Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV)

Summary

Generación de la biblioteca de visualización de péptidos AAV y posterior validación a través del código de barras de candidatos con propiedades novedosas para la creación de AAV de próxima generación.

Abstract

Los vectores de entrega de genes derivados del virus adenoasociado (AAV) son una de las herramientas más prometedoras para el tratamiento de enfermedades genéticas, evidenciada por el fomento de datos clínicos y la aprobación de varias terapias génicas AAV. Dos razones principales para el éxito de los vectores AAV son (i) el aislamiento previo de varios serotipos virales naturales con propiedades distintas, y (ii) el posterior establecimiento de tecnologías poderosas para su ingeniería molecular y reutilización en alto rendimiento. Impulsando aún más el potencial de estas técnicas se han implementado recientemente estrategias para codificar cápsides AAV seleccionadas a nivel de ADN y ARN, lo que permite su estratificación in vivo completa y paralela en todos los órganos principales y tipos de células en un solo animal. Aquí, presentamos una tubería básica que abarca este conjunto de vías complementarias, utilizando la visualización de péptidos AAV para representar el diverso arsenal de tecnologías de ingeniería de cápside disponibles. En consecuencia, primero describimos los pasos fundamentales para la generación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV para la selección in vivo de candidatos con las propiedades deseadas, seguido de una demostración de cómo codificar las variantes de cápside más interesantes para el cribado secundario in vivo. A continuación, ejemplificamos la metodología para la creación de bibliotecas para la secuenciación de próxima generación (NGS), incluida la amplificación de códigos de barras y la ligadura de adaptadores, antes de concluir con una descripción general de los pasos más críticos durante el análisis de datos NGS. Como los protocolos informados aquí son versátiles y adaptables, los investigadores pueden aprovecharlos fácilmente para enriquecer las variantes óptimas de la cápside AAV en su modelo de enfermedad favorito y para aplicaciones de terapia génica.

Introduction

La terapia de transferencia de genes es la introducción de material genético en las células para reparar, reemplazar o alterar el material genético celular para prevenir, tratar, curar o mejorar la enfermedad. La transferencia de genes, tanto in vivo como ex vivo, se basa en diferentes sistemas de administración, no virales y virales. Los virus han evolucionado naturalmente para transducir eficientemente sus células diana y pueden ser utilizados como vectores de entrega. Entre los diferentes tipos de vectores virales empleados en la terapia génica, los virus adenoasociados se han utilizado cada vez más, debido a su falta de patogenicidad, seguridad, baja inmunogenicidad y, lo que es más importante, su capacidad para mantener la expresión no integradora a largo plazo ^1,2,3. La terapia génica AAV ha producido logros considerables en la última década; tres terapias han sido aprobadas por la Agencia Europea de Medicamentos y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para su uso en humanos ^3,4. También se están realizando varios ensayos clínicos para tratar una variedad de enfermedades, como la hemofilia, las enfermedades musculares, cardíacas y neurológicas, como se revisó en otra parte³. A pesar de décadas de avances, el campo de la terapia génica ha experimentado una serie de reveses en los últimos años⁴, sobre todo muertes en ensayos clínicos⁵ que se han suspendido debido a las toxicidades limitantes de la dosis, particularmente para tejidos que son masivos, como los músculos, o difíciles de alcanzar, como el cerebro⁶.

Los vectores AAV que se utilizan actualmente en ensayos clínicos pertenecen a los serotipos naturales con algunas excepciones¹. La ingeniería AAV ofrece la oportunidad de desarrollar vectores con una especificidad y eficiencia superior de órganos o células. En las últimas dos décadas, se han aplicado con éxito varios enfoques, como la visualización de péptidos, el intercambio de bucles, la mezcla de ADN de la cápside, la PCR propensa a errores y el diseño dirigido, para generar variantes individuales de AAV o bibliotecas de las mismas con diversas propiedades⁷. Estos se someten a múltiples rondas de evolución dirigida para seleccionar las variantes dentro de ellos con las propiedades deseadas, como se revisa en otra parte ^1,3. De todas las estrategias de evolución de la cápside, las bibliotecas AAV de visualización de péptidos han sido las más utilizadas, debido a algunas propiedades únicas: son relativamente fáciles de generar y pueden lograr una alta diversidad y una secuenciación de alto rendimiento, lo que permite seguir su evolución.

Las primeras bibliotecas AAV de inserción de péptidos exitosas se describieron hace casi 20 años. En uno de los primeros, Perabo et ^al.8 construyeron una biblioteca de cápsides AAV2 modificadas, en la que se insertó un conjunto de oligonucleótidos generados aleatoriamente en un plásmido en una posición que corresponde al aminoácido 587 de la proteína de la cápside VP1, en el eje triple que sobresale de la cápside. Utilizando la coinfección por adenovirus, la biblioteca AAV evolucionó a través de múltiples rondas de selección, y se demostró que las variantes finales redirigidas eran capaces de transducir líneas celulares refractarias al AAV2 parental⁸. Poco después, Müller et ^al.9 introdujeron el sistema de dos pasos para la producción bibliotecaria, una mejora significativa del protocolo. Inicialmente, la biblioteca de plásmidos, junto con un plásmido auxiliar adenoviral, se utilizan para producir una biblioteca AAV que contiene cápsides quiméricas. Esta biblioteca de lanzadera AAV se utiliza para infectar células a baja multiplicidad de infección (MOI), con el objetivo de introducir un genoma viral por célula. La coinfección con adenovirus asegura la producción de AAV con un genoma y una cápside^{9 coincidentes}. Aproximadamente una década después, Dalkara¹⁰ utilizó la evolución dirigida in vivo para crear la variante de 7m8. Esta variante tiene una inserción de 10 aminoácidos (LALGETTRPA), tres de los cuales actúan como enlazadores, y se dirige eficientemente a la retina externa después de la inyección intravítrea¹⁰. Esta cápside diseñada es una historia de éxito excepcional, ya que es una de las pocas cápsides diseñadas para llegar a la clínica hasta ahora¹¹.

El campo experimentó un segundo impulso con la introducción de técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS). Dos publicaciones de Adachi et al.12 en 2014 y de Marsic et ^al.13 en 2015, mostraron el poder de NGS para rastrear la distribución de bibliotecas de cápside AAV con código de barras con alta precisión. Unos años más tarde, la NGS de las regiones con código de barras se adaptó a la región de inserción de péptidos para seguir la evolución de la cápside. Körbelin et ^al.14 realizaron un cribado guiado por NGS para identificar una cápside basada en AAV2 dirigida a los pulmones. El análisis NGS ayudó a calcular tres puntajes de calificación: el puntaje de enriquecimiento entre las rondas de selección, el puntaje de especificidad general para determinar la especificidad del tejido y, finalmente, el puntaje combinado¹⁴. El laboratorio Gradinaru¹⁵ publicó el sistema de evolución dirigida AAV (CREATE) basado en la recombinación de Cre en el mismo año, que facilita una selección específica del tipo de célula. En este sistema, la biblioteca de cápside lleva un interruptor invertible Cre, ya que la señal polyA está flanqueada por dos sitios loxP. Luego, la biblioteca AAV se inyecta en ratones Cre, donde la señal de poliA se invierte solo en células Cre+, proporcionando la plantilla para la unión de un cebador de PCR inversa con el cebador directo dentro del gen de la cápside. Este rescate de PCR altamente específico permitió la identificación del AAV-PHP. Variante B que puede atravesar la barrera hematoencefálica¹⁵. Este sistema evolucionó aún más en M-CREATE (Multiplexed-CREATE), en el que NGS y la generación de bibliotecas sintéticas se integraron en la tubería¹⁶.

Una versión mejorada basada en ARN de este sistema del laboratorio¹⁷ de Maguire, iTransduce, permite la selección a nivel de ADN de cápsides que transducen funcionalmente células y expresan sus genomas. El genoma viral de la biblioteca de visualización de péptidos comprende un gen Cre bajo el control de un promotor ubicuo y el gen de la cápside bajo el control del promotor p41. La biblioteca se inyecta en ratones que tienen un casete loxP-STOP-loxP aguas arriba de tdTomato. Las células transducidas con variantes AAV que expresan el genoma viral y, por lo tanto, Cre expresan tdTomato y, en combinación con marcadores celulares, pueden clasificarse y seleccionarse¹⁷. Del mismo modo, Nonnenmacher et al.18 y Tabebordbar et ^al.19 colocaron la biblioteca de genes de la cápside bajo el control de promotores específicos de tejido. Después de la inyección en diferentes modelos animales, se utilizó ARN viral para aislar las variantes de la cápside.

