Une méthode simple et évolutive a été développée pour évaluer la signification fonctionnelle des variantes faux-sens dans Ube3a, un gène dont la perte et le gain de fonction sont liés à la fois au syndrome d’Angelman et au trouble du spectre autistique.
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Article de méthode
Une méthode évolutive basée sur des cellules pour l’évaluation fonctionnelle des variantes d’Ube3a
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’utilisation accrue du séquençage en médecine a permis d’identifier des millions de variantes codantes dans le génome humain. Beaucoup de ces variantes se produisent dans les gènes associés aux troubles neurodéveloppementaux, mais la signification fonctionnelle de la grande majorité des variantes reste inconnue. Le présent protocole décrit l’étude des variantes de Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 liée à la fois à l’autisme et au syndrome d’Angelman. La duplication ou la triplication d’Ube3a est fortement liée à l’autisme, alors que sa délétion provoque le syndrome d’Angelman. Ainsi, la compréhension de la valence des changements dans l’activité de la protéine UBE3A est importante pour les résultats cliniques. Ici, une méthode rapide basée sur les cellules qui associe les variantes Ube3a avec un rapporteur de voie Wnt est décrite. Ce test simple est évolutif et peut être utilisé pour déterminer la valence et l’ampleur des changements d’activité dans n’importe quelle variante d’Ube3a . De plus, la facilité de cette méthode permet la génération d’une mine d’informations structure-fonction, qui peuvent être utilisées pour obtenir des informations approfondies sur les mécanismes enzymatiques d’UBE3A.
Introduction
Les progrès technologiques récents ont rendu le séquençage des exomes et des génomes systématique en milieu clinique 1,2. Cela a conduit à la découverte d’un grand nombre de variantes génétiques, y compris des millions de variantes faux-sens qui modifient généralement un acide aminé dans une protéine. Comprendre la signification fonctionnelle de ces variantes reste un défi, et seule une petite fraction (~2%) des variantes faux-sens connues ont une interprétation clinique 1,3.
Un exemple frappant de ce problème est Ube3a<....
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Protocole
1. Clonage de mutagenèse pour générer des variantes d’Ube3a
- Cloner toutes les variantes d’Ube3a dans le plasmide pCIG2 (Figure 1A), un vecteur bicistronique qui contient un promoteur de la β-actine de poulet et un site d’entrée interne du ribosome (IRES) pour l’expression EGFP19. Les constructions Ube3a complètes contiennent une séquence Myc-tag N-terminale et sont clonées en pCIG2 à l’aide d’un site SacI de 5' et d’un site XmaI de 3'. En outre, les sites naturels EcoRI, EcoRV et PstI dans la séquence de codage Ube3a sont également utilisés pour sous-cl....
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Résultats
Le criblage fonctionnel à grande échelle des variantes faux-sens d’Ube3a identifie un large paysage de mutations de perte et de gain de fonction
Des travaux antérieurs avec des mutants Ube3a ont suggéré que la réponse Wnt peut servir de rapporteur de l’activité cellulaire de la protéine UBE3A. Ces observations ont été élargies et des expériences de validation supplémentaires ont été réalisées pour déterminer si le test BAR est approprié pour signaler une gamme d’activités UBE3A dans .......
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Discussion
Le protocole décrit ici fournit une méthode efficace et évolutive pour évaluer l’activité enzymatique des variantes d’Ube3a. Plusieurs détails techniques méritent d’être soigneusement examinés lors de l’utilisation de ce test. Une considération est le choix des plasmides rapporteurs Wnt utilisés dans ce test. Le protocole décrit ici utilise spécifiquement le rapporteur activé par la β-caténine (BAR)21, un rapporteur qui contient un concatémère de 12 éléments de réponse du facteur T (TCF) .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par un prix Bridge to Independence de la Fondation Simons (SFARI Award #387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), une bourse de recherche de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) et des subventions de recherche de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), de la Whitehall Foundation (J.J.Y.) et du NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsine-EDTA (1x), rouge de phénol | Gibco | 25300-054 | |
| Échelle d’ADN 1 Kb | Lambda Biotech | M108-S | |
| Échelle d’ADN 100 pb | Lambda Biotech | M107 | |
| Tampon 10x pour ADN Ligase T4 avec 10 mM | ATP New England BioLabs | B0202A | |
| Tampon de réaction 5x Phusion HF | New England BioLabs | B0518S | |
| Solution antibiotique-antimycosique | Corning | 30004CI | |
| Noir/Blanc Isoplate-96 Noir Cadre Blanc Plaque de puits | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicilline Sel disodique | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Chambre de comptage de cellules Comtess ; lames | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Compteur de cellules automatisé | technologies de la vie | Machine de comptage cellulaire | |
| Oligos d’ADN personnalisés | d’ADN intégrées (IDT) | ||
| Désoxynucléotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, glycémie élevée, supplément GlutaMAX, pyruvate | Gibco | 10569044 | milieu de base pour soutenir la croissance de HEK293T lignée cellulaire |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Système de dosage à double rapporteur de luciférase | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF ; | New England BioLabs | R3101S | Enzyme de restriction |
| Sérum de veau fœtal, qualifié, inactivé thermiquement | veau fœtal | Gibco | 16140071 |
| Fisherbrand Boîtes de culture de tissus traitées en surface | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Réactif de transfection | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cellules | ATCC | CRL-3216 | |
| Cellules ig 10B à haut rendement chimiquement compétentes | Génomique intacte | 1011-12 | Cellules E. coli DH10B |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmide | |||
| pGL3 BAR Plasmide | |||
| Phusion HF ADN polymérase | New England BioLabs | M0530L | ADN polymérase |
| ProFlex 3 x 32 puits Système PCR | Biosystèmes appliqués par life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Purification |
| de gelQIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | Purification PCR |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Lecteur multimode | BioTek | ; Le lecteur de plaques exécute le logiciel Gen5 v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acétate-EDTA, solution 50x, électrophorèse | Fisher Scientific | BP13324 | |
| plaque de culture tissulaire 96 puits, fond plat | Fisherbrand | FB012931 | |
| solution de bromure d’éthidium UltraPure | Invitrogen de Thermo Fisher Scientific | ||
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Enzyme de restriction |
Références
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Natu....
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