Isolering av neste generasjons genterapivektorer gjennom engineering, strekkoding og screening av adeno-associated virus (AAV) kapsidvarianter

Summary

AAV peptid display bibliotek generering og påfølgende validering gjennom strekkoding av kandidater med nye egenskaper for etablering av neste generasjons AAVs.

Abstract

Genleveringsvektorer avledet fra adenoassosiert virus (AAV) er et av de mest lovende verktøyene for behandling av genetiske sykdommer, dokumentert ved oppmuntrende kliniske data og godkjenning av flere AAV-genterapier. To hovedårsaker til suksessen til AAV-vektorer er (i) den tidligere isoleringen av forskjellige naturlig forekommende virale serotyper med distinkte egenskaper, og (ii) den påfølgende etableringen av kraftige teknologier for molekylærteknikk og gjenbruk i høy gjennomstrømning. Ytterligere å øke potensialet i disse teknikkene er nylig implementerte strategier for strekkoding av utvalgte AAV-kapsider på DNA- og RNA-nivå, noe som muliggjør deres omfattende og parallelle in vivo-stratifisering i alle større organer og celletyper i et enkelt dyr. Her presenterer vi en grunnleggende pipeline som omfatter dette settet av komplementære veier, ved hjelp av AAV-peptidskjerm for å representere det mangfoldige arsenalet av tilgjengelige capsid engineering-teknologier. Følgelig beskriver vi først de sentrale trinnene for generering av et AAV-peptiddisplaybibliotek for in vivo-utvelgelse av kandidater med ønskede egenskaper, etterfulgt av en demonstrasjon av strekkode for de mest interessante kapsidvariantene for sekundær in vivo-screening. Deretter eksemplifiserer vi metodikken for opprettelse av biblioteker for neste generasjons sekvensering (NGS), inkludert strekkodeforsterkning og adapterligering, før vi avslutter med en oversikt over de mest kritiske trinnene under NGS-dataanalyse. Siden protokollene som er rapportert her er allsidige og tilpasningsdyktige, kan forskere enkelt utnytte dem til å berike de optimale AAV-kapsidvariantene i deres favorittsykdomsmodell og for genterapiapplikasjoner.

Introduction

Genoverføringsterapi er innføring av genetisk materiale i celler for å reparere, erstatte eller endre det cellulære genetiske materialet for å forebygge, behandle, kurere eller forbedre sykdom. Genoverføring, både in vivo og ex vivo, er avhengig av forskjellige leveringssystemer, ikke-virale og virale. Virus har utviklet seg naturlig for effektivt å transducere sine målceller og kan brukes som leveringsvektorer. Blant de forskjellige typer virale vektorer som brukes i genterapi, har adenoassosierte virus blitt brukt i økende grad på grunn av deres mangel på patogenisitet, sikkerhet, lav immunogenisitet og viktigst av alt deres evne til å opprettholde langsiktig, ikke-integrerende uttrykk ^1,2,3. AAV-genterapi har gitt betydelige prestasjoner det siste tiåret; tre behandlinger er godkjent av European Medicines Agency og US Food and Drug Administration for bruk hos mennesker ^3,4. Flere kliniske studier pågår også for å behandle en rekke sykdommer, som hemofili, muskel-, hjerte- og nevrologiske sykdommer, som gjennomgått andre steder³. Til tross for flere tiår med fremskritt har genterapifeltet opplevd en rekke tilbakeslag de siste årene⁴, viktigst dødsfall i kliniske studier⁵ som har blitt satt på vent på grunn av dosebegrensende toksisiteter, spesielt for vev som er massive, for eksempel muskler eller vanskelig å nå, for eksempel hjerne⁶.

AAV-vektorene som i dag brukes i kliniske studier, tilhører de naturlige serotypene, med noen få unntak:¹. AAV-engineering tilbyr muligheten til å utvikle vektorer med overlegen organ- eller cellespesifisitet og effektivitet. I løpet av de siste to tiårene har flere tilnærminger blitt brukt med suksess, for eksempel peptidvisning, loop-swap, kapsid-DNA-stokking, feilutsatt PCR og målrettet design, for å generere individuelle AAV-varianter eller biblioteker derav med forskjellige egenskaper⁷. Disse blir deretter utsatt for flere runder med rettet evolusjon for å velge variantene i dem med de ønskede egenskapene, som gjennomgått andre steder ^1,3. Av alle kapsidevolusjonsstrategiene har AAV-biblioteker med peptidvisning vært de mest brukte på grunn av noen unike egenskaper: de er relativt enkle å generere, og de kan oppnå høyt mangfold og høy gjennomstrømningssekvensering, noe som gjør det mulig å følge utviklingen.

De første vellykkede AAV-bibliotekene for peptidinnsetting ble beskrevet for snart 20 år siden. I en av de første konstruerte Perabo et ^al.8 et bibliotek av modifiserte AAV2-kapsider, hvor en pool av tilfeldig genererte oligonukleotider ble satt inn i et plasmid i en posisjon som tilsvarer aminosyre 587 av VP1-kapsidproteinet, i den trefoldige aksen som stikker ut fra kapsiden. Ved hjelp av adenovirus-koinfeksjon ble AAV-biblioteket utviklet gjennom flere seleksjonsrunder, og de endelige remålrettede variantene viste seg å være i stand til å transdusere cellelinjer som var refraktære mot foreldrenes AAV2⁸. Kort tid etter introduserte Müller et ^al.9 totrinnssystemet for bibliotekproduksjon, en betydelig forbedring av protokollen. I første omgang brukes plasmidbiblioteket, sammen med et adenoviralt hjelperplasmid, til å produsere et AAV-bibliotek som inneholder kimære kapsider. Dette AAV-skyttelbiblioteket brukes til å infisere celler ved lav infeksjonsgrad (MOI), med sikte på å introdusere ett virusgenom per celle. Koinfeksjon med adenovirus sikrer produksjon av AAVer med matchende genom og kapsid⁹. Omtrent et tiår senere brukte Dalkara¹⁰ in vivo-rettet evolusjon for å lage 7m8-varianten. Denne varianten har en 10 aminosyreinnsetting (LALGETTRPA), hvorav tre fungerer som linkere, og effektivt retter seg mot den ytre netthinnen etter intravitreal injeksjon¹⁰. Dette konstruerte kapsidet er en eksepsjonell suksesshistorie, da det er en av de få konstruerte kapsidene som har kommet seg til klinikken så langt¹¹.

Feltet opplevde et nytt løft med introduksjonen av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS). To publikasjoner fra Adachi et al.12 i 2014 og fra Marsic et ^al.13 i 2015, viste NGS' evne til å spore distribusjonen av strekkodede AAV-kapsidbiblioteker med høy nøyaktighet. Noen år senere ble NGS av strekkodede regioner tilpasset peptidinnføringsområdet for å følge kapsidutviklingen. Körbelin et ^al.14 utførte en NGS-veiledet screening for å identifisere et lungemålrettet AAV2-basert kapsid. NGS-analysen bidro til å beregne tre vurderingspoeng: anrikningspoengsummen mellom utvalgsrunder, den generelle spesifisitetspoengsummen for å bestemme vevsspesifisitet, og til slutt den kombinerte poengsummen¹⁴. Gradinaru lab¹⁵ publiserte Cre-recombination-based AAV targeted evolution (CREATE) system samme år, som muliggjør et celletypespesifikt utvalg. I dette systemet bærer kapsidbiblioteket en Cre-inverterbar bryter, da polyA-signalet er flankert av to loxP-steder. AAV-biblioteket injiseres deretter i Cre-mus, hvor polyA-signalet kun inverteres i Cre+-celler, og gir mal for binding av en omvendt PCR-primer med fremre primer i kapsidgenet. Denne svært spesifikke PCR-redningen gjorde det mulig å identifisere AAV-PHP. B-variant som kan krysse blod-hjernebarrieren¹⁵. Dette systemet ble videreutviklet til M-CREATE (Multiplexed-CREATE), der NGS og syntetisk bibliotekgenerering ble integrert i rørledningen¹⁶.

En forbedret RNA-basert versjon av dette systemet fra Maguire lab¹⁷, iTransduce, tillater seleksjon på DNA-nivået av kapsider som funksjonelt transducerer celler og uttrykker deres genomer. Det virale genomet til peptiddisplaybiblioteket består av et Cre-gen under kontroll av en allestedsnærværende promotor og kapsidgenet under kontroll av p41-promotoren. Biblioteket injiseres i mus som har en loxP-STOP-loxP-kassett oppstrøms tdTomato. Celler transdusert med AAV-varianter som uttrykker virusgenomet og derfor Cre uttrykker tdTomato og i kombinasjon med cellemarkører kan sorteres og selekteres¹⁷. På samme måte plasserte Nonnenmacher et al.18 og Tabebordbar et ^al.19 kapsidgenbiblioteket under kontroll av vevsspesifikke promotorer. Etter injeksjon i forskjellige dyremodeller ble viralt RNA brukt til å isolere kapsidvariantene.

En alternativ tilnærming er å bruke strekkoding til å merke capsid-biblioteker. Björklund^{lab 20} brukte denne tilnærmingen til strekkode peptid innsetting capsid biblioteker og utviklet strekkode rasjonell AAV vektor evolusjon (BRAVE). I et plasmid er Rep2Cap-kassetten klonet ved siden av et invertert terminal repeats (ITR)-flankert, gult fluorescerende protein (YFP)-uttrykkende, strekkodemerket transgen. Ved å bruke loxP-steder mellom slutten av hetten og begynnelsen av strekkoden, genererer en in vitro Cre-rekombinasjon et fragment som er lite nok for NGS, og tillater dermed assosiasjonen av peptidinnsetting med den unike strekkoden (oppslagstabell, LUT). AAV-produksjonen utføres ved hjelp av plasmidbiblioteket og strekkodene uttrykt i mRNA screenes etter in vivo-applikasjon , igjen med NGS²⁰. Når kapsidbibliotekene består av varianter av hele kapsidgenet (dvs. blandede biblioteker), må langlessekvensering brukes. Flere grupper har brukt strekkoder for å merke disse forskjellige bibliotekene, noe som muliggjør NGS med høyere lesedybde. Kay lab²¹ merket svært varierte capsid blandet biblioteker med strekkoder nedstrøms for cap polyA-signalet. I et første trinn ble et strekkodet plasmidbibliotek generert, og det blandede kapsidgenbiblioteket ble klonet inn i det. Deretter ble en kombinasjon av MiSeq (kort lest, høyere lesedybde) og PacBio (lang lest, lavere lesedybde) NGS samt Sanger-sekvensering brukt til å generere LUT²¹. I 2019 avgrenset Ogden og kolleger fra Kirkens laboratorium²² AAV2-kapsidegnetheten for flere funksjoner ved hjelp av biblioteker som hadde enkeltpunktmutasjoner, innsettinger og slettinger i hver posisjon, noe som til slutt muliggjorde maskinstyrt design. For genereringen av biblioteket ble mindre fragmenter av kapsidgenet syntetisert, merket med en strekkode, neste generasjons sekvensert og deretter klonet inn i det fulle kapsidgenet. NGS-dataene ble brukt til å generere en LUT. Biblioteket ble deretter screenet ved hjelp av bare strekkodene og kortlesingssekvenseringen, noe som igjen gir høyere lesedybde²².

Strekkodebiblioteker har hovedsakelig blitt brukt til å skjerme et basseng av kjente, naturlige og konstruerte varianter etter flere runder med utvalg av kapsidbiblioteker eller uavhengig av en kapsidevolusjonsstudie. Fordelen med slike biblioteker er muligheten til å skjerme flere kapsider, samtidig som antall dyr reduseres og variasjonen mellom dyr minimeres. De første studiene som introduserte denne teknologien på AAV-feltet ble publisert for snart ti år siden. Nakai lab 12 merket 191 doble alanin mutanter som dekker aminosyrer 356 til 736 på VP1 fra AAV9 med et par 12-nukleotid strekkoder. Ved hjelp av NGS ble biblioteket screenet in vivo for galaktosebinding og andre egenskaper¹². Marsic og kolleger avgrenset biodistribusjonen av AAV-varianter ved hjelp av en dobbelt streket analyse 1 år senere¹³. En nyere studie på ikke-menneskelige primater sammenlignet biodistribusjonen i sentralnervesystemet av 29 kapsider ved hjelp av forskjellige leveringsveier²³. Vårt laboratorium har nylig publisert strekkodede AAV-bibliotekskjermer med 183 varianter som inkluderte naturlige og konstruerte AAV-er. Disse skjermene på DNA- og RNA-nivå førte til identifisering av en svært myotrop AAV-variant²⁴ hos mus så vel som andre som viste en høy celletypespesifisitet i musehjernen²⁵.

Her beskriver vi metodikken som er brukt i dette arbeidet og utvider den til også å omfatte screening av AAV-peptiddisplaybiblioteker. Dette omfatter generering av AAV2 peptiddisplaybiblioteker, en digital dråpe-PCR (dd-PCR) metode for kvantifisering, og til slutt en NGS-pipeline for å analysere AAV-variantene, delvis basert på arbeidet til Weinmann og kolleger²⁴. Til slutt gis en beskrivelse av genereringen av strekkodede AAV-biblioteker og NGS-pipelinen som brukes i samme publikasjon.

Protocol

1. AAV2 tilfeldig 7-mer peptid display bibliotek forberedelse

MERK: For utarbeidelse av et AAV2 tilfeldig peptiddisplaybibliotek, syntetiser de degenererte oligonukleotidene som enkeltstrenget DNA, konverter det til dobbeltstrenget DNA, fordøy, ligat til akseptorplasmidet og elektroporat.

1. Design av degenererte oligonukleotider
   1. Bestill de degenererte oligonukleotidene og unngå kodonskjevhet. I oligonukleotidet 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', tilsvarer X01 20 kodoner, som hver koder for en av de 20 aminosyrene. W kan være A eller T, som produserer kodonene AGA eller AGT, som koder for aminosyrene arginin (R) eller serin (S).
   2. Bestill forsterkningsprimeren: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (se figur 1 for detaljer). Dette gir følgende proteininnsats: R/S G_{X 7}. Det teoretiske mangfoldet beregnes slik: 1 x 2 x 20⁷ = 2,56 x 10⁹ unike varianter.
      MERK: Det bør bemerkes at dette mangfoldet kan være begrenset av transformasjonseffektiviteten.
2. Andrestrengs syntese
   1. Resuspender begge oligonukleotidene (degenererte oligonukleotider og amplifikasjonsprimer) til en 100 μM endelig konsentrasjon med TE-buffer.
      1. For PCR-reaksjonen, sett opp en 50 μL-reaksjon med 1 μL av hver primer, 10 μL buffer, 1,5 μL DMSO, 0,5 μL dNTP (10 mM), 0,5 μL Hi-fidelity Hot Start Polymerase II og 35,5 μL nukleasefritt vann.
      2. Overfør reaksjonen til en termosyklist og kjør et pre-inkubasjonstrinn i 10 s ved 98 ° C, etterfulgt av tre sykluser på 10 s ved 98 ° C, 30 s ved 59 ° C og 10 s ved 72 ° C, deretter 5 minutter ved 72 ° C og et siste avkjølingstrinn.
   2. Rens reaksjonen ved hjelp av et nukleotidfjerningssett og eluer i 100 μL nukleasefritt vann.
   3. Bekreft effektiviteten av andrestrengssyntesen ved analyse på en bioanalysator (se figur 2). Analyser størrelsen og renheten til den dobbeltstrengede innsatsen ved å legge 1 μL av reaksjonen på en mikrofluidisk chip fra et DNA 1000-reagenssett i henhold til produsentens instruksjoner. Dette settet er optimalisert for å måle størrelsen og konsentrasjonen av dobbeltstrengede DNA-fragmenter fra 25-1000 bps.
3. Fordøyelse av innsats- og plasmidvektor
   1. Fordøy 85 μL av den rensede innsatsen med 10 μL 10x buffer og 5 μL BglI enzym i et endelig 100 μL reaksjonsvolum (se figur 1 for detaljer). Inkuber ved 37 °C over natten. Rens ved hjelp av et nukleotidfjerningssett, eluer i 50 μL nukleasefritt vann, og kvantifiser ved hjelp av typen "Oligo DNA" i et spektrofotometer.
   2. Fordøye 10 μg av et replikasjonskompetent AAV-plasmid (pRep2Cap2_PIS)²⁶ (ITR-flankert virusgenom) med 20 μL 10x buffer og 10 μL SfiI-enzym i et endelig 200 μL reaksjonsvolum (se figur 1 for detaljer). Inkuber ved 50 °C over natten. Rens vektoren på en 1% agarosegel ved hjelp av gelekstraksjonssettet etterfulgt av et ekstra rensetrinn ved hjelp av et DNA-rensesett. Kvantifiser konsentrasjonen i et spektrofotometer.
4. Ligering av innsats til vektor
   1. Ligat 955 ng plasmidvektor med 45 ng innsats med 2 μL buffer og 2 μL ligase i en 20 μL ligeringsreaksjon. Inkuber ved 16 °C over natten, etterfulgt av 10 minutter ved 70 °C for å varmeinaktivere ligasen.
5. Transformasjon, kompleksitetsberegning og klargjøring av plasmidbibliotek
   1. Rens reaksjonen med et DNA-rensesett i henhold til produsentens instruksjoner. Elute reaksjonen i ca. 80% av startvolumet av nukleasefritt vann og lagre på is for påfølgende transformasjon.
   2. Transformer elektrokompetente celler: tine ett hetteglass med elektrokompetente celler på is i 10 minutter. Deretter tilsettes 1-2 μL av den rensede ligeringsreaksjonen til 30 μL (ett hetteglass) elektrokompetente celler og blandes ved forsiktig å tappe. Deretter pipetterer du forsiktig cellen/DNA-blandingen til en forkjølt 1 mm elektroporeringskuvette uten å introdusere luftbobler.
   3. Elektroporer ved hjelp av følgende innstillinger: 1800 V, 600 Ω og 10 μF. Innen 10 sekunder fra elektroporasjonspulsen, tilsett 970 μL forvarmede gjenopprettingsmedier (utstyrt med de elektrokompetente cellene) til kyvetten og bland ved pipettering. Til slutt, overfør cellene til et mikrosentrifugerør og inkuber i 1 time ved 37 ° C ved 250 o / min. For å oppnå ønsket mangfold, utfør 10-100 reaksjoner, og etter inkubering, samle alle reaksjoner i ett rør.
   4. Beregn mangfoldet ved å fortynne 10 μL av de samlede transformasjonene 10-, 100- eller 1000 ganger i PBS og spre 100 μL på nærings-agarplater som inneholder passende antibiotika (75 mg / ml ampicillin). Inkuber agarplatene over natten ved 37 °C og tell deretter koloniene på agarplatene.
   5. Beregn det teoretiske mangfoldet som følger:
      Teoretisk maksimalt mangfold = 10 x fortynningsfaktor x antall kolonier x antall elektroporasjonsreaksjoner.
      MERK: For å bekrefte bibliotekets kvalitet, sekvenser minst 20 kolonier ved Sanger-sekvensering. De fleste kloner skal inneholde en innsats, og alle skal være unike.
   6. Inokuler 400-1000 ml LB-medium som inneholder passende antibiotika med resten av de samlede transformasjonene og inkuber over natten ved 37 °C, 180 o / min.
6. Utarbeidelse av plasmidbibliotek
   1. Fra nattens kultur, lag en glyserolbestand (bland like store mengder bakteriekultur og 50% glyseroloppløsning i nukleasefritt vann og frys ved -80 ° C) og rens plasmidbiblioteket ved hjelp av et plasmid maxi-sett.
7. Produksjon av AAV virusbibliotek
   1. Forbered virusbiblioteket som tidligere beskrevet²⁷. Transfekt plasmidbiblioteket (pRep2Cap2_PI, peptidinnsats) sammen med et adenohjelperplasmid til HEK293T-celler ved bruk av et transfeksjonsreagens som polyetylenimin (PEI).
   2. Samle cellene etter 3 dager og utsett dem for tre sykluser med fryse-tining. Rens det virale lysatet ved hjelp av cesiumkloridgradient ultrasentrifugering, etterfulgt av bufferutveksling til PBS, og til slutt konsentrere viruspartiklene.
8. AAV-vektortitrering med dd-PCR
   1. Seriell fortynn 2 μL av AAV-vektorstamen i 198 μL nukleasefritt vann for å gi en 1:10⁶ endelig fortynning. Bland grundig hver gang med en 200 μL pipette. Legg til én ikke-malkontroll (NTC) som en negativ kontroll.
      MERK: Ytterligere lavere eller høyere fortynninger kan analyseres (1:10;^5-1:10,⁷).
   2. Forbered en 20x primer-sondeblanding. Tilsett 3,6 μL av hver av de 100 μM primerne (fremover og bakover, Rep2 og ITR), 1 μL hver av de 100 μM dd-PCR-sondene (Rep2 og ITR), og 3,6 μL nukleasefritt vann til et 1,5 ml sentrifugerør.
      MERK: AAV-biblioteket måles ved hjelp av et transgenmålrettet primersondesett (Rep2) detektert med en FAM-merket sonde, og et ITR-målrettet primersondesett oppdaget med en HEX-merket sonde.
   3. Forbered en 22 μL PCR-reaksjon ved å tilsette 5,5 μL prøve, 1,1 μL 20x primersondeblanding, 11 μL dd-PCR supermix for sonder (ingen dUTP) og 4,4 μL nukleasefritt vann. Dette gir konsentrasjoner på 900 nM og 250 nM for henholdsvis primerne og sonden.
   4. Generer dråpene ved hjelp av en dråpegenerator, overfør reaksjonen til en 96-brønnsplate, plasser platen i en termosyklist og kjør et denatureringstrinn i 10 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 30 s ved 94 ° C og 1 min ved 58 ° C. Deretter varmeinaktiverer du polymerasen i 10 minutter ved 98 °C og legger til et siste kjøletrinn. Les reaksjonene i en dråpeleser og gå videre til analysen²⁸.
   5. Åpne den lagrede dd-PCR-platefilen ved hjelp av analyseprogramvaren. Bruk terskelverktøyet i kategorien 1D-amplitude (fluorescensamplitude kontra hendelsesnummer) til å skille de negative og positive dråpene for hver kanal, bruke NTC som veiledning, og eksportere dataene til en csv-fil.
   6. For å beregne vektorkonsentrasjonen, beregn først korreksjonsfaktoren CF ved hjelp av formelen:
      
      CF bestemmer andelen dråper som er positive for transgenet [positive] som er positive for både transgen og ITR [Ch1+ Ch2⁺], for å sikre påvisning av funksjonelle vektorpartikler. Den endelige vektorkonsentrasjonen c kan nå beregnes ved hjelp av følgende ligning:
      
      DF er fortynningsfaktoren (1:10,^5-1:10,⁷ , som bestemt tidligere). Kopiene per 20 μL/brønnreaksjon tilsvarer 5 μL av den fortynnede prøven. Faktoren 1000 korrigerer skalaen til VG/ml (virusgenom/ml). Et eksemplarisk titreringsresultat er vist i tabell 1 og figur 3.
9. Analyse av AAVs virusbibliotek ved NGS
   1. Forsterk 96-nukleotidpeptidinnføringsfragmentet ved å sette opp en 20 μL PCR-reaksjon ved hjelp av et korrekturavlesende polymerasesett (2x; se figur 4). Tilsett 1 μL AAV-stamløsning inneholdende 1 x 10⁸ vg, 0,5 μL av hver av 100 μM primer (NGS_forward og NGS_reverse) og 10 μL av enzymblandingen til reaksjonen. Juster det endelige volumet til 20 μL med nukleasefritt vann.
   2. Overfør reaksjonen til en termosyklist og kjør et denatureringstrinn i 3 minutter ved 98 ° C, etterfulgt av 30-35 sykluser på 10 s ved 98 ° C, 10 s ved 59 ° C og 20 s ved 72 ° C, etterfulgt av 5 minutter ved 72 ° C og et siste avkjølingstrinn.
   3. Rens prøvene ved hjelp av et PCR-rensesett. Kvantifiser konsentrasjonen i et spektrofotometer og kjør en 3% agarosegel for å verifisere renhet og fragmentstørrelse.
   4. Behandle PCR-fragmentene ved hjelp av biblioteksystemet for prøvesett med lav kompleksitet i henhold til produsentens instruksjoner for utarbeidelse av et NGS-bibliotek. Utfør sluttreparasjonsreaksjonen med 30 ng PCR-fragment, etterfulgt av adapterligering og PCR-amplifikasjon i 10 sykluser. Bruk PCR-rensesettet for rensing av reaksjonene.
   5. Behandle de endelige produktene på en bioanalysator for å verifisere størrelsen og renheten, ved hjelp av et DNA-reagenssett i henhold til produsentens instruksjoner.
   6. Kvantifiser forsterkerne ved hjelp av et fluorometer og samle dem. Kvantifiser det endelige samlede NGS-biblioteket igjen på et fluorometer (i henhold til produsentens instruksjoner) og kontroller kvaliteten på en bioanalysator.
   7. Sekvenser NGS-bibliotekene i en single-end (SE) modus, ved hjelp av en 75-syklus høy output kit, med en leselengde på 84 og en indeks 1 av 8.
      MERK: Sekvensering av eksemplene i denne artikkelen ble utført på GeneCore-anlegget til EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
   8. Analyser NGS-sekvenseringsdataene med Python 3 og biopython. Filene finner du på https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternativt på https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). NGS-analysen består av to trinn.
      1. I det første trinnet søker du i sekvensfilene etter sekvenser som tilfredsstiller visse kriterier (tilstedeværelse av gjenkjenningssekvenser som flankerer innsettingsstedet) (se figur 4, trinn 1.9.8.5.). Dette gjøres ved hjelp av et skript (Script # 1) og en konfigurasjonsfil som gir den nødvendige informasjonen. Når den riktige sekvensen er identifisert, trekker programmet ut og lagrer sekvensen i utdatafilen, som er en txt-fil med samme navn som sekvenseringsfilen.
      2. Det andre trinnet er analysen av utdatafilene. Sekvensene i biblioteket starter med en av seks nukleotider (AGWggc, W = A / T) i de ni aminosyreinnsatsene. Basert på denne startsekvensen blir peptidet oversatt. Dette genererer utdatafilene som inneholder peptidvariantene (PVer).
      3. Forbered to mapper: Skript og Data. Til Data-mappen kopierer du de gzip-komprimerte filene som følge av sekvenseringen. Til skriptmappen kopierer du følgende filer, Python-fil: Skript#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python-fil: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Oppsett fil: Barcode_Script_JoVE.conf; og oppslagstabell (LUT)-fil: Zuordnung.txt.
      4. Før du kjører skriptene, må du redigere følgende filer i Skript-mappen. Åpne filen "Zuordnung.txt" og legg til i to tabulatordelte kolonner, navnene på gzip-filene (kolonne 1) og ønsket sluttnavn (kolonne 2; tabulatordelte verdier).
         MERK: Eksempel på txt-filer finnes i GitHub-mappen "PV_analysis_script". Filene i GitHub-mappen er klargjort for analyse av tre eksempeldata fra biblioteket ovenfor: xaa.txt.gz, xab.txt.gz og xac.txt.gz. Utdatafilene er også gitt.
      5. Endre følgende variabler i konfigurasjonsfilen "Barcode_Script_JoVE.conf":
         my_dir = "~/data/"
         filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
         De sekvensspesifikke variablene: BCV_size = 27, BCV_venstre = TCCAGGGCCAG, BCV_høyre = GCCCAGG, BCV_loc = 30, BCV-margin = 8, BCV _{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC og BCV_{loc_revcomp} = 41 (se figur 4 for detaljer).
      6. Bruk følgende kommando til å kalle variantsekvensdeteksjonen og -ekstraksjonen:
         >python3 ~ / script # 1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~ / Barcode_Script_JoVE.conf
         MERK: Utdataene er txt-filer med ekstraherte DNA-sekvenser og deres antall leser. Overskriften til denne filen inneholder statistiske data (dvs. totalt antall leser og ekstrahert leser). Disse dataene overføres til de neste filene. Disse txt-dataene er inndatafilene for Script # 2, der DNA-sekvensene oversettes, rangeres og analyseres.
      7. Utfør PV-ekstraksjon og analyse ved hjelp av følgende kommando:
         >python3 ~ / script # 2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~ / Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analyser tekstutdatafilene til Script # 2. Utdatafilene til Script # 2 er navngitt ved hjelp av den andre kolonnen i LUT i "Zuordnung.txt" med utvidelser basert på typen analyse.
         MERK: Forsikre deg om at de tre utdatafilene inneholder statistiske data i de første radene ("# av gyldig PV leser", "# av ugyldig PV leser" og "# av unike PV leser"), en første kolonne med indeksen for hver DNA-sekvens fra inngangen txt-filer (utdata av Script # 1), og følgende kolonner: (1) "... analyzed_all.csv": "Sample:" (DNA-sekvens), "#" (antall avlesninger), "Frw eller Rev" (fremover eller bakover lest) og "PVs" (oversatt peptidsekvens). De ugyldige sekvensene har "NA" og "not valid" i de to siste kolonnene. (2) "... analyzed_validSeq.csv": samme som forrige fil, filtrert for gyldige sekvenser. (3) "... analyzed_PV.csv": "PVs" (oversatt peptidsekvens), "#" (antall lesninger) og "count" (frw- og rev-tellingene i de forrige filene slås sammen og antallet gis 1 eller 2).
      9. Visualiser utdatafilene ved hjelp av tilgjengelig programvare basert på brukerens behov.

2. AAV2 tilfeldig 7-mer peptid display bibliotek utvalg

1. Bruk AAV-biblioteket etter kvantifisering og kvalitetskontroll (del 1) for rettet evolusjon i en valgfri modell for iterativt å velge ut kandidater med ønskede egenskaper (Se figur 5)^16,18,21.
   MERK: Disse kandidatene brukes deretter til å generere et strekkodebibliotek som beskrevet nedenfor i avsnitt 3.

3. Utarbeidelse og analyse av AAV-kapsidbibliotek med strekkode

MERK: Etter identifisering av et sett med potensielt spesifikke og effektive AAV-kapsider i peptiddisplayet, verifiser funksjonaliteten til de identifiserte peptidsekvensene og sammenlign dem med et sett med vanlig brukte eller godt beskrevne referanse AAV kapsidvarianter. For å gjøre dette settes kapsidsekvensen inn i en Rep/Cap-hjelperkonstruksjon uten ITR-er.

1. Produksjon av AAV-bibliotek med strekkode
   1. Utfør rekombinant AAV-produksjon for hver kapsidvariant ved bruk av treplasmidsystemet, som tidligere beskrevet²⁴.
      MERK: For å skille de forskjellige kapsidvariantene, har den ITR-flankerte reporteren transgene plasmid en unik strekkode på 15 nukleotider i lengde. Strekkoden er plassert ved 3' UTR (uoversatt region) mellom det forbedrede gule fluorescerende proteinet (EYFP) og polyA-signalet (se figur 6A). EYFP-ekspresjon drives av en sterk allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promotor som gir tilstrekkelige nivåer av RNA-transkripter.
   2. Design strekkoder på 15 nukleotider i lengde med homopolymerer med mindre enn tre nukleotider, GC-innhold på <65%²⁹ og en Hamming avstand større enn fire nukleotider²⁴.
   3. Produser hvert kapsid separat i kombinasjon med et transgent plasmid som bærer en unik strekkode. På denne måten merkes hver kapsidvariant med en distinkt strekkode som muliggjør spesifikk sporing (se figur 6B).
2. AAV-vektortitrering med dd-PCR
   1. Utfør AAV-titreringen som tidligere beskrevet i pkt. 1.8 ved å erstatte Rep2-primerparet med YFP-primerparet.
   2. Kvantifiser de enkelte AAV-produksjonene og samle like mengder av hver produksjon for å generere det endelige strekkodebiblioteket.
   3. Kvantifiser det endelige biblioteket igjen for å sjekke den endelige konsentrasjonen og kvaliteten (se figur 7).
3. Strekkodet AAV-bibliotek in vivo-applikasjon
   1. Påfør det strekkodede AAV-biblioteket systemisk på det valgte modellsystemet (f.eks. systemisk i mus²⁴).
   2. Samle ON- og OFF-target vev (dvs. lever, lunge, hjerte, membran, glatt muskulatur, tolvfingertarm, bukspyttkjertel, kolon, biceps, eggstokkene, mage, indre øre, nyre, abdominal aorta, thorax aorta, hjerne, brunt og hvitt fett og milt) eller celletyper basert på eksperimentet. Frys dem ved -80 °C, trekk ut DNA/RNA, og bruk NGS-kvantitasjonsanalyse, som beskrevet i neste avsnitt.
4. DNA / RNA-ekstraksjon
   1. Ekstraher DNA og RNA fra vevet av interesse ved hjelp av DNA / RNA Mini Kit.
   2. Plasser et lite stykke vev av interesse (1 mm³, ca. 5 mg) i et 2 ml reaksjonsrør.
   3. Tilsett 350 μL lysisbuffer blandet med β-merkaptoetanol (1%) og 5 mm stålperler til vevet (håndter prøver med β-merkaptoetanol under en avtrekkshette).
   4. Homogeniser vevet i et vevLyser i 45 s ved 40 Hz.
   5. Tilsett 10 μL proteinase K (10 mg/ml) og inkuber i 15 minutter ved 55 °C mens du rister ved 400 o / min.
   6. Sentrifuge ved 20 000 x g i 3 minutter ved romtemperatur, samle supernatanten og fortsett med produsentens protokoll for DNA / RNA-settet.
   7. Del vasketrinnet i to trinn med 350 μL vaskebuffer i hvert trinn. Mellom disse vasketrinnene, fordøy resten av DNA på kolonnen med RNase-fri DNase I. Tilsett 80 μL av DNase I-løsningen, tilberedt i henhold til produsentens instruksjoner, på kolonnen og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
   8. Elute RNA/DNA fra kolonnen med nukleasefritt vann. Oppbevar isolert RNA ved -80 °C og gDNA ved -20 °C.
5. cDNA-syntese
   1. Utsett RNA-prøvene for en ny runde med DNase I-behandling på 15-30 minutter (for fullstendig fjerning av forurensende DNA fra RNA-prøvene) før reverstranskripsjonsreaksjonen. Tilsett 1 μL av DNase I-løsningen, 4 μL buffer (følger med settet) og nukleasefritt vann til et endelig volum på 40 μL til 212 ng RNA. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur og varm inaktiver ved 70 °C i 10 minutter.
   2. Syntetiser cDNA, bruk 150 ng RNA ved hjelp av et sett i henhold til produsentens instruksjoner. Inkluder kontroller uten revers transkriptase, for å sikre fravær av forurensende viralt DNA fra prøven. DNA-et lagres ved -20 °C.
      MERK: Mengden inngangs-RNA for optimal revers transkripsjon kan variere avhengig av vevstype og forventet transduksjonseffektivitet i det respektive vevet.
6. Analyse av AAV virusbibliotek (in-vivo) av NGS
   1. For å oppnå høy sekvenseringsdybde til lave kostnader, utfør NGS via Illumina-sekvensering som tidligere beskrevet (pkt. 1.9). Forsterk strekkodesekvensen, og liger deretter sekvenseringsadapterne til forsterkeren.
   2. På grunn av den korte leselengden og ligeringen av sekvenseringsadapterne på begge sider av forsterkeren, må du kontrollere at amplikonen er tilstrekkelig liten til å sikre tilstedeværelse av strekkodesekvensen i NGS-avlesningen. For sekvensering av strekkodene i virusgenomene og virustranskripsjonene er PCR-amplikonen designet for å være 113 bp lang (se figur 8).
   3. Forsterk det strekkodede området med primerne BC-seq fremover og BC-seq bakover. Forbered følgende PCR-reaksjon: 0,5 μL Hi-fidelity DNA-polymerase, 10 μL 5x buffer, 0,25 μL av hver 100 μM primer (BC-seq fw / BC-seq rv) og 1 μl 10 mM dNTP. Bruk 25 ng av cDNA eller DNA / reaksjonen som en mal og juster det endelige volumet til 50 μL med nukleasefritt vann.
   4. Forbered PCR-masterblandingen under en ren PCR-hette for å unngå forurensning. Bruk følgende sykkelforhold: 30 s ved 98 °C, etterfulgt av 40 sykluser ved 98 °C i 10 s og 72 °C i 20 s, og et siste 5 minutters trinn ved 72 °C.
   5. Inkluder PCR-kontroller for å bekrefte fraværet av forurensende DNA i PCR-masterblandingen. For cDNA-prøvene, inkluder kontrollene uten revers transkriptase. Til slutt inkluderer du et eksempel med AAV-inndatabiblioteket. Denne informasjonen vil bli brukt til å generere den Normalization_Variant.txt filen som brukes i analysen.
   6. Kontroller størrelsen på PCR-fragmentet av hver prøve ved gelelektroforese før PCR-rensing. Sistnevnte oppnås ved å bruke enten kommersielt tilgjengelige magnetiske perler eller kolonnebaserte DNA-rensesystemer (se materialtabell).
   7. Forbered NGS-biblioteket ved hjelp av biblioteksystemet for prøver med lav kompleksitet i henhold til produsentens instruksjoner, som tidligere beskrevet i avsnitt 1.9.
   8. Bestem DNA-konsentrasjonen via dsDNA HS-settet og analyser kvaliteten på biblioteket som tidligere beskrevet (seksjon 1.9.6), etterfulgt av sammenslåing. Kvantifiser det samlede biblioteket på et fluorometer og vurder kvaliteten på en bioanalysator.
   9. Utfør NGS-sekvensering som omtalt i pkt. 1.9.7.
   10. Kvantifiser ved qPCR kopinummeret til transgenet (virale genomer) og husholdningsgenet for å vurdere fordelingen av det samlede biblioteket mellom vev eller organer på DNA.
   11. Sett opp en 30 μL qPCR-reaksjon som følger, for å bestemme kopinummeret til EYFP (transgen) og GAPDH (glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, husholdningsgen):
       1. Forbered en 60x primer/sondeblanding for EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv og 0,6 μM YFP_probe; se materialfortegnelse). Bruk GAPDH primer/probe mix (se Table of Materials) for å bestemme kopinummeret til husholderskegenet. Sett opp reaksjonen på is.
       2. Forbered en PCR-masterblanding (15 μL, se materialfortegnelse) og tilsett 60x primer/sondeblanding (0,5 μL) for alle prøver og standarder (for å beregne kopinumre for standardene, bruk følgende lenke: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Sett opp reaksjonen på is.
       3. Overfør 15,5 μL av masterblandingen til en 96-brønnsplate og tilsett 14,5 μL prøve (75 ng av total DNA-konsentrasjon) eller standard til den respektive brønnen. Forsegl platen med 96 brønner med folie, virvel og spinn kort.
       4. Overfør 10 μL av hver prøve til en 384-brønnplate i duplikater. Forsegl platen med folie og sentrifugering ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C.
       5. Inkuber reaksjonsblandingen i en termosyklist ved å bruke en innledende temperatur på 50 °C i 2 minutter, etterfulgt av et innledende aktiveringstrinn på 10 minutter ved 95 °C. Utfør 40 sykluser med denaturering ved 95 °C i 15 s og glødning/forlengelse ved 60 °C i 1 min²⁴.
       6. For å få antall diploide genomer (dg), bruk GAPDH-kopinummeret og divider med to. Ta deretter verdien av EYFP-kopinummeret og divider med antall dg, noe som resulterer i vektorgenomer per diploid genom (vg / dg). Bruk denne verdien til å generere Normalization_Organ.txt filen for bioinformatisk analyse.
   12. Utfør analysen av NGS-sekvenseringsdataene som Weinmann et al.²⁴, ved hjelp av egendefinert kode i Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Arbeidsflyten omfatter deteksjon av strekkodesekvenser styrt av flankerende sekvenser, deres lengde og plassering (Script#1_BarcodeDetection.py), samt analyse av strekkodeberikelse og distribusjon over vevssettet (Script#2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Oppdag strekkode og tilordne dem til AAV-varianter. Plasser sekvenseringsdataene som arkiverte fastq-filer i én katalog (for eksempel "Data_to_analyze"). Sekvensdatafilen for inndatabiblioteket er inkludert i denne mappen og brukes bare til å beregne kapsidproporsjonene i inndatabiblioteket.
       2. Før du kjører skriptet, må du opprette to tabulatordelte tekstfiler: capsid-variantfilen (se eksempelfilen "Varianter.txt") med strekkodesekvensene som er tilordnet AAV-kapsidvariantnavn, og forurensningsfilen (se "Forurensninger.txt") med strekkodesekvenser som kommer fra mulig forurensning (andre strekkoder tilgjengelig i laboratoriet, noe som bidrar til forurensning).
       3. Til slutt redigerer du konfigurasjonsfilen "Barcode_Script.conf" for å inkludere følgende informasjon: bane til mappe med sekvenseringsdata (f.eks. "Data_to_analyze"), sekvens av flankerende regioner av strekkodene, deres posisjon og vindusstørrelse for strekkodedeteksjon (tilsvarende 1.9.8.5, se figur 8).
       4. Bruk følgende kommando til å kreve strekkodegjenkjenning med angitte baner til Script#1_BarcodeDetection.py og konfigurasjonsfiler:
          >python3 ~ / script # 1_BarcodeDetection.py ~ / Barcode_Script.conf
          MERK: Utdataene fra skript#1_BarcodeDetection.py kjøring er tekstfiler med leseantall per kapsidvariant, samt totalt antall lesinger som gjenopprettes fra rådataene.
       5. Evaluere fordelingen av strekkodede AAV-kapsider mellom vev eller organer, ved å utføre Script#2_BarcodeAnalysis.py sammen med følgende txt-filer:
          1. I "Zuordnung.txt" -filen, tilordne navnet til hver txt-fil hentet fra strekkodedeteksjonskjøringen til et vev / organnavn: navn på txt-filer i den første kolonnen og tilsvarende vev / organnavn i tabulatordelt oppgave.
             MERK: For eksempel, sjekk inn "Eksempel" -mappen (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Merk at vevs-/organnavnet kan inneholde tegn som definerer cDNA- eller gDNA-måling og biologisk replikasjonsnummer (M1, M2, etc.).
          2. Opprett en "organs.txt" tekstfil med listen over navn for ON- og OFF-target organer, som tilsvarer navnene gitt i oppgaven "Zuordnung.txt" fil (se "Eksempel" mappe: https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Opprett tabulatordelte tekstfiler med "Normalization_Organ.txt" og "Normalization_Variant.txt" med normaliserte verdier for alle kapsidvarianter og alle organer/vev. I den første kolonnen i "Normalization_Organ.txt" -filen skriver du navnene som er gitt for hvert organ (som i oppdragsfilen "Zuordnung.txt") og i den andre kolonnen normaliseringsverdiene for de tilsvarende vevene, generert i seksjon 3.6.11.
          4. Fyll den første kolonnen i "Normalization_Variant.txt" -filen med listen over kapsidnavn og den andre kolonnen med de normaliserte verdiene for leseantallet for hver kapsid i det samlede biblioteket (normalisering kan beregnes basert på txt-utdatafilen for inngangsbiblioteket som følge av det første skriptet).
          5. Rediger konfigurasjonsfilen ved å angi de fullstendige banene til alle tilleggsfilene nevnt ovenfor. Kjør skript#2_BarcodeAnalysis.py som:
             >python3 / script # 2_BarcodeAnalysis.py ~ / Barcode_Script.conf
             MERK: Strekkodeanalyseskriptet sender ut flere filer: tekstfiler med relativ konsentrasjon (RC) verdier av kapsidfordeling i forskjellige vev basert på flere normaliseringstrinn beskrevet tidligere, og regnearkfilen som kombinerer tekstfildata til sammenslåtte matrisedata. Sistnevnte kan brukes til klyngeanalyse og visualisering.
          6. Visualiser dataene og utfør klyngeanalyse av matrisedataene for å skille mellom kapsidegenskaper og evaluere deres likheter basert på RC-profiler på tvers av vev. Bruk tilleggsskriptet PCA_heatmap_plot. R plassert i depotet:
             >Rscript - vanilje ~ / PCA. R ~/relativ konsentrasjon.xls
             MERK: Skriptet tar relative.xls filer som input og genererer to plott av hierarkisk klyngevarmekart og hovedkomponentanalyse (PCA).
          7. For å endre plott (akser for varmekart, hovedkomponenter i PCA) eller png-parametere (farge, størrelse, merking), åpne R-skriptet og følg instruksjonene i de kommenterte seksjonene.

Representative Results

Generering av et AAV2 peptiddisplaybibliotek. Som et første skritt mot utvelgelsen av konstruerte AAV-er, beskrives genereringen av et plasmidbibliotek. Peptidinnsatsen produseres ved å bruke degenererte primere. Å redusere kombinasjonen av kodoner i de fra 64 til 20 har fordelene ved å eliminere stoppkodoner og legge til rette for NGS-analyse, ved å redusere bibliotekets mangfold på DNA, men ikke proteinnivået. Oligonukleotidinnsatsen kjøpes som enkelttrådet DNA (figur 1), som omdannes til dobbeltstrenget DNA ved PCR-reaksjon. Kvaliteten på denne reaksjonen styres i en bioanalysator. Som vist i figur 2 ga tre sykluser et sterkere bånd, sammenlignet med 10 eller 30 sykluser. Innsatsen fordøyes deretter med BglI for å generere tre-nukleotidoverheng. Nukleotidet ved siden av overhengssekvensen til den dobbeltstrengede innsatsen kan være en A eller en T (W er tvetydighetskoden for A eller T), som er i den tredje posisjonen til et kodon som koder for arginin (R) eller serin (S). Vektoren (pRep2Cap2_PIS) har en rammeskiftmutasjon i peptidinnføringsstedet som forhindrer produksjon av kapsiden i fravær av et innlegg, på grunn av dannelsen av et stoppkodon kort tid etter innføringsstedet. SfiI fordøyelse av dette plasmidet genererer tre-nukleotid overheng som samsvarer med overhengene generert i peptid-kodende oligonukleotidinnsats. Ligering må utføres under optimale forhold for å maksimere kompleksiteten til plasmidbiblioteket. Til dette formål, for transformasjonen, ble elektroporering utført ved bruk av kommersielt tilgjengelige bakterier med høy effektivitet.

Mangfoldet i plasmidbiblioteket beregnes ut fra kolonitellingen, som vanligvis er rundt 1 x 10⁸ for denne typen bibliotek. Det totale antall kolonier tilsvarer det maksimale potensielle mangfoldet i biblioteket ved NGS-analysen, som diskuteres senere. Plasmidbiblioteket brukes da til å generere AAV-biblioteket, som ikke er beskrevet i detalj her, men andre steder²⁷.

Kvantifiseringen av dette biblioteket ble utført ved hjelp av dd-PCR. Vanligvis kvantifiseres to regioner, AAV2-rep-genet i virusgenomet og ITR (se figur 3 og tabell 1). Som vist i tabell 1 er 99,2 % av dråpene positive for virusgenomet også positive for ITR (Ch1+ Ch2⁺), som er en kvalitetskontroll for AAV-biblioteket og antyder at AAV-kapsidene inneholder fulle virusgenomer. For å oppnå en konsentrasjon i vg/ml beregnes andelen dobbeltpositive dråper til positive og brukes for å få riktig antall kopier før forsterkning med fortynningsfaktoren.

Kvaliteten på AAV-biblioteket vurderes deretter ved hjelp av NGS-analyse, med utgangspunkt i en PCR med passende primere. Deretter behandles PCR-produktet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett, som legger til indeksholdige adaptere til PCR-produktet. NGS-produktene sekvenseres, og filene analyseres ved hjelp av Python. Tre eksempeldata fra et AAV2-peptidvisningsbibliotek er tilgjengelig. Hver sekvens i Script#1-inndatafilen (liste over sekvenser av alle PCR-kopiene av det amplifiserte DNA-segmentet i prøven) søkes bioinformatisk etter BCV-venstre_- og BCV-høyresekvensene, eller BCV-left_comp- og BCV-right_comp-sekvensene. Hvis en av kombinasjonene identifiseres, blir den inneholdte sekvensen trukket ut og lagt til utdatafilen (se figur 4). Utdataene fra begge skriptene gir statistiske data angående NGS-bibliotekets forberedelse. I alle tre settene representerte de ekstraherte lesningene, basert på signatursekvenser som er spesifikke for biblioteket, omtrent 94% av de totale lesningene, noe som antyder en god kvalitet. Resultatet av Script#2 gir ytterligere statistiske data, og oversettelsen av den ekstraherte DNA-sekvensen gir ytterligere kvalitetskontrolldata. "# av ugyldig PV leser" (dvs. sekvenser som mangler de seks nukleotidene som brukes til å starte in-silico-oversettelsen og kode rester RG eller SG) er mindre enn 1% av de gjenopprettede lesningene, noe som bekrefter en god sekvenseringskvalitet. Utgangene fra det andre skriptet (dvs. oversettelsen og rangeringen av de ekstraherte DNA-sekvensene) gir tilleggsinformasjon, for eksempel antall avlesninger per peptidvariant eller antall DNA-sekvenser som gir opphav til hver peptidvariant. Av filene inneholder de som slutter på "analyzed_PVs" bare gyldige DNA-avlesninger, og analysen utføres på peptidsekvensnivå. Av de gyldige lesningene er mer enn 99% unike, noe som tyder på at biblioteket er balansert, og det interne mangfoldet er høyt.

Valg av et AAV2 peptidvisningsbibliotek. Dette biblioteket kan deretter brukes til in vivo eller in vitro utvalg. Dette er ikke inkludert i denne protokollen, men en oversikt er gitt i figur 5. Kort sagt, for in vivo seleksjon, samles vevene 1 uke etter systemisk injeksjon av 1 x 10^{12 vg} / mus og DNA isoleres. En rednings-PCR på et større fragment av cap-genet utføres, og produktet klones inn i plasmidvektoren ved hjelp av forskjellige restriksjonssteder, men en lignende protokoll som det som er beskrevet her, og runde 1 AAV-biblioteker utarbeides. For NGS-analysen utføres PCR på det isolerte DNA- eller AAV-biblioteket. Etter utvelgelse reduseres prosentandelen unike PV-er i biblioteket vanligvis i henhold til utvalgstrykket. Avhengig av prosjektet kan utvalget konkluderes når nok dominerende PV er identifisert av NGS.

Strekkodet bibliotekvalg og analyse. Dataene fra et strekkodet AAV-bibliotek med 82 kapsider er beskrevet tidligere²⁴. dd-PCR-kvantifiseringen av AAV-partiklene (se figur 7 og tabell 1) viser at 94 % av kapsidene som er positive for transgenet også inneholder en ITR, noe som indikerer et komplett genom. Dette er lavere enn villtypebiblioteket beskrevet ovenfor, men antyder fortsatt en god kvalitet for rekombinante AAV-er, med tanke på at de vanligvis pakker mindre effektivt. Etter injeksjon av det samlede biblioteket i dyr samles vevene, og DNA og RNA isoleres. PCR for NGS samt NGS bibliotekklargjøring og sekvensering utføres deretter som beskrevet ovenfor og tidligere²⁴. For å beregne vg / dg utføres qPCR, og i de oppgitte prøvedataene varierer verdiene fra 0,1-4. Som typisk for systemisk AAV-forløsning har leveren over 10 vg/dg.

Som en del av analysepipelinen utføres normaliseringstrinn på forskjellige nivåer. I det inndatagrupperte biblioteket er kapsidvariantene vanligvis ikke likt representert. Derfor brukes NGS-analysen av inngangsbiblioteket til å generere en normaliseringsfil, som korrigerer overflod av hver kapsidvariant i det endelige vevet/organet basert på overflod av denne kapsidvarianten i inngangsbiblioteket. Biodistribusjonen av de samlede bibliotekmedlemmene av NGS utføres på DNA- og RNA-nivå. Denne normaliseringen for inngangsbiblioteket gir kvotienten (P*αβ) av proporsjonen i vevet/organet (P_αβ) til andelen i inngangsbiblioteket (L_a). Disse beregningene finner du i "variant_comparison.txt" -filen. Denne kvotienten multipliseres deretter med vg / dg-verdiene fra "Normalization_organ.txt" -filen for å gi verdien Β αβ, og proporsjonene av Β_αβ-verdier beregnes for et enkelt vev eller for alle. Andelen av β αβ-verdien for hver variant i ett vev (V_αβ) gjenspeiler spredningen av denne varianten i dette vevet ("organ_comparison.txt"). I motsetning til dette indikerer andelen av β αβ-verdien for hver variant i alle vev (T_αβ) spredningen av denne varianten i hele kroppen ("relativeconcetrations.xls"). Disse to proporsjonene gjenspeiler intra- og intervevsbiodistribusjonen av hver variant. Alle disse filene kan brukes til forskjellige visualiseringer av kapsideffektivitet og spesifisitet²⁴. Som et eksempel, ved å bruke den endelige tabellen (funnet i "relativeconcetrations.xls"), er hovedkomponentanalysen og hierarkisk gruppering presentert i figur 9.

Normaliseringen av det samlede biblioteket fra NGS-sekvenseringen viser at hvert kapsid har en gjennomsnittlig andel på 0,012, som også samsvarer med den teoretiske andelen av hver av de 82 kapsidene og antyder et velbalansert samlet bibliotek på 0,012 (1/82). Filen "relativ konsentrasjon.xls" generert av den bioinformatiske rørledningen gjenspeiler biodistribusjonen mellom vevskapsid, som illustrert i figur 9. Varmekartet viser relative konsentrasjonsverdier på en log2-skala for hver kapsid i det samlede biblioteket hierarkisk gruppert i henhold til vevets biodistribusjonsprofil. Hovedkomponentanalysen gjør det mulig å skille klynger av AAV-kapsidvarianter med lignende biodistribusjonsegenskaper og fremhever også de ytre kapsidene med unike mønstre av biodistribusjon mellom vev. De to hovedgrenene i varmekarthierarkiet gjenspeiler forskjellen i transduksjonseffektiviteten til kapsidvarianter. Den venstre grenen med flertallet av kapsidvariantene inkluderer alle kapsidene, som viser en høy verdi av relativ konsentrasjon over flertallet av vev. Bortsett fra påfallende høy leverspesifisitet, viste tre andre kapsider (Var60, Var13 og Var63) spesifisitet i mellomgulvet (Di), skjelettmuskulaturen (SM), biceps (BlC) og i hjernen (B). Den høyre grenen av den hierarkiske klyngen inkluderer kapsidvariantene med generell lavere transduksjonseffektivitet, som er uttalt i tolvfingertarmen (Du) og bukspyttkjertelen (P). PCA for den opprinnelige delmengden danner klyngen av kapsidvarianter med høy leverspesifisitet (Var 64, 78, 65, 55, 56) og skisserer Var60-kapsidet med fremragende muskeltropisme.

