Summary
Bu protokol, çay bahçelerindeki PA üreten yabani otlardan alınan çay örneklerinde pirolizidin alkaloidlerinin (PA'lar) kontaminasyonunu açıklamaktadır.
Abstract
Çay örneklerinde insan sağlığı için tehdit oluşturan toksik pirolizidin alkaloidleri (PA'lar) bulunur. Bununla birlikte, çay örneklerinde PA kontaminasyonunun kaynağı ve yolu belirsizliğini korumuştur. Bu çalışmada, Ageratum conyzoides L., A. conyzoides rizosferik toprak, taze çay yaprakları ve kurutulmuş çay örneklerinde 15 PA'yı belirlemek için UPLC-MS / MS ile birleştirilmiş bir adsorban yöntemi geliştirilmiştir . Ortalama iyileşmeler %78-%111 arasında değişirken, göreceli standart sapmalar %0,33-%14,8 arasında değişmiştir. Çin'in Anhui Eyaleti'ndeki Jinzhai çay bahçesinden on beş çift A. conyzoides ve A. conyzoides rizosferik toprak örneği ve 60 taze çay yaprağı örneği toplandı ve 15 PA için analiz edildi . Taze çay yapraklarında, intermedine-N-oksit (ImNO) ve senecionine (Sn) hariç, 15 PA'nın tümü tespit edilmemiştir. ImNO'nun (34.7 μg / kg) içeriği Sn'ninkinden (9.69 μg / kg) daha büyüktü. Ek olarak, hem ImNO hem de Sn, çay bitkisinin genç yapraklarında yoğunlaşırken, içerikleri yaşlı yapraklarda daha düşüktü. Sonuçlar, çaydaki PA'ların çay bahçelerinde PA üreten yabani otlar-toprak-taze çay yaprakları yolundan aktarıldığını göstermiştir.
Introduction
İkincil metabolitler olarak, pirolizidin alkaloidleri (PA'lar) bitkileri otoburlara, böceklere ve patojenlere karşı korur 1,2. Şimdiye kadar, dünya çapında 6.000'den fazla bitki türünde farklı yapılara sahip 660'tan fazla PA ve PA-N-oksit (PANO) bulunmuştur 3,4. PA üreten bitkiler esas olarak Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae ve Apocynaceae 5,6 familyalarında bulunur. PA'lar, güçlü elektrofilisiteye sahip olan ve DNA ve proteinler gibi nükleofillere saldırabilen kararsız dehidropirolizidin alkaloidlerine kolayca oksitlenir, bu da karaciğer hücresi nekrozu, venöz tıkanıklıklar, siroz, asit ve diğer semptomlarla sonuçlanır 7,8. PA toksisitesinin ana hedef organı karaciğerdir. PA'lar ayrıca akciğer, böbrek ve diğer organ toksisitesine ve mutajenik, kanserojen ve gelişimsel toksisiteye neden olabilir 9,10.
Birçok ülkede, PA içeren geleneksel bitkilerin, takviyelerin veya çayların yutulmasından veya süt, bal veya et gibi gıdaların dolaylı kontaminasyonundan (PA'lar içeren meraların yutulmasından kaynaklanan toksik) insan ve hayvan zehirlenmesi vakaları bildirilmiştir11,12,13. Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) bulguları, (bitkisel) çay gibi maddelerin, insanların PA'lara / PANO'lara maruz kalmasının önemli bir kaynağı olduğunu göstermektedir14. Çay örnekleri PA üretmezken, PA üreten bitkiler çay bahçelerinde yaygın olarak bulunur (örneğin, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus ve Ageratum conyzoides)15. Daha önce çayın, toplama ve işleme sırasında üretim tesislerinden PA'larla kontamine olabileceğinden şüpheleniliyordu. Bununla birlikte, bazı elle toplanan çay yapraklarında da PA'lar tespit edilmiştir (yani, PA üreten bitkiler yoktur), bu da başka kirlilik yolları veya kaynakları olması gerektiğini düşündürmektedir16. Ragwort (Senecio jacobaea) ile melissa (Melissa officinalis), nane (Mentha piperita), maydanoz (Petroselinum crispum), papatya (Matricaria recutita) ve nasturtium (Tropaeolum majus) bitkileriyle birlikte yetiştirme deneyi yapıldı ve sonuçlar tüm bu bitkilerde PA'ların tespit edildiğini gösterdi17. PA'ların gerçekten de toprak yoluyla canlı bitkiler arasında aktarıldığı ve değiş tokuş edildiği doğrulanmıştır18,19. Van Wyk ve ark.20, rooibos çayının (Aspalathus linearis) yabani ot bakımından zengin bölgelerde ciddi şekilde kirlendiğini ve aynı tip ve oranda PA'lar içerdiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte, yabancı otsuz bölgelerde rooibos çayında PA tespit edilmemiştir.
Günümüzde, yüksek seçicilik ve duyarlılığa sahip ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (UPLC-MS / MS), tarım ürünleri ve gıdalardaki PA'ların kalitatif ve kantitatif analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır21,22. Numune işleme yöntemi genellikle katı faz ekstraksiyonu (SPE) veya QuEChERS (Hızlı Kolay Ucuz Etkili Sağlam Güvenli) kompleks gıda matrisleri ekstraktlarının temizlenmesinden oluşur ve bu da mümkün olan en yüksek hassasiyeti elde edebilir12,19. Bununla birlikte, toprak, yabani otlar ve taze çay yaprakları gibi karmaşık matrislerde PA'ların tespit edilmesine ve nicelleştirilmesine izin veren sağlam analitik yöntemler hala eksiktir.
Bu çalışma, kurutulmuş çay örnekleri, taze çay yaprakları, yabani otlar ve yabancı ot rizosferik toprak örneklerinde 15 PA'yı bir adsorban saflaştırma yöntemi ile birleştirilmiş UPLC-MS / MS ile analiz etmiştir. Ayrıca, Çin'in Anhui Eyaleti'ndeki Jinzhai çay bahçesindeki beş örnekleme alanından 15 eşleştirilmiş yabani ot ve yabancı ot rizosferik toprak örneği ve 60 taze çay yaprağı örneği toplandı ve 15 PA için analiz edildi. Bu sonuçlar, çayın kalitesini ve güvenliğini sağlamak için bir anket yöntemi ve çay numunelerindeki PA'ların (kontaminasyon) kaynağı ve rotası hakkında bazı bilgiler sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için aşağıdaki yabancı ot türleri toplanmıştır: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. ve Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. Taze çay yaprakları Longjing 43 # çay ağaçlarının çeşitliliğinden toplandı ve kurutulmuş çay örnekleri, yeşil çay üretim sürecine göre işlenmiş ticari olarak temin edilebilen çaylardı (bkz.
1. Örnek toplama
- 40 gerçek örnek toplayın.
- Birden fazla çay bahçesinden rastgele 10 yabani ot, 10 toprak ve 10 taze çay yaprağı toplayın.
NOT: Bu çalışma için toprak, 200 g örneklem miktarı ile 20 cm derinlikte örneklenmiştir. - Bir süpermarketten rastgele 10 kurutulmuş çay ürünü (250 g) toplayın.
- Birden fazla çay bahçesinden rastgele 10 yabani ot, 10 toprak ve 10 taze çay yaprağı toplayın.
- Çaydaki PA'ların kontaminasyon kaynağını incelemek için yabani ot, toprak ve taze çay yaprakları örnekleri toplayın.
- Aynı çay bahçesinde beş örnekleme noktası ayarlayın, her noktada üç kopya var.
- Çay bahçelerinde yaygın olarak bulunan en yüksek PA içeriğine sahip Ageratum conyzoides L. yabancı ot örneklerini toplayın.
NOT: Bu çalışma için örneklem miktarı 250 g idi. - Toprak örneklerini toplayın.
