Summary
Une méthode simple et évolutive a été développée pour évaluer la signification fonctionnelle des variantes faux-sens dans Ube3a, un gène dont la perte et le gain de fonction sont liés à la fois au syndrome d’Angelman et au trouble du spectre autistique.
Abstract
L’utilisation accrue du séquençage en médecine a permis d’identifier des millions de variantes codantes dans le génome humain. Beaucoup de ces variantes se produisent dans les gènes associés aux troubles neurodéveloppementaux, mais la signification fonctionnelle de la grande majorité des variantes reste inconnue. Le présent protocole décrit l’étude des variantes de Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 liée à la fois à l’autisme et au syndrome d’Angelman. La duplication ou la triplication d’Ube3a est fortement liée à l’autisme, alors que sa délétion provoque le syndrome d’Angelman. Ainsi, la compréhension de la valence des changements dans l’activité de la protéine UBE3A est importante pour les résultats cliniques. Ici, une méthode rapide basée sur les cellules qui associe les variantes Ube3a avec un rapporteur de voie Wnt est décrite. Ce test simple est évolutif et peut être utilisé pour déterminer la valence et l’ampleur des changements d’activité dans n’importe quelle variante d’Ube3a . De plus, la facilité de cette méthode permet la génération d’une mine d’informations structure-fonction, qui peuvent être utilisées pour obtenir des informations approfondies sur les mécanismes enzymatiques d’UBE3A.
Introduction
Les progrès technologiques récents ont rendu le séquençage des exomes et des génomes systématique en milieu clinique 1,2. Cela a conduit à la découverte d’un grand nombre de variantes génétiques, y compris des millions de variantes faux-sens qui modifient généralement un acide aminé dans une protéine. Comprendre la signification fonctionnelle de ces variantes reste un défi, et seule une petite fraction (~2%) des variantes faux-sens connues ont une interprétation clinique 1,3.
Un exemple frappant de ce problème est Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 qui cible les protéines substrat pour la dégradation4. Ube3a réside dans le chromosome 15q11-13 et est exprimé exclusivement à partir de l’allèle maternel 5,6,7. Les observations de la génétique de la maladie suggèrent fortement qu’une activité insuffisante ou excessive de l’enzyme UBE3A provoque des troubles neurodéveloppementaux distincts. La délétion du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome d’Angelman (SA)8, un trouble caractérisé par une déficience intellectuelle sévère, des déficiences motrices, des convulsions, un comportement heureux avec des sourires fréquents et des traits du visage dysmorphiques 8,9,10. En revanche, la duplication ou la triplication du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome Dup15q, une maladie hétérogène reconnue comme l’une des formes syndromiques les plus répandues de l’autisme11,12,13. En outre, il existe des centaines de variantes faux-sens identifiées dans Ube3a, dont la majorité sont considérées comme des variantes de signification incertaine (VUS) car leur signification fonctionnelle et clinique est inconnue. Ainsi, il existe un intérêt considérable pour le développement de méthodes permettant d’évaluer empiriquement les variantes d’Ube3a afin de déterminer si elles contribuent à la maladie neurodéveloppementale.
L’enzyme UBE3A appartient à la famille de domaines HECT (homologue à E6-AP C-terminus) des ligases d’ubiquitine E3 qui possèdent toutes le domaine HECT éponyme, qui contient la machinerie biochimique nécessaire pour accepter l’ubiquitine activée des enzymes E2 et la transférer aux protéines substrat14. Historiquement, la caractérisation des enzymes E3 s’est appuyée sur des systèmes in vitro reconstitués qui nécessitent un ensemble de protéines purifiées 4,15,16. Ces méthodes sont lentes et laborieuses et ne se prêtent pas à l’évaluation de l’activité d’un grand nombre de variantes. Dans des travaux antérieurs, UBE3A a été identifié pour activer la voie Wnt dans les cellules HEK293T en modulant la fonction du protéasome pour ralentir la dégradation de la β-caténine17. Cet aperçu permet l’utilisation des rapporteurs de trajectoire Wnt comme méthode efficace et rapide pour identifier les variantes de perte et de gain de fonction d’Ube3a18. Le protocole ci-dessous décrit en détail une méthode pour générer des variantes Ube3a ainsi qu’un rapporteur basé sur la luciférase pour évaluer les changements dans l’activité des variants Ube3a.
