Summary
إنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV والتحقق اللاحق من خلال الترميز الشريطي للمرشحين ذوي الخصائص الجديدة لإنشاء الجيل التالي من AAVs.
Abstract
تعد نواقل توصيل الجينات المشتقة من الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) واحدة من أكثر الأدوات الواعدة لعلاج الأمراض الوراثية ، ويتضح ذلك من خلال تشجيع البيانات السريرية والموافقة على العديد من العلاجات الجينية AAV. هناك سببان رئيسيان لنجاح نواقل AAV هما (i) العزل المسبق لمختلف الأنماط المصلية الفيروسية التي تحدث بشكل طبيعي مع خصائص مميزة ، و (ii) الإنشاء اللاحق لتقنيات قوية لهندستها الجزيئية وإعادة توظيفها في إنتاجية عالية. ومما يعزز إمكانات هذه التقنيات مؤخرا استراتيجيات تم تنفيذها لترميز قفيصات AAV مختارة على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، مما يسمح بتقسيمها الطبقي الشامل والمتوازي في الجسم الحي في جميع الأعضاء الرئيسية وأنواع الخلايا في واحد. هنا ، نقدم خط أنابيب أساسي يشمل هذه المجموعة من السبل التكميلية ، باستخدام عرض الببتيد AAV لتمثيل الترسانة المتنوعة لتقنيات هندسة القفيصة المتاحة. وفقا لذلك ، نصف أولا الخطوات المحورية لإنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV للاختيار في الجسم الحي للمرشحين ذوي الخصائص المطلوبة ، متبوعا بعرض توضيحي لكيفية ترميز متغيرات القفيصة الأكثر إثارة للاهتمام للفحص الثانوي في الجسم الحي . بعد ذلك ، نمثل منهجية إنشاء مكتبات لتسلسل الجيل التالي (NGS) ، بما في ذلك تضخيم الباركود وربط المحول ، قبل أن نختتم بنظرة عامة على الخطوات الأكثر أهمية أثناء تحليل بيانات NGS. نظرا لأن البروتوكولات المذكورة هنا متعددة الاستخدامات وقابلة للتكيف ، يمكن للباحثين تسخيرها بسهولة لإثراء متغيرات قفيصة AAV المثلى في نموذج المرض المفضل لديهم ولتطبيقات العلاج الجيني.
Introduction
العلاج بنقل الجينات هو إدخال مادة وراثية في الخلايا لإصلاح المادة الوراثية الخلوية أو استبدالها أو تغييرها للوقاية من المرض أو علاجه أو علاجه أو تحسينه. يعتمد نقل الجينات ، سواء في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي ، على أنظمة توصيل مختلفة ، غير فيروسية وفيروسية. تطورت الفيروسات بشكل طبيعي لتحويل خلاياها المستهدفة بكفاءة ويمكن استخدامها كناقلات توصيل. من بين الأنواع المختلفة من النواقل الفيروسية المستخدمة في العلاج الجيني ، تم استخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي بشكل متزايد ، نظرا لافتقارها إلى الإمراضية والسلامة وانخفاض المناعة ، والأهم من ذلك قدرتها على الحفاظ على التعبير طويل الأجل وغير المتكامل1،2،3. حقق العلاج الجيني AAV إنجازات كبيرة على مدى العقد الماضي. تمت الموافقة على ثلاثة علاجات من قبل وكالة الأدوية الأوروبية وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية للاستخدام في البشر 3,4. كما تجري العديد من التجارب السريرية لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض ، مثل الهيموفيليا وأمراض العضلات والقلب والأمراض العصبية ، كما تمت مراجعته في مكان آخر3. على الرغم من عقود من التقدم ، شهد مجال العلاج الجيني سلسلة من النكسات في السنوات الأخيرة4 ، وأهمها الوفيات في التجارب السريرية5 التي تم تعليقها بسبب السمية التي تحد من الجرعة ، خاصة بالنسبة للأنسجة الضخمة ، مثل العضلات ، أو التي يصعب الوصول إليها ، مثل الدماغ6.
تنتمي ناقلات AAV المستخدمة حاليا في التجارب السريرية إلى الأنماط المصلية الطبيعية مع استثناءات قليلة1. توفر هندسة AAV الفرصة لتطوير ناقلات ذات خصوصية وكفاءة فائقة للأعضاء أو الخلايا. في العقدين الماضيين ، تم تطبيق العديد من الأساليب بنجاح ، مثل عرض الببتيد ، ومبادلة الحلقة ، وخلط الحمض النووي للقفيصة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ ، والتصميم المستهدف ، لإنشاء متغيرات AAV فردية أو مكتبات لها بخصائص متنوعة7. ثم تخضع هذه لجولات متعددة من التطور الموجه لتحديد المتغيرات داخلها مع الخصائص المطلوبة ، كما تمت مراجعته في مكان آخر 1,3. من بين جميع استراتيجيات تطور القفيصة ، كانت مكتبات عرض الببتيد AAV هي الأكثر استخداما ، نظرا لبعض الخصائص الفريدة: فهي سهلة التوليد نسبيا ، ويمكنها تحقيق تنوع عال وتسلسل عالي الإنتاجية ، مما يسمح بتتبع تطورها.
تم وصف أول مكتبات AAV ناجحة لإدخال الببتيد منذ ما يقرب من 20 عاما. في واحدة من الأولى ، قام Perabo et al.8 ببناء مكتبة من قفيصات AAV2 المعدلة ، حيث تم إدخال مجموعة من قليل النوكليوتيدات المولدة عشوائيا في بلازميد في موضع يتوافق مع الأحماض الأمينية 587 من بروتين قفيصة VP1 ، في المحور ثلاثي الأضواط البارز من القفيصة. باستخدام العدوى المشتركة للفيروس الغدي ، تم تطوير مكتبة AAV من خلال جولات متعددة من الاختيار ، وتبين أن المتغيرات النهائية المعاد استهدافها قادرة على تحويل خطوط الخلايا المقاومة إلى AAV28 الأبوي. بعد ذلك بوقت قصير ، قدم Müller et al.9 نظام الخطوتين لإنتاج المكتبات ، وهو تحسن كبير في البروتوكول. في البداية ، يتم استخدام مكتبة البلازميد ، جنبا إلى جنب مع البلازميد المساعد للفيروسات الغدية ، لإنتاج مكتبة AAV تحتوي على قفيصات خيمرية. تستخدم مكتبة مكوك AAV هذه لإصابة الخلايا بمضاعفات منخفضة للعدوى (MOI) ، بهدف إدخال جينوم فيروسي واحد لكل خلية. تضمن العدوى المشتركة بالفيروس الغدي إنتاج AAVs مع جينوم مطابق وقفيصة9. بعد حوالي عقد من الزمان ، استخدم Dalkara10 التطور الموجه في الجسم الحي لإنشاء متغير 7m8. يحتوي هذا المتغير على 10 إدخال حمض أميني (LALGETTRPA) ، ثلاثة منها تعمل كروابط ، وتستهدف الشبكية الخارجية بكفاءة بعد الحقن داخل الجسم الزجاجي10. هذه القفيصة الهندسية هي قصة نجاح استثنائية ، لأنها واحدة من القفيصات الهندسية القليلة التي وصلت إلى العيادة حتى الآن11.
شهد المجال دفعة ثانية مع إدخال تقنيات التسلسل من الجيل التالي (NGS). عرض منشوران من Adachi et al.12 في عام 2014 ومن Marsic et al.13 في عام 2015 ، قوة NGS لتتبع توزيع مكتبات قفيصة AAV المشفرة بدقة عالية. بعد بضع سنوات ، تم تكييف NGS لمناطق الباركود مع منطقة إدخال الببتيد لمتابعة تطور القفيصة. أجرى Körbelin et al.14 فحصا موجها ب NGS لتحديد قفيصة تعتمد على AAV2 تستهدف الرئة. ساعد تحليل NGS في حساب ثلاث درجات تصنيف: درجة الإثراء بين جولات الاختيار ، ودرجة الخصوصية العامة لتحديد خصوصية الأنسجة ، وأخيرا النتيجة المجمعة14. نشر مختبر Gradinaru15 نظام التطور المستهدف AAV القائم على Cre-reالتركيب (CREATE) في نفس العام ، مما يسهل الاختيار الخاص بنوع الخلية. في هذا النظام ، تحمل مكتبة capsid مفتاحا قابلا للعكس Cre ، حيث أن إشارة polyA محاطة بموقعين loxP. ثم يتم حقن مكتبة AAV في فئران Cre ، حيث يتم عكس إشارة polyA فقط في خلايا Cre + ، مما يوفر نموذجا لربط التمهيدي PCR العكسي مع التمهيدي الأمامي داخل جين القفيصة. مكن هذا الإنقاذ PCR المحدد للغاية من تحديد AAV-PHP. البديل B الذي يمكن أن يعبر حاجز الدم في الدماغ15. تم تطوير هذا النظام بشكل أكبر إلى M-CREATE (Multiplexed-CREATE) ، حيث تم دمج NGS وتوليد المكتبة الاصطناعية في خط الأنابيب16.
تسمح نسخة محسنة من هذا النظام القائم على الحمض النووي الريبي من مختبر ماجواير17 ، iTransduce ، بالاختيار على مستوى الحمض النووي للقفيصة التي تحول الخلايا وظيفيا وتعبر عن جينومها. يشتمل الجينوم الفيروسي لمكتبة عرض الببتيد على جين Cre تحت سيطرة مروج في كل مكان وجين قفيصة تحت سيطرة مروج p41. يتم حقن المكتبة في الفئران التي تحتوي على كاسيت loxP-STOP-loxP في المنبع من tdTomato. يمكن فرز الخلايا التي تم تحويلها باستخدام متغيرات AAV التي تعبر عن الجينوم الفيروسي وبالتالي Cre express tdTomato ، وبالاقتران مع علامات الخلايا ، واختيارها17. وبالمثل ، وضع Nonnenmacher et al.18 و Tabebordbar et al.19 مكتبة جينات القفيصة تحت سيطرة المروجين الخاصين بالأنسجة. بعد الحقن في نماذج حيوانية مختلفة ، تم استخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي لعزل متغيرات القفيصة.
هناك طريقة بديلة تتمثل في استخدام الترميز الشريطي لوضع علامة على مكتبات capsid. استخدم مختبر Björklund20 هذا النهج لمكتبات قفيصة إدخال الببتيد الباركود وطور تطور متجه AAV العقلاني المشفر بالباركود (BRAVE). في بلازميد واحد ، يتم استنساخ كاسيت Rep2Cap بجوار التكرارات الطرفية المقلوبة (ITR) ، والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) - الذي يعبر عن الجينات المحورة ذات العلامات الشريطية . باستخدام مواقع loxP بين نهاية الغطاء وبداية الرمز الشريطي ، تولد إعادة التركيب Cre في المختبر جزءا صغيرا بما يكفي ل NGS ، مما يسمح بربط إدخال الببتيد بالرمز الشريطي الفريد (جدول البحث ، LUT). يتم تنفيذ إنتاج AAV باستخدام مكتبة البلازميد ويتم فحص الرموز الشريطية المعبر عنها في mRNA بعد تطبيق الجسم الحي ، مرة أخرى باستخدام NGS20. عندما تشتمل مكتبات القفيصة على متغيرات من جين القفيصة بالكامل (أي المكتبات المختلطة) ، يجب استخدام تسلسل القراءة الطويلة. استخدمت العديد من المجموعات الرموز الشريطية لوضع علامة على هذه المكتبات المتنوعة ، مما يتيح NGS بعمق قراءة أعلى. قام Kay lab21 بوضع علامة على مكتبات مختلطة شديدة التنوع مع الرموز الشريطية في اتجاه مجرى إشارة cap polyA. في الخطوة الأولى ، تم إنشاء مكتبة بلازميد مشفرة بالباركود ، وتم استنساخ مكتبة جينات القفيصة المختلطة فيها. ثم تم استخدام مزيج من MiSeq (قراءة قصيرة ، عمق قراءة أعلى) و PacBio (قراءة طويلة ، عمق قراءة أقل) NGS بالإضافة إلى تسلسل Sanger لإنشاء LUT21. في عام 2019 ، حدد Ogden وزملاؤه من مختبر Churchlab 22 ملاءمة قفيصة AAV2 لوظائف متعددة باستخدام المكتبات التي تحتوي على طفرات أحادية النقطة وعمليات إدراج وحذف في كل موضع ، مما مكن في النهاية من التصميم الموجه آليا. لتوليد المكتبة ، تم تصنيع أجزاء أصغر من جين القفيصة ، ووضع علامة عليها برمز شريطي ، وتسلسل الجيل التالي ، ثم استنساخها في جين القفيصة الكامل. تم استخدام بيانات NGS لإنشاء جدول بحث. ثم تم فحص المكتبة باستخدام الرموز الشريطية فقط وتسلسل القراءة القصيرة ، والذي بدوره يسمح بعمق قراءة أعلى22.
تم استخدام المكتبات المشفرة في الغالب لفحص مجموعة من المتغيرات المعروفة والطبيعية والهندسية بعد عدة جولات من اختيار مكتبات القفيصة أو مستقلة عن دراسة تطور القفيصة. ميزة هذه المكتبات هي فرصة فحص قفيصات متعددة ، مع تقليل أعداد الحيوانات وتقليل التباين بين الحيوانات. تم نشر الدراسات الأولى التي أدخلت هذه التكنولوجيا إلى مجال AAV منذ ما يقرب من عقد من الزمان. قام مختبر ناكاي 12 بوضع علامة على 191 طفرا مزدوجا من الألانين تغطي الأحماض الأمينية من 356 إلى 736 على VP1 من AAV9 مع زوج من الرموز الشريطية المكونة من12 نيوكليوتيد. باستخدام NGS ، تم فحص المكتبة في الجسم الحي لربط الجالاكتوز وخصائص أخرى12. حدد مارسيك وزملاؤه التوزيع الحيوي لمتغيرات AAV باستخدام تحليل مزدوج الشريط 1 بعد عام13. قارنت دراسة حديثة أجريت على الرئيسيات غير البشرية التوزيع الحيوي في الجهاز العصبي المركزي ل 29 قفيصة باستخدام طرق مختلفة للتوصيل23. نشر مختبرنا مؤخرا شاشات مكتبة AAV ذات الرموز الشريطية ل 183 متغيرا تضمنت AAVs طبيعية وهندسية. أدت هذه الشاشات على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى تحديد متغير AAV عالي الانتحاءالعضلي 24 في الفئران بالإضافة إلى الآخرين الذين يعرضون خصوصية عالية من نوع الخلية في دماغالفأر 25.
هنا ، نصف المنهجية المستخدمة في هذا العمل ونتوسع فيها لتشمل فحص مكتبات عرض الببتيد AAV. ويشمل ذلك إنشاء مكتبات عرض الببتيد AAV2 ، وطريقة PCR الرقمية للقطرات (dd-PCR) للقياس الكمي ، وأخيرا خط أنابيب NGS لتحليل متغيرات AAV ، استنادا جزئيا إلى عمل Weinmann وزملائه24. أخيرا ، يتم تقديم وصف لإنشاء مكتبات AAV المشفرة بالباركود وخط أنابيب NGS المستخدم في نفس المنشور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. AAV2 عشوائي 7-مير عرض الببتيد إعداد مكتبة
ملاحظة: لإعداد مكتبة عرض الببتيد العشوائي AAV2 ، قم بتجميع قليل النيوكليوتيدات المتدهورة كحمض نووي أحادي الشريط ، وقم بتحويله إلى حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل ، وهضمه ، وربطه بالبلازميد المستقبلة ، والكهرباء الكهربائية.
- تصميم قليل النيوكليوتيدات المتدهورة
- اطلب قليل النيوكليوتيدات المتحلل وتجنب تحيز الكودون. في قليل النوكليوتيد 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01) 7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3 '، X01 يتوافق مع 20 كودونا ، كل منها يشفر واحدا من 20 حمضا أمينيا. يمكن أن يكون W A أو T ، مما ينتج عنه الكودونات AGA أو AGT ، والتي تشفر الأحماض الأمينية أرجينين (R) أو سيرين (S).
- اطلب التمهيدي للتضخيم: 5 'CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (انظر الشكل 1 للحصول على التفاصيل). ينتج عن هذا إدراج البروتين التالي: R / S GX 7. يتم حساب التنوع النظري على النحو التالي: 1 × 2 × 207 = 2.56 × 109 متغيرات فريدة.
ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن هذا التنوع قد يكون مقيدا بكفاءة التحويل.
- توليف الخيط الثاني
- إعادة تعليق كل من oligonucleotides (oligonucleotides المتدهورة والتمهيدي التضخيم) إلى تركيز نهائي 100 μM مع العازلة TE.
- بالنسبة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد تفاعل 50 ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من كل برايمر ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، و 1.5 ميكرولتر من DMSO ، و 0.5 ميكرولتر من dNTPs (10 mM) ، و 0.5 ميكرولتر من بوليميراز البدء الساخن عالي الدقة II ، و 35.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
- انقل التفاعل إلى جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل خطوة ما قبل الحضانة لمدة 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، تليها ثلاث دورات من 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 59 درجة مئوية ، و 10 ثوان عند 72 درجة مئوية ، ثم 5 دقائق عند 72 درجة مئوية وخطوة تبريد نهائية.
- قم بتنقية التفاعل باستخدام مجموعة إزالة النوكليوتيدات وقم بإزالته في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
- تأكيد كفاءة تخليق الشريط الثاني عن طريق التحليل على محلل حيوي (انظر الشكل 2). قم بتحليل حجم ونقاء الملحق المزدوج الذي تقطعت به السبل عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من التفاعل مع شريحة الموائع الدقيقة من مجموعة كواشف DNA 1000 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحسين هذه المجموعة لقياس حجم وتركيز شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل من 25-1000 بت في الثانية.
- إعادة تعليق كل من oligonucleotides (oligonucleotides المتدهورة والتمهيدي التضخيم) إلى تركيز نهائي 100 μM مع العازلة TE.
- هضم إدراج وناقلات البلازميد
- هضم 85 ميكرولتر من الملحق المنقى مع 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x و 5 ميكرولتر من إنزيم BglI في حجم تفاعل نهائي 100 ميكرولتر (انظر الشكل 1 للحصول على التفاصيل). احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بالتنقية باستخدام مجموعة إزالة النوكليوتيدات ، وقم باستخلاص 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، وقم بالقياس الكمي باستخدام النوع "Oligo DNA" في مقياس الطيف الضوئي.
- هضم 10 ميكروغرام من بلازميد AAV (pRep2Cap2_PIS) 26 (الجينوم الفيروسي المحاط ب ITR) مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x و 10 ميكرولتر من إنزيم SfiI في حجم تفاعل نهائي 200 ميكرولتر (انظر الشكل 1 للحصول على التفاصيل). احتضان في 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بتنقية الناقل على جل أغاروز 1٪ باستخدام مجموعة استخراج الجل متبوعة بخطوة تنقية إضافية باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي. تحديد التركيز في مقياس الطيف الضوئي.
- ربط الإدراج بالمتجه
- Ligate 955 نانوغرام من ناقل البلازميد مع 45 نانوغرام من الإدراج مع 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت و 2 ميكرولتر من ligase في تفاعل ربط 20 ميكرولتر. احتضان في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها، تليها 10 دقائق في 70 درجة مئوية لتسخين لتعطيل الرباط.
- التحويل وحساب التعقيد وإعداد مكتبة البلازميد
- قم بتنقية التفاعل باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بسحب التفاعل في حوالي 80٪ من حجم البدء للمياه الخالية من النيوكلياز وتخزينها على الجليد للتحول اللاحق.
- تحويل الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية: قم بإذابة قارورة واحدة من الخلايا المختصة بالكهرباء على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم أضف 1-2 ميكرولتر من تفاعل الربط المنقى إلى 30 ميكرولتر (قارورة واحدة) من الخلايا المختصة كهربائيا واخلطها عن طريق النقر برفق. بعد ذلك ، ماصة بعناية خليط الخلية / الحمض النووي إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المبرد مسبقا بفجوة 1 مم دون إدخال فقاعات هواء.
- بالكهرباء باستخدام الإعدادات التالية: 1800 فولت و 600 Ω و 10 ميكروفولت. في غضون 10 ثوان من نبضة التثقيب الكهربائي ، أضف 970 ميكرولتر من وسائط الاسترداد الدافئة مسبقا (المزودة بالخلايا المختصة بالكهرباء) إلى الكوفيت واخلطها عن طريق الماصة. أخيرا ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي صغير واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية عند 250 دورة في الدقيقة. لتحقيق التنوع المطلوب ، قم بإجراء 10-100 تفاعل ، وبعد الحضانة ، قم بتجميع جميع ردود الفعل في أنبوب واحد.
- احسب التنوع عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من التحولات المجمعة 10 أو 100 أو 1000 ضعف في PBS ونشر 100 ميكرولتر على ألواح أجار المغذيات التي تحتوي على المضاد الحيوي المناسب (75 مجم / مل من الأمبيسلين). احتضان ألواح الآجار طوال الليل عند 37 درجة مئوية ثم عد المستعمرات على ألواح الآجار.
- احسب التنوع النظري على النحو التالي:
التنوع الأقصى النظري = 10 × عامل التخفيف × عدد المستعمرات × عدد تفاعلات التثقيب الكهربائي.
