Summary
En enkel och skalbar metod utvecklades för att bedöma den funktionella betydelsen av missensevarianter i Ube3a, en gen vars förlust och funktionsförstärkning är kopplad till både Angelmans syndrom och autismspektrumstörning.
Abstract
Den ökade användningen av sekvensering inom medicin har identifierat miljontals kodande varianter i det mänskliga genomet. Många av dessa varianter förekommer i gener associerade med neurodevelopmental störningar, men den funktionella betydelsen av de allra flesta varianter är fortfarande okänd. Det nuvarande protokollet beskriver studien av varianter för Ube3a, en gen som kodar för en E3 ubiquitin-ligas kopplad till både autism och Angelmans syndrom. Duplicering eller tredubbling av Ube3a är starkt kopplad till autism, medan dess radering orsakar Angelmans syndrom. Således är det viktigt för kliniska resultat att förstå valensen av förändringar i UBE3A-proteinaktivitet. Här beskrivs en snabb, cellbaserad metod som parar ihop Ube3a-varianter med en Wnt-vägreporter. Denna enkla analys är skalbar och kan användas för att bestämma valensen och storleken på aktivitetsförändringar i alla Ube3a-varianter . Dessutom möjliggör anläggningen för denna metod generering av en mängd strukturfunktionsinformation, som kan användas för att få djupa insikter i de enzymatiska mekanismerna för UBE3A.
Introduction
De senaste tekniska framstegen har gjort sekvenseringen av exomer och genom rutin i kliniska miljöer 1,2. Detta har lett till upptäckten av ett stort antal genetiska varianter, inklusive miljontals missense-varianter som vanligtvis förändrar en aminosyra i ett protein. Att förstå den funktionella betydelsen av dessa varianter är fortfarande en utmaning, och endast en liten bråkdel (~ 2%) av de kända missense-varianterna har en klinisk tolkning 1,3.
Ett framträdande exempel på detta problem är Ube3a, en gen som kodar för en E3 ubiquitin-ligas som riktar sig mot substratproteiner för nedbrytning4. Ube3a finns inom kromosom 15q11-13 och uttrycks uteslutande från den moderligt ärvda allelen 5,6,7. Observationer från sjukdomsgenetik tyder starkt på att otillräcklig eller överdriven aktivitet hos UBE3A-enzymet orsakar distinkta neuroutvecklingsstörningar. Radering av moderns kromosom 15q11-13 orsakar Angelmans syndrom (AS)8, en störning som kännetecknas av allvarlig intellektuell funktionsnedsättning, motoriska funktionsnedsättningar, anfall, ett lyckligt uppträdande med frekvent leende och dysmorfa ansiktsdrag 8,9,10. Däremot orsakar duplicering eller tredubbling av moderns kromosom 15q11-13 Dup15q syndrom, ett heterogent tillstånd som erkänns som en av de vanligaste syndromiska formerna av autism11,12,13. Dessutom finns det hundratals missense-varianter identifierade i Ube3a, varav de flesta betraktas som varianter av osäker betydelse (VUS) eftersom deras funktionella och kliniska betydelse är okänd. Det finns således ett stort intresse för att utveckla metoder som empiriskt kan bedöma Ube3a-varianter för att avgöra om de bidrar till utvecklingsneurologisk sjukdom.
UBE3A-enzymet tillhör HECT-domänfamiljen (homolog till E6-AP C-terminus) av E3-ubiquitin-ligaser som alla har den eponymous HECT-domänen, som innehåller det biokemiska maskineriet som är nödvändigt för att acceptera aktiverat ubiquitin från E2-enzymer och överföra det till substratproteiner14. Historiskt sett har karakteriseringen av E3-enzymer förlitat sig på rekonstituerade in vitro-system som kräver en ensemble av renade proteiner 4,15,16. Sådana metoder är långsamma och arbetsintensiva och inte mottagliga för att bedöma aktiviteten hos ett stort antal varianter. I tidigare arbete identifierades UBE3A för att aktivera Wnt-vägen i HEK293T-celler genom att modulera proteasomens funktion för att bromsa nedbrytningen av β-catenin-17. Denna insikt gör det möjligt att använda Wnt-vägreportrar som en effektiv och snabb metod för att identifiera både förlust- och förstärkningsvarianter av Ube3a18. Protokollet nedan beskriver i detalj en metod för att generera Ube3a-varianter samt en luciferasbaserad reporter för att bedöma förändringar i aktiviteten hos Ube3a-varianter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mutagenesis kloning för att generera Ube3a varianter
- Klona alla Ube3a-varianter i pCIG2-plasmiden (figur 1A), en bicistronisk vektor som innehåller en kyckling-β-aktinpromotor och en intern ribosominmatningsplats (IRES) för EGFP-uttryck19. Ube3a-konstruktioner i full längd innehåller en N-terminal Myc-tag-sekvens och klonas till pCIG2 med hjälp av en 5'SacI-plats och en 3' XmaI-plats. Dessutom används naturligt förekommande EcoRI-, EcoRV- och PstI-platser inom Ube3a-kodningssekvensen för att subklona fragment.
OBS: Avidentifierade varianter för Ube3a kan erhållas genom litteraturen och i offentligt tillgängliga arkiv som ClinVar-databasen1. Ytterligare orapporterade varianter kan erhållas genom personlig kommunikation med medicinska centra. - Använd en anpassad tvåstegs megaprimer mutagenes metod20 för att införa mutationer i Ube3a läsram. I det första steget, designa den mutagena oligonukleotiden som innehåller den önskade mutationen (exemplet som visas i detta protokoll är att generera en UBE3A Q588E-variant) flankerad av minst 30 baspar (bp) av homologi 5 ′ och 3 ′ till mutationen (Figur 1B och Tabell 1).
- Använd den mutagena oligonukleotiden tillsammans med en komplementär oligonukleotid för den första omgången PCR för att generera en 200-400 bp megaprimer innehållande mutationen (Figur 1C; Tabell 2 och tabell 3). Använd hela 50 μL av PCR-reaktionsvolymen för agarosgelelektrofores med användning av en 1% gel och efterföljande gelrening (materialtabell). Eluera PCR-produkten i 30 μl avjoniserad H2O(diH2O) för användningi det andra stegetappen nedan.
- Ställ in den andra omgången PCR enligt anvisningarna (figur 1C; Tabell 2 och tabell 3). Detta steg kommer att generera större DNA-fragment (vanligtvis ~ 1-1,5 kb i längd) som innehåller mutationen och terminala restriktionsställen som är lämpliga för subkloning (figur 1C).
- Efter avslutad PCR-reaktion, rena den resulterande produkten med användning av ett PCR-reningssats (materialtabell). Eluera i 30 μl och smälta hela den renade produkten och pCIG2 Ube3a WT-konstruktionen med lämpliga restriktionsenzymer (exemplet visar matsmältningen med EcoRI och XmaI).
- Efter 2 timmars matsmältning vid 37 °C, lös matsmältningsprodukterna genom agarosgelelektrofores (1% gel) och gelrena lämpliga produkter. Ställ in ligeringar enligt tillverkarens protokoll (Materialtabell), omvandla ligeringsprodukterna till en DH10B bakteriestam (Materialtabell) och platta sedan med ampicillin (100 μg / ml) val.
- Nästa dag, välj två till fyra kolonier för att inokulera 3 ml kulturer som innehåller Luria Broth (LB) och 100 μg / ml ampicillin. Låt kulturerna växa över natten vid 37 °C i en orbitalinkubator med skakning (225 rpm).
- Följande dag, använd 1-1,5 ml av bakteriekulturen för att miniprep plasmid-DNA (materialtabell). Spara den återstående kulturen genom att placera dem vid 4 °C. Screena de minipreppade plasmiderna genom Sanger-sekvensering med hjälp av en oligonukleotid som binder ~ 200 bp från den önskade mutationen.
- Använd bakteriekulturerna som sparats vid 4 °C för att återinokulera 50 ml kulturer för att midiprep rätt plasmid (materialtabell). Sekvensera Ube3a-kodningssekvensen fullständigt för att validera den korrekta sekvensen av DNA: t.
- Skapa fungerande lager av plasmider av Ube3a-varianten, liksom den β-cateninaktiverade reportern (BAR)21, TK-Renilla-luciferas, ligasdöd Ube3a (UBE3A C820A-mutation) och pCIG2 tom vektor i en koncentration av 100 ng/μL med sterilH2Oför de efterföljande transfektionsstegen.
2. Beredning och transfektion av 293T-celler (HEK293T) från mänskliga embryonala njurar
- Utför analyserna i HEK293T-celler som odlas i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) förkompletterat med glutamin, 10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika-antimykotiskt medel som beskrivits tidigare17. Odla cellerna i en steril, fuktad inkubator vid 37 °C med 5%CO2.
- Använd ett biosäkerhetsskåp och platta först de upphängda HEK293T-cellerna på vävnadsodlingsbehandlade 96-brunnars plattbottnade plattor med en densitet av 2,2 × 104 celler per brunn i 100 μL odlingsmedier och låt dem växa över natten.
- Den andra dagen transfekterar du cellerna i ett biosäkerhetsskåp med Firefly och Renilla luciferase reporter plasmider (tabell 4) och Ube3a plasmider i tre exemplar. Utför transfektionerna i 10 μL av den totala volymen per brunn med hjälp av ett förhållande på 10:1:8 plasmider (50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla respektive 40 ng Ube3a-plasmid per brunn), som tidigare beskrivits18, respektive 0,4 μL transfektreagens (tabell 4).
OBS: För varje experiment transfekteras också en tom vektor (endast GFP) och en plasmid som kodar för ligasdöd Ube3a för att fungera som negativa kontroller. - Skapa en huvudblandning för transfektionerna för varje variant i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör (tabell 4) och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 15 minuter. Efter inkubationen, rör försiktigt transfektionsblandningen genom att knacka på röret och tillsätt sedan 10 μL av transfektionsblandningen direkt till det befintliga tillväxtmediet i brunnarna.
- Därefter återför cellerna till inkubatorn och låt plasmiderna uttrycka i 48 timmar. Byte av tillväxtmedia är inte nödvändigt.
- Övervaka transfektionseffektiviteten med GFP-fluorescens med hjälp av ett fluorescensmikroskop. HEK293T-celler transfekteras effektivt med denna metod, och >80% av cellerna bör uttrycka GFP efter 48 timmar.
3. Mätning av luciferasaktivitet
OBS: Luciferasaktivitet bedöms med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system som analyserar både Firefly och Renilla luciferase (Materialförteckning) enligt tillverkarens protokoll.
- Aspirera försiktigt odlingsmediet från transfekterade HEK293T-celler och tvätta sedan cellerna med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Aspirera PBS och lysera cellerna genom att tillsätta 25 μL icke-denaturerande lysbuffert och inkubera i 15 minuter med försiktig gungning på is.
- Tillsätt därefter 20 μL av det resulterande lysatet (ingen centrifugering är nödvändig) i en ny 96-brunns analysplatta innehållande 100 μL av ett Firefly-luciferassubstratreagens. Blanda plattan försiktigt genom att knacka.
- Lasta plattan på en plattläsare och mät luminescensen med hjälp av en toppdetektor med en läshöjd på 1 mm och en integrationstid på 1 s.
OBS: Detektorns förstärkning kan behöva justeras baserat på signalens styrka. - Omedelbart efter att ha läst Firefly luciferas-luminescensen, tillsätt 100 μL Renilla luciferassubstrat till brunnarna. Detta steg släcker samtidigt Firefly-luciferasaktiviteten medan du bedömer Renilla-luciferasaktiviteten. Blanda proverna genom försiktig omrörning av plattan och mät luminescensen igen för att bedöma Renilla luciferasaktiviteten.
OBS: Medan andra plattor kan användas för denna analys, kommer användning av plattor med svarta ramar och vita brunnar att ge de mest känsliga resultaten eftersom detta förstärker luciferassignalen samtidigt som bruset minimeras. - Kvantifiera reportersvaren som Firefly luciferase till Renilla luciferas-förhållandet (Firefly / Renilla) och medelvärdet av värdena för de tredubbla mätningarna. Därefter normalisera Firefly / Renilla-värdet för varje variant mot värdena för vildtyp (WT) Ube3a-uttryckande celler för att jämföra den relativa aktiviteten hos variantproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Storskalig funktionell screening av Ube3a-missense-varianter identifierar ett brett landskap av förlust- och gain-of-function-mutationer
Tidigare arbete med Ube3a-mutanter föreslog att Wnt-svaret kan fungera som en reporter av cellulär UBE3A-proteinaktivitet. Dessa observationer utökades och ytterligare valideringsexperiment utfördes för att undersöka om BAR-analysen är lämplig för att rapportera en rad UBE3A-aktiviteter i cellen. Först transfekterades HEK293T-celler med varierande mängder plasmid-DNA som kodar för humant WT Ube3a. Detta experiment visade att BAR-svaret förändras linjärt med mängden Ube3a som transfekteras till celler (figur 2A). För det andra testades BAR-analysen med hjälp av plasmid-DNA som kodar för sjukdomsbundna varianter som tidigare karakteriserats i litteraturen22. Bland dessa fanns godartade varianter (R39H och A178T), en autismlänkad gain-of-function-variant (T458A) och en samling bekräftade Angelmans syndrom-kopplade varianter som orsakar förlust av UBE3A-funktion genom olika mekanismer15,22. BAR-analysen identifierade korrekt varje variant (figur 2B), inklusive alla funktionsförlustvarianter, vilket visar noggrannheten och generaliteten hos denna metod18.
BAR-analysen användes för att screena 152 missense-varianter, varav de flesta identifierades från ClinVar-databasen. I likhet med genetiska bevis för variationer i kopienummer i Ube3a-beroende störningar var den funktionella effekten av missense-varianter bred och inkluderade godartade varianter samt både funktionsförlust och funktionsförstärkningsvarianter (figur 3)18. Av särskilt intresse var de gain-of-function-varianter som identifierades med denna metod alla nya, och efterföljande validering föreslog starkt att de definierar en underklass av Ube3a-beroende störningar med fenotyper som skiljer sig från klassiskt Angelmans syndrom18.
Effekten av missense-varianter är ofta oförutsägbar, vilket understryker behovet av funktionsbedömning
En spännande observation från funktionell screening av Ube3a-varianter är att förändringar vid vissa aminosyrapositioner ger drastiskt olika effekter, vilket understryker vikten av empirisk variantbedömning18. Till exempel identifierades tre individer med varianter vid glutamin 588 (Q588) -positionen i UBE3A som inkluderade en förstärkning av funktion glutamatsubstitution (Q588E), en förlust av funktion argininsubstitution (Q588R) och en annan förlust av funktion prolinsubstitution (Q588P; Figur 4A). En omfattande mutationsmetod användes för att mutera Q588-positionen till alla möjliga aminosyror. När aktiviteten hos dessa varianter mättes med hjälp av BAR-analysen visade den att någon negativt laddad aminosyra vid 588-positionen producerar ett hyperaktivt enzym (figur 4B). Denna insikt gav viktiga funktionella ledtrådar som möjliggjorde upptäckten av en ny plats inom HECT-domänen för UBE3A som underlättar ubiquitinkedjeförlängning18.
Figur 1: PCR-beroende mutagenes av Ube3a. (A) Representation av Ube3a-uttrycksvektorn som indikerar relevanta restriktionsställen. (B) DNA-sekvensen som kodar för UBE3A visas högst upp. Q588-kodonet indikeras med fetstil. Q588E-mutagenesprimern (Mut. primer) visas i linje med UBE3A-sekvensen. De röda bokstäverna indikerar den mutagena platsen. (C) Ett schema över PCR för att generera megaprimern och DNA-fragmentet som används för att subklona Q588E-fragmentet visas. Positionen för Q588E-mutationen indikeras av den röda asterisken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Validering av BAR-analysen som rapportör av UBE3A-ubiquitinligasaktiviteten. (A) HEK293T-celler transfekterade med ökande mängder plasmid som kodar för WT UBE3A visar en linjär ökning av BAR-svaret. Medelvärden visas för Firefly/Renilla luciferasförhållanden ± standardfel (SE). N= 3 självständiga experiment. (B) Tidigare karakteriserade Ube3a-varianter testades i BAR-analysen. Svaren normaliserades till WT UBE3A, och värdena visas som medelvärdet ± SE. Antalet experiment (n) och p-värden beräknade med hjälp av ett t-test med ett prov (tvåsidigt) med Benjamini-Hochberg flera jämförelser korrigering (FDR = 0,05) är följande: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1,519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7,787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Data omtryckta med tillstånd från Weston et al.18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: UBE3A-varianter som omfattar ett brett spektrum av funktionella effekter. BAR-analysskärm av 152 Ube3a-varianter som visar godartade (grå), funktionsförlust (blå) och funktionsförstärkning (röda) mutationer i förhållande till WT UBE3A . Signifikansen bestämdes med hjälp av ett t-test med ett prov (tvåsidigt) med Benjamini-Hochberg multipel jämförelsekorrigering (FDR = 0,05). Röd, förstärkning av funktion; Grå, ingen förändring från WT UBE3A; Blå, förlust av funktion. Data omtryckta med tillstånd från Weston et al.18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: UBE3A-varianter som omfattar ett brett spektrum av funktionella effekter. (A) BAR-analysresultat av varianter vid position 588 i UBE3A som visar både förlust- och förstärkningseffektsubstitutioner. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, Ett prov t-test (tvåsidigt) med Benjamini-Hochberg multipel jämförelsekorrigering (FDR = 0,05). (B) Värmediagram som visar normaliserade BAR-resultat för omfattande mutationsanalys vid position 588 i UBE3A. Den vita skuggningen representerar WT UBE3A-aktivitetsnivåer, den blå skuggningen indikerar funktionsförlust och den röda skuggningen indikerar funktionsförstärkning. Skalstrecket visar den procentuella förändringen i förhållande till WT UBE3A. N = 3 oberoende experiment för Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 för Q588E, n = 6 för Q588D, n = 5 för Q588R, n = 4 för Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Ett prov t-test (tvåsidigt) med Benjamini-Hochberg flera jämförelser korrigering (FDR = 0,05). Data omtryckta med tillstånd från Weston et al.18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sekvens | Används för | |
| Grundfärg 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a EcoRI-känsla | |
| Mut. Primer | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E mutagenes antisens | |
| Grundfärg 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisens | |
Tabell 1: Primers som används för UBE3A Q588E mutagenes.
| 1: a omgången PCR | |
| Reagens | Reaktion mängd |
| 5x hifi-buffert | 10 μl |
| dNTP (10 mM lager) | 1 μL |
| Primer 1 (10 mM lager) | 1 μL |
| Primer 2 (10 mM lager) | 1 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL lager) | 1 μL |
| H2O | 35 μl |
| DNA-polymeras med hög trohet | 1 μL |
| Total volym | 50 μl |
| 2: a omgången PCR | |
| Reagens | Reaktion mängd |
| 5x hifi-buffert | 10 μl |
| dNTP (10 mM lager) | 1 μL |
| Primer 3 (10 mM lager) | 1 μL |
| Renad PCR-produkt (Megaprimer) | 30 μl |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL lager) | 1 μL |
| H2O | 6 μl |
| DNA-polymeras med hög trohet | 1 μL |
| Total volym | 50 μl |
Tabell 2: PCR-parametrar för mutagenes.
| 1: a omgången PCR | ||
| Steg | Temperatur | Tid |
| Inledande denaturering | 95 °C | 2 minuter |
| (1 cykel) | ||
| Denaturering | 95 °C | 30 sekunder |
| Glödgning | 50 °C | 20 sekunder |
| Förlängning | 72 °C | 15 sekunder |
| (30 cykler) | ||
| Slutlig förlängning | 72 °C | 1 minuter |
| Hålla | 4 °C | Oändlig |
| 2: a omgången PCR | ||
| Steg | Temperatur | Tid |
| Inledande denaturering | 95 °C | 2 minuter |
| (1 cykel) | ||
| Denaturering | 95 °C | 30 sekunder |
| Glödgning | 50 °C | 20 sekunder |
| Förlängning | 72 °C | 35 s |
| (30 cykler) | ||
| Slutlig förlängning | 72 °C | 1 minuter |
| Hålla | 4 °C | Oändlig |
Tabell 3: PCR-programparametrar för mutagenes.
