Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bestemmelse av in vitro og cellulær turn-on kinetikk for fluorogene RNA aptamerer

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64367
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen presenterer to metoder for å bestemme kinetikken til de fluorogene RNA-aptamerene Spinat2 og Broccoli. Den første metoden beskriver hvordan man måler fluorogen aptamerkinetikk in vitro med en plateleser, mens den andre metoden beskriver måling av fluorogen aptamerkinetikk i celler ved flowcytometri.

Abstract

Fluorogene RNA-aptamerer har blitt brukt i levende celler for å merke og visualisere RNA, rapportere om genuttrykk og aktivere fluorescerende biosensorer som oppdager nivåer av metabolitter og signalmolekyler. For å studere dynamiske endringer i hvert av disse systemene er det ønskelig å oppnå sanntidsmålinger, men nøyaktigheten av målingene avhenger av at kinetikken til den fluorogene reaksjonen er raskere enn samplingsfrekvensen. Her beskriver vi metoder for å bestemme in vitro og cellulær turn-on kinetikk for fluorogene RNA-aptamerer ved hjelp av en plateleser utstyrt med henholdsvis en prøveinjektor og et flowcytometer. Vi viser at in vitro-kinetikken for fluorescensaktiveringen av spinat2- og brokkoli-aptamerene kan modelleres som tofaseassosiasjonsreaksjoner og har forskjellige raske fasehastighetskonstanter på henholdsvis 0,56 s−1 og 0,35 s−1. I tillegg viser vi at den cellulære kinetikken for fluorescensaktiveringen av spinat2 i Escherichia coli, som ytterligere begrenses av fargestoffdiffusjon i de gramnegative bakteriene, fortsatt er tilstrekkelig rask til å muliggjøre nøyaktig prøvetakingsfrekvens på minutttidsskalaen. Disse metodene for å analysere fluorescensaktiveringskinetikk gjelder for andre fluorogene RNA-aptamerer som er utviklet.

Introduction

Fluorogene reaksjoner er kjemiske reaksjoner som genererer et fluorescenssignal. Fluorogene RNA-aptamerer utfører vanligvis denne funksjonen ved å binde et lite molekylfargestoff for å forbedre fluorescenskvanteutbyttet (figur 1A)1. Ulike fluorogene RNA-aptamersystemer er utviklet og består av spesifikke RNA-aptamersekvenser og de tilsvarende fargeligandene1. Fluorogene RNA-aptamerer er lagt til RNA-transkripsjoner som fluorescerende koder som muliggjør levende celleavbildning av mRNA og ikke-kodende RNA 2,3,4. De har også blitt plassert etter promotorsekvenser som fluorescerende reportere av genuttrykk, i likhet med bruken av grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter, bortsett fra at rapporteringsfunksjonen er på RNA-nivå 5,6. Endelig har fluorogene RNA-aptamerer blitt innlemmet i RNA-baserte fluorescerende biosensorer, som er utformet for å utløse den fluorogene reaksjonen som respons på et bestemt lite molekyl. RNA-baserte fluorescerende biosensorer er utviklet for levende celleavbildning av forskjellige ikke-fluorescerende metabolitter og signalmolekyler 7,8,9,10,11.

Det er økende interesse for utvikling av fluorogene RNA-aptamerer for å visualisere dynamiske endringer i RNA-lokalisering, genuttrykk og små molekylsignaler. For hver av disse applikasjonene er det ønskelig å oppnå sanntidsmålinger, men nøyaktigheten av målingene avhenger av at kinetikken til den fluorogene reaksjonen er raskere enn samplingsfrekvensen. Her beskriver vi metoder for å bestemme in vitro-kinetikken for fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 12 og Brokkoli13 ved hjelp av en plateleser utstyrt med en prøveinjektor og for å bestemme den cellulære turn-on-kinetikken forSpinat2 uttrykt i Escherichia coli ved hjelp av et flowcytometer. Disse to RNA-aptamerene ble valgt fordi de har blitt brukt til å studere RNA-lokalisering 2,3,4, de har blitt brukt i reportere5,6 og biosensorer 7,8,9,10,11, og de tilsvarende fargestoffene (DFHBI eller DFHBI-1T) er kommersielt tilgjengelige. Et sammendrag av deres in vitro-egenskaper bestemt i litteraturen er gitt i tabell 1 4,13,14, som informerte protokollutviklingen (f.eks. bølgelengder og fargestoffkonsentrasjoner som ble brukt). Disse resultatene viser at de fluorogene reaksjonene som påvirkes av RNA-aptamerer er raske og ikke bør hindre nøyaktige målinger for de ønskede cellebiologiske applikasjonene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forsøk med in vitro kinetikk

  1. Fremstilling av DNA-maler ved PCR
    1. Sett opp PCR-reaksjon (er): For å forberede PCR-reaksjoner, kombiner følgende reagenser i et tynnvegget PCR-rør:
      33 μL dobbeltdestillert vann (ddH2O)
      10 μL 5x buffer for hi-fis DNA-polymerase
      5 μL på 2 mM hver deoksyribonukleosidtrifosfat (dNTP)
      0,5 μL av 40 μM fremoverprimer
      0,5 μL av 40 μM omvendt primer
      0,5 μL (10-100 ng) DNA-mal (kun for Spinat2 PCR; Brokkoliprimere overlapper)
      0,5 μL hi-fis DNA-polymerase (legg til sist)
      MERK: Syntetiske oligonukleotider sendes ofte tørre. For å forberede stamløsninger, legg til et kjent volum (100 μL anbefales) av ddH2O, og mål A260 av den løsningen for å bestemme konsentrasjonen ved Ølloven, der utryddelseskoeffisienten kan beregnes etter nærmeste naboregler online. Denne stamløsningen kan deretter brukes til å gjøre fortynninger egnet for bruk i PCR.
    2. Kjør thermocycler-protokollen.
      1. Bruk følgende thermocycler-protokoll for å forsterke DNA-maler for spinat2 og brokkoli i full lengde:
        Første denaturering: 98 ° C i 2 min
        35 sykluser:
        Denaturering:98 °C denaturering i 15 s
        Annealing:72 °C i 30 s
        Forlengelse:72 °C i 30 s
        Endelig forlengelse: 72 °C i 5 min.
      2. Etter reaksjonen analyserer du en liten aliquot av produktet med 2% agarosegel sammen med en lav molekylvektstige (størrelsesområde: 25-766 nukleotider) for å bekrefte tilstedeværelsen av det ønskede DNA-produktet.
      3. Rens produktet med kommersielt tilgjengelige gelekstraksjons- eller PCR-oppryddingssett og eluere med ddH2O eller bufferen levert av produsenten.
        MERK: Pass på at når du velger et PCR-oppryddingssett, er kolonnens molekylvektavskjæring lav nok til å beholde T7-brokkoli (81 nukleotider), ellers vil PCR-produktet gå tapt.
        MERK: Valgfritt pausepunkt: Oppbevar DNA ved −20 °C.
  2. Tilberedning av spinat2 og brokkoli-RNA ved in vitro transkripsjon (IVT)
    1. Sett opp transkripsjonsreaksjonen(e).
      1. For å fremstille en 100 μL transkripsjonsreaksjon, kombiner følgende reagenser i et 1,5 ml mikrosentrifugerør: 10 μL 10x transkripsjonsbuffer + 20 μL av 10 mM ribonukleosidtrifosfater (rNTPs) + 1-64 μL DNA-mal (totalt 1 μg) + 2 μL uorganisk pyrofosfatase + ddH 2 O til 98 μL +2μL av T7 RNA-polymerase (legg til sist).
      2. Inkuber denne reaksjonen i 4 timer ved 37 °C. Slukk reaksjonen ved å tilsette 100 μL 2x urea gelbelastningsbuffer (2x ULB), sammensatt av 20% sukrose, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1x Tris-Borate-EDTA (1x TBE) buffer og ~ 18 M urea.
        MERK: Valgfritt pausepunkt: Oppbevar den slukkede reaksjonen ved −20 °C.
  3. Polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) rensing av RNA
    1. PAGE rensing av spinat2 og brokkoli RNA
      FORSIKTIG: Ikke-polymerisert (flytende eller pulverisert) akrylamid er ekstremt giftig. Hvis du veier ut pulverisert akrylamid, gjør du det i en avtrekkshette. Bruk alltid riktig verneutstyr og fjern umiddelbart hansker som er forurenset med akrylamidpulver eller oppløsning, vask hendene grundig. Hvis akrylamid kommer i direkte kontakt med huden, vask det eksponerte området i minst 15 minutter med såpe og vann. Hvis akrylamid kommer i direkte kontakt med øynene, skyll dem med vann i 15 minutter.
      1. Forbered PAGE-gelen: For å fjerne uønskede abortive transkripsjoner og ikke-reagerte rNTP-er fra produktet i full lengde, lag en 6% urea-polyakrylamidgel. Generelt kan 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm geler brukes med en 8-brønns kam. Sett opp gel- og elektroforeseutstyret, ved hjelp av 1x TBE-buffer for å fylle reservoarene.
      2. Last inn RNA-prøve(r) i PAGE-gelen: Legg gelen med en slukket 200 μL-reaksjon per felt. I en separat bane, last 2x ULB med trackerfarger xylencyanol og bromfenolblå, som migrerer i gelen ved henholdsvis 106 nukleotider og 26 nukleotider15. La det være et tomt kjørefelt mellom hver prøve for å unngå potensiell forurensning i de neste trinnene.
      3. Kjør PAGE-gelen: For å skille 95-nt Spinat2 og 49-nt Broccoli fra deres respektive avkortede produkter, kjør gelen i 1,5-2 timer ved 25 W, og da vil det bromfenolblå fargestoffet ha migrert ~ 5/6 av gellengden.
      4. Visualiser RNA-prøven(e) i PAGE-gelen: Demonter glassplatene rundt gelen og dekk gelen i plastfolie på begge sider, og merk banene på omslaget. Visualiser RNA-bånd i et mørkt rom ved UV-skygge ved å plassere den innpakkede gelen på en fluorescerende TLC-plate under UV-lys. Skisser raskt kanten av RNA-båndene som tilsvarer produktet med en markør, og slå av UV-lampen for å minimere skade fra UV-eksponering.
      5. Excise og trekk ut RNA-prøven (e) fra PAGE-gelen: Med et nytt barberblad for hver prøve, excise de ønskede produktbåndene, terninger i ~ 1 mm kuber, og legg gelbitene til et 2 ml mikrocentrifugerør med 500 μL knusekakebuffer for å trekke ut RNA på en rotator i enten 2 timer ved romtemperatur (RT) eller over natten ved 4 ° C.
        MERK: Valgfritt pausepunkt: prøven kan lagres ved −20 °C.
      6. Bunnfall av RNA
        1. For å skille gelbitene fra det ekstraherte RNA i buffer, sentrifuger prøven ved 13 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C, og bruk deretter en smalspisspipette for å trekke ut supernatanten og legge den inn i et nytt 2 ml mikrosentrifugerør.
        2. For å utfelle RNA, tilsett 1,5 ml iskald etanol og 1 μL 20 mg/ml glykogen, virvel, og oppbevar i minst 1 time ved −20 °C eller −80 °C.
          MERK: Valgfritt pausepunkt: RNA kan oppbevares ved −20 °C i noen måneder.
      7. Innsamling av RNA-bunnfall: Pellet det utfelte RNA ved sentrifugering ved 13 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og la den gjenværende etanolen fordampe under friluft (~ 1 time) før du resuspenderer pelleten i 30 μL ddH2O eller 1x TE buffer.
        MERK: Denne prosessen resulterer vanligvis i en endelig RNA-konsentrasjon på ~ 10 μM.
        MERK: Valgfritt pausepunkt: RNA-prøven kan lagres ved −20 °C i noen måneder.
    2. Bestem RNA-lagerkonsentrasjonene.
      1. Forbered en RNA aliquot for hydrolysereaksjonen.
        1. For å utføre denne analysen, bruk først et UV / Vis nanospektrofotometer for å bestemme A260 av lager-RNA-prøven og lage en fortynnet aliquot av prøven til ~ 10 absorbansenheter (AU) i ddH2O.
        2. Forbered følgende reaksjon i et 0,5 ml PCR-rør: 16 μL ddH 2 O + 2 μL av 10x Na 2 CO3 buffer +2μL RNA aliquotfortynnet til ~ 10 AU. Inkuber reaksjonen i 90 minutter ved 95 °C, og la den avkjøles til RT.
      2. Bestem RNA-konsentrasjonen ved hjelp av nukleotidabsorbanser: Mål A260 av denne prøven med et UV / Vis nanospektrofotometer og beregn RNA-konsentrasjonen ved hjelp av følgende formel:
        Equation 1
        hvor c er konsentrasjonen av RNA, b er banelengden, i er det spesifikke nukleotidet (A, C, G eller U), n i er frekvensen av nukleotid i i RNA-sekvensen, og ε i er molar utryddelseskoeffisienten til nukleotid i. For å bestemme den opprinnelige RNA-konsentrasjonen, multipliser c med fortynningsfaktoren.
        MERK: Valgfritt pausepunkt: RNA kan oppbevares ved −20 °C i noen måneder.
  4. Utføre en in vitro Plate Reader Kinetics Assay
    1. Sett opp RNA-renatureringsprogrammet: Opprett følgende termocycler-protokoll ved å velge Opprett nytt program > Legg til ny fase > Legg til nytt trinn flere ganger for å legge til hvert av følgende trinn før du trykker på Lagre:
      70 °C i 3 minutter
      65 °C i 45 s
      60 °C ved 45 s
      55 °C i 45 s
      50 °C i 45 s
      45 °C ved 45 s
      40 °C i 45 s
      35 °C ved 45 s
      30 °C ved 45 s
    2. Renature RNA: For å renaturere Spinat2 og Broccoli RNA, lag 2 μM bestander av hvert RNA i ddH 2 O i et 0,5 ml tynnvegget PCR-rør, og tilsett deretter et likt volum 2x renatureringsbuffer (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl2) for å lage 1 μM RNA-løsninger. Legg rørene til termocykleren, åpne det lagrede renatureringsprogrammet og trykk på Kjør.
      MERK: Hvis en termocykler ikke er tilgjengelig, kan RNA-ene i stedet inkuberes på en 70 °C varmeblokk i 3 minutter og deretter avkjøles sakte til RT på benken.
    3. Klargjør bindingsreaksjonsbufferen: For å forberede bufferen for en aptamerfargebindingsreaksjon, lag en hovedblanding som inneholder bufferkomponenter (69,5 μL ddH 2 O + 4μL av 1 M HEPES, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL av 2 M KCl + 0,3 μL av 1 M MgCl2). Avhengig av hvor mange prøver og replikaer som trengs, multipliser disse verdiene med antall prøver pluss en. Vanligvis er tre replikasjoner per RNA-prøve tilfredsstillende.
    4. Forbered plateleseren.
      1. Sett opp plateleserinjektorprogrammet: På fluorescensplateleseren velger du Temp og setter ønsket temperatur til 37 °C, og sørger for at temperaturen er likevektet med denne verdien i god tid før du starter kinetikkeksperimenter. Åpne plateleserprogramvaren, velg Settings > Acquisition View, og skriv inn følgende program for kinetikkmålinger:
        Sløyfe: For hver brønn
        Grunnlinjeinnstilling: 60 grunnlinjeavlesninger
        SmartInject-innstillinger: 10 μL injeksjon (som vil skje etter at baseline leser)
        Fluorescens (eller FL) lyder:
        Eksitasjon: 448 nm (båndbredde: 9 nm)
        Utslipp: 506 nm (båndbredde: 15 nm)
        Sylinderampulle: MONO (s/n 3297)
        Timing:
        Total lesetid: 10 min
        Leseintervall: 0,5 s
        PMT og optikk: 6 blinker per lest
        Loop: Neste brønn
      2. Klargjør injektoren
        1. Vask og aspirer injektoren: For å klargjøre plateleserinjektoren, velg først Injiser på plateleseren, tilfør en avfallsplate til plateleseren når den er anvist, og velg deretter Vask, og rengjør injeksjonsrøret ved å følge instruksjonene på plateleseren med 1 ml volumer ddH 2 O, 75% etanol i ddH2O, og deretter ddH2O. Velg deretter Aspirate, slik at injektoren kan kaste ut overflødig væske.
        2. Prime injektoren: Etter å ha gått ut til forrige skjermbilde, velg Prime for å prime injektoren med to 260 μL volumer ligand som skal injiseres for å sikre at ren, konsentrert ligand legges til prøver under eksperimenter - i dette tilfellet prime med 100 μM DFHBI i ddH2O.
    5. Utfør in vitro kinetikkeksperimenter: For å utføre ett kinetikkeksperiment, tilsett først 80 μL tidligere tilberedt bindingsbuffermasterblanding til en brønn med en 96-brønns klarbunnsplate, etterfulgt av 10 μL renaturert RNA. La denne platen og DFHBI-løsningen i injektoren balansere til 37 °C i 15 minutter i plateleseren.
    6. I plateleserprogramvaren Innstillinger under Leseområde velger du brønnen som skal analyseres, og deretter, under Hjem-fanen , velger du Kjør for å utføre kinetikkprogrammet beskrevet tidligere. Gjenta denne prosessen til alle eksperimentene er fullført.
      MERK: Kritisk bør kinetikkeksperimenter utføres en brønn om gangen for å sikre at RNA-kinetikken måles under identiske forhold mellom replikasjoner og prøver.
    7. Vask injektoren: For å fjerne den gjenværende DFHBI-oppløsningen fra injeksjonsslangen, vask injeksjonsslangen som beskrevet i trinn 1.4.4.2.1 med 1 ml volumer ddH 2 O, 75 % etanol i ddH 2 O og deretter ddH2O.
      MERK: Valgfritt pausepunkt.
  5. Analyse av in vitro-kinetikken til fluorogene RNA-aptamerer.
    1. Skriv inn data i analyseprogramvaren: Eksporter eksperimentelle data som et regneark for enkelt å kopiere over dataene for behandling. I analyseprogramvaren oppretter du en ny datatabell i XY-format. I X-kolonnen skriver du inn hvert lesetidspunkt, med t = 0 som tidspunktet for DFHBI-injeksjon. I Y-kolonnen angir du de gjennomsnittlige fluorescensverdiene mellom replikasjoner på det respektive tidspunktet som starter ved t = 0.
    2. Normaliser og graf dataene: For å normalisere fluorescensverdiene, klikk på Analyser > databehandling > Normaliser, og klikk deretter på OK. Velg å bruke de minste og største verdiene i datasettet for normalisering, for å presentere resultater som brøker, og for å tegne resultatene, og klikk deretter på OK. Hvis du vil opprette en graf over normalisert gjennomsnittlig fluorescens over tid, klikker du på ikonet Normaliser av [Datasettnavn] og velger Diagramfamilie: XY med bare poeng.
      MERK: Feilfelt kan være nyttig å se i tilfeller der et lite antall tidspunkter er tegnet inn. Hvis disse er ønskelig, når du velger en XY-formatdatatabell, velger du alternativet under "Y" for å angi replikere verdier i side-ved-side-kolonner. Hvis du tegner en graf over den resulterende tabellen med standardalternativene som er valgt, får du en graf med feilfelt.
    3. Utfør kurvetilpasning for å oppnå kinetiske parametere: For å tilpasse en kurve til kinetikkdataene, klikk på Analyser > Analyser data og velg Ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning) under fanen XY-analyser . Under kategorien Modell klikker du på Eksponentiell > tofasetilknytning for å tilpasse kinetikkdataene til følgende tofaseassosiasjonsligning:
      Equation 2
      hvor Y er fluorescensen på tidspunktet X, Y 0 er fluorescensen ved t = 0, K Fast og K Slow er henholdsvis raske og langsomme hastighetskonstanter, og SpanFast og SpanSlow er områdene for fluorescens-turn-on som forklares av henholdsvis de raske og langsomme hastighetene (se representative resultater, figur 1). Klikk kategorien Nonlin Fit for å vise hastighetskonstanter, t1/2 verdier og PercentFast verdier.
      MERK: For å få et standardavvik for alle disse verdiene, kan individuelle platelesereksperimenter behandles på samme måte som beskrevet ovenfor.

2. Cellulær kinetikkeksperiment

  1. Forberedelse av E. coli-stammer
    1. Transform BL21 Star (DE3) E. coli-celler med ~ 100 ng pET31b tRNA-Spinat2 konstruere etter produsentens protokoll.
      MERK: Plasmidkonstruksjon er kommersielt tilgjengelig (Plasmid #79783).
    2. Plate cellene på LB-agar som inneholder karbenicillin (karbo: 50 mg / ml) plater og inkuber ved 37 ° C i 12-16 timer. Celler som inneholder plasmider vil vokse som kolonier på platen.
      MERK: Valgfritt pausepunkt: Transformerte BL21 Star-celler på plater kan lagres ved 4 °C innpakket i parafilm i 1 uke.
  2. Voksende celler og indusere uttrykket av fluorogen RNA aptamer
    1. Inokulere en 2 ml kultur av ikke-induserende medier (NI) som inneholder karbenicillin (karbo: 50 mg/ml) med en enkelt koloni av de transformerte BL21 Star-cellene. Gjenta dette i minst tre biologiske replikasjoner. Inkuber kulturene ved 37 °C i en inkubator/shaker ved 250 o/min i 22-24 timer.
      MERK: Valgfritt pausepunkt: Celler dyrket i NI-medier beholder plasmidet og kan lagres ved 4 °C i 1 uke.
    2. Etter vekst i NI-medier, fortynn kulturen 100x til en frisk 3 ml ZYP-5052 autoinduksjonsmedier (AI) som inneholder karbenicillin (karbo: 50 mg / ml). Dyrk cellene ved 37 °C i en inkubator/shaker ved 250 o/min i 16-18 timer for å indusere uttrykk.
      MERK: Den typiske OD600 for kulturer vil variere fra 2,0-3,3 etter 18 timers vekst. Det optimale celletetthetsområdet er mellom 2,5-3,0.
  3. Utføre det cellulære kinetikkeksperimentet
    1. Sett opp flowcytometeret.
      1. Slå på flowcytometeret og datamaskinen som er koblet til instrumentet. Når du er logget på programvaren for flowcytometeret, klikker du på oppstartsikonet under kategorien Instrument. Følg trinnene som er angitt på programvareskjermen for å sikre riktig instrumenteringsinitialisering.
        MERK: Noen flowcytometre kaller instrumentets oppstartssekvens Priming. Sørg for å følge produsentens protokoll for flowcytometeret som skal brukes til forsøket.
      2. Kjør en ytelsestest (hvis aktuelt). Under hovedmenyfanen klikker du på Ytelsestest. I et kulturrør legger du til tre dråper av produsentens ytelsessporingsperler i 3 ml fokuseringsvæske.
      3. Plasser kulturrøret i prøverørløfteren og løft løfteren. Før du klikker Kjør ytelsestest, må du kontrollere at parti # av røret til sporingsperlene er det samme som det som er angitt på skjermbildet for ytelsestestoppsett . Klikk på Ytelsestest for å kjøre testen.
      4. Sett opp flowcytometerprogramvaren for dette eksperimentet med følgende oppkjøpsparametere for encellet fluorescens:
        Eksitasjonslaser: 488 nm
        Utslippskanal: GFP (også kalt FITC)
        Oppkjøpsvolum: 40 μL (med et totalt trekkvolum på 90 μL)
        Strømningshastighet: 200 μL / min
        Celletall for hver måling: 30 000
        Instrument Innstillinger:
        Spenning:
        FSC: 480 V
        SSC: 400 V
        BL1: 540 V
        BL2: 392 V
        BL3: 422 V
    2. Konfigurer de eksperimentelle filene.
      1. Opprett en ny eksperimentfil i Eksperimentutforsker-fanen ved å høyreklikke på brukernavnet for flowcytometeret. Velg Nytt eksperiment i rullegardinvinduet. Når et nytt vindu på dataskjermen dukker opp, velger du OK.
      2. I den nye eksperimentfilen høyreklikker du på "Gruppe" -mappen og velger Legg til nytt prøverør. Merk prøverørene for hvert bestemt tidspunkt og repliker ved å høyreklikke på Prøve og velge Gi nytt navn i rullegardinmenyen. Gjenta dette trinnet for totalt antall replikasjoner og tidspunkter for det tiltenkte tidsforløpet for studien.
    3. Forbered en fortynnet celleløsning: Tilsett 1,5 ml 1x PBS-løsning i et nytt kulturrør. Deretter legger du til 3 μL induserte celler i AI-medier i 1x PBS-løsningen for å lage en fortynnet celleløsning. Gjenta dette trinnet for hver biologisk replikasjon i forskjellige kulturrør.
    4. Mål bakgrunnsfluorescensen til cellene: Før du tilsetter fargestoff, ta avlesninger av hvert biologisk replikasjonskulturrør som inneholder celler i 1x PBS-løsning. Dette er slik at den fluorescerende bakgrunnen til cellene måles for å observere folden slå på over tid når fargestoffet er tilsatt.
      1. For å ta en avlesning, plasser kulturrøret i prøverørløfteren, og løft løfteren for hånd til prøveinjeksjonsnålen. Velg riktig eksempelfil i kategorien Samlingspanel , og klikk Registrer.
      2. Når løpet er fullført, senk prøverørløfteren med kulturrøret for hånd. Dette vil initiere et skylletrinn som vil skylle fluidikksystemet og minimere overføring mellom hver biologisk replikasjonsprøve. Dataene lagres automatisk på datamaskinen etter at kjøringen er fullført.
      3. Gjenta trinnene innen 2.3.4 for å måle den cellulære fluorescerende bakgrunnen for minst tre biologiske replikasjoner. Hvis du vil flytte til neste eksempelfil, velger du neste eksempelfil ved å klikke på høyrepilikonet nær eksempelrørnavnet under Record-ikonet .
    5. Mål fluorescens ved tidspunkter for celler med fargestoff.
      1. Tilsett 1,4 μL av et konsentrert fargestoff (50 mM DFHBI-1T i DMSO) i 1x PBS-løsning med celler for å gi en endelig konsentrasjon på 50 μM DFBHI-1T. Deretter fester du kulturrørlokket, og inverterer deretter kulturrørene 3x-5x for å blande løsningen jevnt før du tar første gangs punktavlesning.
        MERK: Den totale prosentandelen av DMSO i kulturrørene for E. coli bør ikke overstige 10%, da dette kan påvirke cellens levedyktighet16.
      2. Fjern lokket og plasser kulturrøret i prøverørløfteren. Løft holderen for hånd til prøveinjeksjonsnålen, og klikk på Record-ikonet under riktig prøvefil. I tillegg starter du en tidtaker ved å trykke på Start for eksperimentet.
      3. Senk rørløfteren for hånd etter at løpet er fullført, og gjenta trinn 2.3.5.1-2.3.5.2. (med timeren i gang) ved å legge til 1,4 μL av den konsentrerte DFHBI-1T, invertere kulturrørene og ta avlesninger for alle de gjenværende biologiske replikaene. Disse første opptakene vil være avlesningene oppnådd ved 0 min for alle biologiske replikasjoner. Gjør dette en om gangen for hver biologisk replikasjon.
        MERK: Noter tidspunktet for når registreringen av flowcytometri trykkes. Hold deg til denne tiden svimlende for tidspunkter i løpet av eksperimentet.
      4. Fortsett å ta avlesninger ved å heve kulturrørene i prøverørløfteren til prøveinjeksjonsnålen, velge riktig prøvefil, klikke på Record og senke løfteren for hånd etter at hver løpetur er fullført. Gjør dette for alle de ekstra tidspunktene og biologiske replikaene som testes. Gjenta trinnene til eksperimentet er fullført.
        MERK: Hold prøvene ute av lys for å unngå fotobleking av DFHBI-1T i oppløsning ved å dekke prøvene med aluminiumsfolie.
    6. Mål fluorescens ved tidspunkter for celler uten fargestoff (Kontroll).
      1. Kjør de riktige rengjøringsprotokollene for flowcytometeret før du gjentar eksperimentet igjen med negative kontroller etter produsentens protokoll. Dette gjøres for å minimere overføring fra det forrige eksperimentet til kontrolltidsanalyseeksperimentet. Nedenfor er trinnene som følges for flowcytometeret mellom eksperimenter:
        1. Plasser et tomt kulturrør i rørløfteren for hånd, løft rørholderen og klikk på Unclog-ikonet i kategorien Instrument . Dette vil kjøre en backflush i fluidics systemet for å rydde opp eventuelle klebrig prøver. Senk rørholderen for hånd og fjern røret når Unclog-sekvensen er ferdig.
        2. Med et nytt kulturrør, tilsett 3 ml av en 10% blekemiddelløsning, plasser kulturrøret i rørholderen og løft holderen for hånd til prøveinjeksjonsnålen. I tillegg plasserer du en ren 96-brønns plate i autosampleren hvis det er aktuelt for flowcytometeret.
        3. Klikk på Sanitize SIP / Sanitize Autosampler SIP-ikonet for å kjøre en rengjøringssekvens med 10% blekemiddel i hele fluidikksystemet. Senk rørholderen for å fullføre rengjøringssekvensen.
      2. Angi eksempelfilene for kontrolltidspunktanalysen som kjøres etter instruksjonene i trinn 2.3.3.
      3. I et nytt kulturrør, lag en fortynnet celleløsning i 1,5 ml 1x PBS-løsning. Tilsett 3 μL av de induserte cellene i AI-medier i 1x PBS-løsningen for å lage en fortynnet celleløsning. Gjenta dette trinnet for hver biologisk replikasjon.
      4. Tilsett 1,4 μL DMSO i dyrkningsrøret en om gangen til 1x PBS-løsningen med celler og test de samme tidspunktene. Fest kulturrørlokket, og inverter deretter kulturrørene 3x-5x for å blande løsningen jevnt før du tar første gangs punktavlesning. Gjør dette en om gangen for hver biologisk replikasjon.
      5. Følg samme protokoll for analyse av kontrollceller som for celler med fargestoff, ved hjelp av trinn 2.3.5.2-2.3.5.4.
    7. Slå av flowcytometeret: Følg produsentens protokoll for riktig avstengning av instrumenteringen. For flowcytometeret er instrumentet klargjort for nedstengning på følgende måte:
      1. Utfør den første rengjøringsprotokollen for flowcytometeret ved å følge trinn 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
      2. Bytt ut kulturrøret med 10% blekemiddelløsning med et kulturrør med 3 ml fokuseringsvæske. Løft rørholderen for hånd, og under Shutdown-ikonet klikker du på rullegardinmenyen og velger Thorough.
        MERK: Valgfritt pausepunkt.
  4. Analyse av flowcytometridata
    1. Eksporter alle FCS-filene for analyse. Åpne FCS-filene med en programvare for flowcytometrianalyse.
    2. Ved hjelp av en av FCS-filene som bare er celle, genererer du en port fra punktdiagrammet fremoverspredning (FSC) og sidespredning (SSC) (FSC-område/SSC-område), ved hjelp av begge loggaksene for å utelukke signaler fra rusk. For å opprette denne porten, klikk på Autogate-ikonet på programvaren for flowcytometrianalyse og gi den navnet Gate 1. Bruk den samme porten på alle prøvene som er testet, under kategorien Alle eksempler i arbeidsområdet for databehandling. Dette vil resultere i gate 1 under alle FCS-filene som behandles.
    3. Opprett en ny delmengdefil med filen Cell only FCS som ble brukt i trinn 2.4.2 ved å dobbeltklikke den. Endre akseinnstillingene til FSC-Area/FSC-Height, der begge bruker tømmerakser. Klikk på Autogate-ikonet på programvaren for flowcytometrianalyse for å generere en oval port, og gi den navnet Gate 2. Bruk denne porten som et delsett under portsettet i trinn 2.4.2 på alle prøvene som testes. Dette vil resultere i at alle prøvene har Gate 1 > Gate 2 tilknyttet hver FCS-fil.
    4. Opprett en annen delsettfil med begge portene angitt i trinn 2.4.2 og trinn 2.4.3 brukt ved å dobbeltklikke gate 2. Endre akseinnstillingene til FSC-Area/Histogram. Bruk denne histogramporten som et delsett på alle prøvene som er testet, noe som resulterer i at alle prøvene har gate 1 > gate 2 > gate 2 tilknyttet hver FCS-fil.
      MERK: Histogrammene kan omdøpes fra gate 2 til histogram for å hjelpe til med å flytte histogrammene inn i layoutvinduet, samt å skape mer organisering med databehandlingen.
    5. Hvis du vil analysere verdiene for gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI), åpner du layoutvinduet. Klikk og dra histogramportene for hvert tidspunkt inn i layoutvinduet.
    6. Utfør en statistisk analyse for "∑ Mean: BL1-A" (GFP) for hver prøve som testes for å vise MFI-resultatene i layoutvinduet.
    7. Beregn standardavviket for MFI-verdiene per tidspunktanalyse for minst tre uavhengige biologiske replikasjoner.
    8. Lagre histogrammene og MFI-verdiene for hvert tidspunkt ved å eksportere layoutvinduet som en PDF-fil.
      MERK: Valgfritt pausepunkt.
  5. Graf flowcytometridata
    1. Åpne PDF-filen som inneholder histogrammer og MFI-verdier for hvert tidspunkt. MFI-verdiene kopieres over til en dataanalyseprogramvare. I datagrafikkprogramvare oppretter du en ny datatabell i XY-format.
      1. Velg dette alternativet for å opprette en XY-tabell der følgende er valgt:
        Datatabell: Skrive inn eller importere data til en ny tabell
        Alternativer:
        X: Medgåtte tider
        Y: Skriv inn (tre til fire) replikere verdier i sidestilte underkolonner
      2. Merk på X-aksen alle tidspunktene for eksperiment- og kontrollkjøringene.
      3. I gruppe A legger du inn MFI-verdiene for alle biologiske replikasjoner i hvert tidspunkt for fluorescensanalyse av cellene med fargestoffet tilsatt.
      4. I gruppe B legger du inn MFI-verdiene for alle biologiske replikaer i hvert tidspunkt for analyse av cellene uten fargestoff (DMSO) tilsatt.
      5. For å observere resultatene, klikk på [Sett inn datasettnavn] under fanen Grafer . Dette vil vise datapunktene som gjennomsnitt, med feilfelt som representerer standardavviket (s.d.) på hvert tidspunkt. X-aksen representerer tiden som har gått, og Y-aksen representerer MFI-verdiene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro kinetikk
Sekvensene av DNA-malene og primerne, som kjøpes som syntetiske oligonukleotider, er vist i tabell 2, og reagensoppskriftene er vist i tilleggsfil 1. PCR-amplifisering brukes til å skalere opp mengden DNA-mal med T7-promotoren, som er nødvendig for den påfølgende in vitro-transkripsjonsreaksjonen (IVT). I tillegg kan PCR-amplifisering brukes til to formål i samme reaksjon: å generere brokkoli DNA-malen i full lengde ved primerutvidelse, samt å skalere opp DNA-malen.

Etter IVT-reaksjonen for å syntetisere RNA, vil PAGE-rensing fjerne uønskede avkortede transkripsjoner, degraderte produkter og ikke-reagerte rNTP-er fra RNA-produktet i full lengde. Denne typen rensing foretrekkes fordi avkortede eller degraderte RNA vil forårsake unøyaktig bestemmelse av RNA-konsentrasjoner. Siden nukleotidbaser absorberer UV-lys, kan RNA-bånd og rNTPer på gelen visualiseres under UV som skygger mot en fluorescerende TLC-plate. Dermed kan bånd som tilsvarer riktig produktstørrelse selektivt ekstraheres.

Den nærmeste nabometoden overvurderer utryddelseskoeffisientene og dermed konsentrasjonene av strukturerte RNA siden den ikke tar hensyn til hypokromitet på grunn av baseparring17. Derfor, for å bestemme nøyaktige RNA-konsentrasjoner, ble nøytrale pH termiske hydrolyseanalyser utført for å hydrolysere RNA til individuelle NMPs18. Den nøyaktige utryddelseskoeffisienten ble beregnet som en sum av utryddelseskoeffisientene til NMP i RNA-sekvensen.

Kinetikken til DFHBI-binding til spinat2 og brokkoli ble bestemt ved hjelp av en plateleseranalyse. RNA ble først renaturert for å sikre at det ville være i riktig konformasjon for fargestoffbinding. Reaksjonsbetingelsene for plateleserkinetikkanalysen besto av 40 mM HEPES, pH 7,5 (KOH), 125 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 nM renaturert RNA og 10 μM DFHBI, og reaksjonen ble målt ved 37 °C. Denne temperaturen og konsentrasjonen av MgCl 2 ble valgt for å etterligne fysiologiske forhold 19, selv om forhold på 28 ° C og10 mM MgCl2 også kan brukes til forbedret aptamerfolding.

Både fluorogene aptamerer spinat2 og brokkoli viser tofaset assosiasjonskinetikk for binding til DFHBI-fargestoffet (figur 2). Kinetikkdataene passet bedre ved tofaseassosiasjon enn enfaseassosiasjon for begge aptamerer (supplerende figur 1). Hastighetskonstantene og t1/2-verdiene for de raske og langsomme assosiasjonene ble bestemt av den beste tilpasningskurven (tabell 3). PercentFast, som beskriver hvilken prosent av fluorescens-turn-on-størrelsen som står for den raskere DFHBI-bindende RNA-populasjonen, ble også bestemt.

Spinat2 i bindingskompetent tilstand viser raskere turn-on enn Brokkoli (t 1/ 2 = 1,2 s vs. 2,0 s). Kinetikken i andre fase for begge aptamerer er lik (t1/2 = 180 s) og tilsvarer sannsynligvis et felles hastighetsbegrensende trinn for en underpopulasjon av utvalget (PercentFast = 68 % og 60 % for henholdsvis spinat2 og brokkoli). Samlet sett viser disse resultatene at godt brettede spinat2- og brokkoli-aptamerer utviser veldig rask turn-on-kinetikk, med den første halvmaksimale turn-on innen 1-2 s fargestofftilsetning.

Cellulær kinetikk
Sekvensene av DNA-konstruksjonene, som er klonet inn i pET31b-plasmidet, er vist i tabell 2, og reagensoppskrifter er vist i tilleggsfil 1. DNA-konstruksjonene av fluorogene RNA-aptamerer finnes vanligvis i et tRNA-stillas for cellulære eksperimenter. BL21 Star (DE3) E. coli-stammen er en ekspresjonsstamme med en mutasjon i RNase E som øker RNA-stabiliteten.

Fluorescenstidsmålingene ble registrert hvert 5. minutt i de første 45 minuttene, etterfulgt av avlesninger ved 1 time, 1,5 timer og 2 timer, noe som ga totalt 12 tidspunkter pluss celleavlesningen. Å ha det korteste tidsintervallet på 5 minutter tillot at flere biologiske replikasjoner ble målt ved hvert tidspunkt, med regelmessig avstand mellom replikasjonsmålingene på 30 s til 1 min. Det totale volumet av celler fortynnet i 1x PBS-løsning som ble brukt til tidsforløpseksperimentet var 1,5 ml.

Cellene ble inngjerdet før bestemmelse av gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av populasjonen av enkeltceller. Gating velger et område på spredningsplottet for å bestemme cellepopulasjonen som skal analyseres. Denne prosessen forhindrer at rusk eller multipletavlesninger blir inkludert i analysen. For flowcytometrianalysen som ble vist, ble det registrert 30 000 hendelser, noe som resulterte i 10 000-20 000 hendelser analysert etter gating.

Den cellulære fluorescenskinetikken er en funksjon av både fargestoffdiffusjon i E. coli og fargestoffbindingskinetikk til RNA-aptameren i det cellulære miljøet (figur 1B). For celler som uttrykker Spinat2-tRNA, ble det observert at gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) øker umiddelbart ved "0" -tidspunktet, på grunn av kort tidsforsinkelse (i sekunder) mellom fargestofftilsetning og prøveanalyse (figur 3A). Videre har cellulær fluorescens allerede nådd sin maksimale likevektede MFI-verdi (40 441 ± 990) ved første tidspunkt på 5 min. I motsetning til dette viser kontrollceller lav bakgrunnsfluorescens (416) og ingen endring i MFI-verdi med DMSO-addisjon (figur 3B). En sammenligning mellom celler med fargestoff og celler uten fargestoff avslører at fluorescensaktivering er 98 ganger ± 2 i celler. Samlet sett viser disse resultatene at Spinat2-tRNA uttrykt i E. coli-celler utviser rask turn-on kinetikk, med maksimal turn-on innen mindre enn 5 minutter med fargestofftilsetning.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fluorescensaktivering. Fluorescensaktivering skjer ved at RNA-aptamerer binder seg til fargemolekyler (A) in vitro og (B) i celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: In vitro kinetikk av fluorogene aptamerer. Representativ in vitro-kinetikk for fluorogene aptamerer (A,B) spinat2 eller (C,D) brokkoli modellert etter tofaseassosiasjon, der t = 0 s er tidspunktet for DFHBI-addisjon (endelig DFHBI-konsentrasjon: 10 μM). Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer. Alle feilfelt representerer standardavvik fra gjennomsnittet. Fra passformen blet1/2-verdier oppnådd for både de raske og langsomme assosiasjonsreaksjonskomponentene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ cellulær kinetikk av spinat2 i et tRNA-stillas . (A) Tidspunktanalyse av tRNA-spinat2 fargestoffopptak i løpet av 2 timer. En celle-bare baseline ble tatt før tillegg i DFHIB-1T eller DMSO. Tidspoeng ble tatt hvert 5. minutt de første 45 minuttene, etterfulgt av en tidspunktavlesning på 1 time, 1,5 time og 2 t. Pilen representerer når DFHBI-1T eller DMSO ble lagt til i 1x PBS-løsning med BL21 Star-celler. Den endelige konsentrasjonen av DFHBI-1T for analyse er 50 μM. For DMSO-kontrollen var tilsetningen av DMSO på et likt volum (1,4 μL) brukt til DFHBI-1T-fargestofftilsetning. (B) Et nærbilde av DMSO-kontrolltidspunktanalysen med BL21 Star E. coli-celler. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) indikerer den totale fluorescerende avlesningen av BL21 Star-celler med fargestoff eller DMSO. Data representerer gjennomsnittlig ± standardavvik for tre biologiske replikasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Aptamer-fargestoff par Lengde (nt) Maks magemuskler (nm) Maks em (nm) Utryddelseskoeffisient (M-1 · cm-1) Kvanteutbytte Lysstyrke Kd (nm) Tm (°C) Referanse
Spinat2-DFHBI 95 445 501 26100 0.7 63 1450 37 4
Spinat2-DFHBI-1T 95 482 505 31000 0.94 100 560 37 13, 14
Brokkoli-DFHBI-1T 49 472 507 29600 0.94 96 360 48 13

Tabell 1: Tidligere publiserte fotofysiske og biokjemiske egenskaper til spinat2-DFHBI4, spinat2-DFHBI-1T 13,14 og Brokkoli-DFHBI-1T 13.

Spinat2 + T7 promotor 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAA
GGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCC
GTAACTAGTTACATC-3'
Brokkoli + T7 promotor 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgg
gtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctc-3'
tRNA-Spinat2 konstruere (i pET31b plasmid) 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCCCGGATAGCTCAGTCGGT
AGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGTAGGCT
GCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGG
CCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA
TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTTG-3'
Spinat2 Fremskutt primer 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG-3'
Spinat2 omvendt primer 5'-GATGTAACTAGTTACGGAGC-3'
Brokkoli Forward Primer 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgggtccagatattcgtatctg-3'
Brokkoli omvendt primer 5'-gagcccacactctactcgacagatacgaatctggacccgaccgtctc-3'

Tabell 2: DNA-sekvenstabell som inneholder DNA-sekvenser og primere brukt til in vitro og cellulære kinetikkstudier. Fet = T7 promotor; understreket = tRNA stillas; Caps = Spinat2; små bokstaver = Brokkoli; Fet kursiv = T7 terminator.

Aptamer Rask t1/2 (s) Langsom t1/2 (s) KRask (s-1) KSakte (s-1) Prosent rask
Spinat2 1.2 ± 0.2 180 ± 10 0,56 ± 0,07 0,0039 ± 0,0002 68 ± 5
Brokkoli 2,0 ± 0,2 180 ± 30 0,35 ± 0,05 0,0039 ± 0,0006 60 ± 3

Tabell 3: In vitro kinetikkverdier for spinat2- og brokkoli-aptamerer avledet fra tilpassede data. Dataene rapporteres som gjennomsnittlig ± standardavvik for tre replikaer.

Supplerende figur 1: Representativ in vitro kinetikk for fluorogene aptamerer. Representativ in vitro kinetikk for fluorogene aptamerer (A,C) spinat2 eller (B,D) brokkoli modellert ved enfaseassosiasjon ved (A,B) 600 s eller (C,D) 20 s måletider, med piler som indikerer tidspunktet for DFHBI-addisjon (endelig DFHBI-konsentrasjon: 10 μM). Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer. Samlet sett er disse dataene mindre egnet av en enfaset assosiasjonsmodell enn en tofaset assosiasjonsmodell når fluorescenssignalet overvåkes i lengre tid. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Oppskrifter for in vitro kinetikkeksperiment. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For in vitro-kinetikkeksperimentet kan den samme generelle protokollen modifiseres for å måle in vitro-kinetikken til en RNA-basert fluorescerende biosensor som inneholder både et ligandbindende og fluoroforbindende domene8. I dette tilfellet bør RNA inkuberes med fluoroforen før målinger ved injeksjon av liganden for å oppnå ligandresponskinetikk. Hvis det observeres høy variabilitet mellom replikaene, kan man feilsøke ved å kontrollere at hver prøve får lov til å balansere i samme tid i 96-brønnsplaten før måling. Hver prøve eller replikasjon skal fremstilles individuelt i en brønn og måles rett etter 15 minutters likevektstrinn, i stedet for å forberede alle prøvene samtidig.

For det cellulære kinetikkeksperimentet kan protokollen modifiseres for kortere eller lengre tidskurs, men det er viktig å planlegge antall biologiske replikasjoner og justere det nødvendige celleløsningsvolumet. Det anbefales å fordele hver biologisk replikasjonsavlesning mellom 30 s og 1 min for å ha tilstrekkelig tid til å utføre trinnene nøye. En annen modifikasjon er å teste et annet fluorogent fargestoff som ikke binder RNA-aptameren som en alternativ negativ kontroll, som ikke skal vise fluorescensaktivering over bakgrunnen. Hvis inkonsekvente resultater observeres, kan man feilsøke ved å kontrollere at flowcytometeret er ordentlig rengjort etter produsentens protokoll mellom forskjellige eksperimentelle kjøringer for å forhindre blødning av celler eller fargestoffer fra forrige kjøring til neste.

Mens in vitro-metoden som presenteres er nyttig for å sammenligne kinetikken mellom fluorogene aptamerer eller RNA-baserte fluorogene biosensorer, kan de oppnådde kinetiske verdiene endres avhengig av temperatur, magnesiumkonsentrasjon eller andre bufferkomponenter som brukes. Selv om denne metoden gir veldefinerte forhold som tidligere har blitt brukt til å karakterisere forskjellige fluorogene RNA-systemer, kan det intracellulære miljøet ikke være perfekt representert på grunn av tilstedeværelsen av andre biologiske makromolekyler.

Mens fluorescensplateleseren utstyrt med en programmerbar injektor ikke har noen dødtid for datainnsamling, har flowcytometerinstrumentet begrenset tidsmessig nøyaktighet på grunn av observerbar dødtid. Det er en ~ 5 s forsinkelse mellom når "Record" -knappen klikkes og når datainnsamlingen starter. Ytterligere ~ 5 s lag oppstår for instrumentet å måle 30.000 hendelser; denne prøveinnsamlingstiden vil variere litt avhengig av hvor fortynnet cellene er i 1x PBS.

En annen potensiell begrensning for cellulære eksperimenter er cellens levedyktighet i 1x PBS. For utvidede tidspunktanalyser kan cellens levedyktighet kontrolleres ved hjelp av propidiumjodid for å flekke døde celler20. Fargestoffaggregering kan også begrense nøyaktigheten av fluorescensmålinger gjort av flowcytometeret. Fargestoffer med svært begrenset løselighet i vandige løsninger kan aggregere og vises som partikler som er store nok til å telles som celler på flowcytometeret. Derfor er det viktig å kjøre eksperimentelle fargekontroller for å se etter aggregater i det inngjerdede området.

Tidligere ble det vist at brokkoli har sammenlignbar lysstyrke med Spinat2 ved 1 mM Mg2 + in vitro, men Broccoli-tRNA utviser ~ to ganger større fluorescensintensitet i levende E. coli sammenlignet med Spinat2-tRNA13. Så vidt vi vet, har fargestoffbindingskinetikken for spinat2 og brokkoli fluorogene aptamerer ikke blitt sammenlignet før og modellert av en tofaseforening. De første hurtighastighetskonstantene for begge RNA-aptamerene støtter at fargestoffbindingslommen er forhåndsfoldet og ingen strukturelle endringer er nødvendige for at fargestoffet skal binde seg, noe som er i samsvar med røntgenkrystallografi og UV-smelteeksperimenter21,22. Den andre fasen med en langsommere hastighetskonstant er ikke tidligere rapportert fordi andre eksperimenter som stoppstrøm og fluorescens levetidsmålinger analyserte spinataptameren i kortere varighet (20 s og 300 s) 23,24. Den mye langsommere andre fasen resulterer i en observert bieksponentiell økning i fluorescens når data analyseres for 600 s. Dette langsomme trinnet kan tilskrives enten et hastighetsbegrensende omfoldingstrinn fra en binding-inkompetent til bindingskompetent RNA-tilstand eller et hastighetsbegrensende fotokonverteringstrinn fra trans- til cis-former av det bundne fargestoffet. Sistnevnte mekanisme ble tidligere modellert for å gi en bieksponentiell fluorescensprofil24 og støttes av en nylig analyse av forskjellen mellom absorpsjons- og eksitasjonsspektrene på den relaterte aptameren, Baby Spinat25. 

Den samlede betydningen av in vitro-funnene er at de viser at fargestoffassosiasjon til den fluorogene RNA-aptameren ikke begrenser sanntids RNA-lokalisering og genuttrykksstudier. For RNA-baserte fluorescerende biosensorer som bruker Spinat2, er den målte turn-on-kinetikken lik den andre fasekinetikken målt her10 fordi biosensorene krever et omfoldingstrinn og dermed bør være tilstrekkelig raske til å muliggjøre nær-sanntids signalstudier.

Det var forventet at den cellulære kinetikken ville være forskjellig fra den observerte in vitro kinetikken for spinat2. En viktig forskjell er at det er et ekstra trinn med fargestoffdiffusjon i E. coli-cellene , som innebærer å krysse ytre og indre membraner. I tillegg utgjør det cellulære miljøet forskjellige forhold for fargestoff-aptamerforeningen når det gjelder molekylær trengsel, ionsammensetning og konsentrasjoner, samt RNA- og fargestoffkonsentrasjoner.

Den samlede betydningen av resultatene er at cellulær fluorescens når maksimalt signal på mindre enn 5 minutter og forblir stabil i minst 2 timer, noe som muliggjør sanntids RNA-lokalisering og genuttrykksstudier i dette tidsområdet. For en RNA-basert biosensor som bruker spinat2, viste vi tidligere at en signifikant fluorescensrespons kunne observeres innen 4-5 minutter etter ligandtilsetning, men at det tar lengre tid å nå det maksimale signalet (15-30 min)8. Samlet sett indikerer disse funnene at fargestoffdiffusjon i celler ikke er det praktiske hastighetsbegrensende trinnet for in vivo eksperimenter med RNA-baserte biosensorer. Endelig kan denne eksperimentelle protokollen brukes til å analysere andre fluorogene RNA-systemer i celler.

De eksperimentelle protokollene som presenteres her, kan brukes til å analysere andre fluorogene RNA-systemer. Utover de to aptamerene som ble analysert i denne studien, Spinat2 og Brokkoli, er det utviklet andre fluorogene RNA-systemer som gir forskjellige utslippsprofiler, forbedret fotostabilitet, strammere bindingsaffiniteter og evnen til å endre fluoroforer (nylig gjennomgått1). I tillegg til deres fluorescensegenskaper, er benchmarking av turn-on kinetikken for disse systemene in vitro og i celler viktig for å vurdere deres egnethet for forskjellige cellebiologiske applikasjoner. Resultatene kan også støtte strukturell pre-folding eller omorganisering av aptameren. Som diskutert, med noen modifikasjoner, har disse protokollene også blitt brukt til å analysere RNA-baserte biosensorer8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til MCH: NSF-BSF 1815508 og NIH R01 GM124589. MRM ble delvis støttet av opplæringsstipend NIH T32 GM122740.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).

Tags

Biokjemi utgave 186 Fluorescens flowcytometri plateleser Spinat2 aptamer Brokkoli aptamer E. coli
Bestemmelse av <em>in vitro</em> og cellulær turn-on kinetikk for fluorogene RNA aptamerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mumbleau, M. M., Meyer, M. R.,… More

Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter