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Biology

Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

Wir beschreiben zwei komplementäre Protokolle zur genauen Bestimmung der S-Phasendauer in S. cerevisiae unter Verwendung von EdU, einem Thymidinanalogon, das in vivo eingebaut und mittels Click-Chemie durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Es ermöglicht die einfache Charakterisierung der Dauer der DNA-Replikation und übersehener Replikationsdefekte in Mutanten.

Abstract

Die eukaryotische DNA-Replikation ist ein stark regulierter Prozess, der sicherstellt, dass der genetische Bauplan einer Zelle vor der Chromosomentrennung korrekt dupliziert wird. Da DNA-Synthesedefekte Chromosomenumlagerungen zugrunde liegen, ist die Überwachung der DNA-Replikation unerlässlich geworden, um die Grundlagen der Genominstabilität zu verstehen. Saccharomyces cerevisiae ist ein klassisches Modell zur Untersuchung der Zellzyklusregulation, aber wichtige DNA-Replikationsparameter, wie der Anteil der Zellen in der S-Phase oder die S-Phasendauer, sind immer noch schwer zu bestimmen. Dieses Protokoll verwendet kurze und ungiftige Impulse von 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU), einem Thymidinanalogon, in technisch hergestellten TK-hENT1-Hefezellen, gefolgt von seiner Detektion durch Click-Reaktion, um die Visualisierung und Quantifizierung der DNA-Replikation mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Diese Methode kann zuvor übersehene Defekte in der S-Phase und im Zellzyklusverlauf von Hefemutanten identifizieren und so die Charakterisierung neuer Akteure ermöglichen, die für die Gewährleistung der Genomstabilität unerlässlich sind.

Introduction

Die Genomstabilität durch mitotische Teilung wird durch die Übertragung eines vollständigen und gleichen Chromosomensatzes auf die beiden produzierten Zellnachkommen gewährleistet. Dies beruht auf der genauen Fertigstellung einer Reihe von Ereignissen, die in einer bestimmten Zeit in jeder Phase des Zellzyklus auftreten. In G 1 werden die Replikationsursprünge nach der Rekrutierung mehrerer Lizenzfaktoren, einschließlich Cdc61, lizenziert. In der S-Phase wird die Duplikation des gesamten Genoms von mehreren aktiven Replikationsursprüngen initiiert und von Replikationsmaschinen durchgeführt, die sich in mikroskopisch sichtbaren Herden sammeln, die als Replikationsfabrikenbezeichnet werden 2. In der M-Phase werden duplizierte Schwesterchromatiden an der mitotischen Spindel befestigt und biorientiert, um ihre Segregation zu den entgegengesetzten Polen der mitotischen Zelle3 zu ermöglichen. Die Regulierung, der ordnungsgemäße Abschluss und die Dauer jeder Phase sind der Schlüssel zur Gewährleistung der Genomstabilität. Tatsächlich führt ein vorzeitiger Ausstieg aus einer dieser Phasen zu einer Instabilität des Genoms. Zum Beispiel wird ein kürzeres G1, das durch Deletion des knospenden Hefe-CDK-Inhibitors Sic1 oder durch die Überexpression vonG1-Cyclinen induziert wird, die nachfolgende S-Phase 4,5,6 verändern. Folglich führen diese Deregulierungen, die mit Replikationsstress verbunden sind oder nicht, zu Chromosomenbrüchen, Umlagerungen und Fehltrennungen 4,5,6. Daher kann die Überwachung der Dauer der S-Phase und allgemeiner der Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus entscheidend sein, um die Defekte zu identifizieren, die in verschiedenen Mutanten und unter verschiedenen Stressbedingungen auftreten.

