Summary
En este estudio se describe una técnica para establecer un modelo de rata con silicosis con la inhalación de sílice a través de todo el cuerpo en una cámara de inhalación. Las ratas con silicosis podrían imitar de cerca el proceso patológico de la silicosis humana de una manera fácil, rentable y con buena repetibilidad.
Abstract
La principal causa de silicosis es la inhalación de sílice en el entorno laboral. A pesar de algunas diferencias anatómicas y fisiológicas, los modelos de roedores siguen siendo una herramienta esencial para el estudio de la silicosis humana. En el caso de la silicosis, el proceso patológico clásico debe ser inducible mediante la inhalación de partículas de cuarzo recién generadas, lo que significa inducir específicamente enfermedades profesionales humanas. En este estudio se describe una técnica para establecer e imitar eficazmente el proceso de evolución dinámica patológica de la silicosis. Además, la técnica tuvo una buena repetibilidad sin necesidad de cirugía. El sistema de exposición por inhalación fue fabricado, validado y utilizado para estudios toxicológicos sobre la inhalación de partículas respirables. Los componentes críticos fueron los siguientes: (1) generador de polvo SiO2 seco a granel ajustado con un controlador de flujo de aire; (2) cámara de exposición por inhalación decuerpo entero de 0,3 m3 con capacidad para hasta 3 ratas adultas; (3) un sistema de monitoreo y control para regular la concentración de oxígeno, la temperatura, la humedad y la presión en tiempo real; y (4) una barrera y un sistema de eliminación de desechos para proteger a los técnicos de laboratorio y el medio ambiente. En resumen, el presente protocolo informa de la inhalación a través de todo el cuerpo, y la cámara de inhalación creó un modelo silicótico de rata fiable, razonable y repetible con baja mortalidad, menos lesiones y más protección.
Introduction
La silicosis, causada por la inhalación de sílice, es la enfermedad profesional más grave en China, y representa más del 80% del número total de informes de enfermedades profesionales cada año1. La etiología de la silicosis es clara y puede prevenirse y controlarse, pero no se dispone de un método de tratamiento eficaz2. Muchos fármacos han demostrado ser eficaces en estudios básicos, pero tienen efectos clínicos imprecisos 3,4. Por lo tanto, los mecanismos patológicos y fisiológicos de la silicosis aún deben ser explorados.
Muchos estudios han utilizado una infusión única de sílice en la tráquea de ratas o ratones para investigar la patogénesis de la silicosis 5,6. A pesar de que estos modelos silicóticos de roedores pudieron obtenerse en poco tiempo7, estos métodos aún presentaban desafíos, como traumatismos animales y alta mortalidad. Algunos estudios han implicado la instilación de sílice almacenada en los pulmones para inducir una reacción pulmonar inespecífica, pero no mencionaron los nódulos silicosicos en ratones8. Además, lejos de la silicosis aguda, la exposición crónica a la sílice en ambientes ocupacionales indujo una inflamación pulmonar significativamente menor y elevó los niveles de marcadores antiapoptóticos, en lugar de marcadores proapoptóticos, en los pulmones9. Por lo tanto, se necesita un modelo animal confiable, razonable y repetible para explorar más a fondo la patogénesis de la silicosis.
El presente estudio describe un método para imitar el proceso de la enfermedad de pacientes con silicosis a través de la inhalación de sílice a través de todo el cuerpo, partículas liberadas por aire en una cámara de inhalación, que comprendía un generador de sílice suministrado por aire, una cámara de cuerpo entero y un sistema de eliminación de desechos. Este método es simple, fácil de operar e imita eficazmente el proceso de evolución dinámica patológica de la silicosis. Además, con este método se identifican muchos mecanismos posibles y la patogenia de la silicosis 10,11,12. Se prevé que el protocolo propuesto ayude a futuras investigaciones en el campo relacionado con la investigación de la silicosis.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Norte de China (código de protocolo LX2019033 y 2019-3-3 de aprobación). Para el presente estudio se utilizaron ratas Wistar macho, de 3 semanas de edad. Todas las ratas se mantuvieron en jaulas estáticas con virutas de madera. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. Los experimentos de seguimiento se llevaron a cabo después de 1 semana de alimentación adaptativa.
1. Preparación animal
- A su llegada, aloje a todas las ratas en una habitación específica libre de patógenos (SPF).
- Divida aleatoriamente las ratas sanas en dos grupos (n = 10): ratas de control que inhalan aire puro y ratas con silicosis que inhalan sílice.
2. Preparación de sílice
PRECAUCIÓN: El polvo de sílice inhalado por el cuerpo humano puede dañar los pulmones. Por lo tanto, las personas deben usar overoles, guantes médicos y máscaras protectoras (N95) durante las operaciones.
- Moler las partículas de sílice (ver Tabla de Materiales) con un mortero de ágata durante 1,5 h antes de cada exposición. Esto se debe a que el cuarzo recién fracturado produce mayores cantidades de especies activas de oxígeno que el cuarzoenvejecido 13, y la sílice con un diámetro de 1-5 μm es la más patógena.
- Pesar la sílice (30 g) con una balanza electrónica después de la molienda, colocarla en un recipiente de vidrio y hornearla a 180 °C durante 6 h en un secador de aire eléctrico (ver Tabla de materiales) para eliminar los patógenos de la superficie de las partículas de sílice.
3. Exposición a la sílice de las ratas
- Conecte la inyección y los sistemas generadores disponibles en el mercado (consulte la tabla de materiales) y coloque la sílice (30 g) en el generador. Compruebe si la tubería de conexión es normal, si el cable de alimentación está conectado y si la fuente de alimentación es normal.
- Verifique el nivel de agua de la torre de pulverización y el humidificador del dispositivo de tratamiento de gases residuales (consulte la Tabla de materiales) manualmente y agregue agua si es insuficiente (no hasta la línea estándar).
- Agregue agua del grifo a la torre de pulverización del dispositivo de tratamiento de gases residuales y agua destilada al humidificador (Figura 1).
- Encienda el dispositivo de descarga de gases de escape (consulte la Tabla de materiales) y el interruptor de la fuente de aire para confirmar si el interior del gabinete de protección está en un estado de presión negativa.
- Confirme que las válvulas de control de flujo de líquido y polvo, mezcla de polvo, y válvula de descarga de aguas residuales debajo de la cámara de inhalación estén cerradas.
- Coloque un total de 10 ratas en la cámara de inhalación (consulte la Tabla de materiales) y cierre el compartimiento de inhalación y las puertas del gabinete con mosquitero.
- Ajuste los siguientes parámetros experimentales en el panel de instrumentos o en la computadora: presión del gabinete: -50 a -30 Pa; concentración de oxígeno: 21%; temperatura del gabinete: 26-30 °C; humedad: 30%-70%; tasa de entrada de polvo: 2,0-2,5 mL/min; y concentración de polvo en el gabinete: 60 ± 5 mg/m3.
NOTA: Observe los datos experimentales y el estado del equipo continuamente durante el experimento. La alarma de falla del equipo provocó un procesamiento oportuno.- Exponga a cada animal a sílice de forma continua durante 3 horas al día, 5 días a la semana, y permita que los animales del grupo de control inhalen aire puro.
- Al finalizar el experimento, cierre la válvula de control de flujo de gas mixto y abra la válvula de flujo de gas puro. Inyecte el gas puro continuamente en la cámara de inhalación.
NOTA: En el presente estudio, el flujo de gas puro (7,0-7,5 m3/h) se inyectó durante al menos 20 minutos hasta que el gas venenoso en la cámara de inhalación fue reemplazado por completo.- Cierre la válvula de flujo de aire puro, abra la puerta, saque a las ratas y envíelas de regreso a la habitación libre de patógenos.
- Retire la rejilla para ratas y los componentes de la tubería de derivación en secuencia y colóquelos en el fregadero para limpiarlos. Después del enjuague, cierre la válvula de limpieza automática y abra la escotilla.
- Limpie la pared interior con un paño limpio o encienda el gas puro para secar el tanque. Por último, realizar la desinfección. Después de limpiar y desinfectar con etanol al 75%, cierre la compuerta de escape y, lo antes posible, abra ligeramente la puerta de la cabina de inhalación para evaporar la humedad, de modo que el interior de la cabina de inhalación permanezca seco.
- Compruebe la concentración de sílice en el armario con un muestreador atmosférico completo siguiendo las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de materiales) dos veces por semana para garantizar la estabilidad de la concentración de sílice durante el experimento. Calibre el muestreador atmosférico antes de tomar muestras.
- Utilice una balanza analítica digital de un solo plato para la determinación gravimétrica. La concentración de sílice calculada fue de 65 mg/m3 (Figura 1 y Tabla 1).
NOTA: Pesar el papel de filtro antes y después de la absorción de sílice. La concentración de sílice se calculó mediante la siguiente fórmula12:
donde W2 = peso del papel de filtro después del muestreo, W1 = peso del papel de filtro antes del muestreo y V = volumen de aire.
- Utilice una balanza analítica digital de un solo plato para la determinación gravimétrica. La concentración de sílice calculada fue de 65 mg/m3 (Figura 1 y Tabla 1).
4. Adquisición y fijación de tejidos pulmonares
- Eutanasia de las ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg/kg de peso corporal) y lidocaína (4 mg/kg de peso corporal). Evaluar la muerte por la pérdida de latidos del corazón14.
- Al final del experimento, fijar el pulmón inferior derecho, el riñón, el hígado, el bazo y el hueso con paraformaldehído al 4% durante al menos 24 h, incrustar en parafina y cortar en secciones de 5 μm 7,15.
5. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
- Desparafinar las secciones de parafina en xilol (ver Tabla de Materiales) dos veces durante 10 minutos cada16, y rehidratar en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 80%, etanol al 70% y agua destilada durante 3 min cada una.
- Tiña las secciones con hematoxilina (ver Tabla de Materiales) durante 5 min, y luego lava las secciones con agua10.
- Coloque las secciones en alcohol clorhídrico al 2% y luego en agua destilada hasta que el color cambie a azul.
- Teñir las secciones con eosina durante 1 min, deshidratarlas con etanol al 95%, hacerlas transparentes con xileno, sellarlas con goma neutra y observar bajo un microscopio óptico12.
6. Tinción inmunohistoquímica
- Lave rutinariamente las secciones de parafina con agua.
- Exponer los antígenos a alta presión (60 kPa) y alta temperatura (100 °C) durante 80 s y luego bloquear con un bloqueador peroxidasa endógeno (3%) durante 15 min para eliminar las peroxidasas endógenas7.
- Incubar las muestras con anticuerpos dirigidos contra CD68 (dilución 1:200; añadir 4 μL de CD68 a 396 μL de diluyente de anticuerpo; ver Tabla de Materiales) a 4 °C durante la noche.
- Incubar las muestras con un anticuerpo secundario (polímero IgG antiratón de cabra conjugado con HRP; ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 30 min, y luego lavar las muestras con 1x PBS.
- Visualizar la inmunorreactividad con 3,3-diaminobenzidina (DAB; ver Tabla de Materiales). Después de aplicar DAB al tejido, observe la tinción del tejido bajo un microscopio óptico10.
NOTA: El tiempo de tinción varió de unos pocos segundos a unos minutos según el tiempo de tinción del tejido. El procedimiento de tinción se abortó colocando las secciones en agua. En este estudio, la tinción marrón del tejido representó la expresión positiva de CD68. Todos los anticuerpos se diluyeron en 1x PBS.
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Representative Results
Utilizando el método propuesto, se exploraron algunos mecanismos potenciales y la patogénesis de la silicosis en ratas. El esquema de la cámara de inhalación se muestra en la Figura 1. La cámara consistía en un generador de sílice suministrado por aire, una cámara de cuerpo entero y un sistema de eliminación de desechos, como se describió anteriormente17. Las funciones pulmonares, los niveles de factores inflamatorios en suero y pulmón, depósito de colágeno y diferenciación de miofibroblastos fueron reportados en estudios previos 10,18,19. La expresión diferencial de miRNA, lncRNA y mRNA fue reportada en nuestros reportes previos 20,21,22. Ninguna rata murió después de la exposición a la sílice en los estudios de lotes múltiples antes mencionados.
Las características patológicas clásicas de las ratas con silicosis fueron resumidas previamente23. Los nódulos silicosicos estaban formados por macrófagos que contenían sílice. En la Figura 2 se presenta el depósito de colágeno en ratas con silicosis. El cristalino polarizado reveló sílice en los macrófagos. En la Figura 3 se presenta la evolución dinámica de los nódulos silicóticos mediante tinción inmunohistoquímica de CD68; Otros marcadores alternativos fueron la óxido nítrico sintasa inducible o la arginasa-124. Como se mencionó anteriormente23, las ratas expuestas a sílice durante 24 semanas mostraron lesiones visibles y observables, incluyendo depósito de colágeno en nódulos silicóticos, tinción positiva para ácido peryólico-Schiff y deterioro de las funciones pulmonares. Por otro lado, los demás órganos (corazón, bazo e hígado) no mostraron diferencias morfológicas entre las ratas control y las ratas con silicosis (Figura 4). El riñón de las ratas expuestas a sílice durante 24 semanas tuvo cambios degenerativos leves en los túbulos contorneados proximales. El metabolismo óseo anormal estaba bien documentado en nuestros estudios previos10,17. En general, estos estudios destacaron que el protocolo propuesto podría imitar bien la progresión de la silicosis en humanos.
Figura 1: Esquema del aparato de control de la exposición. (A) Generador de sílice suministrado por aire. (B) Cámara de cuerpo entero. (C) Paneles de instrumentos. D) Aparatos de control de la exposición. (E) Todos los componentes se ensamblan para formar un instrumento de trabajo; La cámara consta de un generador de sílice suministrado por aire, una cámara de cuerpo entero y un sistema de eliminación de residuos. (F,G) Detector de aire. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tinción de H&E y deposición de colágeno en ratas con silicosis. Tinción de H&E en ratas expuestas a sílice durante 2 y 24 semanas. La estructura alveolar de las ratas aún estaba intacta y la pared alveolar se engrosó después de 2 semanas de inhalación de sílice. La estructura alveolar de las ratas desapareció y se formaron grandes áreas de fibrosis después de 24 semanas de inhalación de sílice. Las partículas de sílice quedaron atrapadas en los lóbulos pulmonares de las ratas (2 y 24 semanas), y las fibras de colágeno de las ratas (24 semanas) se observaron bajo un microscopio de luz polarizada. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evolución dinámica de los nódulos silicóticos detectados por tinción inmunohistoquímica de CD68. (A) A medida que aumentaba el tiempo de exposición (de 2 a 24 semanas), el área de los nódulos silicóticos aumentaba gradualmente y los nódulos silicóticos adyacentes se fusionaban gradualmente en nódulos grandes. (B) El patrón de los nódulos de silicio. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción de H&E de los pulmones, riñón, hígado, bazo y hueso de ratas control y ratas con silicosis. (A) Tinción de H&E de los pulmones, riñón, hígado, bazo y hueso de ratas de control. Barra de escala: 1 mm. (B) Tinción de H&E de los pulmones, riñón, hígado, bazo y hueso de ratas de control. Barra de escala: 50 μm. Se formaron múltiples lesiones fibróticas de diferentes tamaños en ratas expuestas a sílice en comparación con las ratas de control. No se encontraron diferencias significativas en el riñón, el hígado y el bazo entre las ratas control y las ratas con silicosis, pero la pérdida ósea se observó en las ratas con silicosis. (C) Tinción de H&E de los pulmones, riñón, hígado, bazo y hueso de ratas con silicosis. Barra de escamas: 1 mm. (D) Tinción de H&E de los pulmones, riñón, hígado, bazo y hueso de ratas con silicosis. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tiempo de medición (min) | Volumen (L) | W1 (g) | W2 (g) | Concentraciones (mg/m3) |
| 10 | 460 | 0.40 | 0.43 | 65.22 |
| 20 | 923 | 0.40 | 0.46 | 65.01 |
| 30 | 1404 | 0.40 | 0.49 | 64.1 |
Tabla 1: Concentraciones de sílice en la cámara de cuerpo entero.
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Discussion
Como principal causa de silicosis, la sílice juega un papel decisivo en el moldeo. Las partículas de sílice inhaladas por los pacientes con neumoconiosis son partículas de sílice frescas y libres producidas por corte mecánico. La sílice puede generar especies reactivas de oxígeno, ya sea directamente sobre las superficies de partículas recién escindidas o indirectamente a través de su efecto sobre los macrófagos25. Por lo tanto, la molienda de partículas de sílice es de gran importancia. En el protocolo propuesto, la sílice se molió con mortero de ágata durante más de 90 min para hacerla más fina, más irregular y aumentar la superficie. Como se ha informado, las concentraciones de sílice cristalina26 en el aire no deben ser inferiores a 0,05 mg/m3. Sin embargo, este protocolo podría tener un problema con concentraciones de polvo inexactas; La incertidumbre de la concentración de polvo se asoció principalmente con la ausencia de un sistema de monitoreo de concentración de polvo incorporado. La concentración real de sílice se calculó utilizando la masa de SiO2 que entraba en el armario de polvo y el caudal de gas. El volumen de SiO2 se basó en la velocidad de la placa giratoria, en lugar de la masa de SiO2 que realmente ingresó al gabinete. Por lo tanto, las posibles soluciones al problema eran verificar el volumen de sílice en la cámara dos veces por semana para asegurarse de que las ratas estuvieran expuestas al mismo volumen de sílice cada vez o colocar un dispositivo de medición de concentración en la cámara de polvo, siendo esta última la mejor solución.
Las limitaciones de este modelo también eran evidentes: (1) la relación entre la dosis de exposición y su efecto biológico es sólo aproximada porque el tracto respiratorio de las ratas es diferente al de los humanos; (2) existía la incertidumbre de la concentración de polvo; (3) el método requería la compra de equipo especial; (4) el volumen de la cámara de polvo y el número de ratas infectadas con polvo eran limitados; (5) el modelo de silicosis de ratón no pudo construirse porque el tracto respiratorio de los ratones era estrecho y el polvo de sílice no podía depositarse en los pulmones; además, el modelo de ratón era más barato y era fácil generar ratones transgénicos o KO.
La construcción convencional del modelo animal de silicosis incluyó principalmente dos métodos: inyección bronquial e inhalación de SiO2. En la inyección bronquial, la mortalidad estuvo estrechamente relacionada con la dosis de perfusión, y la cirugía invasiva causó inevitablemente daños colaterales adicionales27. Para reemplazar el modelo de inyección intratraqueal, algunos estudiosos establecieron un modelo de silicosis utilizando una suspensión ultrasónica de sílice atomizada para inhalación28. Sin embargo, la atomización ultrasónica no pudo controlar la concentración de sílice en el aire después de la atomización, la repetibilidad fue deficiente y las lesiones fibróticas típicas no pudieron formarse utilizando este método de modelado. Otro modelo económico, práctico y eficaz fue el modelo de goteo nasal de ratón29, pero este método inyectaba sílice líquida en la tráquea y no era tan bueno como inhalarla. El aparato de control de exposición tiene un sistema de entrada de aire múltiple para que la sílice en la cámara de inhalación se distribuya uniformemente, los datos sean precisos y la distribución del polvo en la cámara de polvo sea uniforme. Por lo tanto, el entorno de prueba fue estable durante mucho tiempo y los parámetros relevantes se observaron y registraron en cualquier momento.
La importancia de establecer modelos de enfermedades o lesiones animales es imitar el proceso patológico de la enfermedad o lesión causada por factores patógenos en la mayor medida posible. Por lo tanto, un buen modelo animal es lo más parecido posible a la enfermedad humana. Al exponerse por inhalación a la sílice, las ratas podían inhalar libremente partículas patógenas de sílice en la cámara de polvo. Las sesiones de exposición semanales y diarias también imitaron plenamente las horas de trabajo de los trabajadores con neumoconiosis. Utilizando este método de modelado, identificamos cambios patológicos como la transición epitelio-mesenquimatosa, la activación de señales del factor de crecimiento de transferencia, la activación de macrófagos y la activación de señales relacionadas con la senescencia durante la silicosis en ratas. Algunos de los resultados fueron confirmados en muestras humanas18. Recientemente, también hemos comenzado a estudiar los cambios patológicos dinámicos en la evolución de la silicosis por este método23.
Este protocolo sencillo, de bajo coste y fácil repetición es también de gran importancia en un momento en el que la incidencia de la silicosis está reapareciendo en el mundo30. Después de la exposición inhalatoria de 8 semanas a 100 mg de cuarzo/m3, el 20% de sílice permaneció en los pulmones de la rata después de 6 y 12 meses31. Además, los investigadores investigaron hasta qué punto un animal en un dispositivo similar podía inhalar y exhalar aire; La concentración del gas inhalado por los animales cambió ligeramente32. El protocolo sigue siendo muy prometedor, por ejemplo, combinándolo con la tomografía microcomputarizada para observar la evolución dinámica de la silicosis y combinándolo con la base de datos del transcriptoma para verificar el proceso patológico de la silicosis y validar nuevas terapias sistémicas antiinflamatorias y antifibróticas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82003406), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hebei (H2022209073) y el Proyecto de Ciencia y Tecnología del Departamento de Educación de Hebei (ZD2022127).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air detector (compressive atmospheric sampler) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Anatomical table | No specific brand is recommended. | ||
| Antibody of CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Electric heating air-blowing drier | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Electronic balance | OHRUS | ||
| Embedding machine | leica | ||
| Exhaust gas discharge device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Generator systems | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Gloves (thin laboratory gloves) | The secco medical | ||
| Hematoxylin and eosin | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 exposure control apparatus | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Inhalation chamber | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Injection syringe | No specific brand is recommended. | ||
| Light microscope | olympus | ||
| Object slide | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd | s5631 | |
| Silicon dioxide | Sigma-Aldrich | ||
| Slicing machine | leica | RM2255 | |
| Waste gas treatment device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Wet box | Cooperative plastic Products Factory | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
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