Un enfoque alternativo es usar códigos de barras para etiquetar las bibliotecas de cápside. El laboratorio²⁰ de Björklund utilizó este enfoque para las bibliotecas de cápside de inserción de péptidos de códigos de barras y desarrolló la evolución racional del vector AAV con código de barras (BRAVE). En un plásmido, el casete Rep2Cap se clona junto a un transgén marcado con código de barras que expresa repeticiones terminales invertidas (ITR) y que expresa proteínas fluorescentes amarillas (YFP). Utilizando sitios loxP entre el final de la tapa y el comienzo del código de barras, una recombinación de Cre in vitro genera un fragmento lo suficientemente pequeño para NGS, lo que permite la asociación de la inserción del péptido con el código de barras único (tabla de búsqueda, LUT). La producción de AAV se realiza utilizando la biblioteca de plásmidos y los códigos de barras expresados en el ARNm se examinan después de la aplicación in vivo , nuevamente con NGS²⁰. Cuando las bibliotecas de cápside comprenden variantes de todo el gen de la cápside (es decir, bibliotecas barajadas), se debe utilizar la secuenciación de lectura larga. Varios grupos han utilizado códigos de barras para etiquetar estas diversas bibliotecas, lo que permite que NGS tenga una mayor profundidad de lectura. El laboratorio Kay²¹ etiquetó bibliotecas barajadas de cápside muy diversas con códigos de barras aguas abajo de la señal de poliA de la tapa . En un primer paso, se generó una biblioteca de plásmidos con código de barras, y la biblioteca de genes de la cápside barajada se clonó en ella. Luego se utilizó una combinación de MiSeq (lectura corta, mayor profundidad de lectura) y PacBio (lectura larga, menor profundidad de lectura), así como la secuenciación de Sanger para generar su LUT²¹. En 2019, Ogden y sus colegas del laboratorio Church²² delinearon la aptitud de la cápside AAV2 para múltiples funciones utilizando bibliotecas que tenían mutaciones, inserciones y eliminaciones de un solo punto en cada posición, lo que finalmente permitió el diseño guiado por máquina. Para la generación de la biblioteca, se sintetizaron fragmentos más pequeños del gen de la cápside, se marcaron con un código de barras, se secuenciaron de próxima generación y luego se clonaron en el gen completo de la cápside. Los datos de NGS se utilizaron para generar una LUT. Luego, la biblioteca se examinó utilizando solo los códigos de barras y la secuenciación de lectura corta, lo que a su vez permite una mayor profundidad de lectura²².

Las bibliotecas con código de barras se han utilizado predominantemente para examinar un conjunto de variantes conocidas, naturales y de ingeniería después de varias rondas de selección de bibliotecas de cápside o independientes de un estudio de evolución de la cápside. La ventaja de tales bibliotecas es la oportunidad de examinar múltiples cápsides, al tiempo que reduce el número de animales y minimiza la variación entre los animales. Los primeros estudios que introdujeron esta tecnología en el campo de AAV se publicaron hace casi una década. El laboratorio Nakai 12 etiquetó 191 mutantes de alanina doble que cubrían los aminoácidos 356 a 736 en el VP1 de AAV9 con un par de códigos de barras de¹² nucleótidos. Utilizando NGS, la biblioteca fue examinada in vivo para la unión a galactosa y otras propiedades¹². Marsic y sus colegas delinearon la biodistribución de las variantes de AAV utilizando también un análisis de doble barra 1 año después¹³. Un estudio más reciente en primates no humanos comparó la biodistribución en el sistema nervioso central de 29 cápsides utilizando diferentes vías de entrega²³. Nuestro laboratorio ha publicado recientemente pantallas de biblioteca AAV con código de barras de 183 variantes que incluían AAV naturales y de ingeniería. Estas pantallas a nivel de ADN y ARN condujeron a la identificación de una variante AAV²⁴ altamente miotrópica en ratones, así como otras que muestran una alta especificidad de tipo celular en el cerebro del ratón²⁵.

Aquí, describimos la metodología utilizada en este trabajo y la ampliamos para incluir la detección de las bibliotecas de visualización de péptidos AAV. Esto comprende la generación de bibliotecas de visualización de péptidos AAV2, un método de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación y, finalmente, una tubería NGS para analizar las variantes de AAV, basada en parte en el trabajo de Weinmann y colegas²⁴. Finalmente, se proporciona una descripción de la generación de bibliotecas AAV con código de barras y la canalización NGS utilizada en la misma publicación.

Protocol

1. AAV2 random 7-mer peptide display library preparation

NOTA: Para la preparación de una biblioteca de visualización de péptidos aleatorios AAV2, sintetice los oligonucleótidos degenerados como ADN monocatenario, conviértalo en ADN bicatenario, digiera, liga al plásmido aceptor y electroporate.

1. Diseño de oligonucleótidos degenerados
   1. Ordene los oligonucleótidos degenerados y evite el sesgo del codón. En el oligonucleótido 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC(X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 corresponde a 20 codones, cada uno codificando uno de los 20 aminoácidos. La W puede ser A o T, produciendo los codones AGA o AGT, que codifican los aminoácidos arginina (R) o serina (S).
   2. Solicite el cebador de amplificación: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (consulte la Figura 1 para obtener más detalles). Esto produce el siguiente inserto proteico: R/S G_{X 7}. La diversidad teórica se calcula de la siguiente manera: 1 x 2 x 20⁷ = 2,56 x 10⁹ variantes únicas.
      NOTA: Cabe señalar que esta diversidad puede estar restringida por la eficiencia de la transformación.
2. Síntesis de segunda cadena
   1. Resuspender ambos oligonucleótidos (oligonucleótidos degenerados y cebador de amplificación) a una concentración final de 100 μM con tampón TE.
      1. Para la reacción de PCR, establezca una reacción de 50 μL con 1 μL de cada cebador, 10 μL del tampón, 1.5 μL de DMSO, 0.5 μL de dNTP (10 mM), 0.5 μL de polimerasa II de arranque en caliente de alta fidelidad y 35.5 μL de agua libre de nucleasa.
      2. Transfiera la reacción a un termociclador y ejecute una etapa de preincubación durante 10 s a 98 °C, seguida de tres ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 59 °C y 10 s a 72 °C, luego 5 min a 72 °C y un paso final de enfriamiento.
   2. Purificar la reacción usando un kit de eliminación de nucleótidos y eluir en 100 μL de agua libre de nucleasas.
   3. Confirme la eficiencia de la síntesis de la segunda cadena mediante el análisis en un bioanalizador (ver Figura 2). Analice el tamaño y la pureza del inserto bicatenario cargando 1 μL de la reacción a un chip microfluídico de un kit de reactivos DNA 1000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este kit está optimizado para medir el tamaño y la concentración de fragmentos de ADN bicatenario de 25-1.000 bps.
3. Digestión del inserto y del vector plásmido
   1. Digiera 85 μL del inserto purificado con 10 μL de tampón 10x y 5 μL de enzima BglI en un volumen de reacción final de 100 μL (ver Figura 1 para más detalles). Incubar a 37 °C durante la noche. Purificar usando un kit de eliminación de nucleótidos, eluye en 50 μL de agua libre de nucleasa y cuantifique usando el tipo "Oligo ADN" en un espectrofotómetro.
   2. Digerir 10 μg de un plásmido AAV (pRep2Cap2_PIS)²⁶ competente para la replicación (genoma viral flanqueado por ITR) con 20 μL de tampón 10x y 10 μL de enzima SfiI en un volumen de reacción final de 200 μL (ver Figura 1 para más detalles). Incubar a 50 °C durante la noche. Purifice el vector en un gel de agarosa al 1% utilizando el kit de extracción en gel, seguido de un paso de purificación adicional con un kit purificador de ADN. Cuantificar la concentración en un espectrofotómetro.
4. Ligadura del inserto al vector
   1. Ligate 955 ng de vector plásmido con 45 ng de inserto con 2 μL de tampón y 2 μL de ligasa en una reacción de ligadura de 20 μL. Incubar a 16 °C durante la noche, seguido de 10 minutos a 70 °C para inactivar la ligasa por calor.
5. Transformación, cálculo de complejidad y preparación de bibliotecas de plásmidos
   1. Purificar la reacción con un kit purificador de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluya la reacción en aproximadamente el 80% del volumen inicial de agua libre de nucleasas y guárdela en hielo para su posterior transformación.
   2. Transformar células electrocompetentes: descongelar un vial de células electrocompetentes en hielo durante 10 min. Luego agregue 1-2 μL de la reacción de ligadura purificada a 30 μL (un vial) de células electrocompetentes y mezcle golpeando suavemente. A continuación, pipete cuidadosamente la mezcla de células / ADN a una cubeta de electroporación de espacio de 1 mm preenfriada sin introducir burbujas de aire.
   3. Electroporar usando los siguientes ajustes: 1800 V, 600 Ω y 10 μF. Dentro de los 10 s del pulso de electroporación, añadir 970 μL de medios de recuperación precalentados (provistos de las celdas electrocompetentes) a la cubeta y mezclar por pipeteo. Por último, transfiera las células a un tubo de microcentrífuga e incube durante 1 h a 37 °C a 250 rpm. Para lograr una diversidad deseada, realice 10-100 reacciones y, después de la incubación, agrupe todas las reacciones en un tubo.
   4. Calcule la diversidad diluyendo 10 μL de las transformaciones agrupadas 10, 100 o 1,000 veces en PBS y extienda 100 μL en placas de agar nutriente que contengan el antibiótico apropiado (75 mg / ml de ampicilina). Incubar las placas de agar durante la noche a 37 °C y luego contar las colonias en las placas de agar.
   5. Calcule la diversidad teórica de la siguiente manera:
      Diversidad máxima teórica = 10 x factor de dilución x número de colonias x número de reacciones de electroporación.
      NOTA: Para confirmar la calidad de la biblioteca, secuencie al menos 20 colonias mediante la secuenciación de Sanger. La mayoría de los clones deben contener un inserto, y todos deben ser únicos.
   6. Inocular 400-1.000 ml de medio LB que contenga el antibiótico apropiado con el resto de las transformaciones agrupadas e incubar durante la noche a 37 °C, 180 rpm.
6. Preparación de la biblioteca de plásmidos
   1. A partir del cultivo nocturno, prepare un stock de glicerol (mezcle volúmenes iguales de cultivo bacteriano y solución de glicerol al 50% en agua libre de nucleasa y congele a -80 ° C) y purifique la biblioteca de plásmidos utilizando un kit maxi plásmido.
7. Producción de la biblioteca viral AAV
   1. Prepare la biblioteca viral como se describió anteriormente²⁷. Transfectar la biblioteca de plásmidos (pRep2Cap2_PI, inserto peptídico) junto con un plásmido adeno-ayudante a células HEK293T utilizando un reactivo de transfección como la polietilenimina (PEI).
   2. Recoger las células después de 3 días y someterlas a tres ciclos de congelación-descongelación. Purificar el lisado viral utilizando ultracentrifugación de gradiente de cloruro de cesio, seguido de intercambio de tampón a PBS, y finalmente concentrar las partículas virales.
8. Titulación del vector AAV mediante dd-PCR
   1. Diluir en serie 2 μL de la cepa vectorial AAV en 198 μL de agua libre de nucleasas para obtener una dilución final 1:10⁶ . Mezclar bien cada vez con una pipeta de 200 μL. Agregue un control sin plantilla (NTC) como control negativo.
      NOTA: Se pueden ensayar diluciones adicionales más bajas o más altas (1:10^5-1:10⁷).
   2. Prepare una mezcla de imprimación y sonda 20x. Agregue 3,6 μL de cada uno de los cebadores de 100 μM (avance y retroceso, Rep2 e ITR), 1 μL de cada una de las sondas dd-PCR de 100 μM (Rep2 e ITR) y 3,6 μL de agua libre de nucleasa a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: La biblioteca AAV se mide utilizando un conjunto de sondas de cebador dirigidas a transgenes (Rep2) detectado con una sonda marcada con FAM, y un conjunto de sondas de cebador dirigido a ITR detectado con una sonda marcada con HEX.
   3. Prepare una reacción de PCR de 22 μL agregando 5,5 μL de muestra, 1,1 μL de mezcla de cebad-sonda 20x, 11 μL de supermezcla dd-PCR para sondas (sin dUTP) y 4,4 μL de agua libre de nucleasa. Esto produce concentraciones de 900 nM y 250 nM para los cebadores y la sonda, respectivamente.
   4. Genere las gotas utilizando un generador de gotas, transfiera la reacción a una placa de 96 pocillos, coloque la placa en un termociclador y ejecute un paso de desnaturalización durante 10 minutos a 94 °C, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 °C y 1 min a 58 °C. A continuación, inactive térmicamente la polimerasa durante 10 minutos a 98 °C y agregue un paso final de enfriamiento. Lea las reacciones en un lector de gotas y proceda al análisis²⁸.
   5. Abra el archivo de placa dd-PCR guardado utilizando el software de análisis. Utilice la herramienta de umbral de la ficha Amplitud 1D (amplitud de fluorescencia frente a número de evento) para separar las gotas negativas y positivas de cada canal, utilizando el NTC como guía, y exporte los datos a un archivo csv.
   6. Para calcular la concentración del vector, primero calcule el factor de corrección CF utilizando la fórmula:
      