NOT: Toprak örnekleri 20 cm derinlikte A. conyzoides rizosferik toprak olup, numune miktarı 200 g'dır. - Taze çay yapraklarını, iki yapraklı bir tomurcuk, üç yapraklı bir tomurcuk, dört yapraklı bir tomurcuk ve olgun yapraklar dahil olmak üzere çay bitkilerinin farklı bölümlerinden toplayın.
NOT: Numune miktarı 250 g idi.
2. Örnek işleme
- Aşağıdaki adımları izleyerek numunelere ön işlem uygulayın.
- Kurutulmuş çay ve toprak örneklerini bir öğütücü ile öğütün, toz haline getirilmiş numuneleri 200 ağlı bir elek içinden geçirin ve -20 ° C'de saklayın.
NOT: Kurutulmuş çay, ticari olarak temin edilebilen bir çay ürünüydü (bakınız Malzeme Tablosu), bu nedenle doğrudan ezildi ve depolama için elendi. Toprak örnekleri (200 g), yaklaşık bir hafta boyunca hava kuruması için karanlıkta havalandırılan bir yere yerleştirildi. - Yabancı ot ve taze çay yapraklarını bir homojenizatör ile homojenize edin ve -20 °C'de saklayın.
- Kurutulmuş çay ve toprak örneklerini bir öğütücü ile öğütün, toz haline getirilmiş numuneleri 200 ağlı bir elek içinden geçirin ve -20 ° C'de saklayın.
- Kurutulmuş çay ürünlerinin, taze çay yapraklarının ve yabani otların numune muamelesini gerçekleştirin.
- Her numuneden (kurutulmuş çay ürünleri, taze çay yaprakları ve yabani otlar) 1,00 g tartın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- 10 mL 0,1 mol/L sülfürik asit çözeltisi ve katı faz ekstraksiyonu için 2 dakika boyunca vorteks ekleyin (SPE kartuşu kullanarak, Malzeme Tablosuna bakınız) ve adsorban saflaştırma için 1 dakika boyunca vorteks ekleyin. 15 dakika boyuncaultrasonik ekstraksiyon 23 gerçekleştirin ve daha sonra oda sıcaklığında 9,390 x g hızında 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
NOT: Ultrasonik osilatörün gücü 290 W, salınım frekansı 35 kHz ve sıcaklık 30 ° C'ye ayarlandı. - Süpernatantı plastik uçlu bir damlalık ile 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Ayıklama işlemini bir kez tekrarlamak için yukarıdaki adımları izleyin. İki süpernatantı birleştirin.
- SPE kartuşlarını 5 mL metanol ve 5 mL deiyonize su ile etkinleştirin. Önceden etkinleştirilmiş kartuşa 10 mL süpernatant ekleyin ve numune temizliği gerçekleştirin.
- Numune çözeltisi seviyesi kartuşların üst tabakasına ulaştıktan sonra, analitleri 5 mL% 1 formik asit çözeltisi ve daha sonra 5 mL metanol ile boşaltın. Elüate'i atın.
- 5 mL metanol (% 0.5 amonyak suyu içeren) ile elüatı filtreleyin, 0.22 μm membran filtresinden süzün ve UPLC-MS / MS ile analiz edin (bkz.
- Adsorbanları kullanarak numune temizliği gerçekleştirin.
- GCB: PSA: C18 (10 mg: 20 mg: 15 mg, bkz. Malzeme Tablosuna bakınız) adsorbanlarıyla doldurulmuş 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2 mL süpernatant (adım 2.2.4), 1 dakika boyunca vorteks ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 9.390 x g'de santrifüj alın.
- UPLC-MS/MS ile analizden önce süpernatantın 1 mL'sini 0,22 μm'lik bir membran filtresinden geçirin.
- Toprak örneklerinin işlenmesini gerçekleştirin.
- 1,00 g'lık bir toprak örneğini tartın. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve toprak pH değerini 6.0'a ayarlamak için 0.1 mL 0.1 mol / L trisodyum sitrat çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 2 dakika bekletin ve sonra 10 mL 0.1 mol / L sülfürik asit metanol çözeltisi, 2 dakika vorteks ekleyin ve 30 dakika çalkalayın ve ardından 30 dakika boyunca ultrasonik ekstraksiyon yapın.
- 10 dakika boyunca 9.390 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı plastik uçlu bir damlalık ile 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Ekstraksiyonu tekrarlamak ve süpernatantı iki kez birleştirmek için yukarıdaki adımları izleyin.
NOT: Saflaştırma yöntemi, adım 2.2.5.1 ve adım 2.2.5.2'deki ile aynıydı.
3. Enstrümental analiz
- Kurutulmuş çay numunelerindeki, taze çay yapraklarındaki, yabani otlardaki ve topraktaki (2. adımdaki örnekler) 15 PA'yı, ticari olarak temin edilebilen bir UPLC-MS/MS sistemi (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) kullanarak tespit edin (bkz.
- Kolon sıcaklığını 40 °C'ye, akış hızını 0,250 mL/dak'ya ve enjeksiyon hacmini 3 μL'ye ayarlayın.
- Mobil faz A: metanol (% 0.1 formik asit + 1 mmol / L amonyum format içerir) ve mobil faz B: su (% 0.1 formik asit + 1 mmol / L amonyum format içerir) ayarlayın.
- Bir gradyan elüsyon prosedürü ayarlayın: 0,0 dakika ila 0,25 dakika arasında %10 A, 0,25 dakika ila 6,0 dakika arasında %10 -%30 A, 6,0 dakika ila 9,0 dakika arasında %30-%40 A, 1,9 dakika boyunca tutulan 9,0 dakika ila 9,01 dakika arasında %40-%98 A ve 2,9 dakika boyunca tutulan 11,0 dakika ila 11,1 dakika arasında %98-%100 A.
- Kütle spektrometresi parametrelerini ayarlayın: iyonizasyon modu, elektrosprey pozitif iyon kaynağı (ESI+); atomizer basıncı, 7.0 bar; kılcal gerilim, 4.0 kV; konik delik geri üfleme akışı, 150 L / s; çözücü gaz akışı, 800 L/h; çözünme sıcaklığı, 400 °C; darbe gazı akışı, 0,25 mL/dak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kurutulmuş çay numunelerinde, taze çay yapraklarında, yabancı otlarda ve toprakta 15 PA'nın optimize edilmiş adsorban saflaştırma ve analiz yöntemi oluşturulmuş ve SPE kartuşu kullanılarak yaygın olarak kullanılan saflaştırma yöntemiyle karşılaştırılmıştır. Sonuçlar, SPE kartuşu kullanılarak kurutulmuş çay örnekleri, yabani ot ve taze çay yapraklarındaki 15 PA'nın geri kazanımlarının% 72 -% 120 iken, adsorban saflaştırma kullanımının% 78 -% 98 olduğunu göstermiştir (Şekil 1). Adsorban saflaştırma kullanılarak topraktaki 15 PA'nın geri kazanımları %79-%111 idi (Şekil 1). İki temizleme yöntemini karşılaştırmak için PA'ların içeriğini tespit etmek için kırk (40) gerçek örnek rastgele toplanmıştır (Ek Tablo 1-7). Heliotrin (He), 1.3-22 μg / kg içerikli adsorban yöntemi kullanılarak 10 kurutulmuş çay örneğinin hepsinde tespit edilirken, sadece 1.8-24.6 μg / kg içerikli SPE kartuşu kullanılarak üç kurutulmuş çay örneğinde tespit edilmiştir (Ek Tablo 3-4).
Adsorban saflaştırma yöntemi (GCB: PSA: C18), yabancı otlardaki, yabancı ot rizosferik topraklardaki ve çay ekim sistemlerindeki taze çay yapraklarındaki PA'ları tespit etmek için seçildi. Jinzhai'deki bir çay bahçesinde beş örnekleme alanı seçildi. Jacobine (Jb), senesifilin (Sp), senesifilin N-oksit (SpNO) ve senkirkine (Sk) ek olarak, en yüksek PA içeriği intermedine (Im) (2.006-2.970 μg / kg), heliotrin-N-oksit (HeNO) (2.446-2.731 μg / kg) ve intermedine-N-oksit (ImNO) (13.535-17.345 μg / kg) olan yabancı ot A. conyzoides'te toplam 11 PA tespit edilmiştir (Tablo 1). Toprakta, örnekleme sahası 5'te 6.05 μg / kg içeriğinde sadece ImNO tespit edilmiştir (Ek Tablo 8). Beş örnekleme bölgesinden alınan taze çay yapraklarında ImNO ve Sn tespit edildi (Şekil 2). Çay bitkilerinin farklı kısımlarında ImNO tespit edildi ve içeriği 4.36-26.5 μg / kg arasında değişiyordu, bu da Sn'ninkinden daha büyüktü, ancak örnekleme bölgesi 1 ve örnekleme alanı 2'den olgun yapraklarda Sn'nin tespit edilmemesi dışında. Diğer örnekleme alanlarındaki çay bitkilerinin farklı kısımlarında sn tespit edildi ve içeriği 1.0-3.14 μg / kg arasında değişmiştir (Şekil 2).
Örnekleme alanı 5'te, PA'ların yabancı otlar, yabancı ot rizosferik toprağı ve taze çay yaprakları arasındaki transfer fenomeni gösterilmiştir (Şekil 3). 11 PA yabani otu arasında toprakta 6.05 μg/kg içeriğinde sadece ImNO tespit edilirken, çay bitkilerinin farklı kısımlarında ImNO ve Sn tespit edilmiştir. İki yapraklı bir tomurcuktaki ImNO içeriği en yüksek olanıydı, bu da 12.6 μg / kg idi (Şekil 3).
Şekil 1: Kurtarma karşılaştırması. Adsorban (çivili seviye = 0.02 mg / kg) ve SPE kartuşları (karışık katyon değişimi katı faz ekstraksiyon kolonları, çivili seviye = 0.01 mg / kg) ile temizlendikten sonra (A) taze çay yaprakları, (B) kurutulmuş çay numuneleri, (C) yabancı ot ve (D) toprak numunelerinden elde edilen ekstraktlardaki 15 PA'nın (pirolizidin alkaloidleri) geri kazanımlarının karşılaştırılması. Hata çubukları standart sapmayı gösterir ve anlamlılık testi varyans analizi ile gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Beş örnekleme alanından toplanan çay bitkilerinin farklı bölgelerindeki PA'ların (pirolizidin alkaloidleri) içeriği ve türleri. (A) Örnekleme alanı 1. (B) Örnekleme yeri 2. (C) Örnekleme yeri 3. (D) Örnekleme yeri 4. (E) Örnekleme yeri 5. Hata çubukları standart sapmayı gösterir ve anlamlılık testi varyans analizi ile gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yabancı otlarda bulunan PA'lar ve bunların toprağa ve taze çay yapraklarına transferi. (A) Yabancı otlarda, toprakta ve taze çay yapraklarında tespit edilen PA'ların (pirolizidin alkaloidleri) içeriği ve türü. (B) Yabancı otlarda tespit edilen PA'ların içeriği ve türü. Hata çubukları standart sapmayı gösterir ve anlamlılık testi varyans analizi ile gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnekleme sitesi | Tek PA'ların ortalama içeriği (± bağıl standart sapma), μg/kg | Toplam PA'ların içeriği (μg/kg) | |||||||||||||||||||||||||||
| O | HeNO | Im | ImNO | Arjantin | JbNO | Yeniden | Reno | Sn | SnNO | Sp | Sp HAYIR |
AB | EuNO | Sk | |||||||||||||||
| 1 | 97.4 (2.43) | 2731.1 (2.04) | 2424.9 (1.84) | 13754 (0.56) | ND | 1.92 (1.54) | 21.2 (10.45) | 4.01 (5.72) | 58.4 (2.52) | 17.2 (9.03) | ND | ND | 224.0 (1.75) | 6.9 (2.02) | ND | 19341.03 | |||||||||||||
| 2 | 83.9 (1.21) | 2518.6 (0.81) | 2476.5 (1.15) | 13945 (0.30) | ND | 2.60 (2.52) | 28.8 (1.51) | 4.82 (3.66) | 63.7 (3.52) | 19.8 (10.2) | ND | ND | 248.6 (1.48) | 7.0 (1.58) | ND | 19399.32 | |||||||||||||
| 3 | 96.6 (1.67) | 2470.4 (1.08) | 2969.7 (1.02) | 16829 (0.36) | ND | 2.12 (1.08) | 20.9 (9.30) | 2.94 (1.08) | 51.0 (7.50) | 14.9 (8.25) | ND | ND | 252.1 (3.17) | 5.91 (0.35) | ND | 22715.57 | |||||||||||||
| 4 | 91.4 (1.98) | 2638.6 (2.75) | 2882.4 (1.98) | 17345 (0.76) | ND | 2.42 (10.59) | 15.4 (6.99) | 2.67 (10.59) | 51.6 (6.73) | 15.0 (0.92) | ND | ND | 281.3 (2.36) | 6.78 (2.15) | ND | 23332.57 | |||||||||||||
| 5 | 83.4 (3.79) | 2446.7 (6.0) | 2005.5 (3.79) | 13535 (1.96) | ND | 1.68 (4.94) | 15.2 (0.91) | 2.70 (4.94) | 49.4 (8.78) | 16.9 (10.7) | ND | ND | 215.2 (2.47) | 5.99 (3.76) | ND | 18377.67 | |||||||||||||
Tablo 1: Beş örnekleme bölgesindeki yabancı otların tek ve toplam PA'larının (pirolizidin alkaloidleri) içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez.
Ek Tablo 1: Adsorban yöntemi ile saflaştırılan taze çay yapraklarındaki tek ve toplam PA'ların içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 2: SPE ile saflaştırılan taze çay yapraklarındaki tek ve toplam PA'ların içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 3: Adsorban yöntemi ile saflaştırılan kurutulmuş çaydaki tek ve toplam PA'ların içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 4: SPE ile saflaştırılan kurutulmuş çaydaki tek ve toplam PA'ların içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 5: Adsorban yöntemi ile saflaştırılan yabancı otlardaki tek ve toplam PA'ların içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 6: SPE ile saflaştırılan yabancı otlardaki tek ve toplam PA'ların içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 7: Adsorban yöntemi ile saflaştırılan topraklardaki tek ve toplam PA'ların içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 8: Beş örnekleme sahasındaki toprakların tek ve toplam PA'larının içeriği. ND, algılanan hiçbirini temsil etmez. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, çay numunelerindeki PA'ların kontaminasyon yollarını ve kaynaklarını ve ayrıca çay bitkilerinin farklı bölgelerindeki PA'ların dağılımını araştırmak için etkili ve hassas bir yöntem geliştirmek üzere tasarlanmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmada, kromatografik sütun üzerinde sadece 15 PA başarıyla ayrılmıştır, bu dabitki türleri 3,4'teki çok sayıda alkaloitle karşılaştırıldığında çok küçük bir sayıdır. Bu sadece kolonun kendisinin paketleme özellikleriyle değil, aynı zamanda incelenen çay örneklerinin karmaşık matrisiyle de ilgiliydi. Bu nedenle, çoklu PA'ları tespit etmek için daha iyi ayırma ve saflaştırma yöntemleri hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır.
SPE kartuşları ve adsorban yöntemleri, çeşitli numune matrislerinde çoklu PA'ları tespit etmek için uygulanmıştır, ancak çayın karmaşık matrisinde, adsorban yöntemi bildirilmemiştir24. Bu nedenle, bu çalışmada GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg) oranına sahip adsorban yöntemi geliştirilmiş ve 15 PA'nın geri kazanımları, farklı numune matrislerindeki PA'lar için tespit gereksinimlerini karşılamıştır. Buna karşılık, ImNO, Eu ve Re geri kazanımları, SPE kartuşlarıyla temizlendikten sonra kurutulmuş çayda sırasıyla% 119,% 120 ve% 115 oranında ortalama% 119,% 120 ve% 115 idi ve bu da önemli bir matris etkisi gösterdi. Ayrıca, SPE kartuşlarıyla karşılaştırıldığında, adsorban (GCB: PSA: C18) yöntemi, PA analizi için daha kısa bir numune işleme süresine, daha düşük maliyete ve daha iyi geri kazanımlara sahipti (Şekil 1B). Kurutulmuş çay numunelerinde, taze çay yapraklarında, yabani otlarda ve toprakta 15 PA için tespit yöntemleri oluşturmak, çay numunelerindeki PA'ların kontaminasyon kaynağını araştırmak için etkili bir tespit yöntemi sağlamıştır. Ayrıca mevcut bilgilere göre bu çalışmada ilk kez toprakta multi-PA tespit yöntemi oluşturulmuştur.
Çay plantasyon sistemindeki PA'ların transfer yolları incelenmiştir. Çalışmalarımız, A. conyzoides'in Jinzhai çay bahçesinde en yüksek toplam PA içeriğine sahip yabani otlardan biri olduğunu ve çay bitkilerinin yanında büyüdüğünü göstermektedir. Bu nedenle, A. conyzoides, A. conyzoides rizosferik toprak ve taze çay yapraklarının farklı kısımları, 15 PA'yı analiz etmek için Jinzhai'deki bir çay bahçesindeki beş örnekleme alanından toplanmıştır. Şekil 3, A. conyzoides'te üretilen 11 PA'dan sadece A. conyzoides rizosferik toprakta ImNO'nun tespit edildiğini, taze çay yapraklarında ise ImNO ve Sn'nin tespit edildiğini göstermektedir. Bu, A. conyzoides'te üretilen PA'ların tüm içeriğinin toprak ortamı yoluyla çay bitkilerine taşınamayacağını göstermektedir. Toprağa aktarılan PA'ların bazı içerikleri toprak mikroorganizmaları tarafından bozulabilir.
ImNO ve Sn esas olarak iki yapraklı bir tomurcuk ve üç yapraklı bir tomurcuk halinde dağıtılırken, olgun yapraklardaki PA'ların içeriği nispeten düşüktü. Örnekleme alanı 4'te, iki yapraklı bir tomurcuktaki ImNO içeriği 26.5 μg / kg'a ulaşırken, çay bitkisinin diğer kısımlarında 7.14-10.4 μg / kg arasında değişmiştir. Örnekleme alanı 1 ve örnekleme alanı 2'deki olgun yapraklarda Sn tespit edilmedi. Bu, çay bitkilerindeki PA'ların zenginleştirilmiş kısımlarının esas olarak genç yapraklarda yoğunlaştığını ve içeriğin, Avrupa Birliği tarafından belirlenen çay örneklerinde PA'ların maksimum kalıntı sınırının çok altında olduğunu göstermektedir (yetişkinler için 150 μg / kg, bebekler ve küçük çocuklar için 75 μg / kg)25. Sonuçlar, çay örneklerindeki PA'ların, toprak yoluyla çay bahçelerindeki PA üreten yabani otlardan gelebileceğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, sonuçlar PA'ların bitkiler arasında transferini ve değişimini doğrulamaktadır17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (32102244), Ulusal Tarım Ürünleri Kalite ve Güvenlik ve Risk Değerlendirme Projesi (GJFP2021001), Anhui Eyaleti Doğal Bilimsel Vakfı (19252002) ve USDA (HAW05020H) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
References
- Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
- Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
- Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. 1, Elsevier. 348-355 (2019).
- Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
- Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
- Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
- Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
- Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
- Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
- Mattocks, A. R. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , Academic Press. London, UK. (1986).
- Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
- Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
- Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
- Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
- Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
- Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
- Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
- Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
- Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
- Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
- Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
- Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
- European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).
