Summary
Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.
Abstract
Memeli hücrelerinde ve bitkilerinde, modifiye askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak bilinir) kullanan yakınlık etiketleme (PL) yaklaşımlarının, protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) tanımlamada başarılı olduğu kanıtlanmıştır. BioID'nin revize edilmiş bir versiyonu olan APEX, BioID ve TurboID, değerli teknolojiler olmalarının yanı sıra bazı kısıtlamalara sahiptir. Protein-protein etkileşimlerinde yakınlık tanımlaması için BioID'nin yeni bir versiyonu olan yakın zamanda geliştirilen AirID, bu kısıtlamaların üstesinden geldi. Daha önce, AirID hayvan modellerinde kullanılmışken, mevcut çalışma AirID'nin bitkilerde kullanıldığını göstermektedir ve sonuçlar, AirID'nin bitki sistemlerinde, protein etiketlemesi için BioID ve TurboID gibi diğer PL enzimlerine kıyasla daha iyi performans gösterdiğini doğrulamıştır. İşte model olarak AT4G18020 (APRR2) proteini kullanarak protein etkileşim ortaklarını belirlemek için adım adım bir protokol. Yöntemler, vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla yapının dönüşümünü, biyotin dönüşümünü, proteinlerin ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin zenginleştirilmesini tanımlar. Sonuçlar, AirID'nin bitkilerdeki ÜFE'leri analiz etmek için yeni ve ideal bir enzim olduğu sonucuna varmıştır. Yöntem, bitkilerdeki diğer proteinleri incelemek için uygulanabilir.
Introduction
Çeşitli hücresel proteinler biyolojik olarak düzenleyici sistem altında çalışır ve protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) bu sistemin bir parçasıdır ve birçok hücresel sürecin temelidir. ÜFE'lerin yanı sıra, doğal proteinlerin işlevi, kompleks oluşumu, ubikitinasyon ve fosforilasyon gibi çeşitli modifikasyonlar yoluyla translasyon sonrası olarak desteklenir. Bu nedenle, ÜFE'leri incelemek, hedef proteinlerin olası işlevini anlamak için önemlidir. PPI'lar, immünopresipitasyon sonrası kütle spektrometrisi analizi (IP-MS analizi)1, maya iki hibrit sistemi (Y2H)2 ve ayrıca hücresiz tabanlı diziler3 gibi çeşitli teknolojiler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemler, araştırma alanındaki çeşitli hayati bulguları araştırdı. Ancak bu yöntemlerin bazı sakıncaları vardır; örneğin, Y2H, hedef türün Y2H kitaplığını oluşturmayı gerektiren zaman alıcı, pahalı bir stratejidir.
Ek olarak, Y2H tekniği, daha yüksek ökaryotik hücrelerin hücresel durumunu doğru bir şekilde yansıtamayan heterolog tek hücreli ökaryotik bir organizma olan mayayı kullanır. IP-MS, yüksek hidrofobikliğe sahip proteinler için uygun değildir ve zayıf ÜFE'leri yakalamada düşük verimlilik gösterir. Bitkilerde nükleotid bağlama alanı ve lösin açısından zengin tekrar içeren (NLR) proteinler ve reseptör benzeri kinazlar (RLK'ler) gibi çeşitli temel proteinler düşük bir seviyede eksprese edilir ve çoğunlukla diğer proteinlerle geçici olarak etkileşime girer; Bu nedenle, bu yöntemlerin kullanılması, bu proteinlerin düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için yetersizdir3.
Yakınlık biyotinilasyonu (PB) adı verilen yeni bir teknik, araştırmacıların ÜFE'leri tanımlamasına yardımcı olur. PB, ilgilenilen proteine (POI) bağlanan PL enzimlerine bağlıdır ve ortak protein POI'ye yaklaştığında, PL, ortak proteine kimyasal bir biyotin etiketi ekler. Ayrıca, etiketli protein tanımlanabilir ve hangi ortak proteinin hedef proteine5 bağlandığını hızlı bir şekilde bilebilir. Önceki çalışmalar, BioID ve TurboID'nin özellikle bitkilerde ÜFE'ler için başarılı araçlar olduğunu kanıtladı, ancak belirli sınırlamaları var4. BioID, ortak proteinleri etiketlemek için yüksek düzeyde biyotine ihtiyaç duyar ve bu da 16 saatten fazla sürer. BioID ile karşılaştırıldığında, TurboID, proteini 10 dakikada etiketlediği ve ortak proteini oda sıcaklığında (RT) etiketleyebildiği için daha faydalıdır. Aynı zamanda belirli koşullarda hücreler için toksiktir ve ilgilenilen protein ile etkileşim göstermeyen proteinleri etiketler.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, Kido ve arkadaşları tarafından geliştirilen AirID, BioID ve AirID5 arasındaki dizi benzerliği% 82 olmasına rağmen, etiketleme enzimlerinin geri kalanından daha verimlidir. AirID'nin verimliliğini kontrol etmek için, bilinen ortaklarla bir POI kullanarak bir deney yaptık. Bu deney, AirID'nin şüphesiz bitki hücrelerindeki ilişkili proteinleri etiketleyebileceğini doğruladı. AirID, in vitro ve hücrelerde ÜFE'leri analiz etmek için değerli bir enzimdir. Daha az toksisite yaratır ve ortak olmayanları etiketlemek için TurboID'den daha az zaman alan işlemlerde daha az hatalıdır ve hücrenin öldürülmesine yol açar. AirID'nin yakınlık biyotinilasyonu için diğer etiketleme enzimlerinden daha rekabetçi olduğunu göstermektedir. Daha doğrudur, zaman alan süreçlerde daha fazla potansiyele sahiptir ve in vitro ve canlı hücrelerde daha az toksiktir. Mevcut protokol, AirID'yi bir PL enzimi olarak kullanarak APRR2'nin etkileşimli proteinlerinin tanımlanmasını açıklar; ayrıca yöntem, bitki türlerinde ÜFE'leri araştırmak için diğer proteinlere de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki materyalinin hazırlanması
- Deneysel analiz için Cucumis sativus (Salatalık) kullanılır. Tohumları suya koyun, 50 °C'de 20 dakika inkübe edin ve ardından tohumları 12-16 saat boyunca bir Petri plakası üzerindeki filtre kağıdına koyun.
- Daha sonra, tohumları toprak içeren saksılara aktarın (ticari olarak satın alınır) ve 23 ° C sıcaklıkta ve 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık fotoperiyotta bir iklim odasında büyütün.
- Başarılı bir agroinfiltrasyon için bitkileri 3 veya 4 yaprak aşamasına ulaşana kadar 3-4 hafta iklim odasında tutun.
2. AirID yapısının yapılması
- APRR2'yi hedef protein olarak kullanın ve Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü (p35S: APRR2-AirID) altında APRR2-AirID oluşturun. Bunu, Ağ Geçidi uyumlu ikili vektör pEarleyGate1006'ya (Kansas Eyalet Üniversitesi'nden Dr. Kathrin Schrick tarafından sağlanmıştır) ekleyin ve PL enzimini Ek Dosya 1'de sağlanan diziye göre doğrudan sentezleyin.
3. Yetkili hücrelerin hazırlanması
- DH5α yetkin hücrelerin hazırlanması
- 2 mL LB'yi (10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü ve 10 g/L NaCl; pH = 7.0.) E.Coli DH5α hücreleri (çözülmeden doğrudan donmuş stoktan) ile aşılayın ve gece boyunca büyütün (O/N) 37 ° C'de.
- O / N kültüründen% 0.1 -% 0.5 inokulumu 100 mL LB Ortamına taze olarak aşılayın ve OD600 0.4-0.6 arasına ulaşana kadar hücreleri büyütün ve ardından kültürü 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Kültürü iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne alın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'de döndürün.
- Süpernatanı atın, hücreleri 10 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2'de yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca buzda bekletin. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'lık bir dönüşle peletleyin.
- Hücreleri 1 mL buz gibi soğuk 0.1 M CaCl2 +% 20 gliserol, her 1.5 mL tüpe 100 μL alikot içinde yeniden süspanse edin ve hemen -80 ° C'de saklayın.
- GV3101 yetkili hücrelerin hazırlanması
- 2 mL LB (50 μg/mL gentamisin ve 25 μg/mL rifampisin içerir) tek bir GV3101 kolonisi ile aşılayın. 250 rpm'de çalkalarken kültür O/N'sini 28 °C'de inkübe edin.
- 200 mL LB'yi 1 mL doymuş gece kültürü ile aşılayın. OD 600 0,5'e eşit olana kadar 28 °C'de inkübe ederken kültürü250 rpm'de çalkalayın.
- Kültürü dört adet önceden soğutulmuş steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 30 dakika buz üzerinde bekletin.
- Hücreleri 2500 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve peletleri buzun üzerine yerleştirin.
- Hücreleri 10 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin. Hücreleri önceden soğutulmuş 50 mL'lik bir Oakridge tüpünde bir araya getirin.
- Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mL buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin. 30 dakika buz üzerinde bekletin.
- Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve hücreleri 2 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin.
- Hücreleri önceden soğutulmuş steril polipropilen tüplerde 50 μL'lik bir alikot içine dağıtın. Hücreleri -80 °C'de saklayın.
4. Agroinfiltrasyon
- İlk olarak, plazmiti agrobacterium'a aktarın
- Adım 2.1'den üretilen plazmitin 2.5 μL'sini agrobacterium tumefaciens GV3101 suşunun yetkili hücrelerine aktarın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Plazmidi ve yetkin hücreleri içeren tüpü 3 dakika boyunca sıvı nitrojene aktarın.
- Bir inkübatörde 5 dakika boyunca 37 ° C'de ısı şoku ve ardından tüpü 2 dakika boyunca buza koyun.
- Agrobakteriye 1.000 μLof LB ortamı (10 g / L tripton, 5 g / L maya özü ve 10 g / L NaCl; pH = 7.0) ekleyin ve 30 ° C ve 118 rpm'de 1 saat inkübe edin.
- 4 °C'de 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
- Çözeltinin üst 800 μL'sini atın ve kalan çözeltiyi karıştırın. Daha sonra, LB üzerine kaplayın (adım 4.1.4'te belirtildiği gibi, acar ve plazmit için 50 μg/mL Kanamisin ve GV3010 yetkin hücreler için 50 μg/mL gentamisin ve 25 μg/mL rifampisin ile eklenmiştir). Plakaları 30 °C'de 48 saat inkübe edin.
NOT: İlgilenilen geni doğrulamak için bazı kolonileri seçmek ve PCR yapmakdaha iyidir 7.
- Plakalardan bazı bakteri kolonilerini alın ve bunları LB ortamına ve uygun antibiyotiklere koyun (bkz. adım 4.1.6). 30 °C ve 218 rpm'de 36-48 saat inkübe edin.
- Hücreleri 2 dakika 4 ° C'de 3.000 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri Agroinfiltrasyon tamponunda (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5.6, 250 μM asetosiringon) OD600 = 1.0'a yeniden süspanse edin.
- 1 mL iğnesiz bir şırınga kullanarak (abaksiyal) epidermisteki aşıya (adım 4.3'ten üretilen) sızın.
NOT: Tüm yaprağın içine sızmak ve çoğaltmayı seçmek daha iyidir. 4-5 bitki için bir yapı kullanın. Her yaprak için 1.5 mL yeniden süspanse edilmiş agrobakteri yeterlidir. - Bitkileri iklim odasında 36 saat boyunca 16 saat ışık (yaklaşık 75 μmol·m-2·s-1) ve 8 ° C'de 23 saat karanlık fotoperiyot ile koruyun.
- 36 saatlik yapı sızmasından sonra, yapının zaten filtrelenmiş yapraklarına 1 mL 5 μM Biotin (10 mM MgCl2 çözeltisi içinde) sızın.
- Yaprak dokusunu hasat etmeden önce işlenmiş bitkileri 4-12 saat daha koruyun.
NOT: Önceki çalışmaya göre, hedef protein 36 saatte zirve yapar, bu nedenle 36 hpi biyotin infiltrasyonunuseçin 4,6. Biyotin için inkübasyon süresi hedef çalışmaya bağlıdır, ancak mevcut deneye göre, proteinlerin etiketlenmesi için 8 saatlik bir inkübasyon süresi daha uygundur.
5. Örneklerin toplanması
NOT: Keratin kontaminasyonunu önlemek için numune toplama için tüm malzemeler steril olmalı ve tüm protokol adımları kontaminasyonsuz bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
- Sızan yaprakları kesin ve protein bozulmasını önlemek için bunları hızla sıvı nitrojene aktarın.
- İmmünoblot analizleri ile proteinin ön tespitini gerçekleştirin6; bu, Ko-immünopresipitasyondan (Co-IP) önce şiddetle tavsiye edilir.
6. Yapraktan toplam protein ekstraksiyonu
- Yaprakları havanda ve havanda öğütün, hızlıca 2 mL 1x PBS-BSA PH 7.4 ekleyin ve yavaşça öğütün.