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Protocol
1. Clonage de mutagenèse pour générer des variantes d’Ube3a
- Cloner toutes les variantes d’Ube3a dans le plasmide pCIG2 (Figure 1A), un vecteur bicistronique qui contient un promoteur de la β-actine de poulet et un site d’entrée interne du ribosome (IRES) pour l’expression EGFP19. Les constructions Ube3a complètes contiennent une séquence Myc-tag N-terminale et sont clonées en pCIG2 à l’aide d’un site SacI de 5' et d’un site XmaI de 3'. En outre, les sites naturels EcoRI, EcoRV et PstI dans la séquence de codage Ube3a sont également utilisés pour sous-cloner des fragments.
REMARQUE : Les variantes anonymisées d’Ube3a peuvent être obtenues dans la littérature et dans des dépôts accessibles au public tels que la base de données ClinVar1. D’autres variantes non signalées peuvent être obtenues par le biais d’une communication personnelle avec les centres médicaux. - Utiliser une méthode de mutagénèse mégaamorce adaptée en deux étapes20 pour introduire des mutations dans le cadre de lecture Ube3a . Dans un premier temps, concevoir l’oligonucléotide mutagène qui contient la mutation souhaitée (l’exemple montré dans ce protocole est de générer une variante UBE3A Q588E) flanquée d’au moins 30 paires de bases (pb) d’homologie 5′ et 3′ à la mutation (Figure 1B et Tableau 1).
- Utiliser l’oligonucléotide mutagène avec un oligonucléotide complémentaire pour la première PCR de cycle afin de générer une mégaamorce de 200 à 400 pb contenant la mutation (Figure 1C ; Tableau 2 et Tableau 3). Utiliser la totalité des 50 μL du volume de réaction PCR pour l’électrophorèse sur gel d’agarose en utilisant un gel à 1% et une purification ultérieure du gel (Tableau des matériaux). Éluer le produit de PCR dans 30 μL deH2Odésionisé (diH2O) pour l’utiliser dans la deuxième étape de PCR ronde ci-dessous.
- Configurez la PCR de deuxième cycle comme indiqué (Figure 1C; Tableau 2 et Tableau 3). Cette étape générera des fragments d’ADN plus grands (généralement ~1-1,5 kb de longueur) contenant les sites de mutation et de restriction terminale appropriés pour le sous-clonage (Figure 1C).
- Une fois la réaction PCR terminée, purifier le produit résultant à l’aide d’un kit de purification PCR (Table of Materials). Éluer dans 30 μL et digérer tout le produit purifié et la construction pCIG2 Ube3a WT avec les enzymes de restriction appropriées (l’exemple montre la digestion avec EcoRI et XmaI).
- Après 2 h de digestion à 37 °C, résoudre les produits de digestion par électrophorèse sur gel d’agarose (gel à 1%) et purifier les produits appropriés. Mettre en place des ligatures selon le protocole du fabricant (Table of Materials), transformer les produits de ligature en une souche bactérienne DH10B (Table of Materials), puis plaquer avec une sélection d’ampicilline (100 μg/mL).
- Le lendemain, prélevez de deux à quatre colonies pour inoculer 3 mL de cultures contenant du bouillon de Luria (LB) et 100 μg/mL d’ampicilline. Laisser pousser les cultures pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur orbital avec agitation (225 rpm).
- Le lendemain, utilisez 1 à 1,5 mL de la culture bactérienne pour mini-préparer l’ADN plasmidique (Tableau des matériaux). Conserver la culture restante en les plaçant à 4 °C. Cribler les plasmides mini-imprégnés par séquençage de Sanger à l’aide d’un oligonucléotide qui se lie à ~200 bp de la mutation souhaitée.
- Utiliser les cultures bactériennes conservées à 4 °C pour inoculer à nouveau 50 mL de cultures afin de midipréparer le plasmide correct (Tableau des matériaux). Séquencer complètement la séquence codante Ube3a pour valider la séquence correcte de l’ADN.
- Créer des stocks de travail de plasmides variants Ube3a, ainsi que du rapporteur activé par la β-caténine (BAR)21, de la TK-Renilla luciférase, de l’Ube3a mort par la ligase (mutation UBE3A C820A) et du vecteur vide pCIG2 à une concentration de 100 ng/μL en utilisant leH2Ostérile pour les étapes de transfection suivantes.
2. Préparation et transfection de cellules 293T (HEK293T) embryonnaires humaines
- Effectuer les dosages sur des cellules HEK293T cultivées dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco pré-supplémenté en glutamine, 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et un agent antibiotique-antimycotique comme décrit précédemment17. Cultiver les cellules dans un incubateur stérile humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.
- À l’aide d’une enceinte de biosécurité, plaquez d’abord les cellules HEK293T en suspension sur des plaques à fond plat à 96 puits traitées par culture tissulaire à une densité de 2,2 × 10à 4 cellules par puits dans 100 μL de milieux de culture et laissez-les croître pendant la nuit.
- Le deuxième jour, transfectez les cellules dans une armoire de biosécurité avec des plasmides rapporteurs Firefly et Renilla luciferase (tableau 4) et Ube3a en trois exemplaires. Effectuer les transfections dans 10 μL de volume total par puits en utilisant un rapport de 10:1:8 de plasmides (50 ng de BAR, 5 ng de TK-Renilla et 40 ng de plasmide Ube3a par puits, respectivement), comme décrit précédemment,18, et 0,4 μL de réactif de transfection (tableau 4).
NOTE: Pour chaque expérience, un vecteur vide (GFP uniquement) et un plasmide codant pour la ligase morte Ube3a sont également transfectés pour servir de témoins négatifs. - Créer un mélange maître pour les transfections pour chaque variante dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL (tableau 4) et incuber à température ambiante (TR) pendant 15 min. Après l’incubation, agiter doucement le mélange de transfection en tapotant le tube, puis ajouter 10 μL du mélange de transfection directement dans le milieu de croissance existant dans les puits.
- Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur et laissez les plasmides s’exprimer pendant 48 h. Le remplacement du milieu de culture n’est pas nécessaire.
- Surveiller l’efficacité de la transfection par fluorescence GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les cellules HEK293T sont efficacement transfectées par cette méthode, et >80% des cellules devraient exprimer la GFP après 48 h.
3. Mesure de l’activité de la luciférase
REMARQUE : L’activité de la luciférase est évaluée à l’aide d’un système disponible dans le commerce qui analyse à la fois Firefly et Renilla luciferase (tableau des matériaux) conformément au protocole du fabricant.
- Aspirez soigneusement les milieux de culture des cellules HEK293T transfectées, puis lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS). Aspirer le PBS et lyser les cellules en ajoutant 25 μL de tampon de lyse non dénaturant et incuber pendant 15 minutes en berçant doucement sur la glace.
- Ensuite, ajoutez 20 μL du lysat résultant (aucune centrifugation n’est nécessaire) dans une nouvelle plaque de dosage de 96 puits contenant 100 μL d’un réactif de substrat de luciférase Firefly. Mélangez doucement l’assiette en tapotant.
- Chargez la plaque sur un lecteur de plaques et mesurez la luminescence à l’aide d’un détecteur supérieur avec une hauteur de lecture de 1 mm et un temps d’intégration de 1 s.
REMARQUE: Le gain du détecteur peut devoir être ajusté en fonction de la force du signal. - Immédiatement après avoir lu la luminescence luciférase Firefly, ajoutez 100 μL de substrat de Renilla luciferase aux puits. Cette étape éteint simultanément l’activité de la luciférase Firefly tout en évaluant l’activité de Renilla luciferase. Mélanger les échantillons par agitation douce de la plaque et mesurer à nouveau la luminescence pour évaluer l’activité de Renilla luciférase.
REMARQUE: Bien que d’autres plaques puissent être utilisées pour ce test, l’utilisation de plaques avec des cadres noirs et des puits blancs fournira les résultats les plus sensibles car cela amplifie le signal de luciférase tout en minimisant le bruit. - Quantifier les réponses des rapporteurs comme le rapport luciférase luciférase Firefly / Renilla luciferase (Firefly/Renilla), et faire la moyenne des valeurs des mesures triples. Ensuite, normalisez la valeur Firefly/Renilla pour chaque variant par rapport aux valeurs des cellules exprimant Ube3a de type sauvage (WT) pour comparer l’activité relative des protéines variantes.
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Representative Results
Le criblage fonctionnel à grande échelle des variantes faux-sens d’Ube3a identifie un large paysage de mutations de perte et de gain de fonction
Des travaux antérieurs avec des mutants Ube3a ont suggéré que la réponse Wnt peut servir de rapporteur de l’activité cellulaire de la protéine UBE3A. Ces observations ont été élargies et des expériences de validation supplémentaires ont été réalisées pour déterminer si le test BAR est approprié pour signaler une gamme d’activités UBE3A dans la cellule. Tout d’abord, les cellules HEK293T ont été transfectées avec des quantités variables d’ADN plasmidique codant pour le WT Ube3a humain. Cette expérience a démontré que la réponse BAR change linéairement avec la quantité d’Ube3a transfectée dans les cellules (Figure 2A). Deuxièmement, le test BAR a été testé en utilisant de l’ADN plasmidique codant pour des variantes liées à la maladie précédemment caractérisées dans la littérature22. Parmi ceux-ci figuraient des variantes bénignes (R39H et A178T), une variante de gain de fonction liée à l’autisme (T458A) et une collection de variantes confirmées liées au syndrome d’Angelman qui entraînent une perte de la fonction UBE3A par divers mécanismes15,22. Le test BAR a correctement identifié chaque variante (Figure 2B), y compris toutes les variantes de perte de fonction, démontrant la précision et la généralité de cette méthode18.
Le test BAR a été utilisé pour examiner 152 variantes faux-sens, dont la plupart ont été identifiées à partir de la base de données ClinVar. À l’instar des preuves génétiques concernant les variations du nombre de copies dans les troubles dépendants d’Ube3a, l’impact fonctionnel des variantes faux-sens était large et comprenait des variantes bénignes ainsi que des variantes de perte de fonction et de gain de fonction (Figure 3)18. Fait particulièrement intéressant, les variantes de gain de fonction identifiées à l’aide de cette méthode étaient toutes nouvelles, et la validation ultérieure a fortement suggéré qu’elles définissent une sous-classe de troubles Ube3a-dépendants avec des phénotypes différents du syndrome d’Angelmanclassique 18.
L’effet des variantes faux-sens est souvent imprévisible, ce qui souligne la nécessité d’une évaluation fonctionnelle
Une observation intrigante du criblage fonctionnel des variantes d’Ube3a est que les changements à certaines positions d’acides aminés produisent des effets radicalement différents, soulignant ainsi l’importance de l’évaluation empirique des variantes18. Par exemple, trois personnes ont été identifiées avec des variantes à la position glutamine 588 (Q588) dans UBE3A qui comprenaient une substitution de glutamate de gain de fonction (Q588E), une substitution de perte de fonction arginine (Q588R) et une autre substitution de proline de perte de fonction (Q588P; Figure 4A). Une approche de mutation complète a été utilisée pour muter la position Q588 en tous les acides aminés possibles. Lorsque l’activité de ces variants a été mesurée à l’aide du test BAR, il a montré que tout acide aminé chargé négativement à la position 588 produit une enzyme hyperactive (Figure 4B). Cet aperçu a fourni d’importants indices fonctionnels qui ont permis la découverte d’un nouveau site dans le domaine HECT d’UBE3A qui facilite l’allongement de la chaîne ubiquitine18.
Figure 1 : Mutagénèse dépendante de la PCR d’Ube3a. (A) Représentation du vecteur d’expression Ube3a indiquant les sites de restriction pertinents. (B) La séquence d’ADN codant pour UBE3A est indiquée en haut. Le codon Q588 est indiqué en caractères gras. L’amorce de mutagénèse Q588E (amorce mut.) est montrée alignée sur la séquence UBE3A. Le lettrage rouge indique le site mutagénie. (C) Un schéma de la PCR pour générer la mégaamorce et le fragment d’ADN utilisé pour sous-cloner le fragment Q588E est montré. La position de la mutation Q588E est indiquée par l’astérisque rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Validation du test BAR en tant que déclarant de l’activité de l’ubiquitine ligase UBE3A. (A) Les cellules HEK293T transfectées avec des quantités croissantes de plasmides codant pour WT UBE3A montrent une augmentation linéaire de la réponse BAR. Les valeurs moyennes sont indiquées pour les rapports Firefly/Renilla luciferase ± erreur type (ET). N= 3 expériences indépendantes. (B) Des variantes Ube3a précédemment caractérisées ont été testées dans le test BAR. Les réponses ont été normalisées à WT UBE3A, et les valeurs sont indiquées comme la moyenne ± SE. Le nombre d’expériences (n) et les valeurs p calculées à l’aide d’un test t à un échantillon (bilatéral) avec correction des comparaisons multiples de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05) sont les suivants : GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1,519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7,787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Données reproduites avec la permission de Weston et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Variantes UBE3A englobant un large éventail d’effets fonctionnels. Criblage BAR de 152 variantes d’Ube3a présentant des mutations bénignes (gris), de perte de fonction (bleu) et de gain de fonction (rouge) par rapport à WT UBE3A. La signification a été déterminée à l’aide d’un test t à un échantillon (bilatéral) avec correction des comparaisons multiples de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). Rouge, gain de fonction; Gris, aucun changement par rapport à WT UBE3A; Bleu, perte de fonction. Données reproduites avec la permission de Weston et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Variantes UBE3A englobant un large éventail d’effets fonctionnels. (A) Résultats du test BAR des variantes à la position 588 d’UBE3A montrant à la fois des substitutions de perte et de gain de fonction. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, Test t à un échantillon (bilatéral) avec correction de comparaison multiple de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). (B) Diagramme thermique montrant les résultats normalisés de BAR pour une analyse mutationnelle complète à la position 588 dans UBE3A. L’ombrage blanc représente les niveaux d’activité de WT UBE3A, l’ombrage bleu indique la perte de fonction et l’ombrage rouge indique le gain de fonction. La barre d’échelle montre la variation en pourcentage par rapport à WT UBE3A. N = 3 expériences indépendantes pour Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 pour Q588E, n = 6 pour Q588D, n = 5 pour Q588R, n = 4 pour Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Test t à un échantillon (bilatéral) avec correction des comparaisons multiples de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). Données reproduites avec la permission de Weston et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom | Séquence | Utilisé pour | |
| Introduction 1 | GATTATATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a Sens EcoRI | |
| Amorce mut. | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E antisens de mutagénèse | |
| Introduction 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisens | |
Tableau 1 : Amorces utilisées pour la mutagénèse UBE3A Q588E.
| 1er tour PCR | |
| Réactif | Quantité de réaction |
| 5x tampon haute fidélité | 10 μL |
| dNTP (10 mM de stock) | 1 μL |
| Amorce 1 (10 mM de stock) | 1 μL |
| Introduction 2 (10 mM de stock) | 1 μL |
| ADN WT-Ube3a (150 ng/μL de stock) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| ADN polymérase haute fidélité | 1 μL |
| Total Volume | 50 μL |
| 2e tour PCR | |
| Réactif | Quantité de réaction |
| 5x tampon haute fidélité | 10 μL |
| dNTP (10 mM de stock) | 1 μL |
| Introduction 3 (10 mM de stock) | 1 μL |
| Produit PCR purifié (Megaprimer) | 30 μL |
| ADN WT-Ube3a (150 ng/μL de stock) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| ADN polymérase haute fidélité | 1 μL |
| Total Volume | 50 μL |
Tableau 2 : Paramètres de PCR pour la mutagénèse.
| 1er tour PCR | ||
| Pas | Température | Heure |
| Dénaturation initiale | 95 °C | 2 min |
| (1 cycle) | ||
| Dénaturation | 95 °C | 30 s |
| Recuit | 50 °C | 20 s |
| Extension | 72 °C | 15 s |
| (30 cycles) | ||
| Prolongation finale | 72 °C | 1 min |
| Tenir | 4 °C | Infini |
| 2e tour PCR | ||
| Pas | Température | Heure |
| Dénaturation initiale | 95 °C | 2 min |
| (1 cycle) | ||
| Dénaturation | 95 °C | 30 s |
| Recuit | 50 °C | 20 s |
| Extension | 72 °C | 35 s |
| (30 cycles) | ||
| Prolongation finale | 72 °C | 1 min |
| Tenir | 4 °C | Infini |
Tableau 3 : Paramètres du programme de PCR pour la mutagénèse.
| Réactif | Concentration de travail | 1x transfection | 3,5x Master Mix |
| pGL3 BAR plasmide | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 μL |
| pTK Plasmide de Renilla | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Plasmide Ube3a | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 μL |
| DMEM complété par de la glutamine | 8,65 μL | 30,275 μL | |
| Réactif de transfection | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tableau 4 : Mélanges de transfection.
