms ved hjelp av det flerdimensjonale innsamlingsverktøyet i MicroManager 245,46.
    12. I mellomtiden konfigurerer du UV-aktiveringen ved hjelp av aktiveringsalternativet til EMU-plugin38,47 for å opprettholde ønsket blinkefrekvens.
      MERK: Bruk UV-laseren ved en 3 kW/cm2 bestråling i stigende modus med maksimal pulslengde satt til 10 000.
    13. Utfør SMLM-bilderekonstruksjon og etterbehandling.
      MERK: Hvis du vil rekonstruere bilder fra rå SMLM-data, kan du se publiserte metoder. Dataene som presenteres her ble behandlet ved hjelp av programvaren SMAP48,49. Superoppløst bilderekonstruksjon, kanaltildeling, driftkorreksjon og filtrering av lokaliseringer med dårlig lokaliseringspresisjon og et filter med maksimal sannsynlighet ble utført i SMAP48-programvaren.
  2. Stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi
    MERK: Bilder ble tatt på det integrerte mikroskopiske systemet STED utstyrt med en hvit lyslaser, en 775 nm pulserende STED-laser og FALCON Fluorescence Lifetime IM-aldringsmodul (Table of Materials) ved EMBL Imaging Centre (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre).
    1. Plasser en 20 μL dråpe monteringsmedium (materialtabell) på et mikroskopglass. Ta en deksel fra trinn 4.2.2 og plasser prøven forsiktig på lysbildet som vender mot monteringsmediet (figur 2B).
      MERK: Unngå å innføre luftlommer i monteringsmediet.
    2. La monteringsmediet herde over natten.
      MERK: Avbilde prøvene påfølgende dag eller hold dem ved 4 °C til de er avbildning.
    3. For å montere prøven, tilsett en dråpe nedsenkningsolje på dekselet til prøven fra trinn 5.2.2. Plasser prøven forsiktig på mikroskopstadiet ved hjelp av et 100x / 1,40 oljemål.
    4. Fokuser på prøven og finn germlinevevet ved hjelp av lysfeltbelysningen.
    5. Bruk mikroskopprogramvaren til å angi interesseområdet som TauSTED-bildet skal anskaffes for.
    6. Velg eksitasjonslasere og deres passende kraft som brukes til å opphisse fluoroforene som brukes i prøven.
      MERK: Her ble 580 nm-laseren med 4% effekt brukt til å avbilde AlexaFluor 594-konjugerte F(ab')2 sekundære antistofffragmenter, og 635 nm ved 3% effekt for å avbilde STAR 635P-konjugerte F(ab')2-fragmenter.
    7. Bruk mikroskopprogramvaren til å velge en passende STED-uttømmingslasereffekt og sette opp bildedeteksjonen.
      MERK: Her ble 775 nm STED-uttømmingslasereffekten satt til 40 %. Detektoren ble brukt i tellemodus med en forsterkningsverdi på 10 for fotondeteksjon, med en skannehastighet på 100 Hz og ved en pikselstørrelse på 17 nm. Fire-linjers akkumulering ble brukt til TauSTED-oppkjøp.

Representative Results

For å avbilde SC i C. elegans germline vev av SMLM, har vi ansatt 2-fargeforholdmetrisk 3D-SMLM for å lokalisere HTP-3, en komponent i kromosomaksene, og C-terminalen til det tverrgående filamentet SYP-5 endogent merket med en hemagglutinin (HA) tag. Plasseringen av begge proteinene i SC av C. elegans ble tidligere bestemt av andre studier16,30.

For å minimere lysspredning og optiske avvik som er forbundet med tykke biologiske prøver, avbildet vi den nederste delen av meiotiske kjerner som inneholder SCs (figur 3, gule linjer). For hvert ervervet bilde ble piezo-sceneposisjonen til bildeplanet markert i forhold til piezo-sceneposisjonen når målet var fokusert på dekselet. Dette tillot beregning av piezoavstanden fra dekselet. Vellykket monterte prøver er stabilt festet nær dekselet og beholder gonadformen (dvs. vevet knuses ikke mellom de to dekselene under postfikseringstrinnet). Kvaliteten på prøvemonteringen kan lett vurderes under et stereomikroskop siden godt festede gonader ikke viser noen bevegelse i løsning (trinn 4.2.6). Likevel, på grunn av stokastisiteten til monteringsprosessen, vil gonadvevet ikke nødvendigvis bli lagt helt flatt på dekselet. Derfor kan bunnplanet til kjernene som inneholder SCs bli funnet i varierende avstander i forhold til dekselet i samme gonade.