- 15 mL'lik konik bir tüp alın, konik tüpün üzerine hızlı bir filtrasyon malzemesi filtresi yerleştirin, numune karışımını hızlı filtrasyon malzemesi filtresinden tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun.
- Numuneleri 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve% 1 protein inhibitörü kokteyli ekleyin.
- İçeriği 7-8 kez yukarı ve aşağı çevirerek karıştırın ve 1,000 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
- Numunelerin üst çözücüsünü yeni 2 mL'lik tüplere aktarın,% 10 β-D-maltosit (β-DM) ekleyin ve 5 dakika boyunca buz üzerine koyun. 20.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
7. Tuzdan arındırma kolonunu dengeleyin
- Kolonu 1,000 °C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
NOT: Tüm santrifüj işlemleri sırasında kolonun bir tarafını işaretleyin ve işaretli tarafın dışa baktığından emin olun. - Kolonun üst ve alt kapağını çıkarın ve 1,000 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Sıvı çözeltiyi kolonun toplama tüpünden atın ve yıkama için 5 mL 1x PBS tamponu ekleyin.
- Kolonu 1,000 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- 7.3 ve 7.4 adımlarını en az beş kez tekrarlayın.
8. Manyetik boncuk yıkama
- 1.5 mL'lik bir tüp alın ve 50 μL streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuk ekleyin.
- Yıkamak için 1 mL 1x PBS-BSA ekleyin, iyice karıştırın ve 3 dakika boyunca mıknatıs standına koyun. Süpernatanı atın.
- Adım 8.2'yi en az üç kez tekrarlayın.
- Her yıkamadan sonra, yıkama tamponunu çıkarmak için boncukları tüpün bir tarafına doğru adsorbe etmek için tüpü manyetik rafa yerleştirin.
9. Biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi
- Kolona 2 mL numune ekleyin ve 4 °C'de 8 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
- Dengelemek için 50 μL streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklara 1 mL tuzdan arındırılmış protein özü ekleyin.
- Tüpü döndürücüye normal hızda yerleştirin, böylece çözelti iyice karışır ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe eder.
- Süpernatanı nazikçe çıkarmak için boncukları RT'de 3 dakika veya tüpün bir tarafında toplanana kadar manyetik rafa yerleştirin.
- 1 mL yıkama tamponu I (suda% 2 SDS) ekleyin, bir döndürücüde 2 dakika boyunca RT'de döndürün ve 9.4 adımını tekrarlayın.
- 1 mL yıkama tamponu II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [a/h] ve %1 Triton X-100) ekledikten sonra tüpü RT'de 2 dakika döndürücüye yerleştirin. Adım 9.4'ü tekrarlayın.
- 1 mL yıkama tamponu III (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [a/h], %1 NP40 [v/v]) ekleyin ve RT'de 2 dakika çalkalayıcı kullanarak döndürün. Ardından, 9.4 adımını tekrarlayın.
- Deterjanı çıkarmak için 1,7 mL 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) ekleyin ve 9.4 adımını tekrarlayın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Boncukları RT'de 1 mL 50 mM amonyum bikarbonat tamponunda her biri 2 dakika boyunca altı kez yıkayın ve 9.4 adımını tekrarlayın.
- Boncuklara 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), %12 (a/h) sükroz (Suc), %2 (a/h) lityum lauril sülfat ve %1.5 (a/h) ditiotreitol içeren 50 μL protein özütü ekleyin, inkübatörde 100 °C'de 5 dakika boyunca ısı şoku uygulayın ve 9.4 adımını izleyin. Süpernatanı LC-MS/MS analizi için -80 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki araştırmalara göre, salatalık geni APRR2 , beyaz olgunlaşmamış meyve rengini kontrol eden aday gendir8. Burada, salatalıkta APRR2'nin etkileşimli ortak proteinini bulmak için yakınlık etiketleme enzimi olarak AirID kullanılarak bir protokol geliştirildi. Yapı salatalık yapraklarına aktarıldı ve infiltrasyondan 36 saat sonra biyotin aktarıldı. 48 saat sonra, başarılı dönüşümü doğrulamak için western blot analizi için örnekler alındı. Proteinler, western blot protokolünde yukarıda belirtildiği gibi ekstrakte edildi. Şekil 1'deki temsili veriler, yeni modifiye edilmiş tekniğe dayalı olarak beklenen bulgular olan sızmış salatalık yapraklarında protein ekspresyonunu ve biyotinilasyonu göstermiştir. Sonuçlar, kontrole kıyasla etiketli proteinlerin ve ekstra bantların daha yüksek bir ekspresyon seviyesini gösterdi. Bu, AirID'nin ilgilenilen genin (GOI) hedef proteinlerini başarıyla etiketlediğini doğrular. Ayrıca, sonuçlar, anti-bayrak antikoru ile hedef bandı başarılı bir şekilde gösteren anti-flag ve anti-fare antikorları kullanılarak da doğrulandı (Şekil 2). Western blot analizi ile doğrulandıktan sonra, yukarıda belirtilen protokolü kullanarak Co-IP gerçekleştirdik ve sızan yaprakların biyotinillenmiş proteinleri, Şekil 3'te gösterildiği gibi kütle spektrometrisi analizi için başarıyla zenginleştirildi. Biyotinillenmiş proteinler streptavidin C1 konjuge manyetik boncuklarla zenginleştirildikten sonra, farklı boyutlarda çoklu proteinler gözlendi ve western blot analizinde yayılmış bantlar ortaya çıktı (Şekil 3).
Şekil 1: Streptavidin-HRP kullanılarak AirID'nin işlevini doğrulamak için yapraklara dönüştürüldükten sonra proteinlerin Western blot analizi. Şekil, biyotinillenmiş proteinlerin, yapı dönüştürülmüş numuneler için dört bağımsız kopyaya sahip olduğunu doğrulamaktadır. Yabani tip yapraklar kontrol olarak kullanılmıştır. Her bir kopya için, western blot analizi için 10 μL numune yüklendi. Streptavidin-HRP (1:6000 seyreltme), farklı örneklerde biyotinile proteinleri analiz etmek için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Taq dizisini tespit etmek için yapraklara dönüşümden sonra proteinlerin Western blot analizi. 3x-Flag etiket dizisi, başarılı dönüşümü doğrulamak için ilgilenilen gen ile kaynaştırıldı. Taq dizisi, dönüştürülen tüm örneklerde western blot analizi ile tanımlandı. Kontrol olarak yabani tip hıyar yaprağı örnekleri kullanılmıştır. Western blot analizi için toplam 10 μL numune yüklendi ve sonuçlar, 1:3000 seyreltmede birinci antikor olarak anti-flag ve 1:10000 seyreltmede ikinci bir antikor olarak anti-fare kullanılarak doğrulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Protein ekstraktlarının immünoblot analizi. Ko-immünopresipitasyondan (Co-IP) sonra, Cucumis sativus'un (Hıyar) agroinfiltre edilmiş yapraklarındaki biyotinillenmiş proteinlerin streptavidin-HRP ile Western blot analizi yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut deneyde, Kido ve ark. büyük bir genom veri seti ve beş geleneksel BirA enzimi5 kullanarak atalardan kalma enzim rekonstrüksiyonu algoritması aracılığıyla geliştirdi. Rastgele mutasyonlar dinamik dizi değişiklikleri üretemediğinden, geleneksel evrimsel protein mühendisliğindeaktivite 9,10'u geliştirmek için rastgele mutasyonlar kullanıldı. Diğer PL enzimleriyle karşılaştırıldığında, AirID'nin çeşitli avantajları vardır. Daha önce bu PL yöntemi sadece hayvan sistemlerine uygulanabiliyordu. Bu çalışmada bitkilerde protein-protein etkileşimlerinin araştırılmasında kullanılmıştır. Protokol, yaprak örneklerinin hazırlanması, serbest biyotinin uzaklaştırılması, ekstrakte edilen proteinlerin miktarının belirlenmesi ve biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi dahil olmak üzere bitkilerde AirID tabanlı PL'nin adım adım nasıl kurulacağını özetlemektedir.
Salatalıkta iyi kurulmuş Agrobacterium aracılı geçici ekspresyon kullanılarak, bu yaklaşım Salatalıkta ilgilenilen hedef proteinin ÜFE'lerini bulmak için kullanılır. Geçici ekspresyon, füzyon proteinlerinin aşırı ekspresyonuna neden olabilir. AirID füzyonu, bir diğer önemli husus olan ilgilenilen hedef proteinin işlevine müdahale etmediğinden emin olmak için de test edilmelidir. Bununla birlikte, PL, geçici veya zayıf ÜFE'leri tespit etmek için standart IP-MS tekniklerine göre çeşitli avantajlar sağlarken, bazı sınırlamaları da vardır. Her şeyden önce, bir aday etkileşim proteininin keşfedilmesi, yem proteini ile otomatik olarak doğrudan veya dolaylı bir etkileşim anlamına gelmez, bunun yerine yem proteinineyakınlığı yansıtır 9. ÜFE'ler, bağımsız tahliller (örneğin , ko-immünopresipitasyon, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) veya in vitro GST-aşağı çekme testi, ÜFE'leri daha fazla doğrulamak için gerçekleştirilebilir.
Çalışma, AirID'nin proksimal biyotinilasyon aktivitesinin TurboID'ninkinden önemli ölçüde daha düşük olduğunu buldu. İn vitro ve hücrelerde, TurboID en yüksek proksimal biyotinilasyon aktivitesine sahipti. Bu enzim,biyotinilat yapmak için 10 dakika içinde kullanılabilir 9,11. Bununla birlikte, 6 saatten uzun süreli inkübasyon ve daha yüksek biyotin konsantrasyonları için tedavi edilen hücrelerde, en yüksek TurboID aktivitesi, tübülin ve GFP (50 mM biyotin gibi) gibi beklenmedik proteinler üzerinde ekstra biyotinilasyona yol açtı. ÜFE'ler için proksimal bir biyotinilasyon enzimi olarak kullanılmasının aksine, TurboID ilk olarak bir biyotin etiketleme enzimi 4,6,5,7 olarak rapor edilmiştir. TurboID, ÜFE'leri değerlendirecek olsaydı, hücrelerde yaklaşık 1 saat olan sürenin kısa olması gibi sınırlayıcı koşullar altında en iyi şekilde çalışırdı. AirID, tübülin biyotinilasyonu ve GFP, TurboID biyotinilasyonu için gözlemlenenlerle aynı koşullar altında bulunmadı. AirID-füzyon proteinlerinin, streptavidin-pull down testi ve LC-MS/MS analizi5 ile gösterildiği gibi, her iki geçici entalanda da iyi bilinen her bir etkileşimcinin biyotinilasyonunu yapabildiği bulundu. Düşük ATP konsantrasyonlarında (1 mM), biyotinoil-5-AMP oluşumu AirID için TurboID'den daha güçlüydü. Daha yüksek konsantrasyonları tercih eden TurboID'den daha düşük biyotin konsantrasyonlarını (5 mM biyotin ile veya biyotin takviyesi olmadan) tercih eder. Ek olarak, LC-MS/MS kullanılarak biyotinilasyon bölgelerinin incelenmesi, AirID biyotinilasyonunun yakındaki bir Lys kalıntısı üzerinde benzersiz bir dizi tercihi olmadan meydana geldiğini ortaya çıkardı ve bu da biyotinilasyon işleminin tercihsiz olduğunu gösterdi5. BioID ve AirID arasındaki dizi benzerliği %82 olmasına rağmen, AirID etkileşen proteinlere karşı yüksek biyotinilasyon aktivitesi göstermiştir. Kido ve ark., 2020, AirID'nin in vitro ve hücrelerde protein-protein etkileşimlerini analiz edebildiğini buldu. Bulguları, AirID'ye bağlı biyotinilasyonun kimyasal bileşiklerin PPI analizi için yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Hedef proteinlerin in vivo ortaklarının tanımlanması, biyolojik fonksiyonların anlaşılması için çok önemlidir12,13 ve yeni PPI'ları ortaya çıkarmıştır, bu nedenle BioID kullanılarak in vivo yakınlık biyotinilasyonu çok sayıda çalışmada kullanılmıştır. Biyotin takviyesi yapıldığında bile, AirID'nin stabil ekspresyonu hücre büyümesinin inhibisyonu ile sonuçlanmadı, bu da AirID-füzyon proteinlerinin ekspresyonunun çok düşük toksik olacağını gösterdi5. AirID'nin kombinasyon halinde ÜFE'ye bağlı biyotinilasyon doğruluğunu iyileştirmesi bekleniyor; Özetle, AirID'nin tesislerde ÜFE analizi için ideal olduğu sonucuna varılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemişlerdir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32000197 - X.H.), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı'ndan Özel Mali Hibe (Hibe No. 2019T120467 - KH) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
References
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
- Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
- Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
- Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
- Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
- Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
- Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
- Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).