      La FQ determina la proporción de gotitas positivas para el transgén [Positivos] que son positivas tanto para el transgén como para el ITR [Ch1+ Ch2⁺], para asegurar la detección de partículas vectoriales funcionales. La concentración vectorial final c ahora se puede calcular usando la siguiente ecuación:
      
      DF es el factor de dilución (1:10^5-1:10⁷ como se determinó anteriormente). Las copias por reacción de 20 μL/pocillo corresponden a 5 μL de la muestra diluida. El factor 1.000 corrige la escala a VG/mL (genoma viral/mL). Un resultado ejemplar de valoración se demuestra en la Tabla 1 y la Figura 3.
9. Análisis de la biblioteca viral AAV por NGS
   1. Amplíe el fragmento de inserción del péptido de 96 nucleótidos configurando una reacción de PCR de 20 μL utilizando un kit de polimerasa de lectura de pruebas (2x; ver Figura 4). Añadir 1 μL de AAV que contenga 1 x 10⁸ vg, 0,5 μL de cada uno de los 100 μM de cebador (NGS_forward y NGS_reverse), y 10 μL de la mezcla enzimática a la reacción. Ajustar el volumen final a 20 μL con agua libre de nucleasas.
   2. Transfiera la reacción a un termociclador y ejecute un paso de desnaturalización durante 3 min a 98 °C, seguido de 30-35 ciclos de 10 s a 98 °C, 10 s a 59 °C y 20 s a 72 °C, seguidos de 5 min a 72 °C y un paso final de enfriamiento.
   3. Purificar las muestras utilizando un kit de purificación por PCR. Cuantifique la concentración en un espectrofotómetro y ejecute un gel de agarosa al 3% para verificar la pureza y el tamaño del fragmento.
   4. Procesar los fragmentos de PCR utilizando el sistema de biblioteca para muestras de baja complejidad kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la preparación de una biblioteca NGS. Realice la reacción de reparación final con 30 ng de fragmento de PCR, seguida de ligadura del adaptador y amplificación por PCR durante 10 ciclos. Utilice el kit de purificación por PCR para la purificación de las reacciones.
   5. Procesar los productos finales en un Bioanalizador para verificar el tamaño y la pureza, utilizando un kit de reactivos de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   6. Cuantifique los amplicones usando un fluorómetro y agruparlos. Cuantificar la biblioteca NGS final agrupada nuevamente en un fluorómetro (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y verificar la calidad en un Bioanalizador.
   7. Secuencie las bibliotecas NGS en un modo de extremo único (SE), utilizando un kit de salida alta de 75 ciclos, con una longitud de lectura de 84 y un índice de 1 de 8.
      NOTA: La secuenciación de los ejemplos de este artículo se realizó en las instalaciones de GeneCore del EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
   8. Analice los datos de secuenciación NGS con Python 3 y biopython. Los archivos se pueden encontrar en https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternativamente en https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). El análisis NGS se compone de dos pasos.
      1. En el primer paso, busque en los archivos de secuencia secuencias que satisfagan ciertos criterios (presencia de secuencias de reconocimiento que flanquean el sitio de inserción) (consulte la Figura 4, paso 1.9.8.5.). Esto se hace utilizando un script (Script # 1) y un archivo de configuración que proporciona la información necesaria. Una vez que se identifica la secuencia correcta, el programa extrae y almacena la secuencia en el archivo de salida, que es un archivo txt con el mismo nombre que el archivo de secuenciación.
      2. El segundo paso es el análisis de los archivos de salida. Las secuencias en la biblioteca comienzan con cualquiera de los seis nucleótidos (AGWggc, W = A / T) en el inserto de nueve aminoácidos. Sobre la base de esta secuencia inicial, se traduce el péptido. Esto genera los archivos de salida que contienen las variantes peptídicas (PV).
      3. Prepare dos carpetas: Script y Data. En la carpeta Datos, copie los archivos comprimidos gzip resultantes de la secuenciación. En la carpeta Script, copie los siguientes archivos, archivo Python: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Archivo Python: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Archivo de configuración: Barcode_Script_JoVE.conf; y archivo de tabla de búsqueda (LUT): Zuordnung.txt.
      4. Antes de ejecutar los scripts, edite los siguientes archivos en la carpeta Script. Abra el archivo "Zuordnung.txt" y agregue dos columnas separadas por tabulaciones, los nombres de los archivos gzip (columna 1) y el nombre final deseado (columna 2; valores separados por tabulaciones).
         NOTA: Los archivos txt de ejemplo se encuentran en la carpeta de GitHub "PV_analysis_script". Los archivos proporcionados en la carpeta GitHub se preparan para el análisis de tres datos de ejemplo de la biblioteca anterior: xaa.txt.gz, xab.txt.gz y xac.txt.gz. También se proporcionan los archivos de salida.
      5. Cambie las siguientes variables en el archivo de configuración "Barcode_Script_JoVE.conf":
         my_dir = "~/Datos/"
         filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
         Las variables específicas de la secuencia: BCV_size = 27, BCV_izquierdo = TCCAGGGCCAG, BCV_derecho = GCCCAGG, BCV_loc = 30,_margen BCV = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC y BCV_{loc_revcomp} = 41 (consulte la Figura 4 para obtener más detalles).
      6. Utilice el siguiente comando para llamar a la detección y extracción de secuencias de variantes:
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         NOTA: La salida son archivos txt con las secuencias de ADN extraídas y su número de lecturas. El encabezado de este archivo contiene datos estadísticos (es decir, el número total de lecturas y las lecturas extraídas). Estos datos se transfieren a los siguientes archivos. Estos datos txt son los archivos de entrada para el Script # 2, en el que se traducen, clasifican y analizan las secuencias de ADN.
      7. Realice la extracción y el análisis fotovoltaicos utilizando el siguiente comando:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analice los archivos de salida de texto del Script#2. Los archivos de salida del Script # 2 se nombran utilizando la segunda columna de la LUT en "Zuordnung.txt" con extensiones basadas en el tipo de análisis.
         NOTA: Asegúrese de que los tres archivos de salida contengan datos estadísticos en las primeras filas ("# de lecturas PV válidas", "# de lecturas PV no válidas" y "# de lecturas PV únicas"), una primera columna con el índice de cada secuencia de ADN de los archivos txt de entrada (salida del script # 1) y las siguientes columnas: (1) "... analyzed_all.csv": "Muestra:" (secuencia de ADN), "#" (número de lecturas), "Frw o Rev" (lectura directa o inversa) y "PVs" (secuencia peptídica traducida). Las secuencias no válidas tienen "NA" y "no válido" en las dos últimas columnas. (2) "... analyzed_validSeq.csv": igual que el archivo anterior, filtrado por secuencias válidas. (3) "... analyzed_PV.csv": "PVs" (secuencia peptídica traducida), "#" (número de lecturas) y "count" (los recuentos frw y rev en los archivos anteriores se fusionan y el recuento recibe 1 o 2).
      9. Visualice los archivos de salida utilizando el software disponible según las necesidades del usuario.