For å illustrere hvordan oppløsningen endres avhengig av at vevet festes til omslaget, tok vi bilder på forskjellige piezoavstander til omslaget. For å vurdere kvaliteten på et individuelt bilde ble Fourier-ringkorrelasjonskurver (FRC)50,51 beregnet, og oppløsningen ble bestemt ved hjelp av FRCResolution-plugin i SMAP-programvaren48. To representative kjerner hentet fra to separate 3D-SMLM-bilder tatt i forskjellige avstander til dekselet vises i figur 4. I SC-er som ligger nær dekselet, er kromosomaksene og C-terminalen til SYP-5::HA godt løst i alle tre dimensjonene (figur 4A, 0,8 μm fra dekselet). For å løse to strukturer atskilt med en gitt avstand, må den oppnådde FRC-oppløsningen generelt være mindre enn halvparten av denne avstanden i aksialoppløsningen.

For å skille de samme strukturene sideveis, må enda mindre FRC-oppløsningsverdier oppnås. Faktisk, i prøver som ligger i nærheten av dekselet, er FRC-oppløsningen 38 nm for AlexaFluor 647-kanalen og 34 nm for CF680-kanalen, og dermed godt under forventet avstand på 84 nm mellom C-termini på SYP-516. Denne resolusjonen løser derfor lett organiseringen av SC ikke bare i frontal, men også i lateral visning (figur 4B i, ii). Derimot forverres oppløsningen i SCs plassert i en 5 μm avstand fra dekselet på grunn av lysspredning og sfæriske avvik (figur 4B). FRC-oppløsningene på denne avstanden faller til 47 nm (AlexaFluor 647) og 41 nm (CF680), som ikke fullt ut kan løse C-termini av SYP-5. Siden de optiske avvikene svekker sideoppløsningen mer alvorlig enn den aksiale oppløsningen, er HTP-3- og SYP-5-båndene ikke lenger klart løst i tverrsnittet av sidevisningen i prøver som ligger i en 5 μm avstand fra dekselet (figur 4B ii). Sammenligning av FRC-oppløsningen til bilder tatt på forskjellige piezoavstander fra dekselet viste at det avbildede vevet ikke skulle være lenger enn 2 μm fra dekselet (figur 5). Dette resultatet fremhever viktigheten av korrekt utførelse av postfikseringstrinnet, hvor vevet må være vellykket tverrbundet til poly-L-lysinbelegget på dekselet.