| Reagens | Arbetskoncentration | 1x transfektion | 3,5x huvudmix |
| pGL3 BAR plasmid | 100 ng/μl | 0,5 μL | 1,75 μL |
| pTK Renilla plasmid | 100 ng/μl | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Ube3a plasmid | 100 ng/μl | 0,4 μL | 1,4 μL |
| DMEM kompletterat med glutamin | 8,65 μL | 30,275 μL | |
| Transfektion reagens | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tabell 4: Transfektblandningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en effektiv och skalbar metod för att bedöma den enzymatiska aktiviteten hos Ube3a-varianter. Det finns flera tekniska detaljer som motiverar noggrant övervägande när du använder denna analys. Ett övervägande är valet av Wnt-reporterplasmider som används i denna analys. Protokollet som beskrivs här använder specifikt β-catenin-aktiverad reporter (BAR)21, en reporter som innehåller en sammanfogare av 12 T-cellfaktorsvarselement (TCF) separerade av specifikt utformade länksekvenser för att minimera rekombination och förlust av TCF-bindande platser. Det finns ytterligare luciferasbaserade Wnt-reporterplasmider som beskrivs i litteraturen23, och även om tidigare studier indikerar att vissa kan användas för att bedöma UBE3A-aktivitet, har BAR-plasmiden karakteriserats mest noggrant för detta ändamål17,18. För det andra är valet av Renilla luciferasplasmid kritiskt. En plasmid som kodar för Renilla luciferas ingår under transfektionssteget för att normalisera transfektionseffektiviteten. Plasmiden som används i detta protokoll uttrycker konstitutivt Renilla luciferas under kontroll av en tymidinkinas (TK) promotor (TK-Renilla). Användningen av plasmider som innehåller andra promotorer, såsom den allmänt använda cytomegalovirus (CMV) promotorn, kan leda till varierande resultat i Renilla luciferasuttryck.
Ett andra övervägande är cellernas beteende beroende på typ och mycket FBS som används för cellodling. Till exempel kan FBS variera tillväxthastigheten för HEK293T-celler. Det nuvarande protokollet optimerades med celler som uppvisade en typisk fördubblingstid på 18-24 timmar, vilket gjorde celldensiteten vid tidpunkten för transfektion ungefär ~ 4 × 104 celler per brunn. Eftersom celltätheten kan påverka transfektionseffektiviteten bör celltillväxthastigheterna bedömas noggrant av användaren och cellnumren justeras i enlighet därmed vid pläteringstillfället. Dessutom kräver det UBE3A-beroende BAR-svaret att en viss mängd Wnt-ligand finns under experimentet. Under de flesta standardförhållanden finns det tillräckligt med Wnt i FBS för att driva detta svar; Detta svar kan dock också variera. Titrering av plasmidförhållanden som används för transfektion rekommenderas för att säkerställa att BAR-responsen mäts inom lämpligt linjärt intervall. Ett alternativt tillvägagångssätt är att stimulera Wnt-signalering med hjälp av en rekombinant Wnt-ligand eller Wnt-kompletterade tillväxtmedier17.
En fördel med BAR-analysen är att den kan rapportera ubiquitinligasaktiviteten för alla Ube3a-isoformer . Människor uttrycker tre isoformer av Ube3a som skiljer sig åt vid deras extrema N-termini på grund av användningen av alternativa transkriptionella startplatser24. BAR-analysen ger samma avläsningsagnostiker till isoformer, och därmed kan denna analys användas för att bedöma alla Ube3a-varianter . Dessutom ger den storskaliga karakteriseringen av Ube3a-varianter djupa strukturfunktionsdata som kan avslöja nya domäner och mekanismer som är kritiska för enzymfunktionen. En tidigare studie använde variantdata för att upptäcka en ubiquitinbindande domän inom UBE3A som underlättar ubiquitinkedjeförlängning18. Ytterligare struktur-funktionsstudier kommer sannolikt att ge nya insikter om de biokemiska mekanismerna för UBE3A som kan utnyttjas för terapeutisk utveckling.
Det finns vissa begränsningar för BAR-analysen som motiverar noggrant övervägande vid bestämning av patogeniciteten hos en variant. På grund av den epigenetiska präglingen av Ube3a i neuroner kan denna analys inte diskriminera moder- och faderliga alleler, och ytterligare genetiska bevis måste vägas tillsammans med funktionella data för att bestämma patogeniciteten hos en variant. Dessutom måste ytterligare variabler utöver ubiquitinligasaktiviteten hos UBE3A beaktas i samband med sjukdom. Till exempel visade tidigare arbete att kärnlokaliserad UBE3A bidrar till Angelmans syndrompatologi25 och att vissa varianter stör detta lokaliseringsmönster av enzymet26. Således måste ytterligare nedströms karakteriseringar utföras för att få en fullständig förståelse för bidraget från Ube3a-varianter till neurodevelopmental patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; JJY), ett NARSAD Young Investigator Award från Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), ett forskningsstipendium från Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) och forskningsbidrag från Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), Whitehall Foundation (J.J.Y.) och NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