Figur 1: Oversikt over kloningsstrategien for AAV2 random 7-mer peptide display library.
Oligonukleotidet med den tilfeldige 7-mer peptidinnsettingssekvensen er flankert av sekvenser som inneholder BglI fordøyelsesstedet og et bindingssted for amplifikasjonsreaksjonen. Vektoren inneholder pRep2Cap2_PIS SfiI-nettsteder. Overhengene som genereres av BglI og SflI fordøyelsen er komplementære. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Bioanalysator kvalitetskontroll av oligonukleotid andrestrengssyntese.
Andrestrengssyntese av degenererte oligonukleotider bekreftes ved analyse på en bioanalysator. PCR-reaksjoner med tre, 10 og 30 amplifikasjonssykluser sammenlignes, noe som viser at den mest effektive er de tre amplifikasjonssyklusene. (A) Bioanalysatordata representert som gelbilde. (VG Nett) Plottede fragmentlengder (i bp, x-akse) versus fluorescensenheter (FU, y-aksen), sammenlignet med standardtopper, synlige ved 15 og 1500 bp. Røde piler indikerer dobbeltstrengede oligonukleotider. Merk at den høyeste FU-verdien, som representerer den høyeste DNA-konsentrasjonen, av dobbeltstrengede oligonukleotider observeres etter tre amplifikasjonssykluser (røde piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Titrering av et AAV2-peptiddisplaybibliotek ved bruk av dd-PCR.
(A) Påvisning av rep2-positive dråper i kanal 1 (FAM, kanal 1) for en vannkontroll som ikke er mal, og en 1:10⁶ fortynnet virusprøve. (B) Påvisning av ITR-positive dråper i kanal 2 (HEX, kanal 2). (C) Påvisning av dråper som er positive for både rep2 og ITR (uthevet i oransje). Lilla linjer angir terskler for påvisning av positive versus negative dråper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Oversikt over DNA-fragmentet som brukes til NGS og innstillinger for pythonanalysen.
NGS PCR forsterker en 96-nukleotidregion. PCR-fragmentet brukes til å generere NGS-biblioteket. For bioinformatisk analyse må gjenkjenningssekvenser til høyre og venstre for innsettingsstedet gis for begge tråder, samt avstanden fra begynnelsen av DNA-fragmentet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Iterativt utvalg av AAV-biblioteker in vivo.
Mus injiseres i AAV-biblioteket. Mål ON- og OFF-vev samles 1 uke senere og underkastes NGS og analyse. ON-målvevet brukes til å redde kapsidgenet, som klones inn i foreldrevektoren. Det valgte AAV-biblioteket produseres og brukes til å gjenta den nevnte utvalgssyklusen. Denne figuren ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Oversikt over generering av AAV-bibliotek med strekkode.
(A) Grafisk fremstilling av et selvkomplementært AAV-genom med et CMV-promotordrevet eyfp-transgen flankert av ITR. 3' UTR inneholder en 15 nukleotid-lang strekkode (BC) plassert ved 3' UTR mellom eyfp og bovint veksthormon (BGH) polyadenyleringssignal. BC muliggjør kapsidsporing på DNA- og mRNA-nivå. (B) Under AAV-produksjon pakkes et unikt strekkodet genom av en eneste variant av cap-genet, noe som letter kapsididentifikasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Titrering av et strekkodet AAV-bibliotek med dd-PCR.
(A) Påvisning av YFP-positive dråper i kanal 1 (FAM, kanal 1) for en vannkontroll som ikke er mal, og en 1:10⁶ fortynnet vektorprøve. (B) Påvisning av ITR-positive dråper i kanal 2 (HEX, kanal 2). (C) Påvisning av dråper som er positive for både rep2 og ITR (uthevet i oransje). Lilla linjer angir terskler for påvisning av positive versus negative dråper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Oversikt over DNA-fragmentet som brukes til NGS og innstillinger for Python-analysen.
NGS PCR forsterker en 113-nukleotidregion. For bioinformatisk analyse må gjenkjenningssekvenser til høyre og venstre for strekkoden gis for begge trådene, samt avstanden fra begynnelsen av DNA-fragmentet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Prinsipal komponentanalyse (PCA) og hierarkisk klyngeanalyse.
(A) PCA av relative konsentrasjonsverdier for 82 kapsider over alle vev gjør det mulig å definere klynger av kapsidvarianter med lignende egenskaper og varianter med unike transduksjonsmønstre. (B) For bedre å skille den høyt befolkede klyngen ble registreringene av ytre unike varianter ekskludert fra matrisen og PCA-analysen ble gjentatt. (C) Hierarkisk klyngeanalyse gjør det mulig å visuelt evaluere varianttransduksjonsprofiler over vev som et varmekartplott (Li = lever, Lu = lunge, FatB = brunt fett, H = hjerte, Di = membran, SM = glatt muskulatur, Du = tolvfingertarm, P = bukspyttkjertel, C = tykktarm, BIC = biceps, O = eggstokker, St = mage, I = indre øre, K = nyre, Aa = abdominal aorta, Ved = thorax aorta, B = hjerne, FatW = hvitt fett, og S = milt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Eksempel	Mål	Kopier/20 μL brønn	Positive	Ch1+ Ch2+	JF	kopier korrigert	DF	VG/ml
H2O	rep2	28	2	0	0	0	1,00E+06	5,60E+09
AAV2lib	rep2	90600	16396	16266	0.99	89882	1,00E+06	1,80E+13
H2O	YFP	4	3	2	0.67	3	1,00E+06	8,00E+08
BCAAVlib	YFP	34680	13229	12452	0.94	32643	1,00E+06	6,53E+12

Tabell 1 Titreringsresultater fra et AAV2-peptidvisningsbibliotek ("AAV2lib") og det strekkodede EYFP-vektorbiblioteket ("BCAAVlib").

Discussion

I denne protokollen skisseres trinnene som trengs for AAV-kapsidteknikk for peptidvisning og for strekkodet AAV-bibliotekscreening, samt for bioinformatisk analyse av biblioteksammensetning og kapsidytelse. Denne protokollen fokuserer på trinnene som letter bioinformatisk analyse av disse typer biblioteker, fordi de fleste virologilaboratorier henger etter i programmeringsferdigheter for å matche deres ferdigheter i molekylærbiologiske teknikker. Begge typer biblioteker har blitt omfattende beskrevet i litteraturen, som skissert i innledningen, og kan gjengis relativt enkelt.

Som et første trinn er utformingen av et peptidvisningsbibliotek i posisjon 588 i variabel region VIII i AAV2 skissert. Dette designet (AAV2_Peptide(ii) i tidligere publikasjon 26) og den beskrevne kloningsmetoden kan enkelt tilpasses andre serotyper basert på informasjonen gitt i en nylig publikasjon²⁶. Et kritisk trinn i kloningsrørledningen er ligering / transformasjonseffektiviteten (ved bruk av ~ 1 x 10⁸ kolonier cut-off). Det anbefales å legge til en ligeringsreaksjon med bare vektor. Dette bidrar til å identifisere prosentandelen bakteriekolonier med innsats, som skal være høyere enn 80%. En lavere effektivitet enn forventet, det vil si et antall bakteriekolonier (beregning av prosentandelen med innsats) lavere enn det teoretiske mangfoldet av oligonukleotidinnsatsene, vil ha negativ innvirkning på varianter med lav overflod. Flere forbedringer inkluderer lengre fordøyelsestider og oppryddingstrinn for vektor- eller ligeringsreaksjonen, ved hjelp av kommersielle sett.

Det neste trinnet er kvalitetskontroll av variantbiblioteket ved bruk av NGS av et PCR-fragment som omfatter oligonukleotidinnsettingsstedet. NGS utføres ved hjelp av et Illumina-sekvenseringssystem. Det finnes flere alternativer, der PCR-produkter kan sendes direkte inn uten forutgående NGS-bibliotekforberedelse. Dette er mer egnet for småskala eksperimenter eller når høy lesedybde ikke er nødvendig. Protokollen rapportert her omfatter NGS-bibliotekforberedelse, inkludert tillegg av adaptere med Illumina-indekser til PCR-produktene, ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett. En felles begrensning med hensyn til NGS er at disse PCR-fragmentene har et lavt mangfold, fordi sekvensene som flankerer innsettingsstedet med høyt mangfold er identiske i alle varianter, noe som igjen reduserer sekvenseringseffektiviteten. For å løse dette legger dette settet til et hvilket som helst antall på to til åtte tilfeldige nukleotider mellom PCR-fragmentet og adapteren. Alternativt må prøven være tilsatt PhiX. Den detaljerte Python-rørledningen er beskrevet for å analysere AAV2-peptidvisningsbiblioteker. Som en mal leveres eksempelfiler hentet fra den opprinnelige NGS-filen i AAV2-peptidvisningsbiblioteket. Dette kan tilpasses andre serotyper med instruksjonene som er gitt. Utdatafilene i denne analysen kan brukes i nedstrømsanalyse, for eksempel sammenligning av plasmid- og AAV-bibliotek 30, aminosyresammensetning i hver posisjon³⁰, beregning av anrikningsscore mellom biblioteker etter utvalgsrunde 14, eller generering av sekvenslogoer eller grafer¹⁹. Når det gjelder inngangsbiblioteket, er det ønskelig med en høy andel unike varianter. Noen varianter produserer imidlertid ikke like godt som andre, noe som kan føre til skjevfordeling etter produksjon. Et lavt variantdiversitet, eller med andre ord tilstedeværelsen av dominerende varianter, kan tilskrives lav oligonukleotidinnsatskvalitet eller et høyt antall andrestrengssyntesesykluser (trinn 1.2). Videre kan aminosyresammensetningen påvirkes fra produksjonen. Hver aminosyre skal ha en frekvens på 5,00%. Hvis fordelingen varierer sterkt fra denne verdien, foreslås det å utføre samme analyse på plasmidbiblioteket for å identifisere potensielle skjevheter³⁰.

Ettersom protokollene for generering av AAV-bibliotek og de påfølgende utvelgelsesrundene i ulike dyre- og in vitro-modeller er grundig beskrevet i flere publikasjoner og protokoller 27,30,31,32^, beskrives her bare analysen av strekkodede biblioteker av utvalgte konstruerte varianter og benchmarks. Det er verdt å merke seg at kloning av biblioteket etter hver seleksjonsrunde kan utføres ved PCR-isolering av cap-genet, som nevnt i protokoll- og resultatseksjonene. Omfattende runder med seleksjon og PCR-amplifikasjon kan føre til påløp av mutasjoner eller stoppkodoner, som kan observeres av NGS. Alternativt kan berikede varianter velges fra NGS-dataene, og oligonukleotidene bestilles og klones slik det er beskrevet for generering av et peptidvisningsbibliotek^16,18. Til slutt inneholder protokollen en kort beskrivelse for valg av bibliotek på DNA-nivå, 1 uke etter systemisk injeksjon. RNA-baserte seleksjoner er strengere, da de også velger for varianter som trafikkerer gjennom smittsomme inngangsveier, om enn er teknisk mer utfordrende. Det skal bemerkes at RNA- eller transgenbaserte seleksjoner (dvs. Cre) krever en lengre in vivo varighet på ca. 3-4 uker 15,16,17,18,19,33. Spesielt for DNA-basert seleksjon er det avgjørende å validere de utvalgte variantene mot kjente naturlige og konstruerte serotyper både på DNA- og RNA-nivå ved hjelp av et strekkodet AAV-bibliotek.

Den andre delen av protokollen beskriver generering og screening av strekkodede AAV-biblioteker ved hjelp av pipelinen som tidligere er utviklet²⁴. Hvert AAV-kapsid i bassenget inneholder det samme transgenet (eyfp under kontroll av en CMV-promotor) med en distinkt strekkode mellom eyfp og polyA-signalet. Strekkodene som brukes i dette biblioteket finnes i den tidligere publikasjonen²⁴. Designet var basert på det grunnleggende prinsippet om Hamming avstand (dvs. strekkodesekvensene må være tilstrekkelig forskjellige), slik at sekvenseringsfeil ikke fører til feilaktige strekkodetildelinger. Som beskrevet i Lyons et al²⁶, er sjansen for at to feil oppstår i avlesninger mellom 25-100 nukleotider svært lav. En Hamming avstand på 4 betyr at to sekvenseringsfeil ville være nødvendig for å tilordne en lese som feil strekkode. Leser med en feil vil bli ignorert under analysen, og i dette tilfellet bli kategorisert som "leser med ukjente varianter". I en relevant publikasjon er det gitt retningslinjer og et Python-skript for å generere strekkoder²⁹ som kan brukes i rørledningen. For identifisering av nyttige strekkoder kan en annen populær feilrettingskode brukes som beskrevet i publikasjonen av Buschmann og Bystrykh³⁴, nemlig Levenshtein-avstanden. Denne gruppen tilbyr også en programvarepakke for programmeringsspråket R³⁵.

Etter AAV-produksjon kan det samlede AAV-biblioteket brukes til biodistribusjonsstudier i ulike modeller. Denne studien skisserer pipeline ved hjelp av 82-variantbiblioteket fra forrige publikasjon²⁴ og gir eksempeldata for praksis. Denne protokollen kan også tilpasses basert på hver brukers behov. Biodistribusjonsanalysen er basert på innsamling av forskjellige ON- og OFF-target vev eller celler, ekstraksjon av DNA og RNA fra dem, PCR-amplifisering av strekkodeområdet for NGS-sekvensering, og måling av vg / dg på DNA-nivå. For RNA ville det være best å beregne forholdet til mRNA-kopinummeret til et referansegen. Det valgte referansegenet bør uttrykkes likt over forskjellige vev 36, slik som RPP30 (ribonuklease P/MRP-subenhet P30)³⁷ eller Hprt (hypoksantinfosforibosyltransferase 1)³⁶. Dette er imidlertid krevende, så man må kanskje bruke flere referansegener samtidig for å normalisere RNA-dataene. Av denne grunn kan normaliseringen til dg på DNA-nivå fullføres, noe som korrelerer omtrent med antall celler. Dette peker også på bruken av qPCR for denne beregningen, som tidligere beskrevet²⁴, om enn dd-PCR er mer presis og dermed foretrekkes for fremtidig bruk, spesielt med tanke på fremdriften på dette feltet³⁷. Sist, men ikke minst, er grunnleggende molekylærbiologiske optimaliseringer ekstremt kritiske for metodikken beskrevet her. PCR-reaksjonene må optimaliseres for å unngå å introdusere skjevheter i distribusjonen av bibliotekene. dd-PCR-sondene må utformes for å inkludere introniske regioner for DNA og intereksoniske regioner for RNA. God laboratoriepraksis, som fysisk oppdeling av trinnene, spesielt DNA- og AAV-produksjon fra bibliotekpreparering, og riktig desinfeksjon er av avgjørende betydning for å unngå feilaktig forsterkning og bibliotekforurensninger.

Spesielt representerer bruken av peptiddisplaybiblioteker og vektor-DNA / RNA-strekkoding for å velge for konstruerte kapsider med nye tropismer eller andre klinisk relevante egenskaper bare to eksempler på rettet AAV-kapsidevolusjonsteknologi. De har alle til felles at de kommer med begrensninger og krever ytterligere optimalisering for å realisere sitt fulle potensiale. For eksempel etterlater bare innsetting av et peptid en stor andel (~ 99%) av den underliggende kapsidsekvensen uendret, hvis egenskaper, inkludert interaksjon med nøytraliserende anti-AAV-antistoffer, kanskje må modifiseres ytterligere før human applikasjon³⁸. Videre er det faktiske mangfoldet av peptidvisning eller andre biblioteker typisk lavere enn det teoretiske, på grunn av for eksempel tekniske begrensninger under kloning eller bakteriell transformasjon³¹. Generelt er det også en aktiv debatt om den translasjonelle relevansen av rettet evolusjon i dyre- eller in vitro-modeller , fostret av økende bevis for en mulig arts- eller til og med stammespesifikk ytelse av syntetiske AAV-kapsider³⁸. Likevel er det betydelig håp om at mange eller alle disse begrensningene vil bli overvunnet, og at dagens arsenal av teknologier vil bli utvidet til et enda større utvalg av sykdomsmodeller og bli enda mer tilgjengelig for de fleste forskningsgrupper. I denne forbindelse er en spesielt oppmuntrende nylig utvikling bruken av strekkodede AAV-biblioteker som de som er rapportert her for å validere utvalgte kapsider ikke lenger bare på orgel, men nå også på cellenivå, noe som kan oppnås med nye teknologier som enkeltcelle (sc) RNA-sekvensering³⁹. Protokollene som presenteres her vil legge til rette for en bredere etablering av AAV-evolusjonsteknikker og dermed akselerere utviklingen av nye kapsider tilpasset behovene til en mengde forskningsgrupper og menneskelige pasienter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864003	dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28306	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28704	Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	12162	Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28104	Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer	Invitrogen (Waltham, MA, USA)	Q32857	NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Q32851	NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix	Qiagen (Venlo, Netherlands)	1044234	Taqman qPCR
rep_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC	dd-PCR primer
rep_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CAATCACGGCGCACATGT	dd-PCR primer
rep_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1	dd-PCR probe
RNase-free DNase	Qiagen (Venlo, Netherlands)	79254	DNA/RNA extraction
SfiI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0123	Digestion of vector
5 mm, steel Beads	Qiagen (Venlo, Netherlands)	69989	DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	M0202L	Plasmid library ligation
TissueLyserLT	Qiagen (Venlo, Netherlands)	85600	DNA/RNA extraction
YFP_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GAGCGCACCATCTTCTTCAAG	dd-PCR primer
YFP_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	TGTCGCCCTCGAACTTCAC	dd-PCR primer
YFP_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1	dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)	Zymo research (Irvine, CA, USA)	D4013	Vector and Ligation purification