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Discussion
Le protocole décrit ici fournit une méthode efficace et évolutive pour évaluer l’activité enzymatique des variantes d’Ube3a. Plusieurs détails techniques méritent d’être soigneusement examinés lors de l’utilisation de ce test. Une considération est le choix des plasmides rapporteurs Wnt utilisés dans ce test. Le protocole décrit ici utilise spécifiquement le rapporteur activé par la β-caténine (BAR)21, un rapporteur qui contient un concatémère de 12 éléments de réponse du facteur T (TCF) séparés par des séquences de liaison spécialement conçues pour minimiser la recombinaison et la perte des sites de liaison au TCF. Il existe d’autres plasmides rapporteurs Wnt à base de luciférase décrits dans la littérature23, et bien que des études antérieures indiquent que certains peuvent être utilisés pour évaluer l’activité UBE3A, le plasmide BAR a été caractérisé le plus complètement à cette fin17,18. Deuxièmement, le choix du plasmide Renilla luciferase est critique. Un plasmide codant pour Renilla luciferase est inclus lors de l’étape de transfection pour normaliser l’efficacité de la transfection. Le plasmide utilisé dans ce protocole exprime de manière constitutive la Renilla luciférase sous le contrôle d’un promoteur de la thymidine kinase (TK) (TK-Renilla). L’utilisation de plasmides contenant d’autres promoteurs, tels que le promoteur du cytomégalovirus (CMV) largement utilisé, peut entraîner des résultats variables dans l’expression de Renilla luciferase.
Une deuxième considération est le comportement des cellules en fonction du type et du lot de FBS utilisé pour la culture cellulaire. Par exemple, FBS peut affecter de manière variable le taux de croissance des cellules HEK293T. Le protocole actuel a été optimisé avec des cellules présentant un temps de doublement typique de 18-24 h, ce qui rend la densité cellulaire au moment de la transfection d’environ ~4 × 104 cellules par puits. Comme la densité cellulaire peut affecter l’efficacité de la transfection, les taux de croissance cellulaire doivent être soigneusement évalués par l’utilisateur et le nombre de cellules ajusté en conséquence au moment du placage. De plus, la réponse BAR dépendante d’UBE3A nécessite la présence d’une certaine quantité de ligand Wnt pendant l’expérience. Dans la plupart des conditions standard, il y a suffisamment de Wnt dans le FBS pour piloter cette réponse ; Cependant, cette réponse peut également varier. Le titrage des rapports plasmidiques utilisés pour la transfection est recommandé pour s’assurer que la réponse BAR est mesurée dans la plage linéaire appropriée. Une autre approche consiste à stimuler la signalisation Wnt à l’aide d’un ligand Wnt recombinant ou d’un milieu de croissance complété par Wnt17.
Un avantage du test BAR est qu’il peut rapporter l’activité de l’ubiquitine ligase de toutes les isoformes d’Ube3a . Les humains expriment trois isoformes d’Ube3a qui diffèrent à leur extrême N-termini en raison de l’utilisation de sites de départ transcriptionnels alternatifs24. Le test BAR fournit la même lecture agnostique aux isoformes, et ainsi, ce test peut être utilisé pour évaluer toutes les variantes Ube3a . En outre, la caractérisation à grande échelle des variantes d’Ube3a fournit des données approfondies structure-fonction qui peuvent découvrir de nouveaux domaines et mécanismes essentiels à la fonction enzymatique. Une étude antérieure a utilisé des données variantes pour découvrir un domaine de liaison à l’ubiquitine dans UBE3A qui facilite l’élongation de la chaîne ubiquitine18. D’autres études structure-fonction fourniront probablement de nouvelles informations sur les mécanismes biochimiques d’UBE3A qui pourraient être exploitées pour le développement thérapeutique.
Certaines limites du test BAR justifient un examen attentif lors de la détermination de la pathogénicité d’une variante. En raison de l’empreinte épigénétique d’Ube3a dans les neurones, ce test ne peut pas discriminer les allèles maternels et paternels, et des preuves génétiques supplémentaires doivent être pesées avec des données fonctionnelles pour déterminer la pathogénicité d’un variant. De plus, des variables supplémentaires au-delà de l’activité ubiquitine ligase d’UBE3A doivent être considérées dans le contexte de la maladie. Par exemple, des travaux antérieurs ont montré que UBE3A localisé dans le nucléaire contribue à la pathologie du syndrome d’Angelman25 et que certaines variantes perturbent ce schéma de localisation de l’enzyme26. Ainsi, des caractérisations supplémentaires en aval doivent être effectuées pour acquérir une compréhension complète de la contribution des variantes Ube3a à la pathologie neurodéveloppementale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un prix Bridge to Independence de la Fondation Simons (SFARI Award #387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), une bourse de recherche de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) et des subventions de recherche de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), de la Whitehall Foundation (J.J.Y.) et du NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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