Summary
Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll för att utföra PL-experimentet (Proximity Labeling) i gurka (Cucumis sativus L.) med AT4G18020 (APRR2)-AirID-protein som modell. Metoden beskriver konstruktionen av en vektor, omvandlingen av en konstruktion genom agroinfiltration, biotininfiltration, proteinextraktion och rening av biotinmärkta proteiner genom affinitetsreningsteknik.
Abstract
I däggdjursceller och däggdjursväxter har närhetsmärkning (PL) med modifierat askorbatperoxidas (APEX) eller Escherichia coli biotinligas BirA (känt som BioID) visat sig vara framgångsrikt för att identifiera protein-proteininteraktioner (PPI). APEX, BioID och TurboID, en reviderad version av BioID, har vissa begränsningar förutom att de är värdefulla tekniker. Det nyligen utvecklade AirID, en ny version av BioID för närhetsidentifiering i protein-proteininteraktioner, övervann dessa begränsningar. Tidigare har AirID använts i djurmodeller, medan den aktuella studien visar på användningen av AirID i växter, och resultaten bekräftade att AirID presterar bättre i växtsystem jämfört med andra PL-enzymer som BioID och TurboID för proteinmärkning som är proximala till målproteinerna. Här är ett steg-för-steg-protokoll för att identifiera proteininteraktionspartners med hjälp av AT4G18020 (APRR2) protein som modell. Metoderna beskriver konstruktion av vektor, omvandling av konstrukt genom agroinfiltration, biotintransformation, extraktion av proteiner, och anrikning av biotinmärkta proteiner genom affinitetsreningsteknik. Resultaten drar slutsatsen att AirID är ett nytt och idealiskt enzym för att analysera protonpumpshämmare i växter. Metoden kan användas för att studera andra proteiner i växter.
Introduction
Olika cellulära proteiner arbetar under det biologiskt reglerande systemet, och protein-proteininteraktioner (PPI) är en del av detta system och grunden för många cellulära processer. Förutom protonpumpshämmare främjas funktionen hos naturliga proteiner posttranslationellt via olika modifieringar såsom bildandet av komplex, ubiquitinering och fosforylering. Därför är det viktigt att studera protonpumpshämmare för att förstå målproteinernas möjliga funktion. PPI:er har utförts med hjälp av olika tekniker såsom masspektrometrianalys efter immunoprecipitation (IP-MS-analys)1, jäst-två-hybridsystem (Y2H)2, även cellfria baserade arrayer3. Dessa metoder utforskade olika viktiga resultat inom forskningsområdet. Dessa metoder har dock vissa nackdelar; till exempel är Y2H en tidskrävande, dyr strategi som kräver att man bygger upp målarternas Y2H-bibliotek.
Dessutom använder Y2H-tekniken jäst, en heterolog encellig eukaryot organism, som inte exakt kunde återspegla det cellulära tillståndet hos högre eukaryota celler. IP-MS är olämplig för proteiner med hög hydrofobicitet och visar låg effektivitet när det gäller att fånga upp svaga protonpumpshämmare. Olika essentiella proteiner i växter, såsom nukleotidbindande domän och leucinrika upprepande (NLR) proteiner och receptorliknande kinaser (RLK), uttrycks på en låg nivå och interagerar mestadels med andra proteiner övergående; Därför är det inte tillräckligt att använda dessa metoder för att förstå de mekanismer som ligger till grund för regleringen av dessaproteiner.
En ny teknik som kallas proximitetsbiotinylering (PB) hjälper forskare att identifiera protonpumpshämmare. PB är beroende av PL-enzymer, som fäster vid proteinet av intresse (POI), och när partnerproteinet kommer nära POI fäster PL en kemisk biotintagg på partnerproteinet. Vidare kan det märkta proteinet identifieras och snabbt veta vilket partnerprotein som fäster vid målproteinet5. Tidigare studier har visat att BioID och TurboID är framgångsrika verktyg för protonpumpshämmare, särskilt i växter, men de har vissa begränsningar4. BioID behöver en hög nivå av biotin för märkning av partnerproteiner, vilket tar mer än 16 timmar. Jämfört med BioID är TurboID mer fördelaktigt eftersom det märker protein på 10 minuter och kan märka partnerproteinet vid rumstemperatur (RT). Det är också giftigt för celler under vissa förhållanden och märker de proteiner som inte visar interaktion med proteinet av intresse.
För att övervinna dessa problem är AirID, utvecklat av Kido et al., effektivare än resten av märkningsenzymerna, även om sekvenslikheten är 82 % mellan BioID och AirID5. För att kontrollera effektiviteten hos AirID genomförde vi ett experiment genom att använda en POI med kända medarbetare. Detta experiment bekräftade att AirID utan tvekan kunde märka associerade proteiner i växtceller. AirID är ett värdefullt enzym för analys av protonpumpshämmare in vitro och i celler. Det skapar mindre toxicitet och är mindre felaktigt i tidsåtgångsprocesser än TurboID för att märka icke-partners, vilket leder till att cellen dödas. Det visar att AirID är mer konkurrenskraftigt än andra märkningsenzymer för proximitetsbiotinylering. Det är mer exakt, har större potential i tidstagningsprocesser och mindre toxiskt in vitro och i levande celler. Det nuvarande protokollet beskriver identifieringen av interagerande proteiner av APRR2 med hjälp av AirID som ett PL-enzym; Dessutom kan metoden tillämpas på andra proteiner för att undersöka protonpumpshämmare i växtarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av växtmaterial
- Cucumis sativus (Gurka) används för experimentell analys. Lägg fröna i vatten, inkubera vid 50 °C i 20 minuter och lägg sedan fröna på filterpapper på en petriskål i 12-16 timmar.
- Överför sedan fröna till krukor som innehåller jord (köps kommersiellt) och odlar i en klimatkammare vid 23 °C temperatur och 16 timmar ljus och 8 timmar mörk fotoperiod.
- Behåll plantorna i klimatkammaren i 3-4 veckor tills plantorna når 3 eller 4 bladstadier för framgångsrik agroinfiltration.
2. Att få AirID att konstruera
- Använd APRR2 som målprotein och konstruera APRR2-AirID under blomkålsmosaikvirus 35S-promotorn (p35S: APRR2-AirID). Introducera den i den Gateway-kompatibla binära vektorn pEarleyGate1006 (tillhandahållen av Dr. Kathrin Schrick, Kansas State University) och syntetisera PL-enzymet direkt enligt sekvensen i tilläggsfil 1.
3. Beredning av kompetenta celler
- Beredning av DH5α-kompetenta celler
- Inokulera 2 ml LB (10 g/l trypton, 5 g/l jästextrakt och 10 g/l NaCl; pH = 7,0.) med E.Coli DH5α-celler (direkt från den frysta buljongen utan upptining) och odla över natten (O/N) vid 37 °C.
- Inokulera 0,1–0,5 % inokulat från O/N-kulturen till 100 ml LB Medium och odla cellerna tills OD600 når mellan 0,4-0,6, och inkubera sedan kulturen vid 4 °C i 30 minuter.
- Ta upp kulturen i två 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 2500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten, återsuspendera cellerna i 10 ml 0,1 M iskall CaCl2 och lägg på is i 15 minuter. Pelletera cellerna med 2500 x g centrifugering i 5 minuter vid 4 °C.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml iskall 0,1 M CaCl2 + 20 % glycerol, alikvot 100 μL i varje 1,5 ml rör, och förvara dem omedelbart vid -80 °C.
- Beredning av GV3101-kompetenta celler
- Inokulera 2 ml LB (innehållande 50 μg/ml gentamycin och 25 μg/ml rifampicin) med en enda GV3101-koloni. Inkubera O/N-kulturen vid 28 °C under skakning vid 250 varv per minut.
- Inokulera 200 ml LB med 1 ml mättad odling över natten. Skaka grödan med 250 varv per minut medan du inkuberar den vid 28 °C tills OD600 är lika med 0,5.
- Överför kulturen till fyra förkylda sterila 50 ml centrifugrör och lägg den på is i 30 minuter.
- Pelletera cellerna i 2500 x g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och lägg pelletsen på is.
- Återsuspendera cellerna i 10 ml 0,1 M iskall CaCl2-lösning . Slå ihop cellerna till ett förkylt 50 ml Oakridge-rör.
- Pelletera cellerna vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml iskall CaCl2-lösning . Ställ på is i 30 min.
- Pelletera cellerna vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 ml 0,1 M iskall CaCl2-lösning .
- Fördela cellerna i en 50 μl alikvot i förkylda sterila polypropenrör. Förvara cellerna vid -80 °C.
4. Agroinfiltration
- Överför först plasmiden till agrobacterium
- Överför 2,5 μl av den plasmid som genererats från steg 2.1 till de kompetenta cellerna i Agrobacterium tumefaciens GV3101-stammen och inkubera på is i 30 minuter.
- Överför röret som innehåller plasmiden och de kompetenta cellerna till flytande kväve i 3 minuter.
- Värmechock vid 37 °C i 5 minuter i en inkubator och lägg sedan röret på is i 2 minuter.
- Tillsätt 1 000 μl LB-medium (10 g/l trypton, 5 g/l jästextrakt och 10 g/l NaCl; pH = 7,0) till agrobakterien och inkubera vid 30 °C och 118 varv per minut i 1 timme.
- Centrifugera vid 3 000 x g i 2 minuter vid 4 °C.
- Kassera de övre 800 μlen av lösningen och blanda den återstående lösningen. Plätera den sedan på LB (som nämnts i steg 4.1.4 tillsatt med agar och 50 μg/ml kanamycin för plasmid och 50 μg/ml gentamycin och 25 μg/ml rifampicin för GV3010-kompetenta celler). Inkubera plattorna vid 30 °C i 48 timmar.
OBS: Det är bättre att välja några kolonier och utföra PCR för att bekräfta genen av intresse7.
- Plocka upp några bakteriekolonier från plattorna och lägg dem i LB-media plus lämplig antibiotika (se steg 4.1.6). Inkubera vid 30 °C och 218 varv/min i 36-48 timmar.
- Centrifugera cellerna vid 3 000 x g i 2 minuter vid 4 °C. Återsuspendera cellerna till OD600 = 1,0 i Agroinfiltration buffert (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringon).
- Infiltrera inokulatet (genererat från steg 4.3) i (abaxial) epidermis med en 1 ml nållös spruta.
OBS: Det är bättre att infiltrera hela bladet och välja att replikera. För 4-5 plantor, använd en konstruktion. För varje blad räcker det med 1,5 ml resuspenderade agrobakterier. - Förvara plantorna i 36 timmar i klimatkammaren med 16 timmars ljus (ca 75 μmol·m-2·s-1) och 8 timmars mörk fotoperiod vid 23 °C.
- Efter 36 timmars konstruktinfiltration infiltreras 1 ml 5 μM biotin (i 10 mM MgCl2-lösning ) i de redan ofiltrerade bladen i konstruktet.
- Behåll de behandlade plantorna i ytterligare 4-12 timmar innan du skördar bladvävnaden.
OBS: Enligt den tidigare studien når målproteinet sin topp vid 36 timmar, så välj 36 hpi biotininfiltrationer 4,6. Inkubationstiden för biotin beror på målstudien, men enligt det aktuella försöket är en inkubationstid på 8 timmar lämpligare för märkning av proteiner.
5. Provtagning
OBS: Allt material för sample insamling bör vara sterilt för att undvika keratinkontaminering, och alla protokollsteg bör utföras i en kontaminfri miljö.
- Klipp av de infiltrerade bladen och överför dem snabbt till flytande kväve för att undvika proteinnedbrytning.