ملاحظة: لتأكيد جودة المكتبة ، قم بتسلسل 20 مستعمرة على الأقل بواسطة تسلسل سانجر. يجب أن تحتوي معظم الحيوانات المستنسخة على ملحق ، ويجب أن تكون جميعها فريدة من نوعها. - تلقيح 400-1000 مل من وسط LB الذي يحتوي على المضاد الحيوي المناسب مع بقية التحولات المجمعة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة.
- إعداد مكتبة البلازميد
- من المزرعة الليلية ، قم بإعداد مخزون الجلسرين (امزج كميات متساوية من الثقافة البكتيرية ومحلول الجلسرين بنسبة 50٪ في ماء خال من النيوكلياز وقم بتجميده عند -80 درجة مئوية) وقم بتنقية مكتبة البلازميد باستخدام مجموعة ماكسي البلازميد.
- إنتاج مكتبة AAV الفيروسية
- قم بإعداد المكتبة الفيروسية كما هو موضح سابقا27. قم بنقل مكتبة البلازميد (pRep2Cap2_PI ، إدراج الببتيد) مع بلازميد مساعد غدي إلى خلايا HEK293T باستخدام كاشف نقل مثل polyethylenimine (PEI).
- اجمع الخلايا بعد 3 أيام وأخضعها لثلاث دورات من ذوبان الجليد. تنقية المحللة الفيروسية باستخدام الطرد المركزي الفائق التدرج كلوريد السيزيوم ، تليها تبادل العازلة إلى PBS ، وأخيرا تركيز الجسيمات الفيروسية.
- معايرة متجه AAV باستخدام dd-PCR
- قم بتخفيف 2 ميكرولتر من مخزون ناقل AAV بشكل متسلسل في 198 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لإنتاج تخفيف نهائي 1:106 . تخلط جيدا في كل مرة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. إضافة عنصر تحكم واحد بدون قالب (NTC) كعنصر تحكم سالب.
ملاحظة: يمكن فحص تخفيفات إضافية أقل أو أعلى (1:105-1:107). - تحضير 20x مزيج مسبار التمهيدي. أضف 3.6 ميكرولتر من كل من البادئات 100 ميكرومتر (الأمامي والخلفي ، Rep2 ، و ITR) ، و 1 ميكرولتر لكل من مجسات 100 ميكرومتر dd-PCR (Rep2 و ITR) ، و 3.6 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
ملاحظة: يتم قياس مكتبة AAV باستخدام مجموعة مسبار أولي مستهدف بالجينات المحورة (Rep2) تم اكتشافه باستخدام مسبار يحمل علامة FAM ، ومجموعة مسبار أولي مستهدف بواسطة ITR تم اكتشافه باستخدام مسبار يحمل علامة HEX. - قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 22 ميكرولتر عن طريق إضافة 5.5 ميكرولتر من العينة ، و 1.1 ميكرولتر من مزيج مسبار التمهيدي 20x ، و 11 ميكرولتر من المزيج الفائق dd-PCR للمجسات (بدون dUTP) ، و 4.4 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. ينتج عن هذا تركيزات 900 نانومتر و 250 نانومتر للبادئات والمسبار ، على التوالي.
- قم بتوليد القطرات باستخدام مولد قطرات ، وانقل التفاعل إلى لوحة 96 بئرا ، وضع اللوحة في دورة حرارية ، وقم بتشغيل خطوة تمسخ لمدة 10 دقائق عند 94 درجة مئوية ، تليها 40 دورة من 30 ثانية عند 94 درجة مئوية و 1 دقيقة عند 58 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتعطيل البلمرة بالحرارة لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية وإضافة خطوة تبريد نهائية. اقرأ ردود الفعل في قارئ القطيرات وانتقل إلى التحليل28.
- افتح ملف لوحة dd-PCR المحفوظ باستخدام برنامج التحليل. استخدم أداة العتبة في علامة التبويب 1D Amplitude (السعة الفلورية مقابل رقم الحدث) لفصل القطرات السالبة والموجبة لكل قناة ، باستخدام NTC كدليل ، وتصدير البيانات إلى ملف csv.
- لحساب تركيز المتجه ، احسب أولا عامل التصحيح CF باستخدام الصيغة:
يحدد التليف الكيسي نسبة القطرات الموجبة لجين التحوير [الإيجابيات] الإيجابية لكل من جين التحوير و ITR [Ch1+ Ch2+] ، لضمان الكشف عن جسيمات النواقل الوظيفية. يمكن الآن حساب تركيز المتجه النهائي c باستخدام المعادلة التالية:
DF هو عامل التخفيف (1:105-1:107 كما هو محدد سابقا). تتوافق النسخ لكل تفاعل 20 ميكرولتر / بئر مع 5 ميكرولتر من العينة المخففة. العامل 1,000 يصحح المقياس إلى VG / mL (الجينوم الفيروسي / مل). يوضح الجدول 1 والشكل 3 نتيجة المعايرة بالتحليل الحجمي النموذجية.
- قم بتخفيف 2 ميكرولتر من مخزون ناقل AAV بشكل متسلسل في 198 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لإنتاج تخفيف نهائي 1:106 . تخلط جيدا في كل مرة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. إضافة عنصر تحكم واحد بدون قالب (NTC) كعنصر تحكم سالب.
- تحليل المكتبة الفيروسية AAV بواسطة NGS
- قم بتضخيم جزء إدخال الببتيد 96 نيوكليوتيد عن طريق إعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 20 ميكرولتر باستخدام مجموعة بوليميراز قراءة التدقيق (2x ؛ انظر الشكل 4). أضف 1 ميكرولتر من مخزون AAV يحتوي على 1 × 108 vg ، 0.5 ميكرولتر من كل من 100 ميكرومتر التمهيدي (NGS_forward و NGS_reverse) ، و 10 ميكرولتر من مزيج الإنزيم إلى التفاعل. اضبط الحجم النهائي على 20 ميكرولتر بالماء الخالي من النيوكلياز.
- انقل التفاعل إلى جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل خطوة تمسخ لمدة 3 دقائق عند 98 درجة مئوية ، تليها 30-35 دورة من 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 10 ثوان عند 59 درجة مئوية ، و 20 ثانية عند 72 درجة مئوية ، تليها 5 دقائق عند 72 درجة مئوية وخطوة تبريد نهائية.
- تنقية العينات باستخدام مجموعة تنقية PCR. حدد التركيز في مقياس الطيف الضوئي وقم بتشغيل هلام الأغاروز بنسبة 3٪ للتحقق من النقاء وحجم الشظية.
- قم بمعالجة شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام نظام المكتبة لمجموعة العينات منخفضة التعقيد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإعداد مكتبة NGS. قم بإجراء تفاعل الإصلاح النهائي باستخدام 30 نانوغرام من جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، متبوعا بربط المحول وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمدة 10 دورات. استخدم مجموعة تنقية PCR لتنقية التفاعلات.
- قم بمعالجة المنتجات النهائية على محلل حيوي للتحقق من الحجم والنقاء ، باستخدام مجموعة كواشف الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- حدد كمية الأمبليونات باستخدام مقياس الفلور وقم بتجميعها. قم بتحديد مكتبة NGS المجمعة النهائية مرة أخرى على مقياس الفلور (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) وتحقق من الجودة على محلل حيوي.
- قم بتسلسل مكتبات NGS في وضع أحادي الطرف (SE) ، باستخدام مجموعة مخرجات عالية 75 دورة ، بطول قراءة 84 وفهرس 1 من 8.
ملاحظة: تم إجراء تسلسل الأمثلة في هذه المقالة في منشأة GeneCore التابعة لشركة EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/). - تحليل بيانات تسلسل NGS باستخدام Python 3 و biopython. يمكن العثور على الملفات في https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (بدلا من ذلك في https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). يتكون تحليل NGS من خطوتين.
- في الخطوة الأولى ، ابحث في ملفات التسلسل عن التسلسلات التي تفي بمعايير معينة (وجود تسلسلات التعرف المحيطة بموقع الإدراج) (انظر الشكل 4 ، الخطوة 1.9.8.5.). يتم ذلك باستخدام برنامج نصي (Script # 1) وملف تكوين يوفر المعلومات المطلوبة. بمجرد تحديد التسلسل الصحيح ، يقوم البرنامج باستخراج وتخزين التسلسل في ملف الإخراج ، وهو ملف txt يحمل نفس اسم ملف التسلسل.
- الخطوة الثانية هي تحليل ملفات الإخراج. تبدأ التسلسلات في المكتبة بأي من النيوكليوتيدات الستة (AGWggc ، W = A / T) في إدراج الأحماض الأمينية التسعة. بناء على تسلسل البداية هذا ، يتم ترجمة الببتيد. يؤدي هذا إلى إنشاء ملفات الإخراج التي تحتوي على متغيرات الببتيد (PVs).
- قم بإعداد مجلدين: البرنامج النصي والبيانات. إلى مجلد البيانات ، انسخ ملفات gzip المضغوطة الناتجة عن التسلسل. إلى مجلد البرنامج النصي ، انسخ الملفات التالية ، ملف Python: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; ملف بايثون: البرنامج النصي # 2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ؛ ملف التكوين: Barcode_Script_JoVE.conf; وملف جدول البحث (LUT): Zuordnung.txt.
- قبل تشغيل البرامج النصية، قم بتحرير الملفات التالية في مجلد البرنامج النصي. افتح ملف "Zuordnung.txt" وأضف في عمودين مفصولين بعلامات جدولة ، أسماء ملفات gzip (العمود 1) ، والاسم النهائي المطلوب (العمود 2 ؛ قيم مفصولة بعلامات جدولة).
ملاحظة: تم العثور على نماذج ملفات txt في المجلد GitHub "PV_analysis_script". يتم إعداد الملفات المتوفرة في مجلد GitHub لتحليل ثلاثة بيانات نموذجية من المكتبة أعلاه: xaa.txt.gz و xab.txt.gz و xac.txt.gz. يتم توفير ملفات الإخراج أيضا. - تغيير المتغيرات التالية في ملف التكوين "Barcode_Script_JoVE.conf":
my_dir = "~/البيانات/"
filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
المتغيرات الخاصة بالتسلسل: BCV_size = 27 ، BCVاليسار = TCCAGGGCCAG ، BCVاليمين = GCCCAGG ، BCVloc = 30 ،هامش BCV = 8 ، BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC ، BCVright_revcomp = CTGGCCC ، و BCVloc_revcomp = 41 (انظر الشكل 4 للحصول على التفاصيل). - استخدم الأمر التالي لاستدعاء الكشف عن تسلسل المتغير واستخراجه:
>python3 ~ / البرنامج النصي # 1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
ملاحظة: الإخراج عبارة عن ملفات txt مع تسلسلات الحمض النووي المستخرجة وأعداد قراءاتها. يحتوي رأس هذا الملف على بيانات إحصائية (أي العدد الإجمالي للقراءات والقراءات المستخرجة). يتم نقل هذه البيانات إلى الملفات التالية. بيانات txt هذه هي ملفات الإدخال الخاصة ب Script # 2 ، حيث يتم ترجمة تسلسلات الحمض النووي وترتيبها وتحليلها. - قم بإجراء استخراج وتحليل PV باستخدام الأمر التالي:
>python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf - تحليل ملفات إخراج النص من البرنامج النصي # 2. تتم تسمية ملفات إخراج Script#2 باستخدام العمود الثاني من جدول البحث في "Zuordnung.txt" مع امتدادات تستند إلى نوع التحليل.