Eine traditionelle Methode zur Messung der Zellzyklusphasendauer umfasst die einfache DNA-Inhaltsdurchflusszytometrie (Abbildung 1A) und basiert auf einem geeigneten Algorithmus (verfügbar in den meisten Zytometrie-Software), der verwendet wird, um die Population in G1, S und G2 + M-Phasenfraktionen von den 1C- und 2C-Peaks zu trennen. Die Brüche werden dann mit der Populationsverdopplungszeit7 multipliziert. Diese Methode liefert jedoch nur geschätzte Werte, erfordert eine homogene Zellgrößenverteilung innerhalb eines gegebenen Bruchteils und ist nicht auf synchronisierte Kulturen anwendbar. Um die S-Phasendauer in Säugetierzellen zu untersuchen, wurden mehrere Thymidinanaloga entwickelt und weit verbreitet, einschließlich EdU. Ihre Aufnahme aus dem extrazellulären Medium und die Phosphorylierung durch Thymidinkinase (im Folgenden als TK bezeichnet) machen sie für DNA-Polymerasen verfügbar, um sie an Orten der DNA-Synthese (Replikation, Rekombination, Reparatur) einzubauen. Um das Fehlen des TK-Gens in Saccharomyces cerevisiae-Zellen zu umgehen, wurden Hefestämme so entwickelt, dass sie eine stabile und konstitutive Expression des Herpes-simplex-Virus TK8 und des humanen equilibrativen Nukleosidtransporters (hENT1)9 ermöglichen. Einmal in die DNA eingebaut, wird EdU durch die selektive Click-Reaktion nachgewiesen, die seinen Alkinanteil chemisch an azidmodifizierte Fluorochrome10 koppelt.

Dieser Artikel bietet zwei optimierte umfassende Protokolle zur Pulsmarkierung asynchroner und synchroner TK-hENT1-Zellen mit EdU, um die Dauer und Dynamik der DNA-Replikation sowie die Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie präzise zu visualisieren und zu messen.

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Protocol

1. Zellkultur von S. cerevisiae

HINWEIS: Die verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.

HINWEIS: Die S-Phasendauer kann auf verschiedene Arten überwacht werden. Je nach Fragestellung können die Zellen nach demG1-Arrest asynchron oder synchron gezüchtet werden.

