次世代AAVの作成のための新規特性を持つ候補のバーコード化によるAAVペプチドディスプレイライブラリの生成とその後の検証。
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方法論記事
アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド変異体のエンジニアリング、バーコード化、スクリーニングによる次世代遺伝子治療ベクターの単離(英語)
この記事について
サマリー
要約
アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する遺伝子送達ベクターは、遺伝病の治療のための最も有望なツールの1つであり、有望な臨床データといくつかのAAV遺伝子治療の承認によって証明されています。AAVベクターの成功の2つの主な理由は、(i)異なる特性を持つさまざまな天然に存在するウイルス血清型の事前分離、および(ii)その後の分子工学とハイスループットでの転用のための強力な技術の確立です。これらの技術の可能性をさらに高めるために、最近、選択されたAAVカプシドをDNAおよびRNAレベルでバーコード化するための戦略が実装され、単一の動物のすべての主要な臓器および細胞タイプで包括的かつ並行したin vivo層別化が可能になります。ここでは、AAVペプチドディスプレイを使用して、利用可能なカプシドエンジニアリング技術の多様な武器を表す、この一連の補完的な手段を網羅する基本的なパイプラインを紹介します。したがって、まず、所望の特性を有する候補のin vivo選択のためのAAVペプチドディスプレイライブラリを生成するための極めて重要なステップを説明し、続いて、二次in vivoスクリーニングのために最も興味深いカプシド変異体をバーコード化する方法のデモンストレーションを行います。次に、バーコード増幅やアダプターライゲーションを含む次世代シーケンシング(NGS)用のライブラリ作成の方法論を例示し、NGSデータ解析中の最も重要なステップの概要で締めくくります。ここで報告されているプロトコルは汎用性と適応性があるため、研究者はそれらを簡単に利用して、お気に入りの疾患モデルや遺伝子治療アプリケーションに最適なAAVキャプシドバリアントを濃縮できます。
概要
遺伝子導入療法は、細胞に遺伝物質を導入して、細胞の遺伝物質を修復、置換、または変更して、病気を予防、治療、治癒、または改善することです。遺伝子導入は、インビボとエクスビボの両方で、非ウイルス性とウイルス性の異なる送達システムに依存しています。ウイルスは、標的細胞を効率的に形質導入するために自然に進化しており、送達ベクターとして使用できます。遺伝子治療に使用されるさまざまな種類のウイルスベクターの中で、アデノ随伴ウイルスは、病原性の欠如、安全性、免疫原性の低下、そして最も重要なことに、長期の非組み込み型発現を維持する能力のためにますます使用されています1,2,3。AAV遺伝子治療は、過去10年間でかなりの成果を上げてきました。3つの治療法が、欧州医薬品庁と米国食品医薬品局によってヒトでの使用が承認されています3,4。他の場所でレビューされているように、血友病、筋肉、心臓、神経疾患などのさまざまな疾患を治療するためのいくつかの臨床試験も進行中です3。何十年にもわたる進歩にもかかわらず、遺伝子治療の分野は近年一連の挫折を経験しており
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プロトコル
1. AAV2ランダム7量体ペプチドディスプレイライブラリーの調製
注:AAV2ランダムペプチドディスプレイライブラリの調製では、縮重オリゴヌクレオチドを一本鎖DNAとして合成し、それを二本鎖DNAに変換し、消化し、アクセプタープラスミドにライゲートし、エレクトロポレートします。
- 縮重オリゴヌクレオチドの設計
- 縮重オリゴヌクレオチドを注文し、コドンバイアスを回避します。オリゴヌクレオチド5'CAGTCGGCCAG AG W GGC(X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3'において、X01は20個のコドンに対応し、それぞれが20個のアミノ酸のうちの1つをコードする。WはAまたはTであり得、アミノ酸アルギニン(R)またはセリン(S)をコードするコドンAGAまたはAGTを生じる。
- 増幅プライマーを注文する:5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (詳細については 図1 を参照)。これにより、次のタンパク質インサートが生成されます: R/S GX 7。理論上の多様性は次のように計算されます:1 x 2 x 207 = 2.56 x 109 つの一意のバリアント。
注:この多様性は、変換効率によって制限される可能性があることに....
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結果
AAV2ペプチドディスプレイライブラリの作製。 改変されたAAVの選択に向けた最初のステップとして、プラスミドライブラリの生成について説明します。ペプチドインサートは、縮重プライマーを使用して製造されます。コドンの組み合わせを64から20に減らすと、タンパク質レベルではなくDNAのライブラリの多様性を減らすことで、終止コドンを排除し、NGS分析を容易にするという利点があります。オリゴヌクレオチドインサートは一本鎖DNAとして購入され(図1)、PCR反応を使用して二本鎖DNAに変換されます。この反応の質はバイオアナライザーで制御されます。 図2に示すように、3サイクルは、10サイクルまたは30サイクルと比較して、より強いバンドを生成しました。次に、インサートをBglIで消化して、3ヌクレオチドのオーバーハングを生成します。二本鎖インサートのオーバーハング配列の隣のヌクレオチドは、アルギニン(R)またはセリン(S)をコードするコドンの3番目の位置にあるAまたはT(WはAまたはTのあいまいさ.......
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ディスカッション
このプロトコルでは、ペプチドディスプレイAAVキャプシドエンジニアリングとバーコードAAVライブラリスクリーニング、およびライブラリ組成とキャプシド性能のバイオインフォマティクス分析に必要な手順が概説されています。このプロトコルは、ほとんどのウイルス学研究所が分子生物学技術の習熟度に匹敵するプログラミングスキルに遅れをとっているため、これらのタイプのライブラリのバイオインフォマティクス分析を容易にするステップに焦点を当てています。どちらのタイプのライブラリも、序論で概説したように文献に広く説明されており、比較的簡単に再現できます。
第1のステップとして、AAV2の可変領域VIIIにおける位置588におけるペプチドディスプレイライブラリの設計が概説される。この設計(以前の刊行物26のAAV2_Peptide(ii))および記載されたクローニング方法は、最近の刊行物26で提供される情報に基づいて、他の血清型に容易に適合させることができる。クローニングパイプラインの重要なステップは、ライゲーシ.......
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開示事項
D.G.はAaviGen GmbHの共同創設者であり、D.G.とK.R.は、免疫回避AAVキャプシド変異体の生成に関連する出願中の特許出願の発明者です。残りの著者は開示するものは何もありません。
謝辞
D.G.は、DFG共同研究センターSFB1129(Projektnummer 240245660)およびTRR179(Projektnummer 272983813)を通じたドイツ研究財団(DFG)、ならびにドイツ感染研究センター(DZIF、BMBF;TTU-HIV 04.819)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 増幅プライマー | ELLA Biotech (ミュンヘン、ドイツ) | - | オリゴヌクレオチドインサートの二本鎖合成 |
| Agilent DNA 1000 試薬 | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Miniキット | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT(米国カリフォルニア州サンジョース) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGSライブラリの調製 |
| BC-seq rv: | IDT(米国カリフォルニア州カリフォルニア州サンジョース) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGSライブラリの調製 |
| β-メルカプトエタノール | ミリポアシグマ(米国マサチューセッツ州バーリントン) | 44-420-3250ML | DNA/RNA抽出 |
| BglI | New England Biolabs(米国マサチューセッツ州イプスウィッチ) | R0143 | 二本鎖インサート |
| C1000タッチサーマルサイクラー | バイオラッド(米国カリフォルニア州ヘラクレス) | 1851196 | dd-PCRサイク |
| ラーdNTPS | New England Biolabs (米国マサチューセッツ州イプスウィッチ) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR Supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR Droplet |
| Generation Oil DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR 液滴発生カートリッジ |
| DG8 カートリッジホルダー | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR カートリッジホルダー |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | ddPCR カートリッジ用カバー |
| ddPCR プレート 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME ElectrocompetentCells Lucigen | (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | エレクトロポレーション |
| 大容量cDNA逆転写キット | Applied Biosystems(米国マサチューセッツ州ウォルサム) | ||
| ITR_fw | IDT(米国カリフォルニア州サンジョース) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCRプライマー |
| ITR_rv | IDT(米国カリフォルニア州サンジョース) | https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Libraryシーケンシング |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (バーゼル、スイス) | KK2600 07958919001 | NGS サンプル調製 |
| MagnaBot 96 磁気分離装置 | Promega GmbH (米国ウィスコンシン州マディソン) | V8151 | NGS ライブラリ用サンプル調製 |
| NanoDrop 2000 分光光度計 | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | 二本鎖インサートの分解 |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (米国マサチューセッツ州バーリント) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS プライマー |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (米国マサチューセッツ州バーリント) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS プライマー |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library |
| sequencing Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (米国カリフォルニア州サンカルロス) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat | Seal Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR シーリング Foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR ベクター.Cap2 ORF内のペプチド挿入部位、ラボで製造/調製 | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR Droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR Droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo,オランダ) | 28704 | プラスミドベクター精製 |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library |
| preparation QubitdsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (米国マサチューセッツ州ウォルサム) | Q32851 | NGS ライブラリ調製 |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (オランダ、フェンロー) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (米国カリフォルニア州サンジョース) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR プライマー |
| rep_rv | IDT (米国カリフォルニア州サンジョース) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR プライマー |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLABiotech (Munich, Germany) | - | Desized oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCRプライマー |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean &Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | ベクターおよびライゲーション精製 |
参考文献
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene ....
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再版と許可