ملاحظة: تأكد من أن ملفات الإخراج الثلاثة تحتوي على بيانات إحصائية في الصفوف الأولى ("# من قراءات PV صالحة" و "# من قراءات PV غير صالحة" و "# من قراءات PV الفريدة") ، عمود أول يحتوي على فهرس كل تسلسل DNA من ملفات txt الإدخال (إخراج البرنامج النصي # 1) ، والأعمدة التالية: (1) "... analyzed_all.csv": "عينة:" (تسلسل الحمض النووي) ، "#" (عدد القراءات) ، "Frw أو Rev" (قراءة أمامية أو عكسية) ، و "PVs" (تسلسل الببتيد المترجم). تحتوي التسلسلات غير الصالحة على "NA" و "غير صالح" في العمودين الأخيرين. (2) "... analyzed_validSeq.csv": نفس الملف السابق ، تمت تصفيته للتسلسلات الصالحة. (3) "... analyzed_PV.csv": "PVs" (تسلسل الببتيد المترجم) و "#" (عدد القراءات) و "العد" (يتم دمج عدد frw و rev في الملفات السابقة ويتم إعطاء العدد 1 أو 2). - تصور ملفات الإخراج باستخدام البرامج المتاحة بناء على احتياجات المستخدم.
2. اختيار مكتبة عرض الببتيد العشوائي AAV2 7 مير
- استخدم مكتبة AAV بعد القياس الكمي ومراقبة الجودة (القسم 1) للتطور الموجه في نموذج الاختيار للاختيار المتكرر للمرشحين ذوي الخصائص المطلوبة (انظر الشكل 5)16،18،21.
ملاحظة: يتم استخدام هؤلاء المرشحين بعد ذلك لإنشاء مكتبة مشفرة كما هو موضح أدناه في القسم 3.
3. إعداد وتحليل مكتبة قفيصة AAV المشفرة بالباركود
ملاحظة: بعد تحديد مجموعة من قفيصات AAV التي يحتمل أن تكون محددة وفعالة في شاشة عرض الببتيد ، تحقق من وظائف تسلسلات الببتيد المحددة ومقارنتها بمجموعة من متغيرات قفيصة AAV المرجعية شائعة الاستخدام أو الموصوفة جيدا. للقيام بذلك ، يتم إدراج تسلسل capsid في بناء مساعد Rep / Cap بدون لوائح الاتصالات الدولية.
- إنتاج مكتبة AAV ذات الرمز الشريطي
- قم بإجراء إنتاج AAV المؤتلف لكل متغير قفيصة باستخدام نظام ثلاثي البلازميد ، كما هو موضح سابقا24.
ملاحظة: للتمييز بين متغيرات القفيصة المختلفة ، يحتوي بلازميد التحوير المراسل المحاط ب ITR على رمز شريطي فريد من 15 نيوكليوتيد في الطول. يقع الرمز الشريطي في 3 'UTR (المنطقة غير المترجمة) بين البروتين الفلوري الأصفر المحسن (EYFP) وإشارة polyA (انظر الشكل 6A). يتم تحفيز تعبير EYFP بواسطة مروج قوي للفيروس المضخم للخلايا (CMV) في كل مكان يوفر مستويات كافية من نسخ الحمض النووي الريبي. - تصميم الرموز الشريطية من 15 نيوكليوتيدات في الطول مع البوليمرات المتجانسة من أقل من ثلاثة نيوكليوتيدات ، ومحتوى GC من <65 ٪ 29 ، ومسافة هامينغ أكبر من أربعة نيوكليوتيدات24.
- أنتج كل قفيصة على حدة مع بلازميد جين محوري يحمل رمزا شريطيا فريدا. بهذه الطريقة ، يتم تمييز كل متغير قفيصة برمز شريطي مميز يتيح تتبعه المحدد (انظر الشكل 6 ب).
- قم بإجراء إنتاج AAV المؤتلف لكل متغير قفيصة باستخدام نظام ثلاثي البلازميد ، كما هو موضح سابقا24.
- معايرة متجه AAV باستخدام dd-PCR
- قم بإجراء معايرة AAV كما هو موضح سابقا في القسم 1.8 ، عن طريق استبدال زوج التمهيدي Rep2 بزوج التمهيدي YFP.
- تحديد كمية إنتاجات AAV الفردية وتجميع كميات متساوية من كل إنتاج لإنشاء مكتبة الباركود النهائية.
- حدد المكتبة النهائية مرة أخرى للتحقق من التركيز النهائي والجودة (انظر الشكل 7).
- مكتبة AAV المشفرة بالباركود في تطبيق vivo
- قم بتطبيق مكتبة AAV المشفرة بشكل منهجي على النظام النموذجي المختار (على سبيل المثال بشكل منهجي في الفئران24).
- اجمع الأنسجة داخل وخارج الهدف (مثل الكبد والرئة والقلب والحجاب الحاجز والعضلات الملساء والاثني عشر والبنكرياس والقولون والعضلة ذات الرأسين والمبيضين والمعدة والأذن الداخلية والكلى والشريان الأورطي البطني والشريان الأورطي الصدري والدماغ والدهون البنية والبيضاء والطحال) أو أنواع الخلايا بناء على التجربة. قم بتجميدها عند -80 درجة مئوية ، واستخرج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، وقم بتطبيق التحليل الكمي NGS ، كما هو موضح في القسم التالي.
- استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي
- استخرج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الأنسجة ذات الأهمية باستخدام مجموعة DNA / RNA Mini.
- ضع قطعة صغيرة من الأنسجة المهمة (1 مم3 ، حوالي 5 ملغ) في أنبوب تفاعل 2 مل.
- أضف 350 ميكرولتر من محلول التحلل الممزوج ب β-mercaptoethanol (1٪) وحبيبات فولاذية 5 مم إلى الأنسجة (تعامل مع العينات باستخدام β-mercaptoethanol تحت غطاء الدخان).
- تجانس الأنسجة في الأنسجةمحلل لمدة 45 ثانية عند 40 هرتز.
- أضف 10 ميكرولتر من البروتيناز K (10 مجم / مل) واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية أثناء رجه عند 400 دورة في الدقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وجمع المادة الطافية ، والمضي قدما في بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة DNA / RNA.
- قسم خطوة الغسيل إلى خطوتين مع 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل في كل خطوة. بين خطوات الغسيل هذه ، اهضم الحمض النووي المتبقي على العمود باستخدام DNase I. أضف 80 ميكرولتر من محلول DNase I ، المحضر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، على العمود واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- قم باستخلاص الحمض النووي الريبي / الحمض النووي من العمود بالماء الخالي من النيوكلياز. قم بتخزين الحمض النووي الريبي المعزول عند -80 درجة مئوية والحمض النووي المعزول عند -20 درجة مئوية.
- تخليق الحمض النووي cDNA
- إخضاع عينات الحمض النووي الريبي لجولة أخرى من معالجة DNase I لمدة 15-30 دقيقة (للإزالة الكاملة للحمض النووي الملوث من عينات الحمض النووي الريبي) قبل تفاعل النسخ العكسي. أضف 1 ميكرولتر من محلول DNase I ، و 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت (مزود مع المجموعة) ، والماء الخالي من النيوكلياز إلى الحجم النهائي من 40 ميكرولتر إلى 212 نانوغرام من الحمض النووي الريبي. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والحرارة تعطيل عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- توليف cDNA ، باستخدام 150 نانوغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قم بتضمين عناصر التحكم بدون النسخ العكسي ، لضمان عدم وجود الحمض النووي الفيروسي الملوث من العينة. يتم تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية الحمض النووي الريبي المدخل للنسخ العكسي الأمثل اعتمادا على نوع الأنسجة وكفاءة النقل المتوقعة في الأنسجة المعنية.
- تحليل المكتبة الفيروسية AAV (in-vivo) بواسطة NGS
- لتحقيق عمق تسلسل عالي بتكلفة منخفضة ، قم بإجراء NGS عبر تسلسل Illumina كما هو موضح سابقا (القسم 1.9). قم بتضخيم تسلسل الباركود ، ثم قم بربط محولات التسلسل بمكبر الصوت.
- نظرا لطول القراءة القصيرة وربط محولات التسلسل على جانبي amplicon ، عند التصميم ، تحقق من أن amplicon صغير بما يكفي لضمان وجود تسلسل الباركود داخل قراءة NGS. لتسلسل الرموز الشريطية داخل الجينومات الفيروسية والنصوص الفيروسية ، تم تصميم amplicon PCR ليكون طوله 113 نقطة أساس (انظر الشكل 8).
- قم بتضخيم المنطقة المشفرة باستخدام البادئات BC-seq للأمام و BC-seq للخلف. تحضير تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل التالي: 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة ، 10 ميكرولتر من 5x buffer ، 0.25 ميكرولتر من كل 100 ميكرومتر التمهيدي (BC-seq fw / BC-seq rv) ، و 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs. استخدم 25 نانوغرام من cDNA أو DNA / التفاعل كقالب واضبط الحجم النهائي على 50 ميكرولتر بالماء الخالي من النيوكلياز.
- قم بإعداد المزيج الرئيسي PCR تحت غطاء PCR نظيف لتجنب التلوث. استخدم ظروف ركوب الدراجات التالية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، تليها 40 دورة عند 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، وخطوة أخيرة لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
- قم بتضمين عناصر تحكم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد عدم وجود حمض نووي ملوث في المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل. بالنسبة لعينات cDNA ، قم بتضمين عناصر التحكم بدون النسخ العكسي. أخيرا ، قم بتضمين عينة مع مكتبة إدخال AAV. سيتم استخدام هذه المعلومات لإنشاء ملف Normalization_Variant.txt المستخدم في التحليل.
- تحقق من حجم جزء PCR لكل عينة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام قبل تنقية PCR. يتم تحقيق هذا الأخير إما باستخدام الخرز المغناطيسي المتاح تجاريا أو أنظمة تنقية الحمض النووي القائمة على العمود (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد مكتبة NGS باستخدام نظام المكتبة للعينات منخفضة التعقيد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، كما هو موضح سابقا في القسم 1.9.
- حدد تركيز الحمض النووي عبر مجموعة dsDNA HS وقم بتحليل جودة المكتبة كما هو موضح سابقا (القسم 1.9.6) ، متبوعا بالتجميع. تحديد المكتبة المجمعة على مقياس الفلور وتقييم الجودة على محلل حيوي.
- إجراء تسلسل NGS كما تمت مناقشته في القسم 1.9.7.
- حدد بواسطة qPCR رقم نسخة جين التحوير (الجينومات الفيروسية) وجين التدبير المنزلي لتقييم توزيع المكتبة المجمعة بين الأنسجة أو الأعضاء على الحمض النووي.
- قم بإعداد تفاعل qPCR سعة 30 ميكرولتر على النحو التالي ، لتحديد عدد نسخ EYFP (جين التحوير) و GAPDH (غليسيرالدهيد 3-فوسفات ديهيدروجيناز ، جين التدبير المنزلي):
- قم بإعداد مزيج تمهيدي / مسبار 60x ل EYFP (1.5 ميكرومتر YFP_fw ، 1.5 ميكرومتر YFP_rv ، و 0.6 ميكرومتر YFP_probe ؛ انظر جدول المواد). استخدم مزيج التمهيدي / المسبار GAPDH (انظر جدول المواد) لتحديد رقم نسخة جين مدبرة المنزل. إعداد رد الفعل على الجليد.
- قم بإعداد مزيج رئيسي PCR (15 ميكرولتر ، انظر جدول المواد) وأضف 60x مزيج التمهيدي / المسبار (0.5 ميكرولتر) لجميع العينات والمعايير (لحساب أرقام النسخ للمعايير ، استخدم الرابط التالي: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). إعداد رد الفعل على الجليد.
- انقل 15.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى صفيحة 96 بئرا وأضف 14.5 ميكرولتر من العينة (75 نانوغرام من إجمالي تركيز الحمض النووي) أو قياسي إلى البئر المعني. أغلق اللوحة المكونة من 96 بئرا بورق القصدير والدوامة والدوران لفترة وجيزة.
- نقل 10 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 384 بئر في نسخ. أغلق اللوحة بورق القصدير وقم بتدويرها عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- احتضان مزيج التفاعل في جهاز تدوير حراري باستخدام درجة حرارة أولية تبلغ 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها خطوة تنشيط أولية مدتها 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. قم بإجراء 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية والتلدين / التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة24.
- للحصول على عدد الجينومات ثنائية الصيغة الصبغية (dg) ، استخدم رقم نسخة GAPDH واقسم على اثنين. بعد ذلك ، خذ قيمة رقم نسخة EYFP واقسمها على عدد dg ، مما ينتج عنه جينومات متجهة لكل جينوم ثنائي الصيغة الصبغية (vg / dg). استخدم هذه القيمة لإنشاء ملف Normalization_Organ.txt للتحليل المعلوماتي الحيوي.
- قم بإجراء تحليل بيانات تسلسل NGS مثل Weinmann et al.24، باستخدام التعليمات البرمجية المخصصة في Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). يتضمن سير العمل الكشف عن تسلسلات الباركود التي تسترشد بالتسلسلات المرافقة وطولها وموقعها (Script # 1_BarcodeDetection.py) ، بالإضافة إلى تحليل إثراء الباركود وتوزيعه على مجموعة الأنسجة (Script # 2_BarcodeAnalysis.py).
- كشف الباركود وتعيينها لمتغيرات AAV. ضع بيانات التسلسل كملفات fastq مؤرشفة في دليل واحد (على سبيل المثال ، "Data_to_analyze"). يتم تضمين ملف بيانات التسلسل لمكتبة الإدخال في هذا الدليل ويستخدم فقط لحساب نسب القفيصة في مكتبة الإدخال.
- قبل تنفيذ البرنامج النصي ، قم بإنشاء ملفين نصيين محددين بعلامات جدولة: ملف متغيرات capsid (انظر مثال الملف "Variants.txt") مع تسلسلات الباركود المخصصة لأسماء متغيرات AAV capsid ، وملف التلوث (انظر "التلوث.txt") مع تسلسلات الباركود التي تأتي من التلوث المحتمل (الرموز الشريطية الأخرى المتوفرة في المختبر ، مما يساهم في التلوث).
- أخيرا ، قم بتحرير ملف التكوين "Barcode_Script.conf" لتضمين المعلومات التالية: المسار إلى المجلد الذي يحتوي على بيانات التسلسل (على سبيل المثال ، "Data_to_analyze") ، وتسلسل المناطق الجانبية للرموز الشريطية ، وموضعها ، وحجم النافذة لاكتشاف الباركود (على غرار 1.9.8.5 ، انظر الشكل 8).
- استخدم الأمر التالي للاتصال باكتشاف الرمز الشريطي مع المسارات المتوفرة إلى Script#1_BarcodeDetection.py وملفات التكوين:
>python3 ~ / البرنامج النصي # 1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
ملاحظة: إخراج تنفيذ Script # 1_BarcodeDetection.py هو ملفات نصية مع عدد القراءة لكل متغير capsid بالإضافة إلى إجمالي عدد القراءات المستردة من البيانات الأولية. - تقييم توزيع قفيصات AAV المشفرة بالباركود بين الأنسجة أو الأعضاء ، عن طريق تنفيذ Script # 2_BarcodeAnalysis.py مع ملفات txt التالية:
- في ملف "Zuordnung.txt" ، قم بتعيين الاسم لكل ملف txt تم الحصول عليه من تشغيل اكتشاف الباركود إلى اسم الأنسجة / الأعضاء: أسماء ملفات txt في العمود الأول وأسماء الأنسجة / الأعضاء المقابلة في التعيين المحدد بعلامات جدولة.
ملاحظة: على سبيل المثال، تحقق في المجلد "مثال" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). من الجدير بالذكر أن اسم النسيج / العضو يمكن أن يتضمن أحرف تحدد قياس cDNA أو gDNA ورقم النسخ المتماثل البيولوجي (M1 ، M2 ، إلخ). - قم بإنشاء ملف نصي "أعضاء.txt" مع قائمة أسماء الأجهزة المستهدفة وخارج الهدف ، والتي تتوافق مع الأسماء الواردة في ملف "Zuordnung.txt" (انظر مجلد "مثال": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
- قم بإنشاء ملفات نصية محددة بعلامات جدولة "Normalization_Organ.txt" و "Normalization_Variant.txt" بقيم طبيعية لجميع متغيرات capsid وجميع الأعضاء / الأنسجة. في العمود الأول من ملف "Normalization_Organ.txt" ، اكتب الأسماء المعطاة لكل عضو (كما في ملف المهمة "Zuordnung.txt") وفي العمود الثاني قيم التطبيع للأنسجة المقابلة ، التي تم إنشاؤها في القسم 3.6.11.
- املأ العمود الأول من ملف "Normalization_Variant.txt" بقائمة أسماء capsid والعمود الثاني بالقيم المعيارية لأعداد القراءة لكل قفيصة في المكتبة المجمعة (يمكن حساب التسوية بناء على ملف إخراج txt لمكتبة الإدخال الناتجة عن البرنامج النصي الأول).
- قم بتحرير ملف التكوين عن طريق تحديد المسارات الكاملة لجميع الملفات الإضافية المذكورة أعلاه. تنفيذ البرنامج النصي # 2_BarcodeAnalysis.py على النحو التالي:
>python3 / البرنامج النصي # 2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
ملاحظة: يقوم البرنامج النصي لتحليل الباركود بإخراج عدة ملفات: ملفات نصية ذات قيم تركيز نسبي (RC) لتوزيع القفيصة داخل أنسجة مختلفة بناء على خطوات التطبيع المتعددة الموضحة سابقا ، وملف جدول البيانات الذي يجمع بيانات الملف النصي في بيانات المصفوفة المدمجة. يمكن استخدام هذا الأخير للتحليل العنقودي والتصور. - تصور البيانات وإجراء تحليل عنقودي لبيانات المصفوفة من أجل التمييز بين خصائص القفيصة وتقييم أوجه التشابه بينها بناء على ملفات تعريف RC عبر الأنسجة. استخدم البرنامج النصي الإضافي PCA_heatmap_plot. R وضعت في المستودع:
> Rscript - الفانيليا ~ / PCA. R ~ / التركيز النسبي.xls
ملاحظة: يأخذ البرنامج النصي ملفات التركيز النسبي.xls كمدخلات ويولد مخططين من خريطة الحرارة الهرمية للكتلة وتحليل المكون الرئيسي (PCA). - لتعديل المؤامرات (محاور خريطة الحرارة ، المكونات الرئيسية ل PCA) أو معلمات png (اللون والحجم ووضع العلامات) ، افتح البرنامج النصي R واتبع الإرشادات الواردة في الأقسام التي تم التعليق عليها.
- في ملف "Zuordnung.txt" ، قم بتعيين الاسم لكل ملف txt تم الحصول عليه من تشغيل اكتشاف الباركود إلى اسم الأنسجة / الأعضاء: أسماء ملفات txt في العمود الأول وأسماء الأنسجة / الأعضاء المقابلة في التعيين المحدد بعلامات جدولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV2. كخطوة أولى نحو اختيار AAVs الهندسية ، يتم وصف إنشاء مكتبة البلازميد. يتم إنتاج إدراج الببتيد باستخدام الاشعال المتحللة. إن تقليل اتحاد الكودونات في تلك من 64 إلى 20 له مزايا القضاء على كودونات التوقف وتسهيل تحليل NGS ، عن طريق تقليل تنوع المكتبة على الحمض النووي ولكن ليس مستوى البروتين. يتم شراء ملحق قليل النوكليوتيد كحمض نووي أحادي الشريط (الشكل 1) ، والذي يتم تحويله إلى حمض نووي مزدوج الشريط باستخدام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم التحكم في جودة هذا التفاعل في محلل حيوي. كما هو موضح في الشكل 2 ، أنتجت ثلاث دورات نطاقا أقوى ، مقارنة ب 10 أو 30 دورة. ثم يتم هضم الإدخال باستخدام BglI لتوليد نتوءات ثلاثية النوكليوتيدات. يمكن أن تكون النوكليوتيدات المجاورة للتسلسل المتدلي للإدراج المزدوج الذي تقطعت به السبل A أو T (W هو رمز الغموض ل A أو T) ، والذي يقع في الموضع الثالث من الكودون الذي يشفر الأرجينين (R) أو السيرين (S). يحتوي المتجه (pRep2Cap2_PIS) على طفرة إزاحة الإطار في موقع إدخال الببتيد الذي يمنع إنتاج القفيصة في حالة عدم وجود إدخال ، بسبب إنشاء كودون توقف بعد وقت قصير من موقع الإدخال. يولد هضم SfiI لهذا البلازميد ثلاثة نيوكليوتيدات متدلية تتطابق مع الأجزاء المتدلية المتولدة في إدراج قليل النوكليوتيد المشفر للببتيد. يجب إجراء الربط في ظل الظروف المثلى لزيادة تعقيد مكتبة البلازميد. تحقيقا لهذه الغاية ، من أجل التحول ، تم إجراء التثقيب الكهربائي باستخدام البكتيريا المتاحة تجاريا بكفاءة عالية.
يتم حساب تنوع مكتبة البلازميد بناء على عدد المستعمرات ، والذي يكون عادة حوالي 1 × 108 لهذا النوع من المكتبات. يتوافق العدد الإجمالي للمستعمرات مع أقصى تنوع محتمل للمكتبة في تحليل NGS ، كما تمت مناقشته لاحقا. ثم يتم استخدام مكتبة البلازميد لإنشاء مكتبة AAV ، والتي لم يتم وصفها بالتفصيل هنا ولكن في مكان آخر27.
تم إجراء القياس الكمي لهذه المكتبة باستخدام dd-PCR. عادة ، يتم تحديد منطقتين كميا ، جين مندوب AAV2 داخل الجينوم الفيروسي و ITR (انظر الشكل 3 والجدول 1). كما هو موضح في الجدول 1 ، من القطرات الإيجابية للجينوم الفيروسي ، 99.2٪ إيجابية أيضا ل ITR (Ch1 + Ch2+) ، وهي مراقبة جودة لمكتبة AAV وتشير إلى أن قفيصة AAV تحتوي على جينومات فيروسية كاملة. للحصول على تركيز في vg / mL ، يتم حساب نسبة القطرات الموجبة المزدوجة إلى الإيجابيات واستخدامها للحصول على العدد الصحيح من النسخ قبل التضخيم بواسطة عامل التخفيف.
ثم يتم تقييم جودة مكتبة AAV من خلال تحليل NGS ، بدءا من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المناسبة. بعد ذلك ، تتم معالجة منتج PCR باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا ، والتي تضيف محولات تحتوي على مؤشر إلى منتج PCR. يتم تسلسل منتجات NGS ، ويتم تحليل الملفات باستخدام Python. يتم توفير ثلاثة بيانات عينة من مكتبة عرض الببتيد AAV2. يتم البحث عن كل تسلسل في ملف إدخال Script # 1 (قائمة تسلسلات جميع نسخ PCR لمقطع الحمض النووي المضخم في العينة) معلوماتيا حيويا عن تسلسلات BCVاليسرى و BCVاليمنى ، أو تسلسلاتright_comp left_comp BCV و BCV. إذا تم تحديد أي من المجموعتين ، يتم استخراج التسلسل المضمن وإضافته إلى ملف الإخراج (انظر الشكل 4). يوفر ناتج كلا النصين بيانات إحصائية تتعلق بإعداد مكتبة NGS. في جميع المجموعات الثلاث ، مثلت القراءات المستخرجة ، بناء على تسلسلات التوقيع الخاصة بالمكتبة ، حوالي 94٪ من إجمالي القراءات ، مما يشير إلى جودة جيدة. يوفر إخراج Script # 2 مزيدا من البيانات الإحصائية ، وتنتج ترجمة تسلسل الحمض النووي المستخرج بيانات إضافية لمراقبة الجودة. "# من قراءات PV غير صالحة" (أي التسلسلات التي تفتقر إلى النيوكليوتيدات الستة المستخدمة لبدء الترجمة داخل السيليكو وتشفير المخلفات RG أو SG) أقل من 1٪ من القراءات المستردة ، مما يؤكد جودة تسلسل جيدة. توفر مخرجات النص الثاني (أي ترجمة وترتيب تسلسلات الحمض النووي المستخرجة) معلومات إضافية ، مثل عدد القراءات لكل متغير ببتيد أو عدد تسلسلات الحمض النووي التي أدت إلى ظهور كل متغير ببتيد. من بين الملفات ، تحتوي الملفات التي تنتهي ب "analyzed_PVs" على قراءات الحمض النووي الصالحة فقط ، ويتم إجراء التحليل على مستوى تسلسل الببتيد. من بين القراءات الصحيحة ، أكثر من 99٪ فريدة من نوعها ، مما يشير إلى أن المكتبة متوازنة ، والتنوع الداخلي مرتفع.
اختيار مكتبة عرض الببتيد AAV2. يمكن بعد ذلك استخدام هذه المكتبة للاختيار في الجسم الحي أو في المختبر . لم يتم تضمين هذا في هذا البروتوكول ، ولكن تم توفير مخطط تفصيلي في الشكل 5. باختصار ، للاختيار في الجسم الحي ، يتم جمع الأنسجة بعد أسبوع واحد من الحقن الجهازي ل 1 × 1012 vg / mouse ويتم عزل الحمض النووي. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الإنقاذي على جزء أكبر من جين الغطاء ، ويتم استنساخ المنتج في ناقل البلازميد باستخدام مواقع تقييد مختلفة ولكن بروتوكول مشابه لما هو موصوف هنا ، ويتم إعداد مكتبات AAV الجولة 1. لتحليل NGS ، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي المعزول أو مكتبات AAV. بعد الاختيار ، تنخفض النسبة المئوية لل PVs الفريدة في المكتبة عادة وفقا لضغط الاختيار. اعتمادا على المشروع ، يمكن الانتهاء من الاختيار بمجرد تحديد عدد كاف من PVs المهيمنة بواسطة NGS.
اختيار وتحليل مكتبة الباركود. تم وصف البيانات من مكتبة AAV المشفرة التي تضم 82 قفيصة سابقا24. يظهر القياس الكمي dd-PCR لجسيمات AAV (انظر الشكل 7 والجدول 1) أن 94٪ من القفيصات الموجبة لجين التحوير تحتوي أيضا على ITR ، مما يدل على وجود جينوم كامل. هذا أقل من مكتبة النوع البري الموصوفة أعلاه ، ولكنه لا يزال يشير إلى جودة جيدة ل AAVs المؤتلفة ، مع الأخذ في الاعتبار أنها عادة ما تكون أقل كفاءة. بعد حقن المكتبة المجمعة في الحيوانات ، يتم جمع الأنسجة ، ويتم عزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي. ثم يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ل NGS وكذلك إعداد مكتبة NGS وتسلسلها كما هو موضح أعلاه وسابقا24. لحساب vg / dg ، يتم إجراء qPCR ، وفي بيانات العينة المقدمة ، تتراوح القيم من 0.1-4. كما هو معتاد لتوصيل AAV الجهازي ، يحتوي الكبد على أكثر من 10 vg / dg.
كجزء من خط أنابيب التحليل ، يتم تنفيذ خطوات التطبيع على مستويات مختلفة. في مكتبة الإدخال المجمعة ، لا يتم تمثيل متغيرات capsid عادة بالتساوي. لذلك ، يتم استخدام تحليل NGS لمكتبة الإدخال لإنشاء ملف تطبيع ، والذي يصحح وفرة كل متغير قفيصة في الأنسجة / الأعضاء النهائية بناء على وفرة متغير القفيصة هذا في مكتبة الإدخال. يتم إجراء التوزيع البيولوجي لأعضاء المكتبة المجمعة بواسطة NGS على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي. ينتج عن هذا التطبيع لمكتبة المدخلات حاصل القسمة (P * αβ) للنسبة داخل الأنسجة / الأعضاء (P αβ) إلى النسبة الموجودة في مكتبة الإدخال (La). يمكن العثور على هذه الحسابات في ملف "variant_comparison.txt". ثم يتم ضرب هذا الحاصل في قيم vg / dg من ملف "Normalization_organ.txt" للحصول على القيمة Β αβ ، ويتم حساب نسب قيم Βαβ لنسيج واحد أو للجميع. تعكس نسبة قيمة Β αβ لكل متغير داخل نسيج واحد (Vαβ) انتشار هذا المتغير داخل هذا النسيج ("organ_comparison.txt"). في المقابل ، تشير نسبة قيمة Β αβ لكل متغير في جميع الأنسجة (Tαβ) إلى انتشار هذا المتغير داخل الجسم كله ("النسبية .xls"). تعكس هاتان النسبتان التوزيع الحيوي داخل الأنسجة وفيما بينها لكل متغير. يمكن استخدام كل هذه الملفات لتصورات مختلفة لكفاءة القفيصة والخصوصية24. على سبيل المثال ، باستخدام الجدول النهائي (الموجود في "التصورات النسبية.xls") ، يتم تقديم تحليل المكون الرئيسي والتجميع الهرمي في الشكل 9.
يظهر تطبيع المكتبة المجمعة من تسلسل NGS أن كل قفيصة لها نسبة متوسطة تبلغ 0.012 ، والتي تتطابق أيضا مع النسبة النظرية لكل من القفيصات ال 82 وتقترح مكتبة مجمعة متوازنة بشكل جيد تبلغ 0.012 (1/82). يعكس ملف "التركيز النسبي.xls" الناتج عن خط أنابيب المعلوماتية الحيوية التوزيع الحيوي للقفيصة بين الأنسجة ، كما هو موضح في الشكل 9. تظهر خريطة التمثيل اللوني قيم التركيز النسبي على مقياس log2 لكل قفيصة من المكتبة المجمعة مجمعة بشكل هرمي وفقا لملف التوزيع الحيوي للأنسجة. يسمح تحليل المكون الرئيسي بتمييز مجموعات متغيرات قفيصة AAV ذات خصائص التوزيع الحيوي المماثلة ويسلط الضوء أيضا على القفيصات النائية ذات الأنماط الفريدة للتوزيع الحيوي بين الأنسجة. يعكس الفرعان الرئيسيان للتسلسل الهرمي للخريطة الحرارية الاختلاف في كفاءة النقل لمتغيرات القفيصة. يشمل الفرع الأيسر الذي يحتوي على غالبية متغيرات القفيصة جميع القفيصات ، والتي تظهر قيمة عالية للتركيز النسبي عبر غالبية الأنسجة. بصرف النظر عن خصوصية الكبد العالية بشكل لافت للنظر ، أظهرت ثلاثة قفيصات أخرى (Var60 و Var13 و Var63) خصوصية في الحجاب الحاجز (Di) والعضلات الهيكلية (SM) والعضلة ذات الرأسين (BlC) وفي الدماغ (B). يتضمن الفرع الأيمن من التجميع الهرمي متغيرات القفيصة ذات كفاءة النقل المنخفضة بشكل عام ، والتي يتم نطقها في الاثني عشر (Du) والبنكرياس (P). يشكل PCA للمجموعة الفرعية الأصلية مجموعة من متغيرات القفيصة ذات خصوصية الكبد العالية (Var 64 ، 78 ، 65 ، 55 ، 56) ويحدد قفيصة Var60 مع انتحاء عضلي متميز.
الشكل 1: نظرة عامة على استراتيجية الاستنساخ لمكتبة عرض الببتيد العشوائية AAV2 7-mer.
يحيط قليل النوكليوتيد مع تسلسل إدخال الببتيد العشوائي 7-mer بتتابعات تحتوي على موقع الهضم BglI وموقع ربط لتفاعل التضخيم. يحتوي pRep2Cap2_PIS المتجه على مواقع SfiI. النتوءات الناتجة عن هضم BglI و SflI متكاملة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مراقبة جودة المحلل الحيوي لتوليف حبلا قليل النوكليوتيد الثاني.
يتم تأكيد تخليق الشريط الثاني من oligonucleotides المتدهورة من خلال التحليل على محلل حيوي. تتم مقارنة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع ثلاث و 10 و 30 دورة من التضخيم ، مما يدل على أن الأكثر كفاءة هي دورات التضخيم الثلاث. (أ) بيانات المحلل الحيوي الممثلة في صورة هلامية. (ب-د) أطوال الشظايا المرسومة (في bp ، المحور x) مقابل وحدات التألق (FU ، المحور y) ، مقارنة بالقمم القياسية ، المرئية عند 15 و 1500 bp. تشير الأسهم الحمراء إلى قليل النيوكليوتيدات المزدوج الذين تقطعت بهم السبل. لاحظ أن أعلى قيمة FU ، والتي تمثل أعلى تركيز للحمض النووي ، من oligonucleotides مزدوجة الشريط لوحظت بعد ثلاث دورات من التضخيم (الأسهم الحمراء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: معايرة مكتبة عرض الببتيد AAV2 باستخدام dd-PCR.
(أ) الكشف عن قطرات إيجابية rep2 في القناة 1 (FAM ، القناة 1) للتحكم في المياه غير القالب وعينة فيروس مخففة 1:106 . (ب) الكشف عن القطرات الموجبة للوائح الاتصالات الدولية في القناة 2 (سداسية عشرية، القناة 2). (ج) الكشف عن القطرات الموجبة لكل من rep2 و ITR (مظللة باللون البرتقالي). تشير الخطوط الأرجوانية إلى عتبات للكشف عن القطرات الإيجابية مقابل السلبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نظرة عامة على جزء الحمض النووي المستخدم في NGS وإعدادات تحليل الثعبان.
يضخم NGS PCR منطقة 96 نيوكليوتيد. يتم استخدام جزء PCR لإنشاء مكتبة NGS. لتحليل المعلوماتية الحيوية ، يجب إعطاء تسلسلات التعرف يمينا ويسارا لموقع الإدخال لكلا الشريطين ، وكذلك المسافة من بداية جزء الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الاختيار التكراري لمكتبات AAV في الجسم الحي.
يتم حقن الفئران بمكتبة AAV. يتم جمع الأنسجة المستهدفة داخل وخارج الأنسجة بعد 1 أسبوع وتخضع ل NGS والتحليل. يستخدم النسيج المستهدف لإنقاذ جين القفيصة ، الذي يتم استنساخه في الناقل الأصلي. يتم إنتاج مكتبة AAV المحددة واستخدامها لتكرار دورة التحديد المذكورة أعلاه. تم إنشاء هذا الرقم مع BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نظرة عامة على إنشاء مكتبة AAV المشفرة بالباركود.
(أ) تمثيل بياني لجينوم AAV مكتمل ذاتيا يحمل جين تحوير EYFP مدفوع بمحفز CMV محاط بلوائح الاتصالات الدولية. يحتوي UTR مقاس 3 بوصات على رمز شريطي بطول 15 نيوكليوتيد (BC) يقع عند 3 'UTR بين eyfp وإشارة polyadenylation لهرمون النمو البقري (BGH). يتيح BC تتبع القفيصة على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبوزي المرسال. (ب) أثناء إنتاج AAV ، يتم تعبئة جينوم فريد من نوعه بواسطة متغير وحيد من جين الغطاء ، مما يسهل تحديد القفيصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: معايرة مكتبة AAV ذات الرمز الشريطي باستخدام dd-PCR.
(أ) الكشف عن قطرات موجبة ل YFP في القناة 1 (FAM ، القناة 1) للتحكم في المياه غير النموذجية وعينة ناقلات مخففة 1:106 . (ب) الكشف عن القطرات الموجبة للوائح الاتصالات الدولية في القناة 2 (سداسية عشرية، القناة 2). (ج) الكشف عن القطرات الموجبة لكل من rep2 و ITR (مظللة باللون البرتقالي). تشير الخطوط الأرجوانية إلى عتبات للكشف عن القطرات الإيجابية مقابل السلبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: نظرة عامة على جزء الحمض النووي المستخدم في NGS وإعدادات تحليل بايثون.
يضخم NGS PCR منطقة 113 نيوكليوتيد. بالنسبة للتحليل المعلوماتي الحيوي ، يجب إعطاء تسلسلات التعرف يمينا ويسارا للرمز الشريطي لكلا الخيطين ، وكذلك المسافة من بداية جزء الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: تحليل المكون الرئيسي (PCA) وتحليل الكتلة الهرمية.
(أ) يسمح PCA لقيم التركيز النسبي ل 82 قفيصة عبر جميع الأنسجة بتحديد مجموعات من متغيرات القفيصة ذات الخصائص والمتغيرات المتشابهة ذات أنماط التنبيغ الفريدة. (ب) لفصل المجموعة المكتظة بالسكان بشكل أفضل ، تم استبعاد سجلات المتغيرات الفريدة النائية من المصفوفة وتكرر تحليل PCA. (ج) يسمح التحليل العنقودي الهرمي بالتقييم البصري لملفات تعريف التنبيغ المتغير عبر الأنسجة كمخطط لخريطة الحرارة (Li = الكبد ، Lu = الرئة ، FatB = الدهون البنية ، H = القلب ، Di = الحجاب الحاجز ، SM = العضلات الملساء ، Du = الاثني عشر ، P = البنكرياس ، C = القولون ، BIC = العضلة ذات الرأسين ، O = المبايض ، St = المعدة ، I = الأذن الداخلية ، K = الكلى ، Aa = الشريان الأورطي البطني ، في = الشريان الأورطي الصدري ، B = الدماغ ، FatW = الدهون البيضاء ، و S = الطحال). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عينة | هدف | نسخ/بئر 20 ميكرولتر | ايجابيات | Ch1+ Ch2+ | انظر | نسخ مصححة | مدافع | VG / مل |
| H2O | ريب2 | 28 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1.00E+06 | 5.60E+09 |
| AAV2lib | ريب2 | 90600 | 16396 | 16266 | 0.99 | 89882 | 1.00E+06 | 1.80E+13 |
| H2O | يفب | 4 | 3 | 2 | 0.67 | 3 | 1.00E+06 | 8.00E+08 |
| BCAAVlib | يفب | 34680 | 13229 | 12452 | 0.94 | 32643 | 1.00E+06 | 6.53E+12 |
الجدول 1: نتائج المعايرة بالتحليل الحجمي لمكتبة عرض الببتيد AAV2 ("AAV2lib") ومكتبة متجهات EYFP المشفرة بالباركود ("BCAAVlib").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول ، يتم تحديد الخطوات اللازمة لعرض الببتيد هندسة قفيصة AAV ولفحص مكتبة AAV المشفرة بالباركود ، وكذلك للتحليل المعلوماتي الحيوي لتكوين المكتبة وأداء القفيصة. يركز هذا البروتوكول على الخطوات التي تسهل التحليل المعلوماتي الحيوي لهذه الأنواع من المكتبات ، لأن معظم مختبرات علم الفيروسات متخلفة في مهارات البرمجة لتتناسب مع كفاءتها في تقنيات البيولوجيا الجزيئية. تم وصف كلا النوعين من المكتبات على نطاق واسع في الأدبيات ، كما هو موضح في المقدمة ، ويمكن استنساخها بسهولة نسبية.
كخطوة أولى ، تم تحديد تصميم مكتبة عرض الببتيد في الموضع 588 في المنطقة المتغيرة الثامنة من AAV2. ويمكن تكييف هذا التصميم (AAV2_Peptide'2' في المنشور السابق 26) وطريقة الاستنساخ الموصوفة بسهولة مع الأنماط المصلية الأخرى استنادا إلى المعلومات المقدمة في منشور حديث26. الخطوة الحاسمة في خط أنابيب الاستنساخ هي كفاءة الربط / التحويل (باستخدام قطع ~ 1 × 108 مستعمرات). يوصى بإضافة تفاعل ربط واحد مع متجه فقط. هذا يساعد في تحديد النسبة المئوية للمستعمرات البكتيرية مع إدراج ، والتي يجب أن تكون أعلى من 80 ٪. إن الكفاءة الأقل من المتوقع ، أي عدد من المستعمرات البكتيرية (حساب النسبة المئوية مع الإدخال) أقل من التنوع النظري لإدخالات قليل النوكليوتيد ، ستؤثر سلبا على متغيرات الوفرة المنخفضة. تشمل العديد من التحسينات أوقات هضم أطول وخطوات تنظيف لتفاعل الناقل أو الربط ، باستخدام مجموعات تجارية.
والخطوة التالية هي مراقبة جودة المكتبة المتغيرة باستخدام NGS لجزء تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يشمل موقع إدخال قليل النوكليوتيدات. يتم تنفيذ NGS باستخدام نظام تسلسل Illumina. هناك العديد من البدائل ، حيث يمكن تقديم منتجات PCR مباشرة دون إعداد مكتبة NGS مسبقا. هذا أكثر ملاءمة للتجارب الصغيرة أو عندما لا يكون عمق القراءة العالي مطلوبا. ويشمل البروتوكول المبلغ عنه هنا إعداد مكتبة NGS، بما في ذلك إضافة محولات مع فهارس Illumina إلى منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل، باستخدام مجموعة متاحة تجاريا. أحد القيود الشائعة فيما يتعلق ب NGS هو أن شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه ذات تنوع منخفض ، لأن التسلسلات المحيطة بموقع الإدخال عالي التنوع متطابقة في جميع المتغيرات ، مما يقلل بدوره من كفاءة التسلسل. لمعالجة هذا الأمر ، تضيف هذه المجموعة أي عدد من اثنين إلى ثمانية نيوكليوتيدات عشوائية بين جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل والمحول. بدلا من ذلك ، يجب رفع العينة باستخدام PhiX. يتم وصف خط أنابيب Python التفصيلي لتحليل مكتبات عرض الببتيد AAV2. كقالب ، يتم توفير ملفات نموذجية مستخرجة من ملف NGS الأصلي لمكتبة عرض الببتيد AAV2. يمكن تكييف هذا مع الأنماط المصلية الأخرى مع التعليمات المقدمة. يمكن استخدام ملفات الإخراج لهذا التحليل في تحليل المصب ، مثل مقارنة مكتبة البلازميد و AAV 30 ، أو تكوين الأحماض الأمينية في كل موضع30 ، أو حساب درجة الإثراء بين المكتبات بعد جولات الاختيار 14 ، أو إنشاء شعارات التسلسل أو الرسوم البيانية19. بقدر ما يتعلق الأمر بمكتبة الإدخال ، فإن وجود نسبة عالية من المتغيرات الفريدة أمر مرغوب فيه. ومع ذلك ، فإن بعض المتغيرات لا تنتج مثل غيرها ، مما قد يؤدي إلى توزيعات منحرفة بعد الإنتاج. يمكن أن يعزى التنوع المتغير المنخفض ، أو بعبارة أخرى وجود المتغيرات السائدة ، إلى انخفاض جودة إدراج قليل النوكليوتيد أو ارتفاع عدد دورات تخليق الشريط الثاني (الخطوة 1.2). علاوة على ذلك ، يمكن أن يتأثر تكوين الأحماض الأمينية من الإنتاج. يجب أن يكون لكل حمض أميني تردد 5.00٪. إذا كان التوزيع يختلف اختلافا كبيرا عن هذه القيمة ، يقترح إجراء نفس التحليل على مكتبة البلازميد لتحديد التحيزات المحتملة30.
نظرا لأن بروتوكولات إنشاء مكتبة AAV وجولات الاختيار اللاحقة في نماذج حيوانية ومختبرية مختلفة قد تم وصفها على نطاق واسع في منشورات وبروتوكولات متعددة27،30،31،32 ، هنا يتم وصف تحليل المكتبات المشفرة بالباركود للمتغيرات والمعايير الهندسية المختارة. وتجدر الإشارة إلى أن استنساخ المكتبة بعد كل جولة من الاختيار يمكن إجراؤه عن طريق عزل تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين الغطاء ، كما هو مذكور في قسمي البروتوكول والنتائج. يمكن أن تؤدي الجولات المكثفة من الانتقاء وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تراكم الطفرات أو توقف الكودونات ، والتي يمكن ملاحظتها بواسطة NGS. بدلا من ذلك ، يمكن اختيار المتغيرات المخصبة من بيانات NGS ، وترتيب oligonucleotides واستنساخها بالطريقة التي تم وصفها بها لتوليد مكتبة عرض الببتيد16,18. أخيرا ، يحتوي البروتوكول على وصف موجز لاختيار المكتبات على مستوى الحمض النووي ، بعد 1 أسبوع من الحقن الجهازي. تعد الاختيارات المستندة إلى الحمض النووي الريبي أكثر صرامة ، لأنها تختار أيضا المتغيرات التي تمر عبر مسارات الدخول المعدية ، وإن كانت أكثر تحديا من الناحية الفنية. تجدر الإشارة إلى أن الاختيارات القائمة على الحمض النووي الريبي أو الجينات المحورة (أي Cre) تتطلب مدة أطول في الجسم الحي تبلغ حوالي 3-4 أسابيع 15،16،17،18،19،33. بالنسبة للاختيارات القائمة على الحمض النووي على وجه الخصوص ، من الأهمية بمكان التحقق من صحة المتغيرات المحددة مقابل الأنماط المصلية الطبيعية والهندسية المعروفة على كل من مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي باستخدام مكتبة AAV المشفرة بالباركود.
يصف الجزء الثاني من البروتوكول إنشاء وفحص مكتبات AAV المشفرة باستخدام خط الأنابيب الذي تم تطويره مسبقا24. يحتوي كل قفيصة AAV في التجمع على نفس الجينات المحورة (eyfp تحت سيطرة مروج CMV) مع رمز شريطي مميز بين eyfp وإشارة polyA. يمكن العثور على الرموز الشريطية المستخدمة في هذه المكتبة في المنشور السابق24. استند التصميم إلى المبدأ الأساسي لمسافة Hamming (أي أن تسلسل الباركود يجب أن يكون مختلفا بشكل كاف) ، بحيث لا تؤدي أخطاء التسلسل إلى تعيينات الباركود الخاطئة. كما هو موضح في Lyons etal 26 ، فإن فرصة حدوث خطأين في القراءات بين 25-100 نيوكليوتيدات منخفضة جدا. تعني مسافة Hamming البالغة 4 أنه ستكون هناك حاجة إلى خطأين في التسلسل لتعيين قراءة كرمز شريطي خاطئ. سيتم تجاهل القراءات التي تحتوي على خطأ واحد أثناء التحليل ، وفي هذه الحالة يتم تصنيفها على أنها "قراءات ذات متغيرات غير معروفة". في منشور ذي صلة ، يتم توفير إرشادات ونص Python لإنشاء رموز شريطية29 يمكن استخدامها في خط الأنابيب. لتحديد الرموز الشريطية المفيدة ، يمكن استخدام رمز شائع آخر لتصحيح الأخطاء كما هو موضح في المنشور الذي نشره Buschmann و Bystrykh34 ، وهو مسافة Levenshtein. توفر هذه المجموعة أيضا حزمة برامج للغة البرمجة R35.
بعد إنتاج AAV ، يمكن استخدام مكتبة AAV المجمعة ذات الرمز الشريطي لدراسات التوزيع الحيوي في نماذج مختلفة. تحدد هذه الدراسة خط الأنابيب باستخدام مكتبة 82 متغيرا من المنشور السابق24 وتوفر بيانات عينة للممارسة. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول بناء على احتياجات كل مستخدم. يعتمد تحليل التوزيع الحيوي على جمع أنسجة أو خلايا مختلفة داخل وخارج الهدف ، واستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي منها ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة الباركود لتسلسل NGS ، وقياس vg / dg على مستوى الحمض النووي. بالنسبة للحمض النووي الريبوزي (RNA) ، سيكون من الأفضل حساب النسبة إلى عدد نسخ mRNA للجين المرجعي. يجب التعبير عن الجين المرجعي المفضل بالمثل عبر الأنسجة المختلفة 36 ، مثل RPP30 (Ribonuclease P / MRP Subunit P30) 37 أو Hprt (هيبوكسانثين فوسفوريبوسيل ترانسفيراز 1)36. ومع ذلك ، هذا أمر شاق ، لذلك قد يحتاج المرء إلى استخدام العديد من الجينات المرجعية في نفس الوقت لتطبيع بيانات الحمض النووي الريبي. لهذا السبب ، يمكن إكمال التطبيع إلى dg على مستوى الحمض النووي ، والذي يرتبط تقريبا بعدد الخلايا. يشير هذا أيضا إلى استخدام qPCR لهذا الحساب ، كما هو موضح سابقا24 ، وإن كان dd-PCR أكثر دقة وبالتالي فهو مفضل للاستخدام في المستقبل ، لا سيما بالنظر إلى التقدم المحرز في هذا المجال37. أخيرا وليس آخرا ، تعد تحسينات البيولوجيا الجزيئية الأساسية بالغة الأهمية للمنهجية الموضحة هنا. يجب تحسين تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجنب إدخال التحيزات على توزيع المكتبات. يجب تصميم مجسات dd-PCR لتشمل المناطق الداخلية للحمض النووي والمناطق بين exonic للحمض النووي الريبي. تعتبر الممارسة المختبرية الجيدة ، مثل التقسيم المادي للخطوات ، وخاصة إنتاج الحمض النووي و AAV من إعداد المكتبة ، والتطهير المناسب ذات أهمية قصوى لتجنب التضخيم الخاطئ وتلوث المكتبة.
والجدير بالذكر أن استخدام مكتبات عرض الببتيد والتشفير الشريطي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي المتجه لاختيار القفيصات المهندسة ذات الانتحاءات الجديدة أو غيرها من الخصائص ذات الصلة سريريا لا يمثل سوى مثالين على تقنيات تطور قفيصة AAV الموجهة. تشترك جميعها في أنها تأتي مع قيود وتتطلب مزيدا من التحسين لتحقيق إمكاناتها الكاملة. على سبيل المثال ، مجرد إدخال الببتيد يترك نسبة كبيرة (~ 99٪) من تسلسل القفيصة الأساسية دون تغيير ، والتي قد تحتاج خصائصها بما في ذلك التفاعل مع الأجسام المضادة المضادة المضادة ل AAV إلى مزيد من التعديل قبل التطبيق البشري38. علاوة على ذلك ، فإن التنوع الفعلي لعرض الببتيد أو المكتبات الأخرى عادة ما يكون أقل من التنوع النظري ، ويرجع ذلك ، على سبيل المثال ، إلى القيود التقنية أثناء الاستنساخ أو التحول البكتيري31. بشكل عام ، هناك أيضا نقاش نشط حول الأهمية الانتقالية للتطور الموجه في النماذج الحيوانية أو في المختبر ، والتي تعززها الأدلة المتزايدة على الأداء المحتمل للأنواع أو حتى الإجهاد الخاص ب قفيصات AAVالاصطناعية 38. ومع ذلك، هناك أمل كبير في التغلب على العديد من هذه القيود أو جميعها وأن يتم توسيع ترسانة التكنولوجيات الحالية لتشمل مجموعة أكبر من نماذج الأمراض وتصبح في متناول معظم مجموعات البحث. في هذا الصدد ، هناك تطور حديث مشجع بشكل خاص هو استخدام مكتبات AAV المشفرة بالباركود مثل تلك التي تم الإبلاغ عنها هنا للتحقق من صحة قفيصات مختارة لم تعد فقط على العضو ، ولكن الآن أيضا على المستوى الخلوي ، والتي يمكن تحقيقها باستخدام تقنيات جديدة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (sc)39. ستسهل البروتوكولات المقدمة هنا إنشاء تقنيات تطور AAV على نطاق أوسع وبالتالي تسريع تطوير قفيصات جديدة مصممة خصيصا لتلبية احتياجات عدد كبير من مجموعات البحث والمرضى من البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.G. هو أحد مؤسسي شركة AaviGen GmbH. D.G. و K.R. مخترعون في طلب براءة اختراع معلق يتعلق بتوليد متغيرات قفيصة AAV المتهربة من المناعة. بقية المؤلفين ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تقدر D.G. تقديرا كبيرا الدعم المقدم من مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) من خلال مراكز البحوث التعاونية DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) و TRR179 (Projektnummer 272983813) ، وكذلك من قبل المركز الألماني لأبحاث العدوى (DZIF، BMBF; TTU-فيروس نقص المناعة البشرية 04.819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | - | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | - | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
References
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
- Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
- Nature Biotechnology.
- Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756 (2022).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
- Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
- Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075 (2014).
- Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041 (2015).
- Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
- Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
- Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
- Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
- Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
- Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
- Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
- Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
- Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
- Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).
- Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
- Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
- Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).
- Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
- Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).
- Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
- Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
- Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
- Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
- Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).
- Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
- Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).
- Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
- Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
- Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).