- Utföra pre-detektion av protein genom immunoblot-analyser6; Detta rekommenderas starkt före Co-immunoprecipitation (Co-IP).
6. Total proteinextraktion från blad
- Mal bladen med en mortelstöt, tillsätt snabbt 2 ml 1x PBS-BSA PH 7,4 och mal långsamt.
- Ta ett 15 ml koniskt rör, placera ett snabbfiltreringsmaterialfilter ovanpå det koniska röret, överför provblandningen till röret genom snabbfiltreringsmaterialfiltret och håll det på is.
- Överför proverna till ett 2 ml rör och tillsätt 1 % proteinhämmarcocktail.
- Blanda innehållet genom att vända uppåt och nedåt 7-8 gånger och centrifugera vid 1 000 x g i 2 minuter vid 4 °C.
- Överför det övre lösningsmedlet från proverna till nya 2 ml rör, tillsätt 10 % β-D-maltosid (β-DM) och lägg på is i 5 minuter. Centrifugera vid 20 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
7. Balansera avsaltningskolonnen
- Centrifugera kolonnen vid 1 000 x g i 1 minut vid 4 °C.
OBS: Markera ena sidan av kolonnen och se till att den markerade sidan är vänd utåt under alla centrifugeringsprocesser. - Ta bort kolonnens övre och nedre lock och centrifugera vid 1 000 x g i 2 minuter vid 4 °C.
- Kassera den flytande lösningen från kolonnens uppsamlingsrör och tillsätt 5 ml 1x PBS-buffert för tvätt.
- Centrifugera kolonnen vid 1 000 x g i 2 minuter vid 4 °C.
- Upprepa steg 7.3 och 7.4 minst fem gånger.
8. Tvätt av magnetiska pärlor
- Ta ett 1,5 ml rör och tillsätt 50 μL streptavidin-C1-konjugerade magnetiska pärlor.
- Tillsätt 1 ml 1x PBS-BSA för tvätt, blanda noggrant och placera på magnetstativet i 3 min. Kassera supernatanten.
- Upprepa steg 8.2 minst tre gånger.
- Efter varje tvätt, placera röret på magnetstället för att adsorbera pärlorna mot ena sidan av röret för att ta bort tvättbufferten.
9. Berikning av biotinylerade proteiner
- Tillsätt 2 ml av proverna till kolonnen och centrifugera vid 1 000 x g i 8 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 1 ml avsaltat proteinextrakt till 50 μl streptavidin-C1-konjugerade magnetiska pärlor för att balansera dem.
- Placera röret på rotatorn på normal hastighet så att lösningen blandas ordentligt och inkuberas i rumstemperatur (RT) i 30 min.
- Placera pärlorna på magnetstället i 3 minuter vid RT, eller tills de samlas på ena sidan av röret, för att försiktigt ta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert I (2% SDS i vatten), rotera vid RT i 2 min på en rotator och upprepa steg 9.4.
- Placera röret på rotatorn vid RT i 2 minuter efter tillsats av 1 ml tvättbuffert II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % deoxicholsyra [w/v] och 1 % Triton X-100). Upprepa steg 9.4.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % deoxicholsyra [w/v], 1 % NP40 [v/v]), och rotera med en shaker i 2 minuter vid RT. Upprepa sedan steg 9.4.
- För att ta bort tvättmedlet, tillsätt 1.7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) och upprepa steg 9.4. Upprepa detta steg en gång till.
- Tvätta pärlorna sex gånger i 2 minuter vardera i 1 ml 50 mM ammoniumbikarbonatbuffert vid RT och upprepa steg 9.4.
- Tillsätt 50 μl av proteinextraktet som innehåller 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12 % (vikt/volym) sackaros (Suc), 2 % (vikt/volym) litiumlaurylsulfat och 1,5 % (vikt/volym) ditotreitol till pärlorna, värmechock i inkubatorn vid 100 °C i 5 minuter och följ steg 9.4. Förvara supernatanten vid -80 °C för LC-MS/MS-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt tidigare forskning är gurkgenen APRR2 den kandidatgen som styr vit omogen fruktfärg8. Här utvecklades ett protokoll med hjälp av AirID som ett närhetsmärkningsenzym för att hitta det interagerande partnerproteinet för APRR2 i gurka. Konstruktionen överfördes till gurkbladen, och efter 36 timmar efter infiltration överfördes biotin. Efter 48 timmar togs proverna för western blot-analys för att bekräfta den lyckade transformationen. Proteinerna extraherades som nämnts ovan i protokollet för western blot. De representativa data som visas i figur 1 indikerade proteinuttrycket och biotinyleringen i de infiltrerade gurkbladen, vilket var de förväntade resultaten baserat på den nyligen modifierade tekniken. Resultaten visade en högre uttrycksnivå av märkta proteiner och extra band jämfört med kontrollgruppen. Detta bekräftar att AirID framgångsrikt har märkt målproteinerna för genen av intresse (GOI). Vidare bekräftades resultaten också med hjälp av anti-flagg- och anti-musantikroppar, som framgångsrikt visade målbandet med anti-flaggantikroppar (Figur 2). Efter bekräftelse genom western blot-analys utförde vi ytterligare Co-IP med hjälp av det protokoll som nämns ovan, och de infiltrerande bladens biotinylerade proteiner anrikades framgångsrikt för masspektrometrianalys, som visas i figur 3. Efter att ha berikat biotinylerade proteiner med streptavidin C1-konjugerade magnetiska pärlor observerades flera proteiner av olika storlek, och western blot-analys avslöjade utsmetade band (Figur 3).
Figur 1: Western blot-analys av proteiner efter omvandling till löv för att bekräfta funktionen av AirID med streptavidin-HRP. Figuren bekräftar att biotinylerade proteiner har fyra oberoende replikat för de konstrukttransformerade proverna. Löv av vildtyp användes som kontroll. För varje replikat laddades 10 μL av proverna för western blot-analys. Streptavidin-HRP (1:6000 spädning) användes för att analysera biotinylerade proteiner i olika prover. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Western blot-analys av proteiner efter omvandling till löv för att detektera Taq-sekvensen. 3x-Flag-taggsekvensen smältes samman med genen av intresse för att bekräfta den lyckade transformationen. Taq-sekvensen identifierades genom western blot-analys i alla de transformerade proverna. Gurkbladsprover av vildtyp användes som kontroll. Totalt 10 μL av proverna laddades för western blot-analys, och resultaten bekräftades med anti-flag som första antikropp vid spädning 1:3000 och anti-mus som en andra antikropp vid spädning 1:10000. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Immunoblot-analys av proteinextrakt. Efter Co-immunoprecipitation (Co-IP) utfördes Western blot-analys av biotinylerade proteiner i de agroinfiltrerade bladen av Cucumis sativus (Gurka) med streptavidin-HRP. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det aktuella experimentet användes AirID för närhetsmärkning, som Kido et al. utvecklade genom en algoritm för rekonstruktion av förfäders enzymer med hjälp av en stor genomdatauppsättning och fem konventionella BirA-enzymer5. Slumpmässiga mutationer användes i traditionell evolutionär proteinteknik för att öka aktiviteten 9,10 eftersom slumpmässiga mutationer inte kan producera dynamiska sekvensförändringar. Jämfört med andra PL-enzymer har AirID flera fördelar. Tidigare var denna PL-metod endast tillämplig på djursystem. I denna studie användes det för att undersöka protein-proteininteraktioner i växter. Protokollet beskriver hur man ställer in den AirID-baserade PL i växter steg för steg, inklusive beredning av bladprover, avlägsnande av fritt biotin, kvantifiering av extraherade proteiner och anrikning av biotinylerade proteiner.
Med hjälp av det väletablerade Agrobacterium-medierade transienta uttrycket i gurkan används detta tillvägagångssätt för att hitta PPI:er av målproteinet av intresse i gurka. Det övergående uttrycket kan leda till överuttryck av fusionsproteinerna. AirID-fusionen måste också testas för att säkerställa att den inte stör funktionen hos målproteinet av intresse, vilket är en annan avgörande faktor. Men även om PL ger flera fördelar jämfört med vanliga IP-MS-tekniker för att upptäcka övergående eller svaga PPI:er, har det också vissa begränsningar. Först och främst, att upptäcka ett kandidatinteraktionsprotein innebär inte automatiskt en direkt eller indirekt interaktion med betesproteinet utan återspeglar istället närheten till betesproteinet9. Protonpumpshämmare kan verifieras ytterligare in vivo med hjälp av oberoende analyser (t.ex. co-immunoprecipitation, bimolekylär fluorescenskomplementering (BiFC) eller in vitro GST-pull down-analys, som kan utföras för att verifiera protonpumpshämmare ytterligare.
Studien visade att den proximala biotinyleringsaktiviteten för AirID var betydligt lägre än för TurboID. In vitro och i celler hade TurboID den högsta proximala biotinyleringsaktiviteten. Detta enzym kan användas inom 10 minuter för att biotinylera 9,11. Men i celler som behandlades för en långvarig inkubation på över 6 timmar och högre biotinkoncentrationer ledde den högsta TurboID-aktiviteten till extra biotinylering på oväntade proteiner, såsom tubulin och GFP (såsom 50 mM biotin). I motsats till att användas som ett proximalt biotinyleringsenzym för protonpumpshämmare, rapporterades TurboID först som ett biotinmärkningsenzym 4,6,5,7. Om TurboID skulle utvärdera protonpumpshämmare skulle det fungera bäst under begränsande förhållanden, såsom att tidslängden är kort, cirka 1 timme i celler. AirID, biotinylering av tubulin och GFP återfanns inte under samma betingelser som de som observerats för TurboID-biotinylering. AirID-fusionsproteiner visade sig vara kapabla till biotinylering av varje välkänd interactor i båda transienterna, vilket demonstrerades av streptavidin-pull down-analysen och LC-MS/MS-analysen5. Vid låga ATP-koncentrationer (1 mM) var bildningen av biotinoyl-5-AMP starkare för AirID än för TurboID. Det gynnar lägre koncentrationer av biotin (med 5 mM biotin eller utan biotintillskott) än TurboID, som föredrar högre koncentrationer. Dessutom visade en undersökning av biotinyleringsställen med LC-MS/MS att AirID-biotinylering inträffade utan någon unik sekvenspreferens på en närliggande Lys-rest, vilket indikerar att biotinyleringsprocessen var icke-preferentia5. Även om sekvenslikheten mellan BioID och AirID är 82 %, visade AirID hög biotinyleringsaktivitet mot interagerande proteiner. Kido et al., 2020 fann att AirID kan analysera protein-proteininteraktioner in vitro och i celler. Deras resultat tyder på att biotinylering beroende av AirID kan vara användbar för PPI-analys av kemiska föreningar. Identifieringen av in vivo-partners till målproteiner är avgörande för att förstå biologiska funktioner12,13, och det har avslöjat nya protonpumpshämmare, så in vivo närhetsbiotinylering med BioID har använts i många studier. Även när biotin tillsattes resulterade inte ett stabilt uttryck av AirID i celltillväxthämning, vilket tyder på att uttrycket av AirID-fusionsproteiner skulle vara mycketlågtoxiskt. AirID förväntas förbättra PPI-beroende biotinyleringsnoggrannhet i kombination; Sammanfattningsvis dras slutsatsen att AirID är idealiskt för PPI-analys i växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerade att det inte förelåg några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (anslag nr 32000197 till X.H.), det särskilda finansiella bidraget från China Postdoctoral Science Foundation (anslag nr 2019T120467 till X.H.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
References
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
- Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
- Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
- Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
- Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
- Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
- Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
- Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).