For å demonstrere den oppnåelige oppløsningen med en annen superoppløsningsteknikk, avbildet vi også SCs i fast intakt germline vev med TauSTED-mikroskopi. Figur 6A viser TauSTED-bilder med høyest og lavest oppløsning oppnådd i denne studien, beregnet ut fra linjeprofilene til SC i frontal visning (figur 6B). I begge kjernene kunne vi løse de to lokaliseringsbåndene av HTP-3 i kromosomaksene og C-termini av SYP-5 i det sentrale området, og demonstrere at oppløsningen som kan oppnås i TauSTED ved hjelp av denne optimaliserte protokollen er under 84 nm. Under optimale forhold (figur 6A, øverst) kunne vi løse C-termini i svakt skråstilte visninger av SC som var atskilt med bare 50 nm (figur 6A, gult rektangel og 6C).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for organiseringen av det synaptonemale komplekset i Caenorhabditis elegans. Tegneserien viser en forenklet struktur av SC i C. elegans som bygger bro mellom to homologe kromosomer (grå). Strukturen vises i frontale, laterale og tverrsnittsvisninger. Kromosomakser vises som røde søyler mens tverrgående filamenter vises i cyan. Tverrgående filamentproteiner (SYP-1, 5, 6 i C. elegans) er orientert på en head-to-head måte (cyan ball-stick grafikk) i det sentrale området for å bygge bro over avstanden mellom de to aksene. De forventede avstandene mellom akser og C-termini for tverrgående filamenter er angitt. Forkortelse: SC = synaptonemal kompleks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Illustrasjon av prøvepreparering brukt i studien . (A) Unge C. elegans voksne blir dissekert på hodet eller halen (grønne, stiplede linjer) og behandlet som beskrevet i protokollen. (B) Individuelle trinn i metoden er indikert med grafikk som er forbundet med grå piler. Forkortelser: STED = uttømming av stimulert utslipp; SMLM = enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Plassering av vevsdelen som kan observeres ved lokalisering av enkeltmolekyler. MIP av en spinnende disk konfokal bilde av en hel mount C. elegans gonad. Vevet ble farget for HTP-3 og C-terminalen til SYP-5 (SYP-5::HA), og det kombinerte signalet vises i grått. Individuelle konfokale bilder ble sydd ved hjelp av Grid / Collection stitching Fiji plugin52 for å lage et bilde av hele gonaden. Innfellingen viser en xy-visning av det nederste z-planet som inneholder SC-ene. Lokaliseringen av dette planet er vist i ortogonale visninger av vevsseksjonen indikert med et rektangel i MIP-bildet av gonaden (gule linjer). Skala barer = 10 μm. Forkortelser: MIP = maksimal intensitetsprojeksjon; SCs = synaptonemale komplekser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi av HTP-3 og C-termini av SYP-5. (A,B) Venstre: SMLM-bilder som viser pachytenkjerner farget for HTP-3 (rød) og C-terminalen til SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) (skalalinje = 1 μm). Sentrum: Innzoomede bilder av interesseområder som er angitt i A og B med tilsvarende tverrsnittsvisninger vist under hvert bilde (i, ii; skalalinje = 100 nm). SC-strekningene i innzoomede bilder roteres for å orientere kromosomaksene parallelt med y-aksen. Høyre: Grafisk fremstilling av lokaliseringen av proteiner av interesse i SC som skildrer retningen til SC i de zoomede områdene som vises i midten av figuren. Forkortelser: SMLM = enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemal kompleks. Rådata for å rekonstruere SMLM-bilder er tilgjengelige gjennom BioStudies-databasen60 (tiltredelses-ID: S-BIAD504). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Fourier-ringkorrelasjonsoppløsningen av enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopibilder avhenger av avstanden til det avbildede z-planet fra dekselets plan. Fargede linjer viser FRC-kurver med bilder som er anskaffet på forskjellige avstander (som vist på fargelinjen) fra omslagsbildet. 1/7-terskelen som brukes til å bestemme FRC-oppløsningen, indikeres av en svart horisontal linje. Innfelt viser avhengigheten av FRC-oppløsningen på piezo-avstanden fra dekselet. Plotting ble utført av et spesialskrevet R-skript (versjon 4.1.2, Supplementary File 1) der originale kurver ble glattet med funksjoner fra "ggplot2" -pakken. Forkortelser: FRC = Fourier ring korrelasjon; SMLM = enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemal kompleks. Data for FRC-kurver og SMLM-data er tilgjengelige gjennom BioStudies-databasen60 (tiltredelses-ID: S-BIAD504). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi forsterket av fluorescens levetidsbasert informasjon (TauSTED) løser to lokaliseringsbånd for både HTP-3 og C-terminalen til SYP-5. (A) To representative TauSTED-bilder viser pachytenkjerner farget for HTP-3 (rød) og C-terminalen til SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) med høyere (øverst) og lavere (nederst) strukturell definisjon (skalalinje = 1 μm). Rektanglene markerer regioner med den oppløste C-termini av SYP-5 i frontal (hvit) og en svakt skråstilt visning (gul) av SC. (B, C) Distribusjon av HTP-3 (rød) og C-terminalen til SYP-5 (cyan) signal løst av TauSTED. Linjeprofiler for interesseområder som inneholder SC i frontvisning (B) eller svakt skråstilt (C), vises som hele linjer med intensitet normalisert til maksimumsverdien. Linjeprofiler ble generert ved hjelp av Fiji ImageJ. Stiplede linjer i B viser gjennomsnittlige data for hvert protein. Den tykke cyanlinjen i C tilsvarer linjeprofilen med kortest oppløst avstand mellom C-terminalen til SYP-5. For å bestemme avstandene mellom antistoffene rettet mot spesifikke proteiner, ble linjeprofilene (n = 9 (B), n = 7 (C)) utstyrt med doble gaussere ved hjelp av et spesialskrevet R-skript (versjon 4.1.2, tilleggsfil 1). Gjennomsnittlig avstand ± standardavvik (B) og området med minimumsverdi uthevet i fet skrift (C) er angitt på toppen av hver graf, henholdsvis. Forkortelser: STED = stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi; SC = synaptonemal kompleks. Viste bilder og datapunkter av plottede linjeprofiler er tilgjengelige via BioStudies-databasen60 (tiltredelses-ID: S-BIAD504). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Sammensetning av buffere og løsninger som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende video 1: Oppkjøp av lokaliseringsmikroskopi for enkeltmolekyler. Video som viser fluoroforer som blinker med riktig hastighet (50 bilder vises, skaleringslinje = 5 μm, 20 ms/bilde). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsfil 1: Dataanalyseskript. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Den stigelignende organisasjonen av SC, som er avgjørende for riktig rekombinasjon og segregering av homologe kromosomer, ble først observert for nesten 70 år siden i elektronmikroskopi 3,4. Mens den overordnede organisasjonen av SC lett løses i elektronmikroskopi, krever lokalisering av individuelle komponenter i dette komplekset en mer målrettet tilnærming. Med sin bredde på bare ~ 100 nm, kan understrukturen til SC ikke løses ved konvensjonell fluorescensmikroskopi. Imidlertid har superoppløsningsmikroskopi blitt en viktig driver for nye funn om strukturen og funksjonen til det synaptonemale komplekset 16,19,24,25,26,27,28,29,30. For å lette denne forskningen har vi demonstrert en monteringsprosedyre som gjør det mulig å studere arkitekturen til SC i C. elegans gonadvev med SMLM og STED-mikroskopi.

