Summary
बायोमार्कर प्रोगैस्ट्रिन-रिलीज़िंग पेप्टाइड (प्रोजीआरपी) के साथ उदाहरण दिए गए सूखे सीरम नमूनों से कम-बहुतायत बायोमार्कर के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग प्रोटिओटिपिक प्रोजीआरपी पेप्टाइड के चयनात्मक सफाई और संवर्धन के लिए किया जाता है। कैप्चर किए गए पेप्टाइड का विश्लेषण बाद में तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा किया जाता है।
Abstract
यह पेपर सूखे नमूनों से कम-बहुतायत प्रोटीन के कुशल नमूना सफाई के लिए विस्तृत विवरण के साथ एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटियोटाइपिक पेप्टाइड आत्मीयता-कैप्चर और तरल क्रोमैटोग्राफी टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) निर्धारण से पहले बीड-आधारित प्रोटियोलिसिस का उपयोग करके किया जाता है। प्रक्रिया को पेपर कार्ड (जैसे, सूखे रक्त के धब्बे [डीबीएस] और सूखे सीरम स्पॉट [डीएसएस]) का उपयोग करके पारंपरिक सूखे नमूनों दोनों पर लागू किया जा सकता है, साथ ही वॉल्यूमेट्रिक अवशोषक माइक्रोसैंपलिंग (वीएएमएस) जैसे नए नमूना विधियों के साथ एकत्र किए गए नमूने। इस प्रक्रिया का वर्णन करने के अलावा, ट्रिप्सिन मोती और एंटीबॉडी-लेपित मोतियों दोनों की तैयारी इस काम में चरण-दर-चरण तरीके से प्रस्तुत की जाती है। प्रस्तुत प्रक्रिया के फायदे मोतियों का उपयोग करके समय-कुशल प्रोटियोलिसिस और पेप्टाइड आत्मीयता-कैप्चर का उपयोग करके चयनात्मक मजबूत सफाई हैं। वर्तमान प्रक्रिया सूखे सीरम (डीएसएस और वीएएमएस दोनों) में कम-बहुतायत वाले छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एससीएलसी) बायोमार्कर, प्रोगैस्ट्रिन-रिलीज़िंग पेप्टाइड (प्रोजीआरपी) के निर्धारण का वर्णन करती है। मोती तैयार करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं नए अनुप्रयोगों या अन्य प्रयोगशालाओं में वर्कफ़्लो को लागू करना आसान बनाती हैं। यह प्रदर्शित किया गया है कि परिणाम नमूना सामग्री पर निर्भर हो सकते हैं; वर्तमान परियोजना के लिए, डीएसएस की तुलना में वीएएमएस का उपयोग करके एकत्र किए गए नमूनों के लिए उच्च सिग्नल तीव्रता देखी गई थी।
Introduction
माइक्रोसैंपलिंग 100 से अधिक वर्षों से है क्योंकि इवर बैंग ने 1913 में डीबीएस से ग्लूकोज निगरानी का वर्णन कियाथा। गुथरी और सूसी ने नवजात शिशुओं में फेनिलएलनिन के निर्धारण के लिए 1963 में डीबीएस पेश करने के बाद, तकनीक तेजी से व्यापक हो गई है। प्रोटीन के नमूने और भंडारण के लिए डीबीएस की पहली रिपोर्ट 1970 के दशक की शुरुआत में बनाई गई थी, और एक दशक बाद, 1980 के दशक में, हमें डीबीएस5 से प्रोटीन के निर्धारण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) की पहली रिपोर्ट मिली। इस शुरुआती परिचय के बावजूद, यह सदी के मोड़ के बाद तक नहीं था कि डीबीएस और अन्य माइक्रोसैंपलिंग तकनीकों से प्रोटीन का एमएस निर्धारण अधिक व्यापक हो गया।
नैदानिक संदर्भ में, रोगों के निदान और अनुवर्ती के साथ-साथ उपचार निगरानी और डोपिंग उद्देश्यों के लिए प्रोटीन निर्धारित करना रुचि का विषय है। सूखे नमूनों की छोटी मात्रा से एमएस द्वारा प्रोटीन विश्लेषणों का यह लक्षित निर्धारण अभी भी चुनौतीपूर्ण है, और अक्सर विश्लेषण से पहले व्यापक नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है।
एमएस द्वारा प्रोटीन का लक्षित मात्रात्मक निर्धारण आमतौर पर नीचे-ऊपर दृष्टिकोण को लागू करके किया जाता है, विश्लेषण से पहले प्रोटीन को पेप्टाइड्स में पचाता है। यह प्रक्रिया पेप्टाइड्स के असंख्य का उत्पादन करती है, जो पचे हुए जैविक नमूने के प्रत्यक्ष विश्लेषण को चुनौतीपूर्ण बनाती है। इसे दरकिनार करने का एक तरीका पाचन 6,7,8 से पहले या बाद में एमएस विश्लेषण के सामने एक चयनात्मक आत्मीयता सफाई चरण लागू करना है। इस तरह, रुचि का प्रोटीन (या इसके प्रोटिओटिपिक पेप्टाइड, यदि पाचन के बाद आत्मीयता कैप्चर चरण किया जाता है) को विश्लेषण से पहले नमूना मैट्रिक्स से चुनिंदा रूप से अलग किया जाता है,जो कम पहचान सीमा प्रदान करता है।
डीबीएस कार्ड का उपयोग करके माइक्रोसैंपलिंग में पारंपरिक रक्त के नमूनों की तुलना में कुछ फायदे हैं, जिनमें कम नमूना मात्रा, कम आक्रामक नमूनाकरण और भंडारण स्थिरता में वृद्धि शामिल है। हालांकि, नमूना मैट्रिक्स अलग है और विश्लेषण में अन्य चुनौतियों को पेश कर सकता है (उदाहरण के लिए, सूखे बनाम तरल नमूना मैट्रिक्स और केशिका रक्त बनाम सीरम या प्लाज्मा)10,11। डीबीएस के साथ देखी जाने वाली एक और चुनौती तथाकथित हेमटोक्रिट प्रभाव है, जहां रक्त हेमटोक्रिट विश्लेषण के लिए संसाधित नमूना मात्रा को प्रभावित करता है, और इसलिए विश्लेषण12 में अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का परिचय देता है। नई माइक्रोसैंपलिंग इकाइयाँ, जैसे कि 201413 में पेश किए गए वीएएमएस, रक्त की बूंद के बजाय रक्त की एक निश्चित मात्रा एकत्र करके इस मुद्दे को संबोधित करते हैं।
यह प्रोटोकॉल सूखे माइक्रोसैंपल से कम-बहुतायत बायोमाकर्स के विश्लेषण के लिए एक सेटअप का वर्णन करता है। क्षालन के बाद, सूखे नमूने को पचाया जाता है और बाद में, प्रोटिओटिक पेप्टाइड को पेप्टाइड आत्मीयता कैप्चर द्वारा अलग किया जाता है। मॉडल विश्लेषण एससीएलसी बायोमार्कर प्रोजीआरपी है। चूंकि प्रोजीआरपी को पूरे रक्त से मज़बूती से निर्धारित नहीं किया जा सकता है, सीरम का उपयोग नमूना मैट्रिक्स के रूप में किया गया था। वीएएमएस का उपयोग करके एकत्र किए गए डीएसएस और सीरम नमूने दोनों के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं।
Protocol
मानक समाधान तैयार करने के लिए स्वस्थ रक्त दाताओं के सीरम का उपयोग किया गया था। स्वस्थ रक्त दाताओं से सीरम का उपयोग नॉर्वेजियन कानून के अनुसार सख्ती से किया गया था। सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। सीरम नमूनों का विश्लेषण प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार विधियों का उपयोग करके किया गया था। वर्णित प्रोटोकॉल पिछले कार्य14 में वर्णित विधि का एक संशोधित संस्करण है। बफर और समाधानों की संरचना और उन्हें कैसे तैयार किया जाए, इसका अवलोकन पूरक तालिका एस 1 में पाया जा सकता है, जबकि सामग्री की तालिका में इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री, उपकरण और अभिकर्मक शामिल हैं।
1. एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोतियों की तैयारी
- मोतियों की वांछित संख्या तैयार करने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा की गणना करें। चुंबकीय मोतियों के प्रति 50 मिलीग्राम एंटीबॉडी के 1 मिलीग्राम का उपयोग करें।
नोट: आमतौर पर, 20 मिलीग्राम / एमएल मोती निलंबन के 20 μL का उपयोग बाद के प्रयोगों में प्रति नमूना किया जाता है (चरण 5.1 देखें)। - मोतियों की वांछित संख्या तैयार करने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी मात्रा की गणना करें।
नोट: एंटीबॉडी की मात्रा एंटीबॉडी एकाग्रता पर निर्भर है और प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए गणना करने की आवश्यकता है। - एंटीबॉडी समाधान की वांछित मात्रा को 5 एमएल कम प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक उदाहरण के रूप में, यदि एंटीबॉडी समाधान में 1 मिलीग्राम / एमएल एंटीबॉडी होता है, तो 1.0 एमएल बीड सस्पेंशन (1 मिलीग्राम एंटीबॉडी / 50 मिलीग्राम मोतियों के साथ 20 मिलीग्राम मोती / एमएल) तैयार करने के लिए 0.4 एमएल का उपयोग करें।
नोट: एंटीबॉडी एक अमाइन-मुक्त बफर में होना चाहिए। सोखने के कारण विश्लेषण हानि से बचने के लिए प्रोटीन युक्त सभी समाधानों के लिए कम प्रोटीन-बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करें। - एंटीबॉडी समाधान में एक छोटी चुंबकीय सरगर्मी पट्टी जोड़ें और निरंतर सरगर्मी के तहत पीएच को 2.5 तक समायोजित करें। पीएच को मापने के लिए एक माइक्रो इलेक्ट्रोड के साथ पीएच मीटर का उपयोग करें और 1.0 एम एचसीएल के परिभाषित वॉल्यूम के चरणवार जोड़कर पीएच को समायोजित करें (1.0 एम एचसीएल के 10 μL भागों को जोड़कर शुरू करें और पीएच 2.5 तक पहुंचने पर मात्रा को कम करें)। पीएच को 2.5 में समायोजित करने के लिए आवश्यक 1.0 एम एचसीएल की कुल मात्रा रिकॉर्ड करें।
- माइक्रो इलेक्ट्रोड को हटा दें और 1 घंटे के लिए चुंबकीय स्टिरर पर बर्फ पर अम्लीय एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करें।
नोट: मोती पर एंटीबॉडी के सही अभिविन्यास को बढ़ावा देने के लिए एंटीबॉडी का एसिड उपचार किया जाता है। एंटीबॉडी समाधान में बफर एकाग्रता के आधार पर एचसीएल की एकाग्रता 0.5 एम या 0.2 एम एचसीएल तक कम हो सकती है। - एंटीबॉडी समाधान को बेअसर करें। पीएच को मापने के लिए एक माइक्रो इलेक्ट्रोड के साथ पीएच मीटर का उपयोग करें और 1.0 एम एनएओएच के परिभाषित वॉल्यूम के चरणवार जोड़कर पीएच को 7 में समायोजित करें (10 μL भाग से शुरू करें और पीएच 7 तक पहुंचने पर मात्रा को कम करें)। 1.0 M NaOH की कुल मात्रा रिकॉर्ड करें।
नोट: एनएओएच की एकाग्रता चरण 1.4 में उपयोग की जाने वाली एचसीएल एकाग्रता के समान होनी चाहिए। एनएओएच अत्यधिक संक्षारक है; दस्ताने और उचित आंखों की सुरक्षा सहित सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करें। - उपयोग किए जाने वाले टोसिल सक्रिय चुंबकीय मोतियों की वांछित मात्रा की गणना करें।
नोट: आमतौर पर, छोटे पैमाने पर युग्मन करते समय 20 मिलीग्राम मोती / एमएल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। कम से कम 5 मिलीग्राम मोतियों का उपयोग किया जाना चाहिए। - एक भंवर मिक्सर पर चुंबकीय मोती निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं और वांछित मात्रा में मोती निलंबन वाली मात्रा वापस लें। एक उदाहरण के रूप में, 1 एमएल बीड सस्पेंशन तैयार करने के लिए, 20 मिलीग्राम मोतियों (667 μL यदि मोतियों की एकाग्रता 30 मिलीग्राम / एमएल है) युक्त मात्रा वापस लें।
- मोती निलंबन को 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 2x को टाइप 1 H2O की समान मात्रा के साथ धोएं (667 μL यदि 30 mg / mL मोती समाधान का उपयोग 20 mg / mL एंटीबॉडी-लेपित मोतियों के 1 एमएल तैयार करने के लिए किया जाता है)। धोने के घोल के प्रत्येक जोड़ के बाद एक भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिलाएं और सतह पर तैरने वाले को हटाने से पहले 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें।
- चुंबकीय मोतियों में निम्नलिखित जोड़ें: एसिड-उपचारित एंटीबॉडी, 0.5 एम बोरेट बफर (पीएच 9.5) (अंतिम एकाग्रता के रूप में कुल मात्रा का 1/5 0.1 एम होना चाहिए; यह 1 एमएल बीड निलंबन तैयार करने के लिए 0.2 एमएल के बराबर है), और एंटीबॉडी युग्मन के लिए युग्मन बफर (एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोतियों के 1 एमएल तैयार करने के लिए, युग्मन बफर की मात्रा 1 एमएल - एसिड उपचारित एंटीबॉडी की मात्रा - 0.2 एमएल बोरेट के बराबर होनी चाहिए)। एक भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिलाएं।
नोट: एसिड-उपचारित एंटीबॉडी की मात्रा एंटीबॉडी समाधान की मात्रा के बराबर होती है (1 मिलीग्राम / एमएल एंटीबॉडी समाधान का उपयोग करके 1 एमएल बीड निलंबन की तैयारी में 0.4 एमएल) + पीएच को 2.5 में समायोजित करने के लिए उपयोग की जाने वाली 1.0 एम एचसीएल की मात्रा + पीएच को 7 में समायोजित करने के लिए उपयोग की जाने वाली 1.0 एम एनएओएच की मात्रा।
नोट: एंटीबॉडी युग्मन के लिए 0.5 एम बोरेट बफर (पीएच 9.5) और युग्मन बफर की संरचना पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती है। - अंत-ओवर-एंड नमूना मिक्सर का उपयोग करके रात भर परिवेश के तापमान पर घुमाएं, अधिमानतः पारस्परिक रोटेशन और कंपन के साथ।
- 239 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। ट्यूब को चुंबक पर 2 मिनट के लिए रखें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- एंड-ओवर-एंड सैंपल मिक्सर का उपयोग करके परिवेश के तापमान पर एंटीबॉडी मोतियों के लिए भंडारण बफर में घुमाकर मोतियों को 2 x 2 घंटे और एक बार रात भर धोएं। चरण 1.10 में कुल वॉल्यूम के समान वॉल्यूम का उपयोग करें। ट्यूब को चुंबक पर 1 मिनट के लिए रखें और प्रत्येक धोने के बीच सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
नोट: एंटीबॉडी मोतियों के लिए भंडारण बफर की संरचना पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती है। - मोतियों की वांछित स्टॉक एकाग्रता (आमतौर पर 20 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग करके वांछित बफर (उदाहरण के लिए, चरण 1.13 में समान बफर) में स्टोर करें। फ्रिज में स्टोर करें।
2. ट्रिप्सिन स्थिर मोतियों के 2 एमएल की तैयारी (20 मिलीग्राम / एमएल मोती)
- मोतियों को धोने के लिए एनएचएस-सक्रिय अगारोस मोतियों के 2 एमएल में 1 एमएम एचसीएल का 20 एमएल जोड़ें।
- 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर मिलाएं और सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.8) के 20 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर भंवर मिक्सर और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके मिलाएं। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
नोट: 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.8) की संरचना पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती है। - एमएल ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें (ट्रिप्सिन युग्मन के लिए ठंडे युग्मन बफर में घुल गया)।
नोट: ट्रिप्सिन युग्मन के लिए युग्मन बफर की संरचना पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती है। बफर को फ्रिज में स्टोर करें। - तापमान-नियंत्रित मिक्सर का उपयोग करके 22 डिग्री सेल्सियस और 1,100 आरपीएम पर 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- ट्रिप्सिन मोतियों की तैयारी के लिए 2 एमएल संशोधन बफर जोड़ें और तापमान-नियंत्रित मिक्सर का उपयोग करके 22 डिग्री सेल्सियस और 1,100 आरपीएम पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
नोट: ट्रिप्सिन मोतियों की तैयारी के लिए संशोधन बफर की संरचना पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती है। बफर को फ्रिज में स्टोर करें। - ट्रिप्सिन मोतियों की तैयारी के लिए 10 एमएल ब्लॉकिंग बफर जोड़ें और तापमान-नियंत्रित मिक्सर का उपयोग करके 22 डिग्री सेल्सियस और 1,100 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
नोट: ट्रिप्सिन मोतियों की तैयारी के लिए ब्लॉकिंग बफर की संरचना पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती है। बफर को फ्रिज में स्टोर करें। - 2 एमएल स्टोरेज बफर जोड़ें, एक भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिलाएं, और उपयोग होने तक फ्रिज में स्टोर करें।
नोट: ट्रिप्सिन मोतियों के लिए भंडारण बफर की संरचना पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती है। बफर को फ्रिज में स्टोर करें।
3. डीएसएस / वीएएमएस नमूनाकरण और सूखे सीरम का बाद में निष्कर्षण
- उचित स्तर पर प्रोजीआरपी (या रुचि के प्रोटीन) के साथ सीरम को स्पाइक करके मानक तैयार करें। स्पाइकिंग वॉल्यूम को कुल वॉल्यूम के 1% ≤ रखें।
नोट: यहां, स्पाइक्ड सीरम मानकों की तैयारी के लिए पानी में 295 μg / mL ProGRP के स्टॉक समाधान का उपयोग किया गया था। - एक भंवर मिक्सर पर मानकों को मिलाएं।
- डीबीएस कार्ड पर सीरम (स्पाइक्ड मानकों) के 10 μL लागू करें या निर्माता के दिशानिर्देशों का उपयोग करके VAMS (10 μL) द्वारा सीरम के 10 μL एकत्र करने की अनुमति दें। डीएसएस के लिए, सुनिश्चित करें कि स्पॉट डॉटेड सर्कल के भीतर है।
- कम से कम 2 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर हवा को सूखने दें।
- पूरे स्थान को काट लें और इसे 2 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें या धारक से वीएएमएस को हटा दें और इसे 2 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
- 100 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट (ABC) समाधान का 1,000 μL जोड़ें। 1,000 आरपीएम पर तापमान-नियंत्रित मिक्सर का उपयोग करके 22 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए स्पॉट / वीएएमएस से सूखे सीरम निकालें।
- ट्राइप्टिक प्रोटियोलिसिस के लिए अर्क को एक नए 1.5 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
4. डीएसएस / वीएएमएस अर्क का पाचन
- प्रति नमूने ट्रिप्सिन मोतियों के 30 μL का उपयोग करें (जैसा कि अनुभाग 2 में तैयार किया गया है)। सभी नमूनों के लिए ट्रिप्सिन मोतियों वाली मात्रा को एक नए 1.5 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को हटा दें।
- ट्रिप्सिन मोतियों को 1 एमएल ठंडे 50 एमएम एबीसी के साथ 2x धो लें, इससे पहले कि उसी मात्रा में पुन: उत्पन्न हो जाएं जो पाइप किया गया था। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर और चरणों के बीच सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- पाचन शुरू करने के लिए प्रत्येक डीएसएस / वीएएमएस अर्क में 30 μL धुले हुए ट्रिप्सिन मोती जोड़ें।
- तापमान-नियंत्रित मिक्सर या इसी तरह का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस और 1,000 आरपीएम पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 2,655 × ग्राम पर और सतह पर तैरने वाला (मोतियों नहीं) को एक नए 2.0 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 100 mM ABC समाधान में स्थिर आइसोटोप-लेबल (SIL) पेप्टाइड ALGNQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15 N 2] युक्त 14 ng/mL आंतरिक मानक (IS) समाधान का25 μL जोड़ें।
5. एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके प्रोटिओटिपिक प्रोजीआरपी पेप्टाइड का कब्जा
- प्रति निष्कर्षण एंटीबॉडी लेपित मोतियों (धारा 1 में तैयार 20 मिलीग्राम / एमएल) के 20 μL का उपयोग करें। सभी एंटीबॉडी-लेपित मोतियों को एक नए 1.5 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 1 मिनट के लिए चुंबक पर रखें, और भंडारण बफर को हटा दें।
- चुंबकीय एंटीबॉडी-लेपित मोतियों को 1 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस), पीएच 7.4, जिसमें 0.05% पॉलीसोर्बेट 20 और 2 x 1 एमएल पीबीएस होता है, के साथ धो लें। एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं और बफर एक्सचेंजों के बीच 1 मिनट के लिए चुंबक पर रखें।
नोट: पीबीएस में 137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 8 एमएम एनए2एचपीओ4, और 1.8 एमएम केएच2पीओ4 शामिल हैं। बढ़ी हुई स्थिरता के लिए 10x एकाग्रता पर समाधान तैयार करने की सिफारिश की जाती है। 10x PBS के 100 mL की संरचना के लिए, पूरक तालिका S1 देखें। 10x PBS 10x को कमजोर करने से ~ 7.4 का पीएच प्राप्त होगा। - वीएएमएस अर्क और आईएस युक्त प्रत्येक कम प्रोटीन-बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में धोए गए चुंबकीय मोती निलंबन के 20 μL जोड़ें। परिवेश के तापमान पर एंड-ओवर-एंड सैंपल मिक्सर का उपयोग करके 1 घंटे के लिए इम्यूनोएक्सट्रैक्शन करें।
- निम्नलिखित समाधानों का उपयोग करके चुंबकीय मोतियों को धोएं: पीबीएस के 500 μL को 0.05% (v/v) पॉलीसोरबेट 20, 400 μL PBS, 10 mM Tris HCl (pH 7.4) के 300 μL और 100 mM ABC के 300 μL के साथ धोएं।
- प्रत्येक धोने के समाधान को जोड़ने के बाद, मोतियों के साथ कम प्रोटीन-बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को हटा दें और चुंबक रैक से घोल धो लें और सजातीय होने तक सावधानीपूर्वक उलटा करें। फिर, कम प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को चुंबक पर 30 सेकंड के लिए रखें, 30 सेकंड के लिए इनवर्ट करें, और चुंबक पर 1 मिनट के लिए रखें। धोने का घोल निकालें।
- माइक्रोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके शेष निलंबन को स्पिन करें। चुंबक पर 1 मिनट के लिए रखें और शेष धोने के घोल को हटा दें।
- प्रत्येक नमूने में टाइप1 एच 2ओ में 2% (वी / वी) फॉर्मिक एसिड का 15 μL जोड़ें और कैप्चर किए गए पेप्टाइड्स को हटाने के लिए तापमान-नियंत्रित मिक्सर का उपयोग करके 22 डिग्री सेल्सियस और 1,000 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। चुंबक पर 1 मिनट के लिए रखें और एलुएट को एक नए 1.5 एमएल कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक बार दोहराएं और दूसरे एलुएट को उसी कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जो पहले एलुएट के रूप में है।
- प्रत्येक एलुएट (50 μL की कुल मात्रा) में 100 mM ABC का 20 μL जोड़ें।
- सेंट्रीफ्यूज (माइक्रोसेंट्रीफ्यूज) और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) शीशियों के लिए 40 μL एल्यूएट को माइक्रो इंसर्ट में स्थानांतरित करें।
6. एलसी-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण
- उच्च मजबूती के लिए इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण के साथ एक माइक्रो एलसी ट्रिपल क्वाड्रोपोल एमएस का उपयोग करें।
- मोबाइल चरण ए (एच 2 ओ और एमसीएन में 20 एमएम एफए, 95: 5 वी / वी) और बी (एच 2 ओ और एमसीएन में20एमएम एफए, 5: 95 वी / वी) के साथपंपोंको शुद्ध करके विश्लेषण के लिए एलसी-एमएस / एमएस सिस्टम तैयार करें।
- विश्लेषणात्मक कॉलम डालें (सी 18, 50 मिमी x 1 मिमी आंतरिक व्यास [आईडी], 3 μm कण)।
- विशिष्ट उपकरण के लिए स्टार्ट-अप प्रक्रियाओं का पालन करके विश्लेषण के लिए उपकरण तैयार करना जारी रखें।
- उपकरण सॉफ्टवेयर में, कॉलम ओवन तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस और प्रवाह दर को 50 μL / min (100% मोबाइल चरण ए) पर सेट करें।
- कॉलम को कम से कम 15 मिनट के लिए मोबाइल चरण ए के साथ बराबर करें।
- नमूने को ऑटोसैंपलर में रखें।
- ProGRP-विशिष्ट, ट्राइप्टिक पेप्टाइड ALGNQQPSWDSESNFK, और इसके आईएस के विश्लेषण के लिए उपकरण विधि तैयार करें।
नोट: कई विधि पैरामीटर उपकरण-विशिष्ट हैं और उपयोग किए गए विशिष्ट उपकरण पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। यहां उपयोग किए गए विधि मापदंडों का विवरण चरण 6.9 से 6.11 में वर्णित है। - एलसी में ढाल कार्यक्रम के लिए, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: प्रवाह दर: 50 μL / समय 0.0 से 3.0 मिनट तक: 100% मोबाइल चरण ए; समय 3.0 से 18.0 मिनट तक: 0% से 50% मोबाइल चरण बी तक रैखिक ढाल चलाएं; समय 18.0 से 18.1 मिनट तक: मोबाइल चरण बी को 50% से 100% तक बढ़ाएं; समय 18.1 से 20.0 मिनट तक: 100% मोबाइल चरण बी; समय 20.0 से 20.1 मिनट तक: मोबाइल चरण बी को 100% से 0% तक कम करें; समय 20.1 से 30 मिनट तक: कॉलम को फिर से संतुलित करने के लिए 100% मोबाइल चरण ए (कम से कम 10 कॉलम वॉल्यूम का उपयोग करें)।
- MS/MS सेटिंग्स के लिए, कुशल आयनीकरण सुनिश्चित करने वाले उपकरण सेटिंग्स का उपयोग करके MS/MS को सकारात्मक मोड में चलाएँ. इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, +4,000 वी के स्प्रे वोल्टेज, 270 डिग्री सेल्सियस के गर्म केशिका तापमान, शीट गैस (5 मनमानी इकाइयों) के रूप में नाइट्रोजन और टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) विखंडन के लिए आर्गन (2 मीटरटोर) का उपयोग करें। यदि उपकरण अनुमति देता है, तो एलसी प्रवाह को एमएस के बजाय रन के पहले 2 मिनट (0-2 मिनट) और अंतिम 1 मिनट (29-30 मिनट) को बर्बाद करने के लिए निर्देशित करें।
- (ए) हस्ताक्षर पेप्टाइड (ALGNQQPSWDSEDSSNFK) के लिए चयनित प्रतिक्रिया निगरानी (SRM) संक्रमण का उपयोग करें: 1,005.45→913.3, 1,005.45→1,028.3,→ और 1,005.45→1,398.5, और (B) IS SIL पेप्टाइड (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13 C 6.009.45→1,009.45→1,009.45→1,009.45→1,009.45.45→ सभी निगरानी किए गए संक्रमणों के लिए अनुकूलित टकराव ऊर्जा (इस प्रोटोकॉल में 35 वी) का उपयोग करें।
- अपने एलसी-एमएस / एमएस सिस्टम के लिए उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके चलाए जाने वाले नमूनों वाला एक अनुक्रम तैयार करें। इंजेक्शन की मात्रा को 10 μL पर सेट करें।
नोट: आवश्यकतानुसार रिक्त नमूने और गुणवत्ता नियंत्रण नमूने जोड़ना सुनिश्चित करें। - अनुक्रम शुरू करने के लिए उपकरण सॉफ़्टवेयर में "रन अनुक्रम" दबाएं।
- आत्मीयता-कैप्चर, प्रोजीआरपी-विशिष्ट, ट्राइप्टिक पेप्टाइड ALGNQQPSWDSEDSSNFK और इसके आईएस एसआईएल पेप्टाइड के चरम क्षेत्र की निगरानी करें।
नोट: हस्ताक्षर पेप्टाइड का चयन और पुष्टि, ALGNQQPSWDSEDSNFK, कहीं और वर्णित है14.
Representative Results
डीएसएस नमूनाकरण और वीएएमएस दोनों का उपयोग करके विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। नमूना विधि में अंतर को छोड़कर, प्रक्रियाएं समान हैं। दो नमूना विधियों का उपयोग करके नमूना लिए गए सीरम की छवियों को चित्रा 2 में देखा जा सकता है।
दोनों नमूना रूप (वीएएमएस और डीएसएस) प्रोजीआरपी युक्त सीरम के नमूने के लिए उपयुक्त हैं। यह चित्रा 3 से देखा जा सकता है जहां प्रोटिओटिपिक पेप्टाइड के एमएस क्रोमैटोग्राम और डीएसएस और वीएएमएस नमूनाकरण से आईएस एसआईएल पेप्टाइड दिखाए गए हैं। इसके अलावा, एमएस क्रोमैटोग्राम एक नियंत्रण नमूने के विश्लेषण के बाद जिसमें 10 μL स्पाइक्ड तरल सीरम नमूना शामिल है, उसी तरह से संसाधित किया जाता है जैसे सूखे नमूने शामिल होते हैं। वीएएमएस निष्कर्षण समाधान की मात्रा के समान मात्रा में पतला किया गया था, ट्रिप्सिन मोतियों का उपयोग करके पाचन के अधीन किया गया था और पेप्टाइड आत्मीयता कैप्चर का उपयोग करके साफ किया गया था।
वीएएमएस और डीएसएस नमूनाकरण (चित्रा 4) की तुलना में, वीएएमएस डीएसएस की तुलना में एक उच्च प्रोटियोटाइपिक पेप्टाइड / आईएस क्षेत्र अनुपात प्रदान करता है। यह इंगित करता है कि डीएसएस (शुद्ध सेल्यूलोज) के लिए उपयोग किए जाने वाले पेपर के लिए लक्ष्य प्रोटीन प्रोजीआरपी का नुकसान हो सकता है। नियंत्रण नमूने की तुलना करते समय, जहां सीरम को आगे के प्रसंस्करण और विश्लेषण (चित्रा 4) से पहले सुखाया नहीं जाता है, यह दिखाया गया है कि वीएएमएस नियंत्रण नमूने (दो पूंछ वाले टी-परीक्षण, पी≤ 0.65) के समान क्षेत्र अनुपात प्रदान करता है, जो नमूना सामग्री को कोई नुकसान नहीं दर्शाता है, जबकि डीएसएस काफी कम क्षेत्र अनुपात (दो पूंछ वाला टी-परीक्षण) प्रदान करता है। पी≤ 0.005), नमूना सामग्री को नुकसान का संकेत देता है।
वीएएमएस का उपयोग करके एक संक्षिप्त मूल्यांकन किया गया था। रैखिकता को 10 से 1,000 एनजी / एमएल (आर2 = 0.9996) से दिखाया गया था, जिसमें 6.7 एनजी / एमएल की पहचान की सीमा (एलओडी, एस / एन = 3) थी। एलओडी को संतोषजनक माना जाता है क्योंकि विश्लेषण 1 मिमी आईडी कॉलम के साथ एक पुराने ट्रिपल क्वाड्रोपोल (2008) पर किया गया था। आईएस सुधार का उपयोग करके 7% और 17% (एन = 3) के बीच आरएसडी के साथ एस / एन > 10 के साथ सभी स्तरों की पुनरावृत्ति को भी संतोषजनक माना गया था।
एफिनिटी कैप्चर पाचन चरण से पहले और बाद में या तो रुचि के प्रोटीन या इसके प्रोटिओटिपिक पेप्टाइड को कैप्चर करके किया जा सकता है। वर्तमान प्रक्रिया पेप्टाइड आत्मीयता कैप्चर का वर्णन करती है। प्रोटीन कैप्चर की तुलना में इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि केवल ब्याज के पेप्टाइड पर कब्जा कर लिया जाता है, और एक और भी कुशल नमूना सफाई प्राप्त की जाती है। यह चित्रा 5 में चित्रित किया गया है, जो पेप्टाइड कैप्चर की तुलना में प्रोटीन कैप्चर के बाद अधिक शोर के साथ अधिक जटिल पूर्ण स्कैन क्रोमैटोग्राम दिखाता है। चित्रा 5 में विश्लेषण किए गए नमूने डीएसएस नमूनाकरण या वीएएमएस का उपयोग करके नमूना नहीं लिए जाते हैं; हालांकि, सीरम नमूना मैट्रिक्स भी है, और आत्मीयता कैप्चर वर्णित प्रक्रिया में पेप्टाइड कैप्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करके किया जाता है।
चित्रा 1: डीएसएस और वीएएमएस नमूनाकरण दोनों का उपयोग करके विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो का अवलोकन। संक्षेप: डीएसएस = सूखे सीरम स्पॉट; वीएएमएस = वॉल्यूमेट्रिक अवशोषक माइक्रोसैंपलिंग; एलसी-एमएस / एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: विभिन्न तरीकों का उपयोग करके नमूना लिए गए सीरम की छवियां। (ए) डीबीएस सेल्यूलोज कार्ड और (बी) वीएएमएस। संक्षेप: डीबीएस = सूखे रक्त स्थान; वीएएमएस = वॉल्यूमेट्रिक अवशोषक माइक्रोसैंपलिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: डीएसएस और वीएएमएस नमूनाकरण के बाद प्रोटिओटिपिक पेप्टाइड और आईएस एसआईएल पेप्टाइड के प्रतिनिधि एमएस क्रोमैटोग्राम, साथ ही साथ निष्कर्षण समाधान में सीधे जोड़े गए एक स्पाइक्ड सीरम नमूने के लिए। एमएस क्रोमैटोग्राम दिखाता है कि 10 μL सीरम नमूने ProGRP के 1.5 μg / mL के साथ स्पाइक किए जाते हैं और (A) VAMS, (B) सेल्यूलोज सैंपलिंग कार्ड (DSS के लिए), या (C) पर सीधे निष्कर्षण बफर (नियंत्रण नमूना) पर लागू होते हैं। 14 एनजी / एमएल आईएस एसआईएल पेप्टाइड के पच्चीस माइक्रोलीटर पेप्टाइड को पेप्टाइड आत्मीयता कैप्चर से पहले सभी नमूनों में जोड़ा गया। संक्षेप: डीएसएस = सूखे सीरम स्पॉट; वीएएमएस = वॉल्यूमेट्रिक अवशोषक माइक्रोसैंपलिंग; एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; प्रोजीआरपी = प्रोगैस्ट्रिन-रिलीजिंग पेप्टाइड; आईएस = आंतरिक मानक; एसआईएल = स्थिर आइसोटोप-लेबल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: सीरम नमूनों के लिए ALGNQQPSWDSEDSSNFK / IS क्षेत्र अनुपात के प्रतिनिधि परिणाम ProGRP के साथ स्पाइक किए गए और VAMS, DSS, या सीधे निष्कर्षण समाधान (नियंत्रण नमूना) पर लागू (10 μL)। प्रत्येक स्थिति के लिए ProGRP की सांद्रता 1.5 μg/mL, n = 4 है; 14 एनजी / एमएल आईएस एसआईएल पेप्टाइड का 25 μL पेप्टाइड आत्मीयता कैप्चर से पहले सभी नमूनों में जोड़ा जाता है। * इंगित करता है कि क्षेत्र अनुपात वीएएमएस (दो पूंछ वाले टी-टेस्ट, पी≤ 0.005) पर लागू नमूनों से काफी अलग है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन ± हैं. संक्षेप: डीएसएस = सूखे सीरम स्पॉट; वीएएमएस = वॉल्यूमेट्रिक अवशोषक माइक्रोसैंपलिंग; प्रोजीआरपी = प्रोगैस्ट्रिन-रिलीजिंग पेप्टाइड; आईएस = आंतरिक मानक; एसआईएल = स्थिर आइसोटोप-लेबल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: बरकरार प्रोटीन निष्कर्षण (नीला) और प्रोटिओटिपिक एपिटोप पेप्टाइड निष्कर्षण (लाल) के बाद बेस पीक क्रोमैटोग्राम (पूर्ण स्कैन ऑर्बिट्राप विश्लेषण) की तुलना। प्रोटिओटिपिक एपिटोप पेप्टाइड (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) के निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम दाईं ओर दिखाए गए हैं। नमूने के रूप में सीरम स्पाइक्ड 150 एनजी एमएल -1 प्रोजीआरपी का उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा Leverns et al.14 से पुनर्मुद्रित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक तालिका एस 1: बफर और समाधान की संरचना का अवलोकन और उन्हें कैसे तैयार किया जाए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल में सूखे माइक्रोसैंपल (डीएसएस और वीएएमएस) से कम-बहुतायत बायोमाकर्स के विश्लेषण में कई महत्वपूर्ण चरणों का संचालन करने के बारे में जानकारी शामिल है, जिसमें ट्रिप्सिन मोती और एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोती की तैयारी शामिल है। पिछले अनुभव के आधार पर, हम हमेशा एंटीबॉडी15 के अभिविन्यास में सुधार के लिए मोती स्थिरीकरण से पहले एसिड के साथ एंटीबॉडी का इलाज करते हैं।
इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों में से एक सबसे उपयुक्त माइक्रोसैंपलिंग प्रारूप का चयन है। सबसे पहले, किसी को यह विचार करना चाहिए कि क्या विचाराधीन विश्लेषण पूरे रक्त से निर्धारित किया जा सकता है, या यदि एकाग्रता रक्त कोशिकाओं से प्रभावित होती है और सीरम या प्लाज्मा में निर्धारित की जानी चाहिए (मॉडल विश्लेषण, प्रोजीआरपी के लिए)।
कागज- और बहुलक-आधारित दोनों दृष्टिकोणों के फायदे और सीमाएं हैं; प्रोजीआरपी के लिए, वीएएमएस नमूनाकर्ता से निष्कर्षण के बाद विश्लेषण वसूली के संबंध में एक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है। हालांकि, यह संभवतः डीएसएस नमूनों के लिए एक अलग निष्कर्षण समाधान का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है। फिर भी, विश्लेषण और नमूना सामग्री के बीच इस संभावित बातचीत को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि इसके परिणामस्वरूप विश्लेषणात्मक भिन्नता और उच्च पहचान सीमा बढ़ सकती है। चूंकि उपयोग किया जाने वाला आईएस एक एसआईएल पेप्टाइड है और पाचन के बाद पहली बार जोड़ा जाता है, आईएस पाचन के बाद के चरणों के लिए सही करता है (उदाहरण के लिए, आत्मीयता निष्कर्षण और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण)। वीएएमएस से निष्कर्षण और पाचन चरण के लिए आईएस सुधार संभव नहीं है।
प्रक्रिया में दो प्रकार के मोतियों का उपयोग किया जाता है: सैंपलर से सीरम नमूने के निष्कर्षण के बाद पाचन के लिए ट्रिप्सिन मोती, और पाचन के बाद प्रोटिओटिक पेप्टाइड को पकड़ने के लिए एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोती। पाचन को तेज करने के अलावा ट्रिप्सिन मोतियों का उपयोग करने का एक प्रमुख कारण, आत्मीयता कैप्चर के दौरान नमूने में अवशिष्ट ट्रिप्सिन गतिविधि को कम करना है। आत्मीयता कैप्चर के दौरान एमएबी के ट्राइप्टिक प्रोटियोलिसिस से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है।
ट्रिप्सिन मोतियों की तैयारी के लिए अगारोस मोतियों का उपयोग किया गया था, जबकि एंटीबॉडी-लेपित मोतियों की तैयारी के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग किया गया था। Agarose मोती चुंबकीय मोतियों की तुलना में कम महंगे होते हैं, लेकिन एक सीमा होती है कि घोल से मोतियों को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है। यह चुंबकीय मोतियों का उपयोग करते समय मोतियों और सतह पर तैरने वाले का पृथक्करण कम कुशल बनाता है। इसके अलावा, अगारोस मोतियों का उपयोग करके वर्कफ़्लो का स्वचालन मुश्किल है। हालांकि, चुंबकीय एनएचएस-सक्रिय मोती उपलब्ध हैं और इसका उपयोग अधिक सुव्यवस्थित और स्वचालित नमूना तैयारी वर्कफ़्लो के लिए किया जा सकता है।
दवाओं और बायोमाकर्स दोनों के जैव विश्लेषण में माइक्रोसैंपलिंग एक महत्वपूर्ण प्रवृत्ति है। वर्तमान दृष्टिकोण के साथ एक चुनौती नमूना मात्रा (10 μL) की सीमित मात्रा है, जो ProGRP (pg / mL-कम ng / mL स्तर) जैसे बहुत कम-बहुतायत विश्लेषणों के निर्धारण में विशेष महत्व का हो सकता है। हालांकि, अत्याधुनिक विश्लेषणात्मक उपकरणों का उपयोग करके इस चुनौती को दरकिनार किया जा सकता है। इन कम-बहुतायत विश्लेषणों के लिए, नमूना तैयार करने का विकल्प महत्वपूर्ण है, और एंटीबॉडी-आधारित आत्मीयता कैप्चर के माध्यम से चयनात्मक नमूना सफाई की सबसे अधिक आवश्यकता होती है। चूंकि पेप्टाइड कैप्चर को प्रोटीन कैप्चर (एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करके) 14 की तुलना में क्लीनर अर्क और कम पहचान सीमा प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, वर्तमान विधि माइक्रोसैंपलिंग के साथ संयोजन में इस दृष्टिकोण पर केंद्रित है। पेप्टाइड कैप्चर दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि आईएस एसआईएल पेप्टाइड आत्मीयता कैप्चर चरण के लिए भी सही है।
इस काम में, पेप्टाइड कैप्चर के लिए एक प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। यह एक फायदा है क्योंकि प्रोटीन को लक्षित करने वाले ऑफ-द-शेल्फ एंटीबॉडी की उपलब्धता प्रोटिओटिक पेप्टाइड्स को लक्षित करने वाले ऑफ-द-शेल्फ एंटीबॉडी की तुलना में अधिक है। हालांकि, एक एंटी-प्रोटीन एंटीबॉडी के लिए एक प्रोटिओटिपिक पेप्टाइड को कुशलतापूर्वक पकड़ने के लिए, प्रोटीन पाचन के बाद एपिटोप को बरकरार रखने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, कई एंटीबॉडी के लिए, सटीक एपिटोप ज्ञात नहीं है, जिससे एंटी-प्रोटीन एंटीबॉडी की खोज थकाऊ हो जाती है। यह पेप्टाइड कैप्चर के लिए लागू उपलब्ध एंटी-प्रोटीन एंटीबॉडी की संख्या को सीमित करता है। वर्णित प्रक्रिया को सीरम को मैट्रिक्स के रूप में और प्रोजीआरपी को लक्ष्य विश्लेषण के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। प्रक्रिया का उद्देश्य अन्य मैट्रिक्स और अन्य लक्ष्य विश्लेषणों पर लागू होना है। प्रोटिओटिपिक पेप्टाइड के आत्मीयता कैप्चर के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटी-प्रोटीन एंटीबॉडी का उपयोग करने के बजाय, कस्टम-निर्मित, एंटी-पेप्टाइड एंटीबॉडी का उपयोग करना भी संभव है। प्रोटीन कैप्चर की तुलना में पेप्टाइड कैप्चर की सफाई दक्षता चित्रा 5 में चित्रित की गई है। चुंबकीय मोतियों के साथ ट्रिप्सिन मोतियों की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले अगारोस मोतियों का आदान-प्रदान करके, प्रक्रिया बाजार पर रोबोट नमूना तैयारी कार्य स्टेशनों के साथ भी संगत होनी चाहिए।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम प्रोजीआरपी मानक और एंटी-प्रोजीआरपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एम 18 प्रदान करने के लिए नॉर्वेजियन रेडियम अस्पताल (ओस्लो यूनिवर्सिटी अस्पताल, ओस्लो, नॉर्वे) में प्रोफेसर एलिजाबेथ पाउस को बहुत स्वीकार करते हैं। प्रकाशन शुल्क को एपोटेकर हैराल्ड कॉनराड थाउलोज लेगेट से अनुदान द्वारा कवर किया गया था। ट्रिन ग्रोनहौग हलवोरसेन और लेओन रूबसेट नेशनल नेटवर्क ऑफ एडवांस्ड प्रोटिओमिक्स इंफ्रास्ट्रक्चर (एनएपीआई) कंसोर्टियम में भागीदार हैं, जिसे नॉर्वे इन्फ्रास्ट्रक्टर-प्रोग्राम की रिसर्च काउंसिल (परियोजना संख्या: 295910) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
References
- Bang, I. B.
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