Summary
이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 <250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.
Abstract
정렬된 콜라겐 I(COL1) 섬유는 종양 세포 운동성을 안내하고, 내피 세포 형태에 영향을 미치고, 줄기 세포 분화를 제어하며, 심장 및 근골격계 조직의 특징입니다. 시험관 내에서 정렬된 미세 환경에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 자기, 기계, 세포 기반 및 미세유체 방법을 포함하여 정의된 섬유 정렬을 가진 COL1 매트릭스를 생성하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었습니다. 이 중 미세유체 접근법은 유체 흐름 및 세포 미세 환경에 대한 정확한 제어와 같은 고급 기능을 제공합니다. 그러나 고급 체외 배양 플랫폼을 위해 정렬된 COL1 매트릭스를 생성하기 위한 미세유체 접근 방식은 500μm 미만의 거리에 걸쳐 확장되고 3D 세포 배양 응용 분야에 도움이 되지 않는 COL1 섬유의 얇은 "매트"(두께 <40μm)로 제한되었습니다. 여기에서 우리는 미세유체 장치에서 정의된 섬유 정렬의 밀리미터 규모 영역을 가진 3D COL1 매트릭스(두께 130-250μm)를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 세포 배양을 위한 미세 엔지니어링 매트릭스에 직접 액세스할 수 있도록 하여 구조화된 조직 미세 환경을 모델링하는 고급 세포 배양 기능을 제공합니다.
Introduction
세포는 세포외 기질(ECM)이라고 하는 복잡한 3D 섬유 네트워크에 존재하며, 그 대부분은 구조 단백질 콜라겐 유형 I(COL1)1,2로 구성됩니다. ECM의 생물물리학적 특성은 세포에 안내 신호를 제공하고, 이에 대한 반응으로 세포는 ECM 마이크로아키텍처 3,4,5를 리모델링합니다. 이러한 상호 세포-매트릭스 상호작용은 종양 환경(7,8,9)에서 혈관신생 및 세포 침윤을 촉진하고 세포 형태(10,11,12), 분극(13) 및 분화(14)에 영향을 미치는 정렬된 COL1섬유 도메인(6)을 발생시킬 수 있다. 정렬된 콜라겐 섬유는 또한 상처 치유를 촉진하고15, 조직 발달에 핵심적인 역할을 하며16, 장거리 세포 통신에 기여한다(17,18). 따라서 시험관 내에서 네이티브 COL1 섬유 마이크로아키텍처를 복제하는 것은 정렬된 미세 환경에 대한 세포 반응을 연구하기 위한 구조화된 모델을 개발하기 위한 중요한 단계입니다.
미세유체 세포 배양 시스템은 미세생리학적 시스템(MPS)19,20,21,22,23을 개발하기 위한 선호 기술로 확립되었습니다. 유리한 마이크로 스케일링 효과를 활용하여이 시스템은 유체 흐름을 정밀하게 제어하고 기계적 힘의 제어 된 도입을 지원하며 마이크로 채널내에서 생화학 적 미세 환경을 정의합니다 21,24,25,26,27. MPS 플랫폼은 조직 특이적 미세 환경을 모델링하고 다기관 상호작용을 연구하는 데 사용되어 왔다28. 동시에, 하이드로겔은 생체 내에서 관찰되는 ECM의 3D 역학 및 생물학적 영향을 요약하기 위해 널리 연구되었습니다 29,30. 3D 배양을 미세유체 플랫폼과 통합하는 데 점점 더 중점을 두면서 다양한 접근 방식이 미세유체 장치에서 COL1 하이드로겔을 결합할 수 있습니다31,32,33. 그러나, 미세유체 채널에서 COL1 하이드로겔을 정렬하는 방법은 채널<1 mm 너비의 얇은 2D "매트"(두께 <40 μm)로 제한되어, 정렬된 3D 미세 환경31,34,35,36에서 세포 반응을 모델링할 수 있는 제한된 잠재력을 제공한다.
미세유체 시스템에서 정렬된 3D COL1 하이드로겔을 달성하기 위해, 자가 조립 COL1 용액이 국소 신장 흐름(흐름 방향에 따른 속도 변화)에 노출될 때, 생성된 COL1 하이드로겔은 그들이 경험하는 신장 변형률의 크기에 정비례하는 섬유 정렬 정도를 나타내는 것으로 나타났다37, 38. 이 프로토콜의 마이크로채널 설계는 두 가지 면에서 독특합니다. 첫째, 분할된 설계는 COL1 솔루션에 국부적인 확장 변형을 도입하고, 둘째, "투피스" 구조를 통해 사용자는 COL1 섬유를 정렬한 다음 채널을 분해하여 정렬된 섬유에 개방형 형식으로 직접 액세스할 수 있습니다. 이 접근법은 정렬된 COL1 매트릭스를 갖는 미세생리학적 시스템을 개발하는 모듈식 미세유체 플랫폼을 개발하기 위해 추가로 채택될 수 있습니다. 다음 프로토콜은 분할된 마이크로채널을 제조하는 과정을 설명하고 소 아텔로 COL1을 정렬하기 위한 채널 사용에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 개방형 웰 형식으로 COL1에서 세포를 배양하기 위한 지침을 제공하고 모듈식 자기 기본 계층을 사용하여 플랫폼에 기능을 추가하는 방법에 대해 설명합니다.
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Protocol
1. 2피스 채널 및 모듈식 플랫폼 베이스 제작
참고: 미세유체 채널은 정의된 두께의 폴리디메틸 실록산(PDMS) 시트에서 면도날로 절단된 미세유체 채널 "컷아웃"과 컷아웃에 가역적으로 결합되어 채널을 형성하는 채널 덮개의 두 부분을 사용하여 구성됩니다. 채널은 미디어 저장소 역할을 하는 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 프레임으로 둘러싸여 있습니다(그림 1). PMMA 프레임은 추가 기능을 위해 특수 모듈을 자석으로 래치하는 데에도 사용할 수 있습니다.
- PDMS 시트의 면도기 절단 채널:
참고: 이 단계를 위한 미세유체 채널 설계는 보충 그림 1에 나와 있습니다. 채널은 각각 길이 5mm, 폭 10mm, 5mm, 2.5mm, 1.25mm 및 0.75mm의 5개 세그먼트로 구성됩니다. 일정한 유속(50-400 μL·min-1)으로 주입된 콜라겐 용액의 속도는 채널 폭이 감소하여 확장 흐름을 생성함에 따라 채널을 따라 국부적으로 증가합니다.- 250μm 두께의 PDMS 시트를 플라스틱 캐리어 시트에 장착하고 크래프트 커터를 사용하여 0.5mm의 블레이드 깊이, 1cm·s-1 속도 및 높은 힘으로 미세유체 설계를 면도날로 절단합니다.
- 초음파 수조를 사용하여 미세유체 채널 컷아웃을 5분 동안 청소합니다. 초음파 처리 된 채널을 탈 이온화 된 (DI) 물로 헹구고 100 °C에서 5 분 동안 깨끗한 핫 플레이트에서 건조시킵니다.
- 사용할 때까지 깨끗하고 덮인 페트리 접시에 채널을 보관하십시오.
- PDMS 커버 및 표면 패시베이션 제작:
알림: 섹션 1.1의 채널 컷아웃에는 COL1 용액을 주입할 수 있는 밀폐된 채널을 생성하기 위해 그 위에 놓을 수 있는 덮개가 필요합니다(보충 그림 1). 덮개는 COL1이 자체 조립된 후에 제거할 수 있습니다. 채널 내의 COL1이 표지에 결합할 가능성을 최소화하기 위해, 표지는 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 부동태화된다. PDMS 커버를 위한 금형 설계가 제공됩니다. 금형의 두께는 최소 2mm 이상이어야 하며 미세유체 채널 컷아웃의 설치 공간과 동일한 설치 공간이 있어야 합니다. 이 프로토콜에서 금형 풋프린트는 35mm x 15mm였습니다.- 금형을 준비하려면 2.5mm 두께의 PMMA 시트에 점착제(PSA) 시트를 부착하고 원하는 금형 모양을 레이저로 절단합니다.
- 보푸라기가 없는 젖은 물티슈로 레이저 절단 PMMA 몰드를 청소하고 PSA 필름에서 뒷면을 제거합니다. 직경 100mm의 실리콘 웨이퍼에 금형을 부착하고 단단히 누릅니다.
- PDMS를 10:1의 비율(베이스:가교제)로 준비합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 1분 동안 격렬하게 혼합하고 진공 챔버에서 혼합물을 탈기하여 기포를 제거합니다.
- 탈기된 PDMS 용액을 PMMA/실리콘 몰드에 붓고 100°C의 핫플레이트에서 20분 동안 경화합니다. 금형을 식히고 경화된 PDMS를 제거한 다음 면도날로 초과분을 다듬습니다.
참고: 다음 모든 단계에서 PDMS 덮개의 실리콘 웨이퍼 면(평평한 면)이 위를 향하도록 하십시오. - 직경 1mm의 생검 펀치를 사용하여 미세유체 채널의 끝단에 해당하는 입구 및 출구 구멍을 만듭니다. 1.1단계의 채널 컷아웃은 구멍의 위치를 안내하는 템플릿으로 사용될 수 있습니다.
- 이소프로판올(IPA)로 덮개를 5분 동안 초음파 처리하고 DI 물로 헹구고 압축 공기 공급원으로 건조시킨 다음 깨끗하고 덮인 페트리 접시에 보관합니다. 페트리 접시를 UV 멸균 챔버(덮개가 없음)에 1분 동안 넣어 멸균합니다.
- 덮개를 씌우고 생물 안전 캐비닛(BSC)으로 옮깁니다.
- 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 담긴 40mg•mL-1 소혈청알부민(BSA) 300μL를 PDMS 커버에 피펫으로 피펫팅하고 피펫 팁을 사용하여 용액을 고르게 펴 바릅니다. 사용하기 전에 최소 4시간 동안 4°C의 냉장고에 두십시오.
- 냉장고의 덮개를 BSC로 옮기고 PBS 5개로 1번 세척한 후 공기 중에서 10분 동안 건조시킵니다.
참고: PDMS 커버는 BSA 코팅 후 최대 1주일 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.
- 커버슬립의 글루타르알데히드 처리
알림: 글루타르알데히드로 커버슬립을 기능화하면 COL1이 커버슬립에 공유 결합되어 하이드로겔이 분리되는 것을 방지할 수 있습니다.- 49mL의 아세톤에 1mL의 APTES를 첨가하여 유리 비커에 2%(v/v) 아미노프로필 트리에톡시실란(APTES) 용액을 준비합니다.
- 25% 글루타르알데히드 용액을 DI 물에 5%로 희석합니다. 2mm x 24mm 커버슬립당 50mL의 용액을 만듭니다. 24mm x 24mm 또는 22mm x 22mm 커버슬립의 경우 각각에 대해 1mL의 용액을 만듭니다.
- IPA를 사용하여 5 분 동안 목욕 초음파 처리기에서 커버 슬립을 청소하십시오. DI 물을 사용하여 커버슬립에서 IPA를 헹굽니다. IPA는 커버슬립에 부드러운 물막이 보이면 완전히 헹굽니다.
- 100°C에서 5분 동안 열판에서 커버슬립을 건조시킵니다. 건조된 커버슬립을 깨끗한 페트리 접시에 넣고 겹치지 않도록 합니다.
- 코로나 방전 봉을 사용하여 커버슬립을 각각 1분 동안 코로나 방전에 노출시킵니다.
알림: 이 단계는 환기가 잘 되는 곳이나 화학 후드에서 수행해야 합니다. - 페트리 접시에서 커버슬립을 제거한 다음 코로나 노출 후 10분 이내에 5초 동안 APTES 용액에 담그고 커버슬립이 잠기도록 합니다.
알림: 어느 쪽이 플라즈마로 처리되었는지 추적하고 위쪽을 향하도록 하십시오. - 그런 다음 커버슬립을 아세톤에 10초 동안 담그고 압축 공기로 건조시킵니다. 마른 커버슬립을 처리된 면이 위를 향하도록 하여 페트리 접시에 다시 넣습니다.
알림: 모든 커버슬립에 대해 1.3.5-1.3.7단계를 반복합니다. - 글루타르알데히드 용액 1mL를 각 커버슬립의 표면에 피펫으로 끼웁니다. 용액이 커버슬립의 가장자리 위로 쏟아지지 않도록 가능한 한 많은 표면을 덮으십시오. 필요한 경우 더 많은 글루타르알데히드 용액을 추가할 수 있습니다. 피펫 팁으로 표면이 긁히지 않도록 하십시오.
- 커버슬립을 용액에 30분 동안 그대로 둔 다음 DI 물로 20초 동안 헹굽니다. 압축 공기를 사용하여 커버슬립을 건조시키고 플라즈마 처리된 면이 위로 향하도록 하여 페트리 접시에 다시 넣습니다.
알림: 커버슬립은 실온(RT)에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
- 모듈식 마그네틱 베이스를 레이저 절단
알림: 모듈식 마그네틱 베이스의 설계는 보충 그림 1에 나와 있습니다. 모듈러 베이스는 매체를 잘 고정하는 역할을 하며, 이전에 발표된 작품 22,37,38,39에 설명된 바와 같이 특수 모듈을 자기적으로 부착하는 데에도 사용할 수 있습니다.- 통과 횟수 및 출력과 같은 적절한 레이저 설정을 사용하여 PMMA 레이어에서 설계를 잘라냅니다.
알림: 자석이 PMMA 레이어에 압입될 수 있도록 레이저 설정을 조정해야 합니다. 각 레이저는 다르며 절단 매개변수는 실험적으로 최적화되어야 합니다. 45W 레이저의 경우 2mm에서 2mm 두께의 PMMA를 절단하려면 100% 속도, 100% 출력 및 3패스를 권장합니다. - 레이저 절단 과정에서 이물질을 제거하기 위해 비누와 물을 사용하여 레이저 절단 부품을 세척합니다.
알림: 레이저 절단 부품을 청소할 때 솔벤트를 사용하지 마십시오. 용매는 레이저 절단 가장자리에 미세 균열을 전파할 수 있습니다.
- 통과 횟수 및 출력과 같은 적절한 레이저 설정을 사용하여 PMMA 레이어에서 설계를 잘라냅니다.
- 플랫폼 조립
- 자석(직경 3/16, 두께 1/16)을 손으로 레이저 절단 베이스에 밀어 넣습니다. 부드러운 망치나 드라이버 끝을 사용하여 자석을 밀어 넣을 수 있습니다. 자석의 두께는 자석이 베이스 표면과 같은 높이가 되도록 PMMA 베이스의 두께보다 작아야 합니다.
알림: 자석을 사용하면 사용자가 추가 모듈을 부착하여 플랫폼에 기능을 추가할 수 있습니다. - PSA 시트에서 뒷면을 떼어내고 기능성 면이 위를 향하도록 하여 베이스를 글루타르알데히드 처리된 커버슬립에 부착합니다.
- PDMS 채널 컷아웃을 프레임에 의해 정의된 캐비티에 부드럽게 배치합니다. 끝이 넓은 핀셋으로 눌러 기포를 제거하고 등각 접촉을 보장합니다.
- BSA 처리된 채널 커버를 BSA 면이 아래를 향하도록 하여 채널 컷아웃 위에 놓습니다. 유체 입구 및 출구 포트가 채널과 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- 장치가 COL1 주입 준비가 되었습니다.
- 자석(직경 3/16, 두께 1/16)을 손으로 레이저 절단 베이스에 밀어 넣습니다. 부드러운 망치나 드라이버 끝을 사용하여 자석을 밀어 넣을 수 있습니다. 자석의 두께는 자석이 베이스 표면과 같은 높이가 되도록 PMMA 베이스의 두께보다 작아야 합니다.
2. COL1 용액을 마이크로채널에 주입하고 세포 배양 응용 분야를 위한 덮개를 제거합니다.
- COL1 용액 준비
- 필요한 모든 시약(COL1 원액[6mg·mL-1], 초순수, 10x PBS, 0.1M NaOH)을 생물 안전 캐비닛의 얼음 위에 놓습니다.
- 다음과 같이 시약의 부피를 계산하십시오
참고: 따라서 1mg·mL-2.5 스톡에서 1mL의 6mL 중화 콜라겐을 만들려면 콜라겐 416.67μL, 탈이온수 429.16μL, 100x PBS 100μL, 0.1M NaOH 54.16μL를 추가하여 최종 pH가 7이 됩니다. 0.1M NaOH 20μL를 추가하여 pH 9.0을 달성합니다. - 시약을 다음 순서로 빈 5mL 바이알에 추가합니다: i) COL1 스톡, ii) DI 물, iii) 10x PBS, iv) 0.1M NaOH.
알림: 변위 피펫을 사용하여 COL1 용액을 처리하십시오. 상당한 샘플 손실이 발생할 수 있습니다.amp일반 피펫을 사용하는 경우 최종 용액 농도의 변동으로 이어질 수 있습니다. - 용액의 pH를 원하는 pH(일반적으로 7-9 사이)로 올립니다.
- COL1 용액 주입
- 주사기 펌프, 냉장 멸균 주사기, 냉장 중화 COL1 용액 및 멸균 20G 90° 앵글 팁 루어 잠금 바늘을 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. COL1 용액을 주사기에 넣고 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.
- 90° 20G 바늘 끝을 주사기에 부착하고 주사기를 주사기 펌프에 넣고 바늘이 아래를 향하도록 한 다음 COL1 용액으로 바늘을 프라이밍합니다.
- 주사기 펌프를 50-2,000 μL/min 사이의 필요한 유속으로 설정합니다.
- 준비된 PDMS 채널(섹션 1)을 실험실 잭에 놓고 바늘과 수평을 맞춥니다.
- PDMS 채널의 입구 포트(넓은 쪽)에 바늘을 삽입합니다. ~30μL의 COL1 방울이 출구 쪽에 모일 때까지 채널을 주입합니다.
- 실험실 잭을 내리고 새로 채워진 채널에서 바늘을 부드럽게 분리합니다.
- 모든 채널이 COL1 용액으로 채워질 때까지 2.2.5-2.2.9단계를 반복합니다.
- 새로 형성된 COL1 젤의 탈수를 방지하기 위해 DI 물로 포화된 깨끗하고 보푸라기가 없는 물티슈와 함께 채워진 채널을 페트리 접시에 넣습니다.
- 페트리 접시를 덮고 필오프 단계 전에 로드된 채널을 인큐베이터(37°C, 95% 습도)에 2시간 동안 두십시오.
- 박리 및 매체 평형
- 핀셋을 사용하여 PDMS 커버를 들어 올려 중합된 COL1 겔을 노출시킵니다. BSA 처리는 COL1이 커버에 부착되는 것을 방지합니다.
- 650 μL의 EGM을 웰에 추가합니다.
- 장치를 인큐베이터(37°C, 95% 습도)에 최소 4시간 동안 두어 젤과 배지의 평형을 유지합니다. 셀로 파종하기 전에 미디어를 교체하십시오
- 시드 셀
- 따뜻한 0.25% 트립신 및 배양 배지를 필요한 수의 5mL 및 10mL 피펫과 함께 생물안전 캐비닛에 넣습니다.
- 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVECs)를 37°C, 95% 습도에서 내피 성장 배지(EGM)에서 80% 컨플루언시로 배양합니다. HUVECs가 포함된 조직 배양 플라스크를 현미경으로 컨플루언스를 확인한 후 BSC에 넣는다.
- T25 플라스크에서 배지를 버리고 세포를 1x PBS로 2배 세척합니다. 플라스크에 트립신 1mL를 넣고 인큐베이터(37°C, 습도 95%)에 3분 동안 넣습니다.
- 3 분 후에 현미경으로 플라스크를 확인하여 세포가 표면에서 완전히 분리되었는지 확인하십시오.
- 플라스크에 EGM(혈청 포함) 3mL를 넣어 트립신을 중화합니다. 다음으로, 5 mL 피펫을 사용하여 세포 용액을 15 mL 코니컬 튜브에 옮긴다. 세포가 들어 있는 원뿔형 튜브를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 원뿔형 튜브를 생물 안전 캐비닛에 넣고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버립니다. 세포를 1mL의 신선한 배양 배지에 재현탁합니다.
- 15 μL의 트립판 블루와 15 μL의 재현탁 세포 용액을 1 mL 코니컬 튜브에 넣고 혼합합니다.
- 세포 계수 슬라이드의 양쪽에 트리판 블루와 세포 용액을 주입하고 슬라이드를 세포 계수 장치에 삽입합니다.
- 내피 성장 배지에서 세포 용액을 세포 계수 장치로부터 얻은 세포 농도를 기준으로 필요한 농도로 희석한다.
참고: 80% 밀도에서 HUVEC의 T25 플라스크는 750,000mL의 배지에 희석하면 ~1개의 세포·ml-1 을 생성합니다. 파종할 세포 현탁액의 부피는 배양 표면의 면적 × 세포 밀도/세포 현탁액의 농도로 계산됩니다. 예: 35mm x 15mm 웰에 20,000개의 세포·cm-2 를 시드하려면 ~140μL의 세포 현탁액이 필요합니다. - 엔지니어링된 COL1 매트릭스에서 매체를 흡입합니다.
- 필요한 부피의 세포 용액을 COL1 기질에 추가하고 이미징 전에 세포가 최소 4시간 동안 안정되도록 합니다.
- 세포핵과 세포골격 표지
- 세포에서 배지를 흡인하고 각 세척에서 1x PBS, 500μL로 3배 세척합니다. RT에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포층을 덮습니다.
- 파라포름알데히드를 흡인하고 1x PBS Tween-20으로 5분 동안 세척합니다.
- PBS에서 0.1% Triton-X 용액 500μL를 사용하여 15분 동안 세포막을 투과시킵니다. 1x PBS Tween-20으로 5분 동안 세척합니다.
- RT에서 30분 동안 PBS 중의 4% BSA 중 500 μL로 비특이적 결합 부위를 차단하였다.
- 팔로이딘-액틴 형광 표지 용액을 4% BSA(BSA 400μL에 스톡 1μL)로 희석합니다.
- BSA 용액을 흡인하고 팔로이딘 용액을 세포에 첨가한 후 RT에서 30분 동안 기다립니다.
- 핵 염색을 4% BSA(500μL에서 1μL)로 희석하고, 팔로이딘을 흡인하고, 작동하는 핵 염색 용액을 첨가하고, RT에서 15분 동안 기다립니다.
- 핵 염색 작업 용액을 흡인하고 PBS Tween-20으로 각각 5분 동안 3x로 세척하고 이미징 전에 1x PBS로 교체합니다.
- 40x 렌즈와 함께 FITC 채널(ex 491 nm/em 516 nm) 및 DAPI 채널(ex 360 nm/em 460 nm)을 사용하는 epifluorescent 현미경을 사용한 이미지. 488nm 레이저 라인(15% 출력) 및 40x 침수 대물렌즈를 사용하는 반사율 모드에서 레이저 스캐닝 공초점 렌즈를 사용하여 콜라겐을 이미지화합니다.
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Representative Results
자체 조립 COL1 용액이 단면적이 감소하는 채널을 통해 흐를 때 COL1 용액의 유속 속도(vx)는 두 세그먼트(∂x) 사이의 수축 길이를 따라 크기 ∂v x만큼 국부적으로 증가하여 ε̇ = ∂v x/∂x인 확장 변형률(ε̇)이 발생합니다. 연신 변형률은 그림 2에서 볼 수 있듯이 입자 이미지 유속계(PIV)를 사용하여 측정되는 유체 속도에서 계산할 수 있습니다.
이전에는 국소 신장 변형이 장거리 COL1 섬유 정렬을 촉진하는 것으로 나타났습니다(37,38,40)(그림 3). COl1의 정렬은 수축에서 신장 변형률의 크기에 직접적인 영향을 받으며 세그먼트의 5mm 길이에 걸쳐 균일하게 확장되는 것을 관찰할 수 있습니다. 섬유 정렬을 측정하기 위해 섬유의 공초점 반사 현미경(CRM) 이미지를 사용하여 섬유 정렬의 히스토그램을 생성했습니다. 정렬 계수(CoA)는 히스토그램 38,42,43,44에서 모드 값의 ±15° 이내에 정렬된 섬유의 비율입니다. CoA 범위는 0-1이며 값 >0.5는 정렬된 것으로 간주되었습니다.
기존의 밀폐된 마이크로채널에 3D 하이드로겔을 주입하면 배지와 세포가 매트릭스에 도입될 수 있는 위치가 제한됩니다. 이 프로토콜의 투피스 채널은 사용자가 채널 커버를 들어 올리고 전체 COL1 매트릭스에 직접 액세스할 수 있도록 하여 채널의 하이드로겔에 액세스하는 한계를 극복합니다. 아민-알데히드-아민 상호작용을 사용하여 COL1 부착을 촉진하기 위해 글루타르알데히드로 유리 커버슬립을 기능화하고, 커버에 COL1 흡착을 방지하기 위해 BSA로 PDMS 커버를 기능화함으로써 채널 리프트 오프가 가능합니다. COL1 섬유 정렬은 그림 4에서 시각적으로 볼 수 있듯이 덮개를 들어 올린 후에도 영향을 받지 않습니다.
정렬된 COL1 기질은 돌출부(9,12,45,46)를 지시하고 차례로 응력 필라멘트의 조직을 지시하여 세포 정렬에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 개발된 COL1 매트릭스에 대한 세포 반응을 조사하기 위해 정렬되지 않은 COL1 세그먼트의 내피 세포를 이미지화했습니다. 세포를 고정시키고 파종 후 4시간 후에 염색하였다. 매트릭스의 정렬된 세그먼트에서 배양된 HUVEC의 대표 이미지는 무작위 섬유가 있는 세그먼트의 HUVEC에 비해 액틴 섬유 정렬이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 5).
그림 1: 레이어의 조립을 보여주는 개략도. 이 수치는 Ahmed et al.38의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 계단식 채널 및 연신 변형률 . (A) 치수가 있는 계단식 채널의 개략도. 시작은 신장 변형률의 계산을 보여줍니다. 각 수축의 신장 변형률은 입자 이미지 유속계(PIV)를 사용하여 측정된 속도에서 계산됩니다. (B) 각 수축의 신장 변형률. 이 수치는 Ahmed et al.38의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: COL1 중합 후 각 마이크로채널 세그먼트에서 COL1 섬유의 컨포칼 반사율 이미지. 세그먼트 (a)에서 세그먼트 (e)로의 섬유 정렬 정도의 증가는 시각적으로 관찰 될 수 있습니다. 스케일 바 = 25 μm. 이 수치는 Ahmed et al.38의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: COL1 섬유의 컨포칼 반사율 이미지는 채널 커버를 제거해도 섬유 정렬이 영향을 받지 않음을 보여줍니다. 스케일 바 = 25 μm. 이 수치는 Ahmed et al.38의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포 및 COL1 섬유의 대표 이미지. COL1 매트릭스의 세그먼트 (e) 및 COL1 매트릭스의 세그먼트 (a)에서 세포 및 COL1 섬유의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 치수가 있는 레이저 절단 부품을 보여주는 그림. (A) 채널, (B) 마그네틱 베이스 및 (C) 채널 커버 몰드. 밀리미터 단위의 모든 치수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
정렬된 섬유를 갖는 COL1 매트릭스를 생성하기 위한 프로토콜은 자기 방법, 기계적 변형의 직접적인 적용, 및 미세유체 기술47을 사용하여 설명되었다. 미세유체 접근법은 생화학적 미세 환경을 정밀하게 제어할 수 있는 잘 정의된 흐름 및 수송 특성으로 인해 미세생리학적 시스템을 만드는 데 일반적으로 사용됩니다. 정렬된 COL1 섬유는 상처 치유, 종양 세포 침습 및 조직 발달과 같은 병태생리학적 과정에서 중요한 지시 신호를 제공하기 때문에 미세유체 시스템에서 정렬된 COL1 매트릭스를 생성하는 것은 생물학적으로 관련된 미세생리학적 시스템을 개발하기 위한 단계입니다.
이 프로토콜은 정의된 광섬유 정렬 영역을 사용하여 밀리미터 단위의 정렬된 COL1 매트릭스를 제작할 수 있는 기능을 제공합니다. 정렬을 유도하기 위해, 폭이 단계적으로 감소된 미세유체 채널이 사용된다. 자체 조립 COL1 용액이 일정한 유속으로 채널을 통해 흐르기 때문에 용액 유속은 수축에서 증가하여 자체 조립 COL1 섬유의 국부적 인 신장 변형 및 장거리 정렬을 초래합니다. 전단 흐름으로 인한 섬유 정렬과 비교하여 최대 250μm 두께의 채널에서 섬유 정렬을 관찰하여 미세유체 채널에서 3D 하이드로겔을 생성할 수 있었습니다. COL1 광섬유 정렬은 연신 변형률에 의존하기 때문에 사용자는 제공된 채널을 수정하거나 맞춤형 채널 설계를 개발하여 인장 흐름을 생성하고 원하는 크기와 모양의 COL1 매트릭스를 생성할 수 있습니다. 소프트 리소그래피가 필요 없는 채널 제작을 통해 추가적인 유연성이 제공되어 채널 설계의 신속한 프로토타이핑이 가능합니다.
이 프로토콜에 제시된 2피스 채널 접근 방식은 마이크로채널에서 3D 하이드로겔에 접근할 때의 한계를 극복합니다. 2피스 채널은 COL1 하이드로겔에 대한 직접적인 접근을 제공하며, 여기서 채널 커버를 들어 올려 채널의 COL1 매트릭스를 드러낼 수 있습니다. 중합 후 COL1에 직접 접근하면 세포를 COL1 전구체 용액에 혼합할 필요가 없어 사용자가 비생리학적 pH 및 저온에서 장기간 COL1 전구체 용액을 조작할 수 있습니다. 또한, 모듈식 접근 방식을 사용하여 세포를 배치하고 이전 연구에서 볼 수 있듯이 층별 생체 제조 기능을 제공할 수 있습니다. 모듈은 공동 배양을 위한 멤브레인을 도입하고, 연속 관류를 도입하고, 또한 다층 ECM 구축물(22,38,39)을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 맞춤형 모듈은 실험 요구 사항에 따라 제작할 수도 있습니다. 마그네틱 래칭과 결합된 모듈식 접근 방식은 시간이 지남에 따라 기능을 추가해야 하는 실험에도 적합합니다.
이 프로토콜에서 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 채널 컷아웃, 커버, 커버슬립 및 모듈식 베이스를 포함한 모든 구성 요소는 적절한 접착 및 화학적 기능화를 보장하기 위해 적절하게 청소해야 합니다. 콜라겐은 얼음 위에서 준비해야 하며 일관성을 보장하기 위해 모든 성분을 차갑게 유지해야 합니다. 일단 준비되면 콜라겐 용액은 준비 후 10분 이내에 사용해야 합니다. 콜라겐 용액의 최종 pH는 일관성을 보장하기 위해 pH 프로브를 사용하여 측정해야 합니다. 따뜻한 인큐베이터에서 콜라겐이 마르지 않도록 깨끗하고 촉촉한 물티슈를 콜라겐과 함께 페트리 접시에 넣어야 합니다.
프로토콜의 일부 수정 및 문제 해결에는 다음이 포함됩니다. (i) 세포 배양 중에 배지가 누출되는 경우 PMMA 프레임과 커버슬립이 접착층에 틈 없이 부착되었는지 확인해야 합니다. (ii) 자석이 베이스 레이어와 같은 높이로 설정되지 않으면 커버슬립이 베이스에 달라붙는 것을 방지하여 틈이 생깁니다. (iii) 커버 슬립의 글루 타르 알데히드 코팅은 필요한 경우 농도를 낮출 수도 있습니다 (0.1 %까지). 글루타르알데히드가 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 독성을 방지하기 위한 글루타르알데히드의 최적 농도는 실험에 사용되는 각 세포주에 대해 실험적으로 결정되어야 합니다. (iv) 콜라겐과 함께 히알루론산, 피브로넥틴 또는 형광 비드와 같은 추가 물질을 포함하여 매트릭스를 추가로 맞춤화할 수 있습니다. (v) 필요하다면, 채널 설계는 경계 및 에지 효과를 피하기 위해 더 길거나 더 짧은 세그먼트를 갖도록 수정될 수 있다(48).
이 프로토콜에는 다음과 같은 제한 사항이 있습니다. Atelo 소 교원질은 2.5 mg·mL-1에 연약한 물자 (G' <100 Pa)입니다. 겔 강성을 높이기 위해 연구자들은 더 높은 농도의 콜라겐을 사용하거나 가교제를 도입할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최대 250μm 두께의 콜라겐 매트릭스를 정렬하는 데만 검증되었지만, 채널 두께를 늘리고 유속을 최적화하여 적절한 신장 변형률을 도입함으로써 더 두꺼운 매트릭스를 개발할 수 있습니다.
이 프로토콜은 조직별 정렬된 미세 환경을 개발하려는 연구자들에게 유용할 것으로 예상됩니다. 또한 미세생리학적 시스템을 구축하기 위한 모듈식 유체 플랫폼을 만들기 위한 지침으로 사용할 수도 있습니다.
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Disclosures
모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 (National Institute of Health)이 R21GM143658 상을 수상하고 국립 과학 재단 (National Science Foundation)이 보조금 번호 2150798로 부분적으로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 자금 지원 기관의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI - University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20x12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
References
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