Et kritisk skritt for å optimalisere oppløsningen i SMLM-avbildning er direkte kryssbinding av germlinevevet til en poly-L-lysinbelagt deksel (trinn 4). Den kovalente festingen av vevet til dekselet er viktig for å redusere bevegelser i prøven som vil resultere i store drifter og gjøre avbildning over lange perioder for SMLM umulig. I tillegg fører selv et suboptimalt vedlegg som etterlater kjernene som inneholder SCs i avstand fra dekselet, til et betydelig fall i den oppnåelige oppløsningen som følge av sfæriske avvik (figur 4). Alternativt til det kovalente vedlegget som brukes her, kan farget kimlinjevev også immobiliseres mellom to forseglede deksler i en liten dråpe bildebuffer19,30. Imidlertid reduserer denne immobiliseringsmetoden volumet av bildebuffer i prøven sterkt fra 1 ml som brukes i den optimaliserte protokollen her til bare noen få μL, noe som vil resultere i en forsuring av bildebufferen og redusere tiden som prøven kan avbildes 38,53,54 for alvorlig.

Lang innsamlingstid for både SMLM- og STED-mikroskopi begrenser bruken av disse metodene til avbildning av kjemisk faste prøver. Her sikrer paraformaldehydfiksering at strukturen til SC blir bevart under prøvepreparering og avbildning. Til tross for forholdsreglene som er tatt her for å avbilde SC i intakt vev, er den resulterende strukturen til SC etter fiksering ikke nødvendigvis identisk med strukturen i sin opprinnelige tilstand i en levende organisme. Videre, siden et enkelt bilde av den faste SC representerer et enkelt "øyeblikksbilde" av den biologiske strukturen, forblir denne tilnærmingen blind for dynamikken i den opprinnelige strukturen in vivo.

Imidlertid kan informasjon om dynamikken og variabiliteten til makromolekylære strukturer også oppnås ved å skaffe seg ikke bare en enkelt, men mange "øyeblikksbilder". Selv om denne tilnærmingen kan løse endringer i strukturen til SC under pachyten19, er det flere faktorer som begrenser antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt prøve utarbeidet ved hjelp av denne protokollen. For det første fører de høye laserkreftene som brukes under bildeoppkjøp til permanent bleking av fluoroforene og utelukker avbildning av tilstøtende områder av interesse eller flere z-plan, og reduserer dermed antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt prøve. For det andre er prøven / vevstettheten på dekselet fremstilt ved denne metoden lav, noe som betydelig begrenser antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt coverslip. Den lave prøvetettheten forbyr også bruk av automatiserte bildeinnsamlingsrørledninger som bidro til å kaste lys over andre biologiske spørsmål 34,55,56,57,58,59. Prøvetettheten kan imidlertid økes litt av en erfaren bruker.

Protokollen som presenteres her er optimalisert for å oppnå en høy merketetthet som er nødvendig for å oppnå optimal oppløsning i SMLM35. Mens tidligere protokoller kovalent fester vevet til dekselet før immunostaining16, kryssbinder denne nye protokollen vevet til dekselet først etter at prøvene ble farget i oppløsning. Denne modifikasjonen gjør at antistoffene som brukes til immunmerking, fritt kan få tilgang til vevet fra alle sider, mens den kovalente festingen av vevet til dekselet kan begrense antistoffer fra å nå kjernene nærmest dekselet, og dermed redusere graden av merking. Sammen forbedrer modifikasjonene beskrevet her oppløsningen fra 40-50 nm (FRC-oppløsning) 16 til 30-40 nm (denne protokollen).

Det er viktig at mens en høy merketetthet og en høy konsentrasjon av antistoffer er avgjørende for SMLM, fant vi at bedre STED-mikroskopibilder oppnås ved bruk av lavere antistoffkonsentrasjoner (trinn 3). Ved en oppløsning på titalls nanometer blir størrelsen på molekylene som brukes til å merke proteinet av interesse stadig viktigere. Vi benyttet derfor F(ab')2-fragmenter som er halvparten så store som antistoffer i full lengde. Forbedringen i lokal kontrast på grunn av en mindre signalkilde, og derfor oppløsning oppnådd ved denne modifikasjonen sammenlignet med bruk av sekundære antistoffer i full lengde, tillot oppløsning av de to C-termini av SYP-5 i den sentrale regionen av TauSTED, som ikke løses ved konvensjonell STED ved bruk av fulllengde antistoffer (16 og data ikke vist). Vi forventer at denne optimaliserte protokollen for avbildning av SC-er i intakte C. eleganskimlinjer vil gjøre det lettere å undersøke struktur-funksjonsforholdet mellom SC under meiose.

Disclosures

Forfattere oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Jonas Ries og Ries-laboratoriet for deling av bildebuffere for SMLM-bildebehandling. Vi takker også Yumi Kim for C. elegans stammen som brukes i denne protokollen og Abby F. Dernburg for kylling-anti-HTP-3 antistoff. Vi takker Marko Lampe og Stefan Terjung fra Advanced Light Microscopy Facility ved EMBL Heidelberg for deres støtte i bruk av Olympus iXplore SPIN SR konfokalmikroskop. Dette arbeidet ble støttet av European Molecular Biology Laboratory og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation - 452616889, SK). Vi anerkjenner tilgangen og tjenestene som tilbys av Imaging Centre ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), sjenerøst støttet av Boehringer Ingelheim Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.5 oil objective Olympus UPLAPO100XOHR UPLAPO100XOHR
2-mercaptoethylamine (MEA) Sigma-Aldrich 30070-10G Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH  8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C.
Additional 640 nm booster laser Toptica IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS ester ThermoFischer Scientific A37572 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
AlexaFluor 647, NHS ester ThermoFischer Scientific A37573 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
anti-HA Thermo Fisher Scientific 2-2.2.14 Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
anti-HTP-3 a gift from Abby F. Dernburg MacQueen et al., 2005 Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans strain  YKM349 a gift from Yumi Kim Hurlock et al., 2020 syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS ester Biotium 92139 Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Circular cover glass 12 mm No. 1 Menzel-Gläser; VWR 631-0713
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 Carl Roth PK26.1
Cylindrical lenses Thorlabs LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x) Edgar 1995 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Ethanol (absolute for analysis) Merck 64-17-5
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY Jackson Immunoresearch AB_2340347 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch AB_2340761 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick Fisher scientific 7107
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10% Kisker 789265
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155),
50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C.
Imaging buffer base a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose.
Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C.
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant ThermoFischer Scientific P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON Leica N/A The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.  Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.
Longwave channel emission filter AHF Analysentechnik F47-702 700/100 nm bandpass
Methanol (absolute for analysis) Merck 67-56-1
NaHCO3 Sigma-Aldrich/Merck S5761-500G 100 mM NaHCO3, pH 8.3
Near-infrared fiber-coupled laser Toptica IBEAM-SMART-PT-CD Custom Design, 808 nm - 75mW
Objective lens piezo mount (PIFOC ) Physik Instrumente P-726.1.CD 100 µm travel range
Orca Fusion BT sCMOS camera Hamamatsu C15440-20UP
PCR tubes Greiner Bio-One 673283 0.2 mL
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) N/A 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free ThermoFischer Scientific 28906 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.
PlasmaPrep2 plasma cleaner GaLa Instrumente GmbH N/A
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich/Merck P2636-25MG 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C.
Primary dichroic (illumination reflecting) AHF Analysentechnik F73-866S quad bandpass @ 405, 488, 561, 640
Quadnotch filter AHF Analysentechnik F40-072 405/488/561/640 nm
Quadrant photodiode (QPD) Laser Components SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Razor blades Apollo Herkenrath Solinger N/A
Refractive beam shaper AdlOptica PiShaper 6_6_VIS
Roche Blocking Reagent Roche 11096176001 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110911
Scalpel removal box Fisher scientific 10002-50
Secondary dichroic (emission reflecting) AHF Analysentechnik F38-785S 750 nm longpass
Shortpass filter Semrock BSP01-785R-25  750 nm
Shortwave channel emission filter AHF Analysentechnik F37-677  676/37 nm bandpass
Single molecule localization microscope EMBL Imaging Centre Diekmann et al., 2020 with modifications The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera  and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm.
For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking).
A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging.
To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser  from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount.
For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine Toptica iCHROME MLE-LFA-HP Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm
Splitting dichroic AHF Analysentechnik F48-665SG 665 nm long pass
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 Menzel-Gläser; VWR 630-2882
STAR 635P, NHS ester Abberior ST635P-0002-1MG Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB Zeiss N/A
Tetramisole hydrochloride Sigma-Aldrich/Merck T1512-2G 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months.
TetraSpeck Microspheres ThermoFischer Scientific T7279  0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red
Tris Saline Buffer (TBS 10x) N/A 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich/Merck P9416-50ML Kept at room temperature in original packaging.
WormStuff worm pick Kisker 789277
XY microscope stage  Smaract N/A Custom Design
Zeba Micro Spin Desalting Column ThermoFischer Scientific 89877  7K MWCO, 75 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annual Review of Genetics. 33, 603 (1999).
  2. Ur, S. N., Corbett, K. D. Architecture and dynamics of meiotic chromosomes. Annual Review of Genetics. 55, 497-526 (2021).
  3. Fawcett, D. W. The fine structure ot chromosomes in the meiotic prophase of vertebrate spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (4), 403-406 (1956).
  4. Moses, M. J. Chromosomal structures in crayfish spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (2), 215-218 (1956).
  5. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. WormBook. , 433-434 (2017).
  6. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes & Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  7. Severson, A. F., Ling, L., Van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes & Development. 23 (15), 1763-1778 (2009).
  8. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Müller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & Development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  9. Martinez-Perez, E. HTP-1-dependent constraints coordinate homolog pairing and synapsis and promote chiasma formation during C. elegans meiosis. Genes & Development. 19 (22), 2727-2743 (2005).
  10. Couteau, F., Zetka, M. HTP-1 coordinates synaptonemal complex assembly with homolog alignment during meiosis in C. elegans. Genes & Development. 19 (22), 2744-2756 (2005).
  11. Goodyer, W., et al. HTP-3 Links DSB Formation with Homolog Pairing and Crossing Over during C. elegans Meiosis. Developmental Cell. 14 (2), 263-274 (2008).
  12. Colaiácovo, M. P., et al. Synaptonemal complex assembly in C. elegans is dispensable for loading strand-exchange proteins but critical for proper completion of recombination. Developmental Cell. 5 (3), 463-474 (2003).
  13. MacQueen, A. J., Colaiácovo, M. P., McDonald, K., Villeneuve, A. M. Synapsis-dependent and -independent mechanisms stabilize homolog pairing during meiotic prophase in C. elegans. Genes & Development. 16 (18), 2428-2442 (2002).
  14. Smolikov, S., et al. Synapsis-defective mutants reveal a correlation between chromosome conformation and the mode of double-strand break repair during Caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 176 (4), 2027-2033 (2007).
  15. Smolikov, S., Schild-Prüfert, K., Colaiácovo, M. P. A yeast two-hybrid screen for SYP-3 interactors identifies SYP-4, a component required for synaptonemal complex assembly and chiasma formation in Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genetics. 5 (10), 1000669 (2009).
  16. Hurlock, M. E., et al. Identification of novel synaptonemal complex components in C. Elegants. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  17. Zhang, Z., et al. Multivalent weak interactions between assembly units drive synaptonemal complex formation. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  18. Schild-Prüfert, K., et al. Organization of the synaptonemal complex during meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 189 (2), 411-421 (2011).
  19. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. The interaction of crossover formation and the dynamic architecture of the synaptonemal complex during meiosis. bioRxiv. , (2020).
  20. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6621), 543-548 (2015).
  21. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  22. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  23. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  24. Schücker, K., Holm, T., Franke, C., Sauer, M., Benavente, R. Elucidation of synaptonemal complex organization by super-resolution imaging with isotropic resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2029-2033 (2015).
  25. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  26. Zwettler, F. U., et al. Tracking down the molecular architecture of the synaptonemal complex by expansion microscopy. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  27. Yoon, S., Choi, E. H., Kim, J. W., Kim, K. P. Structured illumination microscopy imaging reveals localization of replication protein A between chromosome lateral elements during mammalian meiosis. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-12 (2018).
  28. Prakash, K., et al. Superresolution imaging reveals structurally distinct periodic patterns of chromatin along pachytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14635-14640 (2015).
  29. Xu, H., et al. Molecular organization of mammalian meiotic chromosome axis revealed by expansion STORM microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18423-18428 (2019).
  30. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), 4734-4743 (2017).
  31. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  32. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  33. Jahr, W., Velicky, P., Danzl, J. G. Strategies to maximize performance in STimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy of biological specimens. Methods. 174, 27-41 (2019).
  34. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  35. Xu, K., Shim, S. -H., Zhuang, X. Super-resolution imaging through stochastic switching and localization of single molecules: an overview. Far-Field Optical Nanoscopy. , 27-64 (2013).
  36. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22 (13), 15982 (2014).
  37. Winterflood, C. M., Platonova, E., Albrecht, D., Ewers, H. Dual-color 3D superresolution microscopy by combined spectral-demixing and biplane imaging. Biophysical Journal. 109 (1), 3-6 (2015).
  38. Diekmann, R., et al. Optimizing imaging speed and excitation intensity for single molecule localization microscopy. Nature Methods. 17 (9), 909 (2020).
  39. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  40. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 558, 171-195 (2009).
  41. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  42. MacQueen, A. J., et al. Chromosome sites play dual roles to establish homologous synapsis during meiosis in C. elegans. Cell. 123 (6), 1037-1050 (2005).
  43. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  44. Hoess, P., Mund, M., Reitberger, M., Ries, J. Dual-color and 3D super-resolution microscopy of multi-protein assemblies. Methods in Molecular Biology. 1764, 237-251 (2018).
  45. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer Control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  46. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
  47. Deschamps, J., Ries, J. EMU: reconfigurable graphical user interfaces for Micro-Manager. BMC Bioinformatics. 21 (1), 1-13 (2020).
  48. Ries, J. SMAP: a modular super-resolution microscopy analysis platform for SMLM data. Nature Methods. 17 (9), 870-872 (2020).
  49. Li, Y., et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  50. Nieuwenhuizen, R. P. J., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nature Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  51. Banterle, N., Bui, K. H., Lemke, E. A., Beck, M. Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy. Journal of Structural Biology. 183 (3), 363-367 (2013).
  52. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  53. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  54. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gönczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  55. Mund, M., et al. Superresolution microscopy reveals partial preassembly and subsequent bending of the clathrin coat during endocytosis. bioRxiv. , (2022).
  56. Mund, M., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  57. Sabinina, V. J., et al. Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex. Molecular Biology of the Cell. 32 (17), 1523-1533 (2021).
  58. Cieslinski, K., et al. Nanoscale structural organization and stoichiometry of the budding yeast kinetochore. bioRxiv. , (2021).
  59. Sieben, C., Banterle, N., Douglass, K. M., Gönczy, P., Manley, S. Multicolor single-particle reconstruction of protein complexes. Nature Methods. 15 (10), 777-780 (2018).
  60. Sarkans, U., et al. The BioStudies database—one stop shop for all data supporting a life sciences study. Nucleic Acids Research. 46, (2018).

Tags

Biologi utgave 187 C. elegans meiose synaptonemal kompleks immunhistokjemi superoppløsningsmikroskopi enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi
Superoppløsningsmikroskopi av det synaptonemale komplekset i <em>Caenorhabditis elegans</em> germline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, … More

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, D., Zimmermann, T., Köhler, S. Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline. J. Vis. Exp. (187), e64363, doi:10.3791/64363 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter