Summary
Ett protokoll presenteras för bestämning av biomarkörer med låg förekomst från torkade serumprover exemplifierade med biomarkören progastrinfrisättande peptid (ProGRP). Antikroppsbelagda magnetiska pärlor används för selektiv rengöring och anrikning av en proteotypisk ProGRP-peptid. Den fångade peptiden analyseras därefter med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri.
Abstract
Detta dokument presenterar ett protokoll med detaljerade beskrivningar för effektiv provrensning av proteiner med låg förekomst från torkade prover. Detta utförs med hjälp av pärlbaserad proteolys före proteotypisk peptidaffinitetsinfångning och vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) bestämning. Förfarandet kan tillämpas på både konventionella torkade prover med papperskort (t.ex. torkade blodfläckar [DBS] och torkade serumfläckar [DSS]), liksom prover som samlats in med nyare provtagningsmetoder såsom volymetrisk absorberande mikroprovtagning (VAMS). Förutom att beskriva denna procedur presenteras beredningen av både trypsinpärlor och antikroppsbelagda pärlor steg för steg i detta arbete. Fördelarna med den presenterade proceduren är tidseffektiv proteolys med pärlor och selektiv robust rengöring med peptidaffinitetsinfångning. Det nuvarande förfarandet beskriver bestämningen av biomarkören för småcellig lungcancer med låg förekomst (SCLC), progastrinfrisättande peptid (ProGRP), i torkat serum (både DSS och VAMS). Detaljerade procedurer för pärlberedning gör det lättare att implementera arbetsflödet i nya applikationer eller andra laboratorier. Det har visats att resultaten kan vara beroende av provtagningsmaterialet. För det aktuella projektet sågs högre signalintensiteter för prover som samlats in med VAMS jämfört med DSS.
Introduction
Mikroprovtagning har funnits i mer än 100 år sedan Ivar Bang beskrev glukosövervakning från DBS 19131. Efter att Guthrie och Susi introducerade DBS 1963 för bestämning av fenylalanin hos nyfödda2 har tekniken blivit alltmer utbredd. De första rapporterna om DBS för provtagning och lagring av proteiner gjordes i början av 1970-talet3,4, och ett decennium senare, på 1980-talet, hittade vi den första rapporten om masspektrometri (MS) för bestämning av proteiner från DBS5. Trots denna tidiga introduktion var det inte förrän efter sekelskiftet som MS-bestämning av proteiner från DBS och andra mikroprovtagningstekniker blev mer utbredd.
I ett kliniskt sammanhang är det av intresse att bestämma proteiner vid diagnos och uppföljning av sjukdomar, samt för behandlingsövervakning och dopingändamål. Denna riktade bestämning av proteinanalyter av MS från små mängder torkade prover är fortfarande utmanande och kräver ofta omfattande provberedning före analys.
Riktad kvantitativ bestämning av proteiner genom MS utförs vanligen genom att tillämpa bottom-up-metoden, smälta proteinerna till peptider före analys. Denna procedur producerar en myriad av peptider, vilket gör direkt analys av det smälta biologiska provet utmanande. Ett sätt att kringgå detta är att tillämpa ett selektivt affinitetsrensningssteg före MS-analys antingen före eller efter matsmältningen 6,7,8. På detta sätt isoleras proteinet av intresse (eller dess proteotypiska peptid, om affinitetsinfångningssteget utförs efter matsmältningen) selektivt från provmatrisen före analys, vilket ger lägre detektionsgränser9.
Mikroprovtagning med DBS-kort har vissa fördelar jämfört med konventionella blodprover, inklusive låg provvolym, mindre invasiv provtagning och ökad lagringsstabilitet. Provmatrisen är dock annorlunda och kan introducera andra utmaningar i analysen (t.ex. torkad kontra flytande provmatris och kapillärblod kontra serum eller plasma)10,11. En annan utmaning som observeras med DBS är den så kallade hematokriteffekten, där blodhematokriten påverkar provvolymen som bearbetas vidare för analys, och därmed introducerar interindividuell variabilitet i analysen12. Nyare mikroprovtagningsenheter, såsom VAMS som introducerades 201413, tar itu med detta problem genom att samla in en fast volym blod istället för en bloddroppe.
Detta protokoll beskriver en inställning för analys av biomarkörer med låg förekomst från torkade mikroprover. Efter eluering spjälkas det torkade provet och därefter isoleras den proteotypiska peptiden genom peptidaffinitetsinfångning. Modellanalyten är SCLC-biomarkören ProGRP. Eftersom ProGRP inte kan bestämmas på ett tillförlitligt sätt från helblod användes serum som provmatris. Representativa resultat från både DSS och serumprover som samlats in med VAMS visas.
Protocol
Serum från friska blodgivare användes för framställning av standardlösningar. Användningen av serum från friska blodgivare utfördes i strikt överensstämmelse med norsk lag. Informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner. Serumprover analyserades med metoder i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. Det beskrivna protokollet är en modifierad version av metoden som beskrivs i tidigare arbete14. En översikt över sammansättningen av buffertar och lösningar och hur man förbereder dem finns i tilläggstabell S1, medan materialtabellen innehåller material, utrustning och reagens som används i detta protokoll.
1. Beredning av antikroppsbelagda magnetiska pärlor
- Beräkna mängden antikropp som är nödvändig för att förbereda önskat antal pärlor. Använd 1 mg antikropp per 50 mg magnetiska pärlor.
Normalt används 20 μL av en 20 mg/ml strängsuspension per prov i efterföljande experiment (se steg 5.1). - Beräkna den antikroppsvolym som krävs för att förbereda önskat antal pärlor.
OBS: Antikroppsvolymen är beroende av antikroppskoncentrationen och måste beräknas för varje antikropp. - Överför önskad volym antikroppslösning till ett 5 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör. Som ett exempel, om antikroppslösningen innehåller 1 mg / ml antikropp, använd 0,4 ml för att förbereda 1,0 ml pärlsuspension (20 mg pärlor / ml med 1 mg antikropp / 50 mg pärlor).
OBS: Antikropparna ska finnas i en aminfri buffert. Använd lågproteinbindande mikrocentrifugrör för alla lösningar som innehåller proteiner för att undvika analytförlust på grund av adsorption. - Tillsätt en liten magnetisk omrörningsstång till antikroppslösningen och justera pH till 2,5 under kontinuerlig omrörning. Använd en pH-mätare med en mikroelektrod för att mäta pH och justera pH genom stegvis tillsats av definierade volymer på 1,0 M HCl (börja med att tillsätta 10 μL portioner av 1,0 M HCl och minska volymen när pH närmar sig 2,5). Anteckna den totala volymen på 1,0 M HCl som krävs för att justera pH till 2,5.
- Ta bort mikroelektroden och inkubera den surgjorda antikroppen på is på en magnetomrörare i 1 timme.
OBS: Syrabehandling av antikroppen utförs för att främja korrekt orientering av antikropparna på pärlan. Koncentrationen av HCl kan reduceras till 0,5 M eller 0,2 M HCl, beroende på buffertkoncentrationen i antikroppslösningen. - Neutralisera antikroppslösningen. Använd en pH-mätare med en mikroelektrod för att mäta pH och justera pH till 7 genom stegvis tillsats av definierade volymer på 1,0 M NaOH (börja med en 10 μL-portion och minska volymen när pH närmar sig 7). Registrera den totala volymen på 1,0 M NaOH tillsatt.
OBS: Koncentrationen av NaOH bör vara densamma som HCl-koncentrationen som användes i steg 1.4. NaOH är mycket frätande; Använd skyddsutrustning, inklusive handskar och lämpligt ögonskydd. - Beräkna önskad volym tosylaktiverade magnetiska pärlor som ska användas.
OBS: Vanligtvis rekommenderas att använda 20 mg pärlor / ml vid småskalig koppling. Minst 5 mg pärlor ska användas. - Blanda den magnetiska strängsuspensionen noggrant på en virvelblandare och dra upp en volym som innehåller önskad mängd strängsuspension. Som ett exempel, för att förbereda 1 ml pärlsuspension, dra upp en volym innehållande 20 mg pärlor (667 μL om koncentrationen av pärlor är 30 mg / ml).
- Placera pärlupphängningen på ett magnetställ i 1 minut och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna 2x med samma volym typ 1H2O(667 μL om en 30 mg/ml stränglösning används för att bereda 1 ml 20 mg/ml antikroppsbelagda pärlor). Blanda med en virvelblandare efter varje tillsats av tvättlösning och placera på magnetstället i 1 min innan du tar bort supernatanten.
- Lägg till följande till magnetkulorna: syrabehandlad antikropp, 0,5 M boratbuffert (pH 9,5) (1/5 av den totala volymen eftersom den slutliga koncentrationen ska vara 0,1 M; detta motsvarar 0,2 ml för att förbereda 1 ml pärlsuspension) och kopplingsbuffert för antikroppskoppling (för att förbereda 1 ml antikroppsbelagda magnetiska pärlor bör volymen av kopplingsbuffert vara lika med 1 ml - volymen syrabehandlad antikropp - 0,2 ml boratbuffert). Blanda med en virvelblandare.
OBS: Volymen syrabehandlad antikropp är lika med volymen antikroppslösning (0,4 ml vid framställning av 1 ml pärlsuspension med användning av en 1 mg / ml antikroppslösning) + volymen 1,0 M HCl som används för att justera pH till 2,5 + volymen 1,0 M NaOH som används för att justera pH till 7).
OBS: Sammansättningen av 0,5 M boratbuffert (pH 9,5) och kopplingsbuffert för antikroppskoppling finns i kompletterande tabell S1. - Rotera vid omgivningstemperatur över natten med hjälp av en provblandare, helst med ömsesidig rotation och vibration.
- Centrifugera i 10 min vid 239 × g. Placera röret på magneten i 2 minuter och ta bort supernatanten.
- Tvätta pärlorna 2 x 2 timmar och en gång över natten genom att rotera i lagringsbuffert för antikroppspärlor vid omgivningstemperatur med en end-over-end provblandare. Använd samma volym som den totala volymen i steg 1.10. Placera röret på magneten i 1 minut och ta bort supernatanten mellan varje tvätt.
OBS: Sammansättningen av lagringsbuffert för antikroppskulor finns i tilläggstabell S1. - Förvara i önskad buffert (t.ex. samma buffert som i steg 1.13) med önskad lagerkoncentration av pärlor (vanligtvis 20 mg/ml). Förvaras i kylskåp.
2. Beredning av 2 ml trypsin immobiliserade pärlor (20 mg / ml pärlor)
- Tillsätt 20 ml 1 mM HCl till 2 ml NHS-aktiverade agarospärlor för att tvätta pärlorna.
- Blanda och centrifugera vid 2,655 × g i 5 min. Ta bort supernatanten.
- Tillsätt 20 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,8). Blanda med en virvelblandare och centrifugera vid 2 655 × g i 5 min. Ta bort supernatanten.
OBS: Sammansättningen av 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,8) finns i tilläggstabell S1. - Tillsätt 2 ml 20 mg / ml trypsin (upplöst i kallkopplingsbuffert för trypsinkoppling).
OBS: Sammansättningen av kopplingsbuffert för trypsinkoppling finns i kompletterande tabell S1. Förvara bufferten i kylen. - Inkubera i 25 minuter vid 22 °C och 1 100 varv/min med en temperaturkontrollerad blandare. Centrifugera vid 2,655 × g i 5 min. Ta bort supernatanten.
- Tillsätt 2 ml modifieringsbuffert för beredning av trypsinpärlor och inkubera i 20 minuter vid 22 °C och 1 100 varv/min med en temperaturkontrollerad blandare. Centrifugera vid 2,655 × g i 5 min. Ta bort supernatanten.
OBS: Sammansättningen av modifieringsbufferten för beredning av trypsinpärlor finns i kompletterande tabell S1. Förvara bufferten i kylen. - Tillsätt 10 ml blockerande buffert för beredning av trypsinpärlor och inkubera i 10 minuter vid 22 °C och 1 100 varv/min med en temperaturkontrollerad blandare. Centrifugera vid 2,655 × g i 5 min. Ta bort supernatanten.
OBS: Sammansättningen av blockerande buffert för beredning av trypsinpärlor finns i kompletterande tabell S1. Förvara bufferten i kylen. - Tillsätt 2 ml lagringsbuffert, blanda med en virvelblandare och förvara i kylen tills den används.
OBS: Sammansättningen av lagringsbuffert för trypsinpärlor finns i tilläggstabell S1. Förvara bufferten i kylen.
3. DSS/VAMS-provtagning och efterföljande extraktion av torkat serum
- Förbered standarder genom att spika serumet med ProGRP (eller proteinet av intresse) på lämplig nivå. Håll spikvolymen ≤ 1% av den totala volymen.
OBS: Här användes en stamlösning av 295 μg/ml ProGRP i vatten för beredning av spikade serumstandarder. - Blanda standarderna på en virvelblandare.
- Applicera 10 μL serum (spiked standards) på DBS-kort eller låt 10 μL serum samlas in av VAMS (10 μL) enligt tillverkarens riktlinjer. För DSS, se till att platsen ligger inom den prickade cirkeln.
- Låt lufttorka vid rumstemperatur i minst 2 timmar.
- Klipp ut hela fläcken och överför den till ett 2 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör eller ta bort VAMS från hållaren och placera den i ett 2 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 000 μl 100 mM ammoniumbikarbonatlösning (ABC). Extrahera det torkade serumet från fläcken/VAMS i 1 timme vid 22 °C med en temperaturkontrollerad blandare vid 1 000 varv/min.
- Överför extraktet till ett nytt 1,5 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör för tryptisk proteolys.
4. Uppslutning av DSS/VAMS-extrakt
- Använd 30 μL trypsinpärlor (enligt beredning i avsnitt 2) per prov. Överför en volym som innehåller trypsinpärlor för alla prover till ett nytt 1,5 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör, centrifugera vid 2 655 × g i 5 minuter och ta bort supernatanten.
- Tvätta trypsinpärlorna 2x med 1 ml kall 50 mM ABC innan de återsuspenderas i samma volym som pipetterades ut. Centrifugera vid 2,655 × g i 5 minuter och avlägsna supernatanten mellan stegen.
- Tillsätt 30 μL tvättade trypsinpärlor till varje DSS / VAMS-extrakt för att initiera matsmältningen.
- Inkubera i 2 timmar vid 37 °C och 1 000 varv/min med en temperaturkontrollerad blandare eller liknande. Centrifugera vid 2,655 × g i 5 minuter och överför supernatanten (inte pärlorna) till ett nytt 2,0 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 25 μl 14 ng/ml lösning av intern standard (IS) innehållande den stabila isotopmärkta (SIL) peptiden ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2] i 100 mM ABC-lösning.
5. Infångning av proteotypisk ProGRP-peptid med hjälp av antikroppsbelagda magnetiska pärlor
- Använd 20 μl antikroppsbelagda pärlor (20 mg/ml enligt beskrivningen i avsnitt 1) per extraktion. Överför alla antikroppsbelagda pärlor till ett nytt 1,5 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör, placera på magneten i 1 minut och ta bort lagringsbufferten.
- Tvätta de magnetiska antikroppsbelagda pärlorna med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4, innehållande 0,05% polysorbat 20 och 2 x 1 ml PBS innan de återsuspenderas i samma volym som pipetterades ut. Blanda på en virvelblandare och placera på magneten i 1 min mellan buffertbyten.
PBS innehåller 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 och 1,8 mM KH2PO4. Det rekommenderas att bereda lösningen i en 10x koncentration för ökad stabilitet. För sammansättningen av 100 ml 10x PBS, se kompletterande tabell S1. Utspädning av 10x PBS 10x kommer att uppnå ett pH på ~ 7,4. - Tillsätt 20 μL tvättad magnetisk strängsuspension till varje lågproteinbindande mikrocentrifugrör som innehåller ett smält DSS/VAMS-extrakt och IS. Utför immunextraktion i 1 timme med en end-over-end-provblandare vid omgivningstemperatur.
- Tvätta magnetkulorna med följande lösningar: 500 μL PBS med 0,05% (v/v) polysorbat 20, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) och 300 μL 100 mM ABC.
- Efter tillsats av varje tvättlösning, ta bort det lågproteinbindande mikrocentrifugröret med pärlor och tvättlösning från magnetstället och vänd försiktigt tills det är homogent. Placera sedan det lågproteinbindande mikrocentrifugröret på magneten i 30 sekunder, invertera i 30 sekunder och placera på magneten i 1 minut. Ta bort tvättlösningen.
- Snurra ner den återstående suspensionen med en mikrocentrifug. Placera på magneten i 1 min och ta bort den återstående tvättlösningen.
- Tillsätt 15 μl 2 % (v/v) myrsyra av typ 1H2O till varje prov och inkubera i 5 minuter vid22°C och 1 000 varv/min med en temperaturkontrollerad blandare eller liknande för att eluera de fångade peptiderna. Placera på magneten i 1 minut och överför eluatet till ett nytt 1,5 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör. Upprepa en gång och överför det andra eluatet till samma lågproteinbindande mikrocentrifugrör som det första eluatet.
- Tillsätt 20 μL 100 mM ABC till varje eluat (total volym 50 μl).
- Centrifugera (mikrocentrifug) och överför 40 μl av eluatet till mikroinsatser för injektionsflaskor med högtrycksvätskekromatografi (HPLC).
6. Analys av LC-MS/MS
- Använd en mikro LC trippel kvadrupol MS med elektrospray jonisering för hög robusthet.
- Förbered LC-MS/MS-systemet för analysen genom att rensa pumparna med mobil fas A (20 mM FA i H2O och MeCN, 95:5 v/v) och B (20 mM FA iH2Ooch MeCN, 5:95 v/v).
- Lägg till analyskolonnen (C18, 50 mm x 1 mm innerdiameter [ID], 3 μm partiklar).
- Fortsätta att förbereda instrumentet för analys genom att följa inledningsförfarandena för det specifika instrumentet.
- Ställ in kolonnugnens temperatur på 25 °C i instrumentprogramvaran och flödeshastigheten på 50 μl/min (100 % mobil fas A).
- Balansera kolonnen med mobil fas A i minst 15 minuter.
- Placera proverna i autosampler.
- Förbereda instrumentmetoden för analys av den ProGRP-specifika, tryptiska peptiden ALGNQQPSWDSEDSSNFK och dess IS.
OBS: Flera metodparametrar är instrumentspecifika och måste optimeras på det specifika instrument som används. Närmare uppgifter om de metodparametrar som används här beskrivs i steg 6.9 till 6.11. - För gradientprogrammet i LC, använd följande inställningar: flödeshastighet: 50 μL / min; från tid 0,0 till 3,0 min: 100% mobil fas A; från tid 3,0 till 18,0 min: kör en linjär gradient från 0% till 50% mobil fas B; från tid 18,0 till 18,1 min: öka mobil fas B från 50% till 100%; från tid 18,1 till 20,0 min: 100% mobil fas B; från tid 20,0 till 20,1 min: minska mobil fas B från 100% till 0%; från tid 20,1 till 30 min: 100% mobil fas A för att balansera kolumnen (använd minst 10 kolumnvolymer).
- För MS/MS-inställningar, kör MS/MS i positivt läge med hjälp av instrumentinställningar som säkerställer effektiv jonisering. För att följa detta protokoll, använd en sprayspänning på +4 000 V, en uppvärmd kapillärtemperatur på 270 °C, kväve som arkgas (5 godtyckliga enheter) och argon (2 mTorr) för kollisionsinducerad dissociation (CID) fragmentering. Om instrumentet tillåter, rikta LC-flödet till spillo de första 2 minuterna (0-2 min) och de sista 1 minuterna (29-30 min) av körningen, istället för in i MS.
- Använd utvalda reaktionsövervakningsövergångar (SRM) för (A) signaturpeptiden (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1 005,45→913,3, 1 005,45→1 028,3 och 1 005,45→1 398,5 och (B) IS SIL-PEPTIDEN (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1 009,45→921,3, 1 009,45→1 036,3 och 1 009,45→1 406,5. Använd optimerad kollisionsenergi (35 V i detta protokoll) för alla övervakade övergångar.
- Förbered en sekvens som innehåller proverna som ska köras med hjälp av programvaran som är tillgänglig för ditt LC-MS/MS-system. Ställ in injektionsvolymen på 10 μL.
OBS: Se till att lägga till tomma prover och kvalitetskontrollprover efter behov. - Tryck på "Kör sekvens" i instrumentprogramvaran för att starta sekvensen.
- Övervaka toppområdet för den affinitetsinfångade, ProGRP-specifika, tryptiska peptiden ALGNQQPSWDSEDSSNFK och dess IS-SIL-peptid.
OBS: Val och bekräftelse av signaturpeptiden, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, beskrivs på annan plats14.
Representative Results
En översikt över det analytiska arbetsflödet med både DSS-sampling och VAMS visas i figur 1. Med undantag för skillnaderna i provtagningsmetod är förfarandena identiska. Bilder av serum som provtagits med de två provtagningsmetoderna visas i figur 2.
Båda provtagningsformerna (VAMS och DSS) är lämpliga för provtagning av ProGRP-innehållande serum. Detta framgår av figur 3 där MS-kromatogram av den proteotypiska peptiden och IS SIL-peptiden från DSS- och VAMS-provtagning visas. Dessutom ingår MS-kromatogrammet efter analys av ett kontrollprov bestående av 10 μl spikat flytande serumprov som bearbetats på samma sätt som de torkade proverna. Den senare späddes i samma volym som volymen av DSS / VAMS-extraktionslösningen, utsattes för matsmältning med trypsinpärlor och rengjordes med peptidaffinitetsinfångning.
Jämförelse av VAMS- och DSS-provtagning (figur 4) ger VAMS ett högre proteotypiskt peptid / IS-areaförhållande än DSS. Detta indikerar att det kan finnas en förlust av målproteinet ProGRP till papperet som används för DSS (ren cellulosa). Vid jämförelse med ett kontrollprov, där serumet inte torkas före vidare bearbetning och analys (figur 4), visas att VAMS ger liknande areaförhållanden som kontrollprovet (tvåsidigt t-test, s≤ 0,65), vilket indikerar ingen förlust för provtagningsmaterialet, medan DSS ger ett signifikant lägre areaförhållande (tvåsidigt t-test, s≤ 0,005), vilket indikerar förlust för provtagningsmaterialet.
En kort utvärdering utfördes med hjälp av VAMS. Linjäritet visades från 10 till 1 000 ng/ml (R2 = 0,9996), med en detektionsgräns (LOD, S/N = 3) på 6,7 ng/ml. LOD anses tillfredsställande eftersom analysen utfördes på en ganska gammal trippelkvadrupol (2008) med en 1 mm ID-kolumn. Repeterbarheten för alla nivåer med ett S/N > 10 ansågs också tillfredsställande med en RSD mellan 7 % och 17 % (n = 3), med IS-korrigering.
Affinitetsinfångning kan utföras både före och efter matsmältningssteget genom att antingen fånga proteinet av intresse eller dess proteotypiska peptid. Den nuvarande proceduren beskriver peptidaffinitetsinfångning. En fördel med detta tillvägagångssätt jämfört med proteinfångst är att endast peptiden av intresse fångas och en ännu effektivare provrensning uppnås. Detta illustreras i figur 5, som visar ett mer komplext fullscan-kromatogram med mer brus efter proteininfångning jämfört efter peptidinfångning. De prover som analyseras i figur 5 samplas inte med DSS-provtagning eller VAMS. Serum är emellertid också provmatrisen, och affinitetsinfångning utförs med användning av samma antikropp som används för peptidinfångning i den beskrivna proceduren.
Figur 1: Översikt över det analytiska arbetsflödet med både DSS- och VAMS-provtagning. Förkortningar: DSS = torkad serumfläck; VAMS = volymetrisk absorberande mikroprovtagning; LC-MS/MS = vätskekromatografi-tandemmasspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bilder av serum som provtagits med olika metoder . (A) DBS-cellulosakort och (B) VAMS. Förkortningar: DBS = torkad blodfläck; VAMS = volymetrisk absorberande mikroprovtagning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa MS-kromatogram för den proteotypiska peptiden och IS SIL-peptiden efter DSS- och VAMS-provtagning, samt för ett spikat serumprov tillsatt direkt i extraktionslösningen. MS-kromatogrammen visar 10 μL serumprover spetsade med 1,5 μg/ml ProGRP och applicerade på (A) VAMS, (B) cellulosaprovtagningskortet (för DSS) eller (C) direkt på extraktionsbufferten (kontrollprovet). Tjugofem mikroliter 14 ng / ml är Sil-peptid tillsatt till alla prover före peptidaffinitetsinfångning. Förkortningar: DSS = torkad serumfläck; VAMS = volymetrisk absorberande mikroprovtagning; MS = masspektrometri; ProGRP = progastrinfrisättande peptid; IS = intern standard; SIL = stabil isotopmärkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av areaförhållandet ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS för serumprover spetsade med ProGRP och applicerade (10 μL) på VAMS, DSS eller direkt på extraktionslösning (kontrollprov). Koncentrationen av ProGRP är 1,5 μg / ml, n = 4 för varje tillstånd; 25 μL 14 ng/ml IS-SIL-peptid tillsätts till alla prover före peptidaffinitetsinfångning. *indikerar att areaförhållandet skiljer sig signifikant från prover som tillämpas på VAMS (tvåsidigt t-test, p≤ 0,005). Felstaplar är ± standardavvikelse. Förkortningar: DSS = torkad serumfläck; VAMS = volymetrisk absorberande mikroprovtagning; ProGRP = progastrinfrisättande peptid; IS = intern standard; SIL = stabil isotopmärkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av bastoppkromatogram (Orbitrap-analys med full skanning) efter intakt proteinextraktion (blå) och proteotypisk epitoppeptidextraktion (röd). Extraherade jonkromatogram av den proteotypiska epitoppeptiden (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) visas till höger. Serum spetsat med 150 ng ml−1 ProGRP användes som prov. Denna figur är återtryckt från Levernæs et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell S1: En översikt över sammansättningen av buffertar och lösningar och hur man förbereder dem. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det beskrivna protokollet innehåller information om hur man utför flera viktiga steg i analysen av biomarkörer med låg överflöd från torkade mikroprover (DSS och VAMS), inklusive beredning av trypsinpärlor och antikroppsbelagda magnetiska pärlor. Baserat på tidigare erfarenhet behandlar vi alltid antikroppen med syra före pärlimmobilisering för att förbättra orienteringen av antikropparna15.
Ett av de kritiska stegen i denna procedur är valet av det lämpligaste mikroprovtagningsformatet. Först måste man överväga om analyten i fråga kan bestämmas från helblod, eller om koncentrationen påverkas av blodcellerna och måste bestämmas i serum eller plasma (som för modellanalyten, ProGRP).
Både pappers- och polymerbaserade metoder har fördelar och begränsningar; för ProGRP ger VAMS en klar fördel med avseende på analytåtervinning efter extraktion från provtagaren. Detta kan dock förmodligen optimeras med en annan extraktionslösning för DSS-proverna. Denna potentiella interaktion mellan analyten och provtagningsmaterialet är dock viktig att ta hänsyn till eftersom den kan leda till ökad analytisk variation och högre detektionsgränser. Eftersom IS som används är en SIL-peptid och först tillsätts efter matsmältningen, korrigerar IS för stegen efter matsmältningen (t.ex. affinitetsextraktion och LC-MS/MS-analys). IS-korrigering är inte möjlig för extraktion från DSS/VAMS och rötsteget.
Två typer av pärlor används i proceduren: trypsinpärlor för matsmältning efter extraktion av serumprovet från provtagaren och antikroppsbelagda magnetiska pärlor för infångning av den proteotypiska peptiden efter matsmältning. En viktig anledning till att använda trypsinpärlor, förutom att påskynda matsmältningen, är att minimera kvarvarande trypsinaktivitet i provet under affinitetsfångst. Detta är viktigt för att undvika tryptisk proteolys av mAb under affinitetsinfångning.
Agarospärlor användes för beredning av trypsinpärlorna, medan magnetiska pärlor användes för beredning av de antikroppsbelagda pärlorna. Agarospärlor är billigare än magnetiska pärlor men har en begränsning att separering av pärlorna från lösningen kräver centrifugering. Detta gör separationen av pärlor och supernatant mindre effektiv än vid användning av magnetiska pärlor. Dessutom är automatisering av arbetsflödet svårt med agarospärlor. Magnetiska NHS-aktiverade pärlor är dock tillgängliga och kan användas för ett mer strömlinjeformat och automatiserat arbetsflöde för provberedning.
Mikroprovtagning är en viktig trend i bioanalysen av både läkemedel och biomarkörer. En utmaning med det nuvarande tillvägagångssättet är den begränsade mängden provvolym (10 μL), som kan vara av särskild betydelse vid bestämning av analyter med mycket låg förekomst såsom ProGRP (pg / ml låg ng / ml-nivå). Denna utmaning kan dock kringgås med hjälp av toppmodern analysutrustning. För dessa analyter med låg förekomst är valet av provberedning avgörande, och selektiv provrensning genom antikroppsbaserad affinitetsfångst behövs oftast. Eftersom peptidinfångning har visat sig ge renare extrakt och lägre detektionsgränser än proteininfångning (med samma antikropp)14, fokuserar den nuvarande metoden på detta tillvägagångssätt i kombination med mikroprovtagning. En annan fördel med peptidinfångningsmetoden är att IS SIL-peptiden också korrigerar för affinitetsinfångningssteget.
I detta arbete användes en antikropp riktad mot ett protein för peptidinfångning. Detta är en fördel eftersom tillgången på off-the-shelf antikroppar riktade mot proteiner är högre än off-the-shelf antikroppar riktade mot proteotypiska peptider. Men för att en antiproteinantikropp effektivt ska fånga en proteotypisk peptid måste epitopen vara intakt efter proteinförtunning. Dessutom är den exakta epitopen för många antikroppar inte känd, vilket gör sökandet efter en antiproteinantikropp tråkig. Detta begränsar antalet tillgängliga antiproteinantikroppar som är tillämpliga för peptidinfångning. Den beskrivna proceduren demonstreras med serum som matris och ProGRP som målanalyt. Förfarandet är avsett att vara tillämpligt på andra matriser och andra målanalyter. Istället för att använda en kommersiellt tillgänglig antiproteinantikropp för affinitetsinfångning av den proteotypiska peptiden är det möjligt att också använda skräddarsydda antipeptidantikroppar. Rengöringseffektiviteten för peptidinfångning jämfört med proteininfångning illustreras i figur 5. Genom att byta ut agarospärlorna som används för framställning av trypsinpärlor mot magnetiska pärlor bör förfarandet också vara kompatibelt med arbetsstationer för robotprovberedning på marknaden.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar professor Elisabeth Paus vid det norska Radiumsjukhuset (Oslo universitetssjukhus, Oslo, Norge) för att ha tillhandahållit ProGRP-standarden och den monoklonala antikroppen mot ProGRP, M18. Publiceringsavgiften täcktes av ett bidrag från Apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen och Léon Reubsaet är partners i konsortiet National Network of Advanced Proteomics Infrastructure (NAPI), som finansieras av Norges forskningsråds INFRASTRUKTUR-program (projektnummer: 295910).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
References
- Bang, I. B.
- Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
- Laurell, C. B. A screening test for α1-antitrypsin deficiency. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).
- Thielmann, K., Aquino, A. M. Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure. Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).
- Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn). Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).
- Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers. Analytica Chimica Acta. 1182, 338714 (2021).
- Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, Supplement C 132-139 (2017).
- Neubert, H., et al. Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).
- Pan, S., et al. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications. Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).
- Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).
- Londhe, V., Rajadhyaksha, M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102 (2020).
- Denniff, P., Spooner, N. The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).
- Denniff, P., Spooner, N. Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).
- Levernæs, M. C. S., et al. Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies. RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).
- Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase. Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).