2. Selección aleatoria de la biblioteca de visualización de péptidos de 7 mer AAV2

1. Utilice la biblioteca AAV después de la cuantificación y el control de calidad (sección 1) para la evolución dirigida en un modelo de elección para seleccionar iterativamente candidatos con propiedades deseadas (Ver Figura 5)^16,18,21.
   NOTA: Estos candidatos se utilizan para la generación de una biblioteca con código de barras como se describe a continuación en la sección 3.

3. Preparación y análisis de la biblioteca de cápside AAV con código de barras

NOTA: Tras la identificación de un conjunto de cápsides AAV potencialmente específicas y eficientes en la pantalla de visualización de péptidos, verifique la funcionalidad de las secuencias peptídicas identificadas y compárelas con un conjunto de variantes de cápside AAV de referencia comúnmente utilizadas o bien descritas. Para ello, la secuencia de la cápside se inserta en una construcción auxiliar Rep/Cap sin ITR.

1. Producción de biblioteca AAV con código de barras
   1. Realizar la producción de AAV recombinante para cada variante de cápside utilizando el sistema de tres plásmidos, como se describió anteriormente²⁴.
      NOTA: Para distinguir las diferentes variantes de cápside, el plásmido transgénico reportero flanqueado por ITR alberga un código de barras único de 15 nucleótidos de longitud. El código de barras se encuentra en la 3' UTR (región no traducida) entre la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) y la señal poliA (ver Figura 6A). La expresión de EYFP es impulsada por un fuerte promotor ubicuo de citomegalovirus (CMV) que proporciona niveles suficientes de transcripciones de ARN.
   2. Diseñar códigos de barras de 15 nucleótidos de longitud con homopolímeros de menos de tres nucleótidos, contenido de GC de <65%²⁹ y una distancia de Hamming superior a cuatro nucleótidos²⁴.
   3. Producir cada cápside por separado en combinación con un plásmido transgénico que lleva un código de barras único. De esta manera, cada variante de cápside se etiqueta con un código de barras distinto que permite su seguimiento específico (consulte la Figura 6B).
2. Titulación del vector AAV mediante dd-PCR
   1. Realice la valoración AAV como se describió anteriormente en la sección 1.8, reemplazando el par de cebadores Rep2 por el par de cebadores YFP.
   2. Cuantifique las producciones individuales de AAV y agrupe cantidades iguales de cada producción para generar la biblioteca final con código de barras.
   3. Cuantifique la biblioteca final nuevamente para verificar la concentración final y la calidad (ver Figura 7).
3. Aplicación in vivo de biblioteca AAV con código de barras
   1. Aplique la biblioteca AAV con código de barras sistémicamente al sistema modelo de elección (por ejemplo, sistémicamente en ratones²⁴).
   2. Recolectar tejidos ON y OFF (es decir, hígado, pulmón, corazón, diafragma, músculo liso, duodeno, páncreas, colon, bíceps, ovarios, estómago, oído interno, riñón, aorta abdominal, aorta torácica, cerebro, grasa marrón y blanca y bazo) o tipos de células según el experimento. Congelarlos a -80 °C, extraer el ADN/ARN y aplicar el análisis de cuantificación NGS, como se describe en la siguiente sección.
4. Extracción de ADN/ARN
   1. Extraiga el ADN y el ARN de los tejidos de interés utilizando el Mini Kit de ADN/ARN.
   2. Coloque una pequeña porción del tejido de interés (1 mm³, aproximadamente 5 mg) en un tubo de reacción de 2 ml.
   3. Agregue 350 μL de tampón de lisis mezclado con β-mercaptoetanol (1%) y perlas de acero de 5 mm al tejido (manipule muestras con β-mercaptoetanol debajo de una campana extractora).
   4. Homogeneizar el tejido en un tejidoLyser durante 45 s a 40 Hz.
   5. Añadir 10 μL de proteinasa K (10 mg/ml) e incubar durante 15 min a 55 °C mientras agitamos a 400 rpm.
   6. Centrifugar a 20.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente, recoger el sobrenadante, y proceder con el protocolo del fabricante del kit de ADN/ARN.
   7. Divida el paso de lavado en dos pasos con 350 μL de tampón de lavado en cada paso. Entre estos pasos de lavado, digiera el ADN remanente en la columna con DNasa I libre de RNasa. Agregue 80 μL de la solución de DNasa I, preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en la columna e incube a temperatura ambiente durante 15 min.
   8. Eluya el ARN/ADN de la columna con agua libre de nucleasas. Almacenar el ARN aislado a -80 °C y el ADNg a -20 °C.
5. Síntesis de ADNc
   1. Someter las muestras de ARN a otra ronda de tratamiento con DNasa I de 15-30 minutos (para la eliminación completa del ADN contaminante de las muestras de ARN) antes de la reacción de transcripción inversa. Agregue 1 μL de la solución de DNasa I, 4 μL de tampón (provisto con el kit) y agua libre de nucleasas a un volumen final de 40 μL a 212 ng de ARN. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente e inactivar el calor a 70 °C durante 10 min.
   2. Sintetice cDNA, utilizando 150 ng de ARN utilizando un kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incluir controles sin la transcriptasa inversa, para asegurar la ausencia de ADN viral contaminante de la muestra. El ADNc se almacena a -20 °C.
      NOTA: La cantidad de ARN de entrada para una transcripción inversa óptima puede variar según el tipo de tejido y la eficiencia de transducción esperada en el tejido respectivo.
6. Análisis de la biblioteca viral AAV (in-vivo) por NGS
   1. Para lograr una alta profundidad de secuenciación a bajo costo, realice NGS a través de la secuenciación Illumina como se describió anteriormente (sección 1.9). Amplíe la secuencia de códigos de barras y, a continuación, vincule los adaptadores de secuenciación al amplicón.
   2. Debido a la corta longitud de lectura y la ligadura de los adaptadores de secuenciación en ambos lados del amplicón, al diseñar, verifique que el amplicón sea lo suficientemente pequeño como para garantizar la presencia de la secuencia de código de barras dentro de la lectura NGS. Para la secuenciación de los códigos de barras dentro de los genomas virales y las transcripciones virales, el amplicón de PCR está diseñado para tener una longitud de 113 pb (ver Figura 8).
   3. Amplíe la región con código de barras con los cebadores BC-seq hacia adelante y BC-seq hacia atrás. Prepare la siguiente reacción de PCR: 0,5 μL de ADN polimerasa de alta fidelidad, 10 μL de tampón 5x, 0,25 μL de cada cebador de 100 μM (BC-seq fw/BC-seq rv) y 1 μl de 10 mM dNTPs. Use 25 ng del ADNc o ADN/reacción como plantilla y ajuste el volumen final a 50 μL con agua libre de nucleasas.
   4. Prepare la mezcla maestra de PCR bajo una campana de PCR limpia para evitar la contaminación. Utilice las siguientes condiciones de ciclismo: 30 s a 98 °C, seguido de 40 ciclos a 98 °C durante 10 s y 72 °C durante 20 s, y un paso final de 5 minutos a 72 °C.
   5. Incluir controles de PCR para confirmar la ausencia de ADN contaminante en la mezcla maestra de PCR. Para las muestras de ADNc, incluya los controles sin transcriptasa inversa. Por último, incluya un ejemplo con la biblioteca de entrada AAV. Esta información se utilizará para generar el archivo Normalization_Variant.txt utilizado en el análisis.
   6. Verificar el tamaño del fragmento de PCR de cada muestra mediante electroforesis en gel antes de la purificación por PCR. Esto último se logra mediante el uso de perlas magnéticas disponibles comercialmente o sistemas de purificación de ADN basados en columnas (ver Tabla de materiales).
   7. Preparar la biblioteca NGS utilizando el sistema de biblioteca para muestras de baja complejidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se describió anteriormente en la sección 1.9.
   8. Determinar la concentración de ADN a través del kit dsDNA HS y analizar la calidad de la biblioteca como se describió anteriormente (sección 1.9.6), seguido de la agrupación. Cuantifique la biblioteca agrupada en un fluorómetro y evalúe la calidad en un bioanalizador.
   9. Realizar la secuenciación NGS como se explica en la sección 1.9.7.
   10. Cuantificar por qPCR el número de copias del transgén (genomas virales) y el gen de mantenimiento para evaluar la distribución de la biblioteca agrupada entre tejidos u órganos en el ADN.
   11. Configure una reacción qPCR de 30 μL de la siguiente manera, para determinar el número de copias de EYFP (transgén) y GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, gen de mantenimiento):
       1. Prepare una mezcla de cebador/sonda de 60x para AELP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv y 0,6 μM YFP_probe; consulte la Tabla de materiales). Use la mezcla de cebador/sonda GAPDH (consulte la Tabla de materiales) para determinar el número de copias del gen del ama de llaves. Configura la reacción en hielo.
       2. Prepare una mezcla maestra de PCR (15 μL, consulte la Tabla de materiales) y agregue una mezcla de cebador/sonda 60x (0,5 μL) para todas las muestras y patrones (para calcular el número de copias de los estándares, use el siguiente enlace: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Configura la reacción en hielo.
       3. Transfiera 15,5 μL de la mezcla maestra a una placa de 96 pocillos y agregue 14,5 μL de muestra (75 ng de concentración total de ADN) o estándar al pocillo respectivo. Selle la placa de 96 pocillos con papel de aluminio, vórtice y gire brevemente.
       4. Transfiera 10 μL de cada muestra a una placa de 384 pocillos por duplicado. Sellar la placa con papel de aluminio y girar a 800 x g durante 5 min a 4 °C.
       5. Incubar la mezcla de reacción en un termociclador utilizando una temperatura inicial de 50 °C durante 2 min, seguida de un paso de activación inicial de 10 min a 95 °C. Realizar 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s y recocido/extensión a 60 °C durante 1 min²⁴.
       6. Para obtener el número de genomas diploides (dg), use el número de copia GAPDH y divida por dos. Luego, tome el valor del número de copias de EYFP y divídalo por el número de dg, lo que resulta en genomas vectoriales por genoma diploide (vg / dg). Utilice este valor para generar el archivo Normalization_Organ.txt para el análisis bioinformático.
   12. Realizar el análisis de los datos de secuenciación NGS como Weinmann et al.²⁴, utilizando código personalizado en Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). El flujo de trabajo comprende la detección de secuencias de códigos de barras guiadas por secuencias de flanqueo, su longitud y ubicación (Script # 1_BarcodeDetection.py), así como el análisis del enriquecimiento y distribución de códigos de barras en el conjunto de tejidos (Script # 2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Detecte códigos de barras y asígnelos a variantes AAV. Coloque los datos de secuenciación como archivos fastq archivados en un directorio (por ejemplo, "Data_to_analyze"). El archivo de datos de secuenciación para la biblioteca de entrada se incluye en este directorio y se utiliza sólo para calcular las proporciones de cápside en la biblioteca de entrada.
       2. Antes de ejecutar el script, cree dos archivos de texto delimitados por tabulaciones: el archivo de variantes de cápside (consulte el archivo de ejemplo "Variantes.txt") con las secuencias de códigos de barras asignadas a los nombres de variantes de cápside AAV, y el archivo de contaminación (consulte "Contaminaciones.txt") con secuencias de códigos de barras que provienen de una posible contaminación (otros códigos de barras disponibles en el laboratorio, que contribuyen a la contaminación).
       3. Finalmente, edite el archivo de configuración "Barcode_Script.conf" para incluir la siguiente información: ruta a la carpeta con datos de secuenciación (por ejemplo, "Data_to_analyze"), secuencia de regiones flanqueantes de los códigos de barras, su posición y tamaño de ventana para la detección de códigos de barras (similar a 1.9.8.5, consulte la Figura 8).
       4. Utilice el siguiente comando para solicitar la detección de códigos de barras con rutas de acceso proporcionadas a Script#1_BarcodeDetection.py y archivos de configuración:
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          NOTA: El resultado de la ejecución de Script # 1_BarcodeDetection.py son archivos de texto con recuentos de lectura por variante de cápside, así como el número total de lecturas recuperadas de los datos sin procesar.
       5. Evalúe la distribución de cápsides AAV con código de barras entre tejidos u órganos, ejecutando Script # 2_BarcodeAnalysis.py junto con los siguientes archivos txt:
          1. En el archivo "Zuordnung.txt", asigne el nombre a cada archivo txt obtenido de la ejecución de detección de código de barras a un nombre de tejido/órgano: nombres de archivos txt en la primera columna y nombres de tejidos/órganos correspondientes en asignación delimitada por tabulaciones.
             NOTA: Para un ejemplo, compruebe en la carpeta "Ejemplo" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Cabe destacar que el nombre del tejido/órgano puede incluir caracteres que definan la medición de ADNc o ADNg y el número de réplicas biológicas (M1, M2, etc.).
          2. Cree un archivo de texto "órganos.txt" con la lista de nombres para órganos ON y OFF-target, que correspondan a los nombres dados en el archivo de asignación "Zuordnung.txt" (consulte la carpeta "Ejemplo": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Cree archivos de texto delimitados por tabulaciones "Normalization_Organ.txt" y "Normalization_Variant.txt" con valores normalizados para todas las variantes de cápside y todos los órganos/tejidos. En la primera columna del fichero "Normalization_Organ.txt", escriban los nombres dados para cada órgano (como en el fichero de asignación "Zuordnung.txt") y en la segunda columna los valores de normalización para los tejidos correspondientes, generados en la sección 3.6.11.
          4. Rellene la primera columna del archivo "Normalization_Variant.txt" con la lista de nombres de cápside y la segunda columna con los valores normalizados de los recuentos de lectura para cada cápside en la biblioteca agrupada (la normalización se puede calcular en función del archivo de salida txt para la biblioteca de entrada resultante del primer script).
          5. Edite el archivo de configuración especificando las rutas completas a todos los archivos adicionales mencionados anteriormente. Ejecute el script #2_BarcodeAnalysis.py como:
             >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             NOTA: El script de análisis de código de barras genera varios archivos: archivos de texto con valores de concentración relativa (RC) de la distribución de la cápside dentro de diferentes tejidos basados en múltiples pasos de normalización descritos anteriormente, y el archivo de hoja de cálculo que combina datos de archivos de texto en datos de matriz combinados. Este último se puede utilizar para el análisis y la visualización de clústeres.
          6. Visualice los datos y realice análisis de conglomerados de los datos de la matriz para distinguir las propiedades de la cápside y evaluar sus similitudes en función de los perfiles RC entre tejidos. Utilice el script adicional PCA_heatmap_plot. R colocado en el repositorio:
             >Rscript --vainilla ~/PCA. R ~/concentración relativa.xls
             NOTA: El script toma archivos de concentración relativa.xls como entrada y genera dos gráficos de mapa de calor de clúster jerárquico y análisis de componentes principales (PCA).
          7. Para modificar gráficos (ejes de mapa de calor, componentes principales de PCA) o parámetros png (color, tamaño, etiquetado), abra el script R y siga las instrucciones proporcionadas en las secciones comentadas.

Representative Results

Generación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV2. Como primer paso hacia la selección de AAV diseñados, se describe la generación de una biblioteca de plásmidos. El inserto peptídico se produce mediante el uso de cebadores degenerados. Reducir la combinación de codones en aquellos de 64 a 20 tiene las ventajas de eliminar los codones de parada y facilitar el análisis NGS, al reducir la diversidad de bibliotecas en el ADN pero no en el nivel de proteína. El inserto de oligonucleótido se compra como ADN monocatenario (Figura 1), que se convierte en ADN bicatenario mediante una reacción de PCR. La calidad de esta reacción se controla en un Bioanalizador. Como se muestra en la Figura 2, tres ciclos produjeron una banda más fuerte, en comparación con 10 o 30 ciclos. El inserto se digiere con BglI para generar voladizos de tres nucleótidos. El nucleótido junto a la secuencia de voladizo del inserto bicatenario puede ser una A o una T (W es el código de ambigüedad para A o T), que está en la tercera posición de un codón que codifica arginina (R) o serina (S). El vector (pRep2Cap2_PIS) tiene una mutación de desplazamiento del marco en el sitio de inserción del péptido que impide la producción de la cápside en ausencia de un inserto, debido a la creación de un codón de parada poco después del sitio de inserción. La digestión SfiI de este plásmido genera voladizos de tres nucleótidos que coinciden con los voladizos generados en el inserto de oligonucleótidos que codifica péptidos. La ligadura debe realizarse en condiciones óptimas para maximizar la complejidad de la biblioteca de plásmidos. Con este fin, para la transformación, la electroporación se realizó utilizando bacterias disponibles comercialmente con alta eficiencia.

La diversidad de la biblioteca de plásmidos se calcula en función del recuento de colonias, que suele ser de alrededor de 1 x 10⁸ para este tipo de biblioteca. El número total de colonias corresponde a la diversidad potencial máxima de la biblioteca en el análisis NGS, como se discute más adelante. La biblioteca de plásmidos se utiliza para generar la biblioteca AAV, que no se describe en detalle aquí, sino en otros lugares²⁷.

La cuantificación de esta biblioteca se realizó mediante dd-PCR. Típicamente, se cuantifican dos regiones, el gen AAV2 rep dentro del genoma viral y el ITR (ver Figura 3 y Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 1, de las gotitas positivas para el genoma viral, el 99,2% también son positivas para ITR (Ch1 + Ch2 ⁺), que es un control de calidad para la biblioteca AAV y sugiere que las cápsides AAV contienen genomas virales completos. Para obtener una concentración en vg/ml, se calcula la proporción de gotitas doblemente positivas a positivas y se utiliza para obtener el número correcto de copias antes de la amplificación por el factor de dilución.

La calidad de la biblioteca AAV se evalúa mediante análisis NGS, comenzando con una PCR utilizando cebadores apropiados. A continuación, el producto de PCR se procesa utilizando un kit disponible comercialmente, que agrega adaptadores que contienen índice al producto de PCR. Los productos NGS se secuencian y los archivos se analizan con Python. Se proporcionan tres datos de muestra de una biblioteca de visualización de péptidos AAV2. Cada secuencia en el archivo de entrada Script#1 (lista de secuencias de todas las copias de PCR del segmento de ADN amplificado en la muestra) se busca bioinformáticamente para las secuencias_izquierda y_derecha del BCV, o las secuencias_{left_comp} BCV y_{BCV right_comp} secuencias. Si se identifica cualquiera de las combinaciones, la secuencia contenida se extrae y se agrega al archivo de salida (consulte la figura 4). La salida de ambos scripts proporciona datos estadísticos sobre la preparación de la biblioteca NGS. En los tres conjuntos, las lecturas extraídas, basadas en secuencias de firmas específicas de la biblioteca, representaron aproximadamente el 94% del total de lecturas, lo que sugiere una buena calidad. La salida de Script # 2 proporciona más datos estadísticos, y la traducción de la secuencia de ADN extraída produce datos adicionales de control de calidad. El "# de lecturas PV no válidas" (es decir, secuencias que carecen de los seis nucleótidos utilizados para iniciar la traslación in silico y codificar residuos RG o SG) es inferior al 1% de las lecturas recuperadas, lo que confirma una buena calidad de secuenciación. Los resultados del segundo guión (es decir, la traducción y clasificación de las secuencias de ADN extraídas) proporcionan información adicional, como el número de lecturas por variante peptídica o el número de secuencias de ADN que dan lugar a cada variante peptídica. De los archivos, los que terminan en "analyzed_PVs" contienen solo lecturas de ADN válidas, y el análisis se realiza a nivel de secuencia peptídica. De las lecturas válidas, más del 99% son únicas, lo que sugiere que la biblioteca está equilibrada y la diversidad interna es alta.

Selección de una biblioteca de visualización de péptidos AAV2. Esta biblioteca se puede utilizar para la selección in vivo o in vitro . Esto no se incluye en este protocolo, pero se proporciona un esquema en la figura 5. Brevemente, para la selección in vivo , los tejidos se recogen 1 semana después de la inyección sistémica de 1 x^{10 12} vg/ratón y se aísla el ADN. Se realiza una PCR de rescate en un fragmento más grande del gen cap , y el producto se clona en el vector plásmido utilizando diferentes sitios de restricción pero un protocolo similar al que se describe aquí, y se preparan bibliotecas AAV de ronda 1. Para el análisis NGS, la PCR se realiza en el ADN aislado o en las bibliotecas AAV. Después de la selección, el porcentaje de PV únicos en la biblioteca generalmente disminuye de acuerdo con la presión de selección. Dependiendo del proyecto, la selección puede concluirse una vez que NGS identifique suficientes PV dominantes.

Selección y análisis de bibliotecas con código de barras. Los datos de una biblioteca AAV con código de barras que comprende 82 cápsides se han descrito previamente²⁴. La cuantificación por dd-PCR de las partículas AAV (ver Figura 7 y Tabla 1) muestra que el 94% de las cápsides que son positivas para el transgén también contienen un ITR, indicativo de un genoma completo. Esto es más bajo que la biblioteca de tipo salvaje descrita anteriormente, pero aún sugiere una buena calidad para los AAV recombinantes, considerando que generalmente se empaquetan de manera menos eficiente. Después de la inyección de la biblioteca agrupada en animales, se recogen los tejidos y se aíslan el ADN y el ARN. La PCR para NGS, así como la preparación y secuenciación de la biblioteca NGS se realizan como se describió anteriormente y anteriormente²⁴. Para calcular vg/dg, se realiza la qPCR y, en los datos muestrales proporcionados, los valores oscilan entre 0,1-4. Como es típico de la administración sistémica de AAV, el hígado tiene más de 10 vg / dg.

Como parte de la canalización de análisis, los pasos de normalización se realizan en diferentes niveles. En la biblioteca agrupada de entrada, las variantes de cápside normalmente no están representadas por igual. Por lo tanto, el análisis NGS de la biblioteca de entrada se utiliza para generar un archivo de normalización, que corrige la abundancia de cada variante de cápside en el tejido/órgano final en función de la abundancia de esta variante de cápside en la biblioteca de entrada. La biodistribución de los miembros de la biblioteca agrupados por NGS se realiza a nivel de ADN y ARN. Esta normalización para la biblioteca de entrada produce el cociente (P*αβ) de proporción dentro del tejido/órgano (P _αβ) a la proporción en la biblioteca de entrada (L_a). Estos cálculos se pueden encontrar en el archivo "variant_comparison.txt". Este cociente se multiplica por los valores vg/dg del archivo "Normalization_organ.txt" para obtener el valor Β αβ, y las proporciones de los valores de Β_αβ se calculan para un solo tejido o para todos. La proporción del valor de Β αβ para cada variante dentro de un tejido (V_αβ) refleja la diseminación de esta variante dentro de este tejido ("organ_comparison.txt"). Por el contrario, la proporción del valor de Β αβ para cada variante en todos los tejidos (T_αβ) indica la diseminación de esta variante dentro de todo el cuerpo ("concetraciones relativas.xls"). Estas dos proporciones reflejan la biodistribución intra e intertisular de cada variante. Todos estos archivos pueden ser utilizados para diferentes visualizaciones de eficiencia y especificidad de la cápside²⁴. Como ejemplo, utilizando la tabla final (que se encuentra en "concetraciones relativas.xls"), el análisis de componentes principales y la agrupación jerárquica se presentan en la Figura 9.

La normalización de la biblioteca agrupada a partir de la secuenciación NGS muestra que cada cápside tiene una proporción promedio de 0,012, que también coincide con la proporción teórica de cada una de las 82 cápsides y sugiere una biblioteca agrupada bien equilibrada de 0,012 (1/82). El archivo "concentración relativa.xls" generado por la tubería bioinformática refleja la biodistribución de la cápside entre tejidos, como se ilustra en la Figura 9. El mapa de calor muestra los valores de concentración relativos en una escala log2 para cada cápside de la biblioteca agrupada agrupada jerárquicamente agrupada de acuerdo con el perfil de biodistribución tisular. El análisis de componentes principales permite distinguir grupos de variantes de cápside AAV con propiedades de biodistribución similares y también destaca las cápsides periféricas con patrones únicos de biodistribución entre tejidos. Las dos ramas principales de la jerarquía del mapa de calor reflejan la diferencia en la eficiencia de transducción de las variantes de cápside. La rama izquierda con la mayoría de las variantes de cápside incluye todas las cápsides, que muestran un alto valor de concentración relativa en la mayoría de los tejidos. Además de la especificidad hepática sorprendentemente alta, otras tres cápsides (Var60, Var13 y Var63) exhibieron especificidad en el diafragma (Di), el músculo esquelético (SM), los bíceps (BlC) y en el cerebro (B). La rama derecha del agrupamiento jerárquico incluye las variantes de cápside con menor eficiencia de transducción general, que se pronuncia en el duodeno (Du) y el páncreas (P). El ACP para el subconjunto original forma el grupo de variantes de cápside con alta especificidad hepática (Var 64, 78, 65, 55, 56) y describe la cápside Var60 con tropismo muscular sobresaliente.

Figura 1: Descripción general de la estrategia de clonación para la biblioteca de visualización de péptidos aleatorios de 7 mer AAV2.
El oligonucleótido con la secuencia aleatoria de inserción de péptidos 7-mer está flanqueado por secuencias que contienen el sitio de digestión BglI y un sitio de unión para la reacción de amplificación. El vector pRep2Cap2_PIS contiene sitios SfiI. Los voladizos generados por la digestión BglI y SflI son complementarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Control de calidad del bioanalizador de la síntesis de oligonucleótidos de segunda cadena.
La síntesis de oligonucleótidos degenerados se confirma mediante análisis en un bioanalizador. Se comparan las reacciones de PCR con tres, 10 y 30 ciclos de amplificación, mostrando que lo más eficiente son los tres ciclos de amplificación. (A) Datos del bioanalizador representados como imagen de gel. (B-D) Longitudes de fragmentos graficadas (en pb, eje x) versus unidades de fluorescencia (eje FU, y), en comparación con picos estándar, visibles a 15 y 1500 pb. Las flechas rojas indican oligonucleótidos bicatenarios. Tenga en cuenta que el valor más alto de FU, que representa la concentración más alta de ADN, de oligonucleótidos bicatenarios se observa después de tres ciclos de amplificación (flechas rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Titulación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV2 mediante dd-PCR.
(A) Detección de gotitas positivas para rep2 en el canal 1 (FAM, Canal 1) para un control de agua no plantilla y una muestra de virus diluida 1:10⁶ . (B) Detección de gotitas ITR-positivas en el canal 2 (HEX, Canal 2). (C) Detección de gotitas que son positivas tanto para rep2 como para ITR (resaltadas en naranja). Las líneas púrpuras indican umbrales para la detección de gotitas positivas frente a negativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Descripción general del fragmento de ADN utilizado para NGS y configuración para el análisis de python.
La PCR NGS amplifica una región de 96 nucleótidos. El fragmento de PCR se utiliza para generar la biblioteca NGS. Para el análisis bioinformático, se deben dar secuencias de reconocimiento derecha e izquierda del sitio de inserción para ambas hebras, así como la distancia desde el comienzo del fragmento de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Selección iterativa de bibliotecas AAV in vivo.
A los ratones se les inyecta la biblioteca AAV. Los tejidos objetivo ON y OFF se recolectan 1 semana después y se someten a NGS y análisis. El tejido diana ON se utiliza para rescatar el gen de la cápside, que se clona en el vector padre. La biblioteca AAV seleccionada se produce y se utiliza para repetir el ciclo de selección mencionado anteriormente. Esta figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Descripción general de la generación de bibliotecas AAV con código de barras.
(A) Representación gráfica de un genoma AAV autocomplementario con un transgén eyfp impulsado por el promotor del CMV flanqueado por ITR. El 3' UTR contiene un código de barras de 15 nucleótidos de largo (BC) ubicado en el 3' UTR entre el eyfp y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH). El BC permite el rastreo de la cápside a nivel de ADN y ARNm. (B) Durante la producción de AAV, un genoma único con código de barras es empaquetado por una única variante del gen de la tapa , lo que facilita la identificación de la cápside. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Valoración de una biblioteca AAV con código de barras mediante dd-PCR.
(A) Detección de gotitas positivas para PFJ en el canal 1 (FAM, Canal 1) para un control de agua no plantilla y una muestra vectorial diluida 1:10⁶ . (B) Detección de gotitas ITR-positivas en el canal 2 (HEX, Canal 2). (C) Detección de gotitas que son positivas tanto para rep2 como para ITR (resaltadas en naranja). Las líneas púrpuras indican umbrales para la detección de gotitas positivas frente a negativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Descripción general del fragmento de ADN utilizado para NGS y configuración para el análisis de Python.
La PCR NGS amplifica una región de 113 nucleótidos. Para el análisis bioinformático, se deben dar secuencias de reconocimiento derecha e izquierda del código de barras para ambas hebras, así como la distancia desde el comienzo del fragmento de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados jerárquicos.
(A) El ACP de los valores de concentración relativa para 82 cápsides en todos los tejidos permite definir grupos de variantes de cápside con propiedades similares y variantes con patrones de transducción únicos. (B) Para separar mejor el conglomerado altamente poblado, se excluyeron de la matriz los registros de variantes únicas periféricas y se repitió el análisis de PCA. (C) El análisis jerárquico de conglomerados permite evaluar visualmente los perfiles de transducción variantes a través de los tejidos como un diagrama de mapa de calor (Li = hígado, Lu = pulmón, FatB = grasa marrón, H = corazón, Di = diafragma, SM = músculo liso, Du = duodeno, P = páncreas, C = colon, BIC = bíceps, O = ovarios, St = estómago, I = oído interno, K = riñón, Aa = aorta abdominal, At = aorta torácica, B = cerebro, FatW = grasa blanca, y S = bazo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra	Blanco	Copias/20 μL de pocillo	Positivos	Ch1+ Ch2+	CF	Copias corregidas	DF	VG/ml
H2O	rep2	28	2	0	0	0	1,00E+06	5.60E+09
AAV2lib	rep2	90600	16396	16266	0.99	89882	1,00E+06	1.80E+13
H2O	YFP	4	3	2	0.67	3	1,00E+06	8.00E+08
BCAAVlib	YFP	34680	13229	12452	0.94	32643	1,00E+06	6,53E+12

Tabla 1: Resultados de titulación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV2 ("AAV2lib") y la biblioteca de vectores EYFP con código de barras ("BCAAVlib").

Discussion

En este protocolo, se describen los pasos necesarios para la ingeniería de la cápside AAV de visualización de péptidos y para la detección de bibliotecas AAV con código de barras, así como para el análisis bioinformático de la composición de la biblioteca y el rendimiento de la cápside. Este protocolo se centra en los pasos que facilitan el análisis bioinformático de este tipo de bibliotecas, porque la mayoría de los laboratorios de virología están rezagados en las habilidades de programación para que coincidan con su competencia en técnicas de biología molecular. Ambos tipos de bibliotecas han sido ampliamente descritos en la literatura, como se describe en la introducción, y se pueden reproducir con relativa facilidad.

Como primer paso, se describe el diseño de una biblioteca de visualización de péptidos en la posición 588 en la región variable VIII de AAV2. Este diseño (AAV2_Peptide(ii) en la publicación anterior 26) y el método de clonación descrito pueden adaptarse fácilmente a otros serotipos basándose en la información proporcionada en una publicación reciente²⁶. Un paso crítico en la tubería de clonación es la eficiencia de ligadura/transformación (utilizando el límite de ~1 x 10⁸ colonias). Se recomienda agregar una reacción de ligadura con solo vector. Esto ayuda a identificar el porcentaje de colonias bacterianas con inserto, que debe ser superior al 80%. Una eficiencia inferior a la esperada, es decir, un número de colonias bacterianas (calculando el porcentaje con inserto) inferior a la diversidad teórica de los insertos de oligonucleótidos, afectaría negativamente a las variantes de baja abundancia. Varias mejoras incluyen tiempos de digestión más largos y pasos de limpieza para la reacción vectorial o de ligadura, utilizando kits comerciales.

El siguiente paso es el control de calidad de la biblioteca de variantes utilizando NGS de un fragmento de PCR que abarca el sitio de inserción de oligonucleótidos. El NGS se realiza utilizando un sistema de secuenciación Illumina. Existen varias alternativas, en las que los productos de PCR se pueden enviar directamente sin preparación previa de la biblioteca NGS. Esto es más adecuado para experimentos a pequeña escala o cuando no se requiere una alta profundidad de lectura. El protocolo reportado aquí comprende la preparación de la biblioteca NGS, incluida la adición de adaptadores con índices Illumina a los productos de PCR, utilizando un kit disponible comercialmente. Una limitación común con respecto a NGS es que estos fragmentos de PCR tienen una baja diversidad, porque las secuencias que flanquean el sitio de inserción de alta diversidad son idénticas en todas las variantes, lo que a su vez reduce la eficiencia de secuenciación. Para abordar esto, este kit agrega cualquier número de dos a ocho nucleótidos aleatorios entre el fragmento de PCR y el adaptador. Alternativamente, la muestra debe ser enriquecida con PhiX. Se describe la canalización detallada de Python para analizar las bibliotecas de visualización de péptidos AAV2. Como plantilla, se proporcionan archivos de muestra extraídos del archivo NGS original de la biblioteca de visualización de péptidos AAV2. Esto se puede adaptar a otros serotipos con las instrucciones dadas. Los archivos de salida de este análisis se pueden utilizar en análisis posteriores, como la comparación de plásmidos y la biblioteca AAV 30, la composición de aminoácidos en cada posición³⁰, el cálculo de la puntuación de enriquecimiento entre bibliotecas después de las rondas de selección 14, o la generación de logotipos o gráficos de secuencia ¹⁹. En lo que respecta a la biblioteca de entrada, se desea la presencia de un alto porcentaje de variantes únicas. Sin embargo, algunas variantes no producen tan bien como otras, lo que podría conducir a distribuciones sesgadas después de la producción. Una baja diversidad de variantes, o en otras palabras, la presencia de variantes dominantes, podría atribuirse a la baja calidad del inserto de oligonucleótidos o a un elevado número de ciclos de síntesis de segunda cadena (paso 1.2). Además, la composición de aminoácidos podría verse afectada por la producción. Cada aminoácido debe tener una frecuencia de 5.00%. Si la distribución varía mucho de este valor, se sugiere realizar el mismo análisis en la biblioteca de plásmidos para identificar posibles sesgos³⁰.

Como los protocolos para la generación de bibliotecas AAV y las rondas de selección posteriores en diferentes modelos animales e in vitro se han descrito ampliamente en múltiples publicaciones y protocolos 27,30,31,32^, aquí solo se describe el análisis de bibliotecas con códigos de barras de variantes y puntos de referencia de ingeniería seleccionados. Cabe destacar que la clonación de la biblioteca después de cada ronda de selección se puede realizar mediante el aislamiento por PCR del gen cap, como se menciona en las secciones de protocolo y resultados. Las rondas extensas de selección y amplificación por PCR pueden conducir a la acumulación de mutaciones o codones de parada, que pueden ser observados por NGS. Alternativamente, las variantes enriquecidas pueden seleccionarse a partir de los datos de NGS, y los oligonucleótidos ordenados y clonados de la manera en que se ha descrito para la generación de una biblioteca de visualización de péptidos^16,18. Finalmente, el protocolo contiene una breve descripción para la selección de bibliotecas a nivel de ADN, 1 semana después de la inyección sistémica. Las selecciones basadas en ARN son más estrictas, ya que también seleccionan variantes que trafican a través de vías de entrada infecciosas, aunque técnicamente son más desafiantes. Cabe señalar que las selecciones basadas en ARN o transgenes (es decir, Cre) requieren una duración in vivo más larga de aproximadamente 3-4 semanas 15,16,17,18,19,33. Especialmente para las selecciones basadas en ADN, es fundamental validar las variantes seleccionadas contra serotipos naturales y diseñados conocidos tanto a nivel de ADN como de ARN utilizando una biblioteca AAV con código de barras.

La segunda parte del protocolo describe la generación y selección de bibliotecas AAV con código de barras utilizando la canalización desarrollada previamente²⁴. Cada cápside AAV en el grupo contiene el mismo transgén (eyfp bajo el control de un promotor de CMV) con un código de barras distinto entre eyfp y la señal polyA. Los códigos de barras utilizados en esta biblioteca se pueden encontrar en la publicación anterior²⁴. El diseño se basó en el principio básico de la distancia de Hamming (es decir, las secuencias de códigos de barras deben ser adecuadamente diferentes), de modo que los errores de secuenciación no conduzcan a asignaciones erróneas de códigos de barras. Como se describe en Lyons et al²⁶, la probabilidad de que ocurran dos errores en lecturas entre 25-100 nucleótidos es muy baja. Una distancia de Hamming de 4 significa que se necesitarían dos errores de secuenciación para asignar una lectura como código de barras incorrecto. Las lecturas con un error se ignorarán durante el análisis y, en este caso, se clasificarán como "lecturas con variantes desconocidas". En una publicación relevante, se proporcionan pautas y un script de Python para generar códigos^{de barras 29} que se pueden usar en la tubería. Para la identificación de códigos de barras útiles, se puede utilizar otro código popular de corrección de errores como se describe en la publicación de Buschmann y Bystrykh³⁴, a saber, la distancia de Levenshtein. Este grupo también proporciona un paquete de software para el lenguaje de programación R³⁵.

Después de la producción de AAV, la biblioteca AAV con código de barras agrupado se puede utilizar para estudios de biodistribución en diferentes modelos. Este estudio describe la canalización utilizando la biblioteca de 82 variantes de la publicación anterior²⁴ y proporciona datos de muestra para la práctica. Este protocolo también se puede adaptar en función de las necesidades de cada usuario. El análisis de biodistribución se basa en la recolección de diferentes tejidos o células ON y OFF-diana, la extracción de ADN y ARN de ellos, la amplificación por PCR de la región del código de barras para la secuenciación NGS y la medición de vg/dg a nivel de ADN. Para el ARN, sería mejor calcular la relación con el número de copias de ARNm de un gen de referencia. El gen de referencia de elección debe expresarse de manera similar en diferentes tejidos 36, como RPP30 (Ribonucleasa P/MRP Subunidad P30)³⁷ o Hprt (hipoxantina fosforribosiltransferasa 1)³⁶. Sin embargo, esto es arduo, por lo que es posible que sea necesario utilizar varios genes de referencia al mismo tiempo para normalizar los datos de ARN. Por esta razón, se puede completar la normalización a dg en el nivel de ADN, que se correlaciona aproximadamente con el número de células. Esto también señala el uso de qPCR para este cálculo, como se describió anteriormente²⁴, aunque la dd-PCR es más precisa y, por lo tanto, se prefiere para su uso futuro, especialmente considerando el progreso en este campo³⁷. Por último, pero no menos importante, las optimizaciones básicas de biología molecular son extremadamente críticas para la metodología descrita aquí. Las reacciones de PCR deben optimizarse para evitar introducir sesgos en la distribución de las bibliotecas. Las sondas dd-PCR deben diseñarse para incluir regiones intrónicas para el ADN y regiones interexónicas para el ARN. Las buenas prácticas de laboratorio, como la compartimentación física de los pasos, especialmente la producción de ADN y AAV a partir de la preparación de la biblioteca, y la desinfección adecuada son de suma importancia para evitar la amplificación errónea y la contaminación de la biblioteca.

En particular, el uso de bibliotecas de visualización de péptidos y códigos de barras vectoriales de ADN/ARN para seleccionar cápsides diseñadas con tropismos novedosos u otras propiedades clínicamente relevantes solo representa dos ejemplos de tecnologías de evolución de cápside AAV dirigidas. Todos tienen en común que vienen con limitaciones y requieren una mayor optimización para desarrollar todo su potencial. Por ejemplo, la mera inserción de un péptido deja una gran proporción (~99%) de la secuencia de la cápside subyacente sin cambios, cuyas propiedades, incluida la interacción con anticuerpos anti-AAV neutralizantes, podrían necesitar ser modificadas aún más antes de la aplicación humana³⁸. Además, la diversidad real de la visualización de péptidos u otras bibliotecas es típicamente menor que la teórica, debido, por ejemplo, a limitaciones técnicas durante la clonación o la transformación bacteriana³¹. En general, también existe un debate activo sobre la relevancia traslacional de la evolución dirigida en modelos animales o in vitro , fomentado por la creciente evidencia de un posible rendimiento específico de la especie o incluso de la cepa de las cápsides sintéticas de AAV³⁸. No obstante, existe una esperanza sustancial de que muchas o todas estas limitaciones se superen y que el arsenal actual de tecnologías se expanda a una variedad aún mayor de modelos de enfermedades y sea aún más accesible para la mayoría de los grupos de investigación. En este sentido, un desarrollo reciente particularmente alentador es el uso de bibliotecas AAV con códigos de barras, como las que se informan aquí, para validar cápsides seleccionadas ya no solo en el órgano, sino ahora también a nivel celular, lo que se puede lograr con tecnologías novedosas como la secuenciación de ARN unicelular (sc)³⁹. Los protocolos presentados aquí facilitarán el establecimiento más amplio de las técnicas de evolución de AAV y, por lo tanto, acelerarán el desarrollo de nuevas cápsides adaptadas a las necesidades de una gran cantidad de grupos de investigación y pacientes humanos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864003	dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28306	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28704	Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	12162	Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28104	Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer	Invitrogen (Waltham, MA, USA)	Q32857	NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Q32851	NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix	Qiagen (Venlo, Netherlands)	1044234	Taqman qPCR
rep_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC	dd-PCR primer
rep_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CAATCACGGCGCACATGT	dd-PCR primer
rep_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1	dd-PCR probe
RNase-free DNase	Qiagen (Venlo, Netherlands)	79254	DNA/RNA extraction
SfiI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0123	Digestion of vector
5 mm, steel Beads	Qiagen (Venlo, Netherlands)	69989	DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	M0202L	Plasmid library ligation
TissueLyserLT	Qiagen (Venlo, Netherlands)	85600	DNA/RNA extraction
YFP_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GAGCGCACCATCTTCTTCAAG	dd-PCR primer
YFP_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	TGTCGCCCTCGAACTTCAC	dd-PCR primer
YFP_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1	dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)	Zymo research (Irvine, CA, USA)	D4013	Vector and Ligation purification