  1. Aus asynchron wachsenden S. cerevisiae-Zellen
    HINWEIS: Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des Prozentsatzes der Zellen in der S-Phase in einer asynchron wachsenden Zellpopulation. Durch Bestimmung der Verdopplungszeit kann die Dauer der S-Phase (und der anderen Phasen) extrapoliert werden.
    1. Impfung von S. cerevisiae-Zellen in 10 ml synthetischem vollständigem (SC) Medium bei niedriger Zellkonzentration (5 × 104 Zellen/ml) für eine Nachtkultur bei 30 °C mit orbitaler Bewegung bei 130 U/min.
      HINWEIS: Die Konzentration wird mit einem Zellzähler gemessen. Um die Verdopplungszeiten effizient zu berechnen, wird empfohlen, die Kultur aus einer Nachtkultur zu impfen, die sich noch in der exponentiellen Phase befindet (d.h. idealerweise unter 2 × 107 Zellen / ml). Das Züchten von Zellen in Rich Medium (YPD) wird nicht empfohlen, da der EdU-Nachweis nicht effizient ist.
    2. Am nächsten Tag werden die Zellen in 20 ml frischem SC-Medium mit der Endkonzentration von 5 × 105 Zellen/ml verdünnt.
    3. Kultur der Zellen bei 30 °C in einem Schüttelwasserbad mit horizontalem Schütteln bei 120 U/min.
    4. Messen Sie die Zellkonzentration jede Stunde, bis sie 1 × 107 Zellen / ml erreicht.
      HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht eine grafische Darstellung des Anstiegs der Zellkonzentration im Laufe der Zeit. Die Formel zur Berechnung der Verdopplungszeiten wird in der Legende von Tabelle 2 erläutert.
    5. Fahren Sie parallel zu Schritt 2 für die EdU-Markierung fort, wenn die Zellkonzentration etwa 2 × 10 6-5 × 106 Zellen / ml beträgt.
  2. Aus G 1-synchronisierten S. cerevisiae-Zellen
    HINWEIS: Mit dieser Methode kann mittels Durchflusszytometrie und/oder Mikroskopieanalysen bestimmt werden, wann die S-Phase beginnt und endet.
    1. Impfung von S. cerevisiae-Zellen in 10 ml SC-Medium bei niedriger Zellkonzentration (5 × 104 Zellen/ml) für eine Nachtkultur bei 30 °C mit orbitaler Bewegung bei 130 U/min.
      HINWEIS: Siehe die Hinweise nach Schritt 1.1.1.
    2. Am nächsten Tag werden die Zellen in 20 ml frischem SC-Medium bei einer Endkonzentration von 2 × 10 6-3 × 106 Zellen/ml verdünnt.
    3. Fügen Sie 40 μL 1 mg/ml α-Faktor in Wasser verdünnt hinzu.
    4. Kultur der Zellen bei 30 °C mit orbitalem Rühren bei 130 U/min für 1 h.
    5. Fügen Sie erneut 40 μL 1 mg/ml α-Faktor in Wasser verdünnt hinzu.
    6. Kultur der Zellen bei 30 °C mit orbitalem Rühren bei 130 U/min für 1 h.
    7. Visualisieren Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um denG1-Arrest zu überwachen. Fahren Sie fort, wenn mehr als 90% der Zellen einen Shmoo aufweisen und die anderen abgerundete, nicht knospnete Zellen sind.
      HINWEIS: Je nach verwendetem Hintergrund wird empfohlen, die Zellen vor der Shmoo-Visualisierung zu beschallen. Für den W303-Hintergrund 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
    8. 3 min bei 1.500 × g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    9. Resuspendieren Sie die Zellen in 20 ml SC-Medium.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.8-1.2.9 einmal.
      HINWEIS: Der α-Faktor wird mit diesen Schritten weggespült und die Zellen werden im Zellzyklus freigesetzt. Alternativ kann der α-Faktor weggespült werden, indem die Hefezellen mit einem 1,2-μm-Nitrozellulosefilter unter Verwendung eines Trichters auf einem Seitenarmkolben gefiltert werden, der mit einer Vakuumpumpe verbunden ist.
    11. Sammeln Sie 2x alle 5 Minuten 1 ml Zellen und fahren Sie mit Schritt 2 für die EdU-Kennzeichnung fort.
      HINWEIS: Markieren Sie die Zellen von nur einem der beiden Röhrchen mit EdU pulsierend. Die nicht pulsmarkierten Zellen werden verwendet, um EdU-positive von EdU-negativen Zellen auf einem bivariaten Propidiumiodid (PI)-EdU-Graphen zu unterscheiden.
    12. Fügen Sie 400 μL 1 mg/ml α-Faktor in Wasser 30 min nach der Freisetzung hinzu.
      HINWEIS: Diese hohe Dosis des α-Faktors ist erforderlich, um die Zellen in derG1-Phase des nächsten Zellzyklus zu stoppen und zu verhindern, dass die Zellen wieder in die nachfolgende S-Phase eintreten.

2. EdU-Kennzeichnung

  1. 1 ml Zellkultur in ein 2,0 ml Mikrofugenröhrchen mit 1 μL 10 mM EdU überführen. Gut mischen durch Inversion.
    HINWEIS: Um die EdU-positiven Zellen von den EdU-negativen Zellen auf einem bivariaten PI-EdU-FACS zu unterscheiden, überführen Sie weitere 1 ml Zellkultur in ein 2,0-ml-Mikrofugenröhrchen, das 1 μL DMSO enthält.
  2. 3-5 min bei 30 °C unter Rühren in einem schüttelnden Wasserbad inkubieren.
    HINWEIS: Drei Minuten sind ausreichend für die EdU-Detektion mit einem Mikroskop; 5 min sind für eine optimale EdU-Detektion auf einem Durchflusszytometer erforderlich.
  3. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 μL 100% Ethanol.
    1. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 μL 20% Paraformaldehyd, wenn eine Zellgrößenmessung erforderlich ist.
      HINWEIS: Wenn die Kernarchitektur der mitotischen Zellen für weitere Analysen nach der Klickreaktion intakt gehalten werden soll, empfehlen wir, Zellen mit 2% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) zu fixieren, anstatt die Zellen auf Eis zu legen, da letzteres eine Mikrotubuli-Depolymerisation verursacht.
    2. Lassen Sie die Zellen 20 Minuten bei RT unter leichtem Rühren auf einer Wippe mit variabler Geschwindigkeit bei 20 Neigungen/min stehen, um die Zellen vor der Zugabe von 100 μL 100% Ethanol zu fixieren.

3. Zellfixierung und Permeabilisierung

  1. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
  2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL 70% Ethanol. Gut durch Wirbeln mischen.
  3. Lassen Sie für ≥1 h bei RT bei 20 Neigungen / min auf einer Wippe mit variabler Geschwindigkeit, um die Zellen zu permeabilisieren.
    HINWEIS: Zellen, die in SC-Medium gezüchtet werden, pelletieren nicht gut, da sie dazu neigen, an den Mikrofugenwänden zu haften. Die Zugabe von Ethanol verbessert die Pelletierung und reduziert den Zellverlust. Die Zellen können über Nacht bei 4 °C oder über einen längeren Zeitraum bei −20 °C gelagert werden.
  4. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
  5. Waschen Sie die Zellen 2x mit 500 μL 10% Ethanol in PBS.
    HINWEIS: Die Waschungen sind entscheidend, um nicht inkorporiertes EdU aus den Zellen zu entfernen.

4. Click-it-Reaktion

  1. Für die zytometrische Analyse
    1. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    2. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μL PBS, das 0,1 mg/ml RNase A und 0,2 mg/ml Proteinase K enthält.
    3. Inkubieren für 1-2 h bei 50 °C mit gelegentlichem Schütteln (oder über Nacht bei 37 °C).
    4. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    5. Waschen Sie die Zellen mit 500 μL PBS.
    6. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS + 1% Rinderserumalbumin (BSA). Inkubieren Sie für 30 min bei RT.
      HINWEIS: Längere Zeiten sind nicht notwendig und beeinträchtigen sogar die Effizienz von Klickreaktionen.
    8. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    9. Resuspendieren Sie das Pellet in 300 μL PBS + 1% BSA.
    10. Verteilen Sie die Zellen auf zwei Röhrchen: 200 μL in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Click-Reaktion und 100 μL in einem weiteren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Sytox Green-Färbung.
    11. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    12. Für Sytox Green Färbung
      HINWEIS: Wir empfehlen dringend, ein Aliquot für Sytox Green Färbung (ohne Klick) zu nehmen, um qualitativ hochwertige DNA-Referenzprofile zu erhalten. Tatsächlich löscht die Click-Reaktion die Interkalantenfluoreszenz, einschließlich der Sytoxgrün- und PI-Fluoreszenz, stark. Folglich kann die Klickreaktion das Lesen des DNA-Inhalts verzerren.
      1. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μL PBS.
      2. 10-30 μL (abhängig von der Zellkonzentration) in ein Durchflusszytometerröhrchen mit 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 0,5 μM Sytox Green überführen.
      3. Sonicate 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
      4. Im Dunkeln lassen, bis die Proben auf einem Durchflusszytometer verarbeitet werden.
        HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium für einige Tage bei 4 °C gehalten werden.
    13. Für die Klickreaktion
      1. Bereiten Sie einen frischen Azidfarbstoffpuffer vor, indem Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge mischen (Menge für ein Röhrchen): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 MCuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5-Azid und 2 μL 1 M Ascorbinsäure.
        HINWEIS: Es ist möglich, eine Mastermischung des Azidfarbstoffpuffers herzustellen. Die Reagenzien müssen in der gleichen Reihenfolge wie oben beschrieben gemischt werden.
      2. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 40 μL frisch hergestellter Azidfarbstoffmischung. Bei RT im Dunkeln 60 min inkubieren.
      3. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
      4. Waschen Sie die Zellen 3x mit 300 μL 10% Ethanol in PBS.
        HINWEIS: Die Waschungen sind entscheidend, um das gesamte lösliche EdU-Cy5-Azid zu entfernen.
      5. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL von 50 μg / ml PI in PBS. 10 min im Dunkeln stehen lassen.
      6. 10-30 μL der Zellsuspension (abhängig von der Zellkonzentration) in ein Durchflusszytometerröhrchen mit 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 überführen.
      7. Sonicate 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
      8. Im Dunkeln lassen, bis die Proben auf einem Zytometer verarbeitet werden.
        HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium für einige Tage bei 4 °C gehalten werden.
    14. Lesen Sie die Sytox Green-Proben mit einem blauen Anregungslaser bei 488 nm und einem 530/30 BP-Filter ab. Typische Ergebnisse finden Sie in Abbildung 1A . Lesen Sie die bivariaten PI-EdU-Proben in einem Punktdiagramm mit einem blauen Anregungslaser bei 488 nm und einem 615/20 BP-Filter für den PI (x-Achse) und einem roten Anregungslaser bei 640 nm und einem 660/20 BP-Filter (y-Achse). Typische Ergebnisse finden Sie in Abbildung 1B .
      HINWEIS: Abbildung 1C zeigt das typische bivariate PI-EdU-FACS-Ergebnis für EdU-negative Zellen. Es ermöglicht die Unterscheidung der EdU-negativen Zellen von den EdU-positiven Zellen.
  2. Für die Mikroskopie-Analyse
    1. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    2. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μL PBS + 1% BSA. Inkubieren Sie für 30 min bei RT.
    3. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    4. Bereiten Sie einen frischen Azidfarbstoffpuffer vor, indem Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge mischen (Menge für ein Röhrchen): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 MCuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530-Azid, 2 μL 1 M Ascorbinsäure.
      HINWEIS: Eine Mastermischung des Azidfarbstoffpuffers kann frisch hergestellt werden, indem die Reagenzien in der oben genannten Reihenfolge gemischt werden.
    5. Resuspendieren Sie das Pellet mit 40 μL frisch hergestelltem Azidfarbstoffpuffer. Bei RT im Dunkeln 60 min inkubieren.
    6. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    7. Waschen Sie die Zellen 2x mit 300 μL 10% Ethanol in PBS.
      HINWEIS: Die Waschungen sind entscheidend, um alle löslichen Dy-530-Azide zu entfernen.
    8. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    9. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 0,5 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in PBS. 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen lassen.
    10. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    11. Mit 300 μL PBS waschen, um überschüssiges DAPI zu entfernen.
    12. Pelletieren Sie die Zellen für 2 min bei 10.000 × g in einer Mikrofuge. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
    13. Resuspendieren Sie das Pellet mit 10-50 μL PBS in Abhängigkeit von der Zellkonzentration.
    14. Sonicate 2x, jeweils für 2 s, bei einer Amplitude von 40-50.
      HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium für einige Tage bei 4 °C gehalten werden.
    15. 1,7 μL der Zellen auf einen Glasobjektträger pipettieren und mit einem sauberen Deckglas abdecken.
    16. Sofort unter einem Fluoreszenzmikroskop mit DAPI und TexasRed oder Cy3 Filtern beobachten.

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Representative Results

Zur Bestimmung der S-Phasendauer und allgemeiner der Dauer vonG1 undG2+M (Protokollschritt 1.1) wurden S. cerevisiae W303 Wildtypzellen (WT, Tabelle 1) asynchron in SC-Medium für 7 h gezüchtet. Stündlich wurde die Zellkonzentration überwacht, um die Verdopplungszeit zu bestimmen (Abbildung 2B). Unter diesen Wachstumsbedingungen betrug die berechnete Verdopplungszeit 120 min ± 13 min bei 25 °C (Tabelle 2). Wenn sich die Zellen in der exponentiellen Phase befanden (2 × 10 6-5 × 106 Zellen / ml), wurde ein Aliquot von Zellen mit EdU (10 μM) für 5 min pulsmarkiert, um die Zellen in der S-Phase herauszufiltern und den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die sich in den Phasen G1, S und G2 + M befanden. Drei Zellpopulationen wurden in einer bivariaten EdU-PI-Zytometeranalyse beobachtet (Abbildung 1B). Die Unterscheidung zwischen den EdU-negativen und EdU-positiven Populationen erfolgte mittels eines Kontrollexperiments, bei dem die Zellen nicht mit EdU pulsmarkiert wurden, sondern die Click-Reaktion durchgeführt wurde (Abbildung 1C). Die beiden EdU-negativen Populationen im unteren linken und unteren rechten Bereich, die sich in der PI-Intensität um das Zweifache unterschieden, entsprachen G1 bzw. G2 + M (Abbildung 1B,C). Daher entsprach die obere Population (mit einer Intensität >1× 10 4-2 × 104) den EdU-positiven Zellen, die sich zum Zeitpunkt des Pulses in der S-Phase befanden (Abbildung 1B). So befanden sich 27% ± 5% der Zellpopulation in derG1-Phase, 29% ± 3% in der S-Phase und 44% ± 2% in G2 + M. Da die Verdopplungszeit unter diesen Bedingungen 120 min ± 13 min betrug, extrapolierten wir, dass die Phasen G1, S und G 2 + M 32 min ± 4 min, 35 min ± 6 min bzw. 53 min ± 7 min bei 25 °C dauerten (Tabelle2 und Tabelle 3).

Als nächstes wollten wir diese Methode validieren und zeigen, dass sie empfindlich genug ist, um Mutanten mit DNA-Replikationsdefekten zu identifizieren, die bisher übersehen wurden. Wir argumentierten, dass einstellbare Funktionsverlust-Allele der an der DNA-Replikation beteiligten Faktoren ideale Validierungskontrollen wären. Daher verwendeten wir einen Hefestamm, der eine temperaturempfindliche cdc6-1-Mutante enthielt (Tabelle 1)11. Cdc6 ist ein wesentlicher Lizenzfaktor, der in späten M und G1 exprimiert wird, um Präreplikationskomplexe (preRC) an ORC-gebundenen Chromosomenstellen zusammenzusetzen, die später als Replikationsursprünge verwendet werden können. Daher sollte bei einer freizügigen Temperatur die S-Phasendauer der des WT entsprechen, während bei einer restriktiven Temperatur keine DNA-Replikation stattfinden sollte, da kein Ursprung lizenziert ist12. Bei einer semi-permissiven Temperatur, bei der weniger Ursprünge lizenziert sind, aber es gibt genug, um Zelllebensfähigkeit zu verleihen (unsere unveröffentlichten Daten; Barba Tena et al., in Vorbereitung), erwarteten wir unterschiedliche Dauern für jede Phase. Wie erwartet, basierend auf Falltests, wuchsen die cdc6-1-Zellen bei einer permissiven Temperatur (d.h. 25 °C, Abbildung 2A) genauso wie WT-Zellen und zeigten die gleiche Verdopplungszeit (Abbildung 2B und Tabelle 2), waren aber bei oder über 34 °C tot (Abbildung 2A). Interessant ist, dass cdc6-1 bei einer semipermissiven Temperatur (d. h. 28 °C) lebensfähig war (28 °C, Abbildung 2A). Die Verdopplungszeit war jedoch länger als bei WT (Abbildung 2B und Tabelle 2), und die Dauer jeder Phase war unterschiedlich. Tatsächlich war in cdc6-1 G 1 etwas kürzer (12 min ±1 min vs. 16 min ± 2 min), während die S-Phase leicht verlängert war (34 min ± 4 min vs. 29 min ± 5 min) und die G2 + M-Phase signifikant länger war (77 min ± 4 min vs. 45 min ± 3 min) im Vergleich zu WT (Abbildung 2C, D und Tabelle 3). Die S-Phase war überraschenderweise nicht sehr ausgedehnt, aber die mittlere Intensität des EdU-Signals wurde um 25% verringert (Abbildung 2C, D), was mit einer S-Phase übereinstimmt, die von weniger Ursprüngen initiiert wurde. Während die EdU-positiven WT-Zellen homogen zwischen der frühen (S1) und der späten S-Phase (S2) verteilt waren (Abbildung 2C, ergänzende Abbildung S1A, frühe [S1] und späte S[S2]-Phase, begrenzt mit einer vertikalen gestrichelten Linie im oberen Gate), akkumulierten 65% der EdU-positiven cdc6-1-Zellen in der späten S-Phase (Abbildung 2D, ergänzende Abbildung S1B). Es gab nicht einmal eine klare Unterscheidung zwischen den S- und G2 + M-Populationen (Abbildung 2D), was darauf hindeutet, dass die Zellen Schwierigkeiten hatten, die S-Phase abzuschließen, bevor sie in dieG2-Phase eintraten. Daher ist diese Methode geeignet und empfindlich, um Mutanten mit Defekten in der S-Phase (Dauer und/oder Verteilung) und in der Zellzyklusphase zu identifizieren.

Es wurde eine ergänzende Methode entwickelt, um zu bestimmen, wann Zellen ihre DNA-Replikation beginnen und beenden und die S-Phasendauer mit synchronisierten Zellen abzuschätzen (Protokollschritt 1.2). Zu diesem Zweck wurden unter Verwendung von α-Faktor mit synchronisierten Zellen in G1 Zellen in SC-Medium freigesetzt und alle 5 Minuten gesammelt. Die Dauer der S-Phase kann etwa 25 Minuten betragen, basierend auf dem Zeitpunkt, zu dem sich der DNA-Gehalt auf dem Sytox Green-Durchflusszytometerprofil von 1C auf 2C geändert hat (Abbildung 3A). Diese Schätzung hängt jedoch davon ab, wann ein signifikanter Zellanteil der Population genügend Sytoxgrün eingebaut hat, um im FACS-Profil zu sehen. Die frühen und späten Replikationsereignisse können mit dieser Methode nicht erkannt werden. Um genau zu definieren, wann die S-Phase beginnt und endet und wie lange sie dauert, wurden S-Phase-Zellen aus einem Aliquot von Zellen bei der Pulsmarkierung mit EdU (10 μM) für 5 min alle 5 min nach derG1-Freisetzung ausgewählt. Wie erwartet, befanden sich innerhalb der ersten 10 Minuten nach der Freisetzung alle Zellen im unteren linken Bereich (d.h. in G1, Abbildung 3B, Zusatzfigur S2). Fünfzehn Minuten nach der Freisetzung wurde bereits ein Bruchteil von EdU-positiven Zellen nachgewiesen (vergleichen Sie die ersten beiden Reihen in der ergänzenden Abbildung S2 und der ergänzenden Abbildung S3, EdU-behandelte bzw. EdU-freie Zellen), was darauf hindeutet, dass die S-Phase begonnen hatte (Abbildung 3C). Der Verlauf durch die S-Phase wurde durch die Zellwolke gesehen, die sich zuerst nach oben und dann nach rechts im bivariaten PI-EdU-Diagramm bewegte (Abbildung 3D-F). Schließlich, 35 Minuten nach der Freisetzung, war ein Bruchteil der Zellen EdU-negativ, aber mit der doppelten Menge an DNA, was darauf hindeutet, dass diese Zellen die S-Phase abgeschlossen hatten und sich in der G2 + M-Phase befanden (Abbildung 3G). Somit dauert die S-Phase unter diesen Bedingungen 20 min. Trotz der hohen Synchronität, die mit der Überlagerung des mit Sytox Green nachgewiesenen DNA-Gehalts beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die S-Phase in der gesamten Population 40 Minuten nach der Freisetzung vorbei war, zeigten die bivariaten Analysen, dass einige Zellen die S-Phase 60 Minuten nach der Freisetzung beendeten und dass die S-Phase für die gesamte Population 65 Minuten nach der Freisetzung abgeschlossen war (Abbildung 3H, I und ergänzende Abbildung S2).

Zusätzlich können die S-Phase und die DNA-Synthese mikroskopisch überwacht werden. Von jedem aktivierten Replikationsursprung aus wird die DNA-Synthese von zwei angebundenen Replisomen durchgeführt, die einen nuklearen Replikationsfokus bilden, dem eine Mikroskopie folgen kann, indem eine markierte Version eines Replikationsfaktor- und/oder Operatorarrays und ihr entsprechender Repressor mit einem fluoreszierenden Protein 2,13 abgebildet werden. Alternativ kann die DNA-Synthese mikroskopisch unter Verwendung von Thymidinanaloga14,15 nachgewiesen werden. Wir haben EdU verwendet, um die subnuklearen DNA-Regionen zu überwachen, die einer DNA-Synthese unterzogen werden. Dazu pulsierten wir asynchrone WT- und cdc6-1-Zellen mit EdU (10 μM) für 3 min bei 28 °C und bildeten sie nach der Click-Reaktion ab. Wir hatten erwartet, Variationen in den EdU-Signalintensitäten in Abhängigkeit von der DNA-Syntheserate und der Zellprogression im Zellzyklus während des 3-minütigen EdU-Pulses zu erkennen (dh Zellen, die die gesamten 3 Minuten in der S-Phase verbringen, zeigen ein stärkeres Signal als diejenigen, die während des Pulses in die S-Phase eintreten oder diese verlassen). Dementsprechend zeigten WT-S-Phasenzellen ein EdU-Signal in ihrem Kern, das in der Intensität variierte (Abbildung 4A). Die S-Phasendauer kann aus dieser Analyse leicht extrapoliert werden. Tatsächlich wurde aus zwei biologischen Replikaten (mindestens 150 Zellen wurden gezählt) festgestellt, dass 34% ± 3% bzw. 38% ± 3% der WT- bzw. cdc6-1-Zellen EdU-positiv waren. Da unter diesen Wachstumsbedingungen die Verdopplungszeit 90 min bzw. 123 min für die WT- bzw. cdc6-1-Zellen betrug (Tabelle 2), extrapolierten wir, dass die S-Phase 31 min bzw. 47 min dauerte. Das erste Ergebnis stimmt mit dem Ergebnis unserer FACS-Analysen überein (Tabelle 3), was darauf hindeutet, dass der Nachweis von EdU-positiven Zellen durch Mikroskopie die Bestimmung der S-Phasendauer ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass letztere höher ist als die aus unseren FACS-Analysen extrapolierte S-Phasendauer, da es keine klare Unterscheidung zwischen den S- und G2 + M-Populationen gab (Abbildung 2D). Die EdU-Herde wurden in den WT-Zellen leicht beobachtet (Abbildung 4B), waren aber in den cdc6-1-Zellen dunkler und weniger (Abbildung 4C). Um auszuschließen, dass die EdU-Signalintensitätsdifferenz zwischen den WT- und cdc6-1-Zellen vom Schritt der S-Phase abhängt, wurde die Intensität aus synchronisierten Zellen quantifiziert. Wie erwartet, war die mittlere EdU-Signalintensität in den cdc6-1-Zellen dreimal niedriger (Abbildung 4D), was mit der DNA-Replikation übereinstimmt, die von weniger Replikationsursprüngen initiiert wurde. Das EdU-Signal war auf den Kern beschränkt, kolokalisierte mit einem starken DAPI-Signal und war in kugelförmigen Mustern organisiert, die mit der Organisation der DNA-Replikation in Kernregionen oder Replikationsfabriken übereinstimmten. Wichtig ist, dass EdU nur in unknospten oder kleinknospigen Zellen nachgewiesen wurde und nie in Zellen mit großen Knospen vorhanden war, was darauf hindeutet, dass die WT-Hefezellen die Replikation abgeschlossen hatten, als sie in die Mitose eintraten. Diese Methode ist daher empfindlich für die Visualisierung der DNA-Replikation mit hoher räumlicher Auflösung sowie für den Nachweis und die Quantifizierung leichter DNA-Replikationsdefekte.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative FACS-Analysen. (A) Repräsentative Sytox Green FACS-Analysen für WT-Zellen, die bei 25 °C gezüchtet wurden. (B,C) Repräsentative EdU-PI bivariate FACS-Analysen für WT-Zellen, die bei 25 °C gezüchtet und pulsmarkiert für 5 min mit EdU (10 μM) oder 1 μL DMSO gezüchtet wurden. Die Polygone waren in beiden Analysen gleich. C wurde verwendet, um die EdU-negativen von den EdU-positiven Zellen abzugrenzen (im Allgemeinen wird der Grenzwert auf eine Intensität festgelegt >1× 10 4-2 × 104). Das obere Polygongatter grenzte die EdU-positiven Zellen (S-Phasenfraktion) ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Anteil der Zellen in den Zellzyklusphasen G 1, S und G2 + M in asynchronen Zellpopulationen. (A) WT- und cdc6-1-Stämme wurden in seriellen fünffachen Verdünnungen auf reichem Medium entdeckt und entweder bei 25 °C, 28 °C oder 34 °C gezüchtet. (B) Verdopplungszeit der Population. Asynchrone WT- und cdc6-1-Zellen wurden bei 25 °C oder 28 °C gezüchtet, und die Zellkonzentration wurde jede Stunde für 7 h gemessen. (C,D) Bivariate EdU-PI-FACS-Analyse von WT- und cdc6-1-Zellen, die bei 28 °C gezüchtet und für 5 min mit EdU (10 μM) pulsmarkiert wurden. Multipliziert man die Verdopplungