Summary
在这里，我们提出了一个使用AT4G18020（APRR2）-AirID蛋白作为模型在黄瓜（Cucumis sativus L.）中进行邻近标记（PL）实验的分步方案。该方法描述了载体的构建、通过农业浸润、生物素浸润、蛋白质提取和通过亲和纯化技术纯化生物素标记蛋白质的纯化构建体。
Abstract
在哺乳动物细胞和植物中，使用改良的抗坏血酸过氧化物酶 （APEX） 或 大肠杆菌 生物素连接酶 BirA（称为 BioID）的邻近标记 （PL） 方法已被证明可成功识别蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI）。APEX、BioID 和 TurboID（BioID 的修订版）除了是有价值的技术外，还存在一些限制。最近开发的AirID是BioID的一种新型版本，用于蛋白质-蛋白质相互作用中的邻近识别，克服了这些限制。此前，AirID已用于动物模型，而目前的研究证明了AirID在植物中的使用，结果证实，与其他PL酶（如BioID和TurboID）相比，AirID在植物系统中的表现更好，用于接近靶蛋白的蛋白质标记。以下是使用 AT4G18020 （APRR2） 蛋白作为模型识别蛋白质相互作用伙伴的分步方案。这些方法描述了载体的构建、通过农业浸润转化构建体、生物素转化、蛋白质提取以及通过亲和纯化技术富集生物素标记的蛋白质。结果表明，AirID是一种用于分析植物中PPI的新型理想酶。该方法可用于研究植物中的其他蛋白质。
Introduction
各种细胞蛋白在生物调控系统下起作用，蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 是该系统的一部分，也是许多细胞过程的基础。除 PPI 外，天然蛋白质的功能 通过 各种修饰（例如复合物的形成、泛素化和磷酸化）在翻译后得到促进。因此，研究PPI对于了解靶蛋白的可能功能具有重要意义。PPI已使用各种技术进行，例如免疫沉淀后的质谱分析（IP-MS分析）1、酵母双杂交系统（Y2H）2，以及基于无细胞的阵列3。这些方法探索了研究领域的各种重要发现。但是，这些方法有一些缺点;例如，Y2H是一种耗时、昂贵的策略，需要建立目标物种的Y2H库。
此外，Y2H技术使用酵母，一种异源单细胞真核生物，无法准确反映高等真核细胞的细胞状态。IP-MS不适用于高疏水性蛋白，并且在捕获弱PPI方面效率低。植物中的各种必需蛋白，如核苷酸结合域和富含亮氨酸的重复序列蛋白（NLR）和受体样激酶（RLKs）在低水平上表达，并且大多与其他蛋白质瞬时相互作用;因此，使用这些方法不足以理解这些蛋白质调控的机制3.
一种称为邻近生物素化（PB）的新技术可帮助研究人员识别PPI。PB 依赖于附着在目标蛋白 （POI） 上的 PL 酶，当伴侣蛋白接近 POI 时，PL 会将化学生物素标签附着在伴侣蛋白上。此外，标记的蛋白质可以被识别，并且可以快速知道哪个伴侣蛋白附着在靶蛋白5上。先前的研究证明，BioID 和 TurboID 是 PPI 的成功工具，尤其是在植物中，但它们有一定的局限性4.BioID 需要高水平的生物素来标记伴侣蛋白，这需要 16 小时以上。与 BioID 相比，TurboID 更有益，因为它可以在 10 分钟内标记蛋白质，并且可以在室温 （RT） 下标记伴侣蛋白。在某些条件下，它对细胞也有毒，并标记那些不与目标蛋白质相互作用的蛋白质。
为了克服这些问题，Kido 等人开发的 AirID 比其他标记酶更有效，尽管 BioID 和 AirID5 之间的序列相似度为 82%。为了检查 AirID 的效率，我们通过使用已知关联的 POI 进行了一项实验。该实验证实，AirID无疑可以标记植物细胞中的相关蛋白质。AirID 是一种用于 分析体外 和细胞中 PPI 的宝贵酶。与TurboID标记非伴侣相比，它产生的毒性更小，并且在时间过程中的错误更少，从而导致细胞死亡。它表明，AirID在邻近生物素化方面比其他标记酶更具竞争力。它更准确，在耗时过程中具有更大的潜力， 并且在体外 和活细胞中的毒性较小。目前的方案描述了使用 AirID 作为 PL 酶鉴定 APRR2 的相互作用蛋白;此外，该方法可应用于其他蛋白质以研究植物物种中的PPI。
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Protocol
1.植物材料的制备
- Cucumis sativus （黄瓜）用于实验分析。将种子放入水中，在50°C下孵育20分钟，然后将种子放在培养皿上的滤纸上12-16小时。
- 之后，将种子转移到含有土壤的花盆（商业购买）中，并在23°C温度，16小时光照和8小时黑暗光周期的气候室中生长。
- 将植物在气候室中保持 3-4 周，直到植物达到 3 或 4 个叶阶段以成功进行农业渗透。
2. 制作 AirID 构造
- 使用 APRR2 作为靶蛋白，并在花椰菜花叶病毒 35S 启动子 （p35S： APRR2-AirID） 下构建 APRR2-AirID。将其引入与网关兼容的二进制载体pEarleyGate1006（由堪萨斯州立大学的Kathrin Schrick博士提供）中，并根据 补充文件1中提供的序列直接合成PL酶。
3. 感受态细胞的制备
- DH5α感受态细胞的制备
- 用 大肠 杆菌DH5α细胞接种2mLLB（10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/LNaCl;pH = 7.0.）并在37°C下生长过夜（O / N）。
- 将来自O / N培养物的0.1%-0.5%接种物新鲜接种到100mLLB培养基中，并将细胞培养至OD600 达到0.4-0.6之间，然后在4°C下孵育培养物30分钟。
- 将培养物放入两个50mL离心管中，并在4°C下以2500× g旋转5分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于10mL冰冷的CaCl2中，并在冰上放置15分钟。在4°C下用2500×g 旋转沉淀细胞5分钟。
- 将细胞重悬于1mL冰冷的0.1M CaCl2 + 20%甘油中，将100μL等分试样放入每个1.5mL管中，并立即将其储存在-80°C。
- GV3101感受态细胞的制备
- 用单个 GV3101 菌落接种 2 mL LB（含有 50 μg/mL 庆大霉素和 25 μg/mL 利福平）。在28°C下孵育培养物O / N，同时以250rpm振荡。
- 接种 200 mL LB 和 1 mL 饱和过夜培养物。在28°C孵育时，以250rpm摇动培养物，直到OD600 等于0.5。
- 将培养物转移到四个预冷的无菌 50 mL 离心管中，并在冰上放置 30 分钟。
- 在4°C下以2500× g沉淀细胞10分钟。 弃去上清液并将沉淀放在冰上。
- 将细胞重悬于10mL冰冷的CaCl2 溶液中。将细胞集中到一个预冷的 50 mL Oakridge 管中。
- 在4°C下以1,000× g 沉淀细胞5分钟。 弃去上清液并将细胞重悬于10mL冰冷的CaCl2 溶液中。在冰上放置 30 分钟。
- 在4°C下以1,000× g沉淀细胞5分钟。 弃去上清液并将细胞重悬于2mL冰冷的CaCl2 溶液中。
- 将细胞分配到预冷无菌聚丙烯管中的 50 μL 等分试样中。将细胞储存在-80°C。
4. 农业渗透
- 首先，将质粒转移到农杆菌
- 将步骤2.1产生的2.5μL质粒转移到根癌农杆菌GV3101菌株的感受态细胞中，并在冰上孵育30分钟。
- 将含有质粒和感受态细胞的试管转移到液氮中3分钟。
- 在37°C下在培养箱中热休克5分钟，然后将管放在冰上2分钟。
- 向农杆菌中加入1,000μLLB培养基（10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/LNaCl;pH = 7.0），并在30°C和118rpm下孵育1小时。
- 在4°C下以3,000× g 离心2分钟。
- 弃去上面的 800 μL 溶液并混合剩余的溶液。然后，将其铺板在LB上（如步骤4.1.4所述，加入琼脂和50μg/ mL卡那霉素用于质粒，50μg/ mL庆大霉素和25μg/ mL利福平用于GV3010感受态细胞）。将板在30°C孵育48小时。
注意：最好选择一些菌落并进行PCR以确认目的基因7。
- 从平板中取出一些细菌菌落，并将它们放入LB培养基和适当的抗生素中（参见步骤4.1.6）。在30°C和218rpm下孵育36-48小时。
- 在4°C下以3,000×g离心细胞2分钟。 将细胞重悬至OD600 = 1.0在农浸润缓冲液（10mM MgCl 2,10mM MES，pH = 5.6,250μM乙酰丁香酮）中。
- 使用 1 mL 无针注射器浸润（从步骤 4.3 产生）中的（轴向）表皮中的接种物（从步骤 4.3 产生）。
注意：最好渗透到整个叶子并选择复制。对于 4-5 株植物，使用一种构建体。对于每片叶子，1.5 mL 重悬农杆菌就足够了。 - 在23°C下，用16 h光照（约75μmol·m-2·s-1）和8 h暗光周期将植物保持在气候室中36 h。
- 构建体浸润36小时后，将1mL 5μM生物素（在10mM MgCl2 溶液中）浸润到已经过滤的构建体的叶子中。
- 在收获叶组织之前，将处理过的植物再维持4-12小时。
注意：根据先前的研究，目标蛋白在36小时达到峰值，因此选择36 hpi生物素浸润4,6。生物素的孵育时间取决于目标研究，但根据目前的实验，8小时的孵育期更适合标记蛋白质。
5. 样品采集
注意：所有用于样品采集的材料都应是无菌的，以避免角蛋白污染，并且所有方案步骤都应在无污染的环境中进行。
- 切下浸润的叶子，迅速转移到液氮中，以避免蛋白质降解。
- 通过免疫印迹分析进行蛋白质预检测6;强烈建议在免疫共沉淀 （Co-IP） 之前进行此操作。
6. 从叶片中提取总蛋白质
- 用研杵和研钵研磨叶子，快速加入 2 mL 1x PBS-BSA PH 7.4 并缓慢研磨。
- 取一个 15 mL 锥形管，在锥形管顶部放置一个快速过滤材料过滤器，将样品混合物通过快速过滤材料过滤器转移到管中，并将其放在冰上。
- 将样品转移到 2 mL 试管中，并加入 1% 蛋白抑制剂混合物。
- 通过向上和向下转动7-8次来混合内容物，并在4°C下以1,000× g 离心2分钟。
- 将样品的上部溶剂转移到新的 2 mL 管中，加入 10% β-D-麦芽糖苷 （β-D.M），并置于冰上 5 分钟。在4°C下以20,000× g 离心10分钟。
7.平衡脱盐塔
- 在4°C下以1,000× g 离心色谱柱1分钟。
注意：在所有离心过程中，标记色谱柱的一侧并确保标记的一面朝外。 - 取下色谱柱的顶盖和底盖，在4°C下以1,000× g 离心2分钟。
- 从色谱柱的收集管中弃去液体溶液，加入 5 mL 1x PBS 缓冲液进行洗涤。
- 在4°C下以1,000× g 离心柱2分钟。
- 重复步骤 7.3 和 7.4 至少五次。
8.磁珠清洗
- 取 1.5 mL 试管，加入 50 μL 链霉亲和素-C1 偶联磁珠。
- 加入 1 mL 1x PBS-BSA 进行洗涤，充分混合并放在磁架上 3 分钟。弃去上清液。
- 重复步骤 8.2 至少三次。
- 每次洗涤后，将试管放在磁架上，将珠子吸附到试管的一侧以去除洗涤缓冲液。
9. 生物素化蛋白的富集
- 向色谱柱中加入2mL样品，并在4°C下以1,000× g 离心8分钟。
- 将 1 mL 脱盐蛋白提取物加入 50 μL 链霉亲和素-C1 偶联磁珠中以平衡它们。
- 将试管以常速放在旋转器上，使溶液充分混合并在室温（RT）下孵育30分钟。
- 将珠子在室温下放在磁架上3分钟，或直到它们聚集在试管的一侧，轻轻除去上清液。
- 加入 1 mL 洗涤缓冲液 I（2% SDS 水溶液），在旋转器上以室温旋转 2 分钟，然后重复步骤 9.4。
- 加入 1 mL 洗涤缓冲液 II（50 mM HEPES：pH = 7.5、500 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% 脱氧胆酸 [w/v] 和 1% Triton X-100）后，将管子放在室温旋转器上 2 分钟。重复步骤 9.4。
- 加入 1 mL 洗涤缓冲液 III（10 mM Tris-HCl：pH = 7.4、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.1% 脱氧胆酸 [w/v]、1% NP40 [v/v]），并使用振荡器在室温下旋转 2 分钟。然后，重复步骤 9.4。
- 要去除洗涤剂，请加入 1.7 mL 50 mM Tris-HCl （pH = 7.5） 并重复步骤 9.4。再次重复此步骤。
- 在室温下在 1 mL 50 mM 碳酸氢铵缓冲液中洗涤珠子 6 次，每次 2 分钟，并重复步骤 9.4。
- 向珠子中加入50μL含有50mM Tris-HCl（pH 8.0），12%（w / v）蔗糖（Suc），2%（w / v）十二烷基硫酸锂和1.5%（w / v）二硫苏糖醇的蛋白质提取物，在100°C的培养箱中热休克5分钟，然后按照步骤9.4进行操作。将上清液储存在-80°C进行LC-MS/MS分析。
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Representative Results
根据前人的研究，黄瓜基因 APRR2 是控制白色未成熟果实颜色8的候选基因。在这里，开发了一种使用 AirID 作为邻近标记酶的方案，以在黄瓜中找到 APRR2 的相互作用伴侣蛋白。将构建体转移到黄瓜叶片上，浸润后36小时，转移生物素。48小时后，取样进行蛋白质印迹分析，确认转化成功。如上所述提取蛋白质，用于蛋白质印迹的方案。 图1 中的代表性数据表明了浸润黄瓜叶片中的蛋白质表达和生物素化，这是基于新修改技术的预期结果。结果显示，与对照组相比，标记蛋白和额外条带的表达水平更高。这证实了 AirID 成功标记了目的基因 （GOI） 的靶蛋白。此外，还使用抗旗抗体和抗小鼠抗体确认了结果，这成功地用抗旗抗体显示了靶条带（图2）。通过蛋白质印迹分析确认后，我们使用上述方案进一步进行Co-IP，并成功富集浸润叶片的生物素化蛋白进行质谱分析，如 图3所示。在用链霉亲和素 C1 偶联磁珠富集生物素化蛋白后，观察到多种不同大小的蛋白，蛋白质印迹分析显示涂片条带（图 3）。
图 1：使用链霉亲和素-HRP 对转化为叶子后的蛋白质进行蛋白质印迹分析，以确认 AirID 的功能。 该图证实，生物素化蛋白对构建转化的样品有四个独立的重复。以野生型叶片为对照。对于每个重复，上样 10 μL 样品用于蛋白质印迹分析。链霉亲和素-HRP（1：6000稀释度）用于分析不同样品中的生物素化蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：蛋白质转化为叶子后蛋白质的蛋白质蛋白质印迹分析，以检测 Taq 序列。 将 3x-Flag 标签序列与目的基因融合以确认成功转化。通过蛋白质印迹分析在所有转化样品中鉴定taq序列。以野生型黄瓜叶样品为对照。共上样 10 μL 样品用于蛋白质印迹分析，并使用稀释度为 1：3000 的抗旗作为第一抗体和稀释度为 1：10000 的抗小鼠作为第二抗体确认结果。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：蛋白质提取物的免疫印迹分析。 免疫共沉淀（Co-IP）后，用链霉亲和素-HRP对 黄瓜 （Cucumber）农浸润叶片中的生物素化蛋白进行蛋白质印迹分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件 1.请点击此处下载此文件。
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Discussion
在当前的实验中，AirID 用于邻近标记，Kido 等人通过使用大型基因组数据集和五种常规 BirA 酶的祖先酶重建算法开发了 5。在传统的进化蛋白质工程中，随机突变被用来增强活性9,10，因为随机突变不能产生动态序列变化。与其他PL酶相比，AirID具有多项优势。以前，这种PL方法仅适用于动物系统。在这项研究中，它被用于研究植物中的蛋白质-蛋白质相互作用。该协议概述了如何在植物中逐步设置基于 AirID 的 PL，包括制备叶片样品、去除游离生物素、定量提取的蛋白质和富集生物素化蛋白质。
使用黄瓜中公认的农杆菌介导的瞬时表达，该方法用于寻找黄瓜中目标蛋白的 PPI。瞬时表达可能导致融合蛋白的过表达。还必须对AirID融合进行测试，以确保它不会干扰目标靶蛋白的功能，这是另一个关键的考虑因素。然而，虽然PL在检测暂时性或弱PPI方面比标准IP-MS技术具有一些优势，但它也有一些局限性。首先，发现候选相互作用蛋白并不自动意味着与诱饵蛋白的直接或间接相互作用，而是反映出与诱饵蛋白9 的接近程度。可以使用独立测定法（例如免疫共沉淀、双分子荧光互补 （BiFC） 或体外 GST 下拉测定法）在体内进一步验证 PPI，这些测定法可用于进一步验证 PPI。
研究发现，AirID的近端生物素化活性明显低于TurboID。在体外和细胞中，TurboID具有最高的近端生物素化活性。该酶可在 10 分钟内用于生物素化 9,11。然而，在长时间孵育超过 6 小时和更高生物素浓度的细胞中，最高的 TurboID 活性导致意想不到的蛋白质（如微管蛋白和 GFP）（如 50 mM 生物素）的额外生物素化。与用作 PPI 的近端生物素化酶相比，TurboID 最初被报道为一种生物素标记酶 4,6,5,7。如果 TurboID 要评估 PPI，它将在限制条件下发挥最佳作用，例如持续时间很短，在细胞中约为 1 小时。AirID、微管蛋白和GFP的生物素化在与TurboID生物素化观察到的相同条件下未发现。发现 AirID 融合蛋白能够在两种瞬态中对每个众所周知的相互作用物进行生物素化，如链霉亲和素下拉测定和 LC-MS/MS 分析所示 5。在低 ATP 浓度 （1 mM） 下，AirID 的生物酰基-5-AMP 的形成比 TurboID 更强。它偏向于较低浓度的生物素（含 5 mM 生物素或不添加生物素补充剂），而 TurboID 则偏爱较高浓度的生物素。此外，使用 LC-MS/MS 对生物素化位点的检查显示，AirID 生物素化发生在附近的 Lys 残基上，没有唯一的序列偏好，表明生物素化过程是非偏好的 5。尽管 BioID 和 AirID 之间的序列相似性为 82%，但 AirID 对相互作用的蛋白质显示出高生物素化活性。Kido et al.， 2020 发现 AirID 可以分析体外和细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用。他们的研究结果表明，依赖于AirID的生物素化可能有助于化合物的PPI分析。靶蛋白体内伴侣的鉴定对于理解生物学功能至关重要 12,13，并且它揭示了新的 PPI，因此使用 BioID 的体内邻近生物素化已被用于许多研究。即使补充了生物素，AirID 的稳定表达也不会导致细胞生长抑制，这表明 AirID 融合蛋白的表达毒性非常低5。AirID 预计将提高 PPI 依赖性生物素化组合的准确性;综上所述，AirID是植物PPI分析的理想选择。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金（X.H.32000197号）和中国博士后科学基金专项资助（X.H.2019T120467）资助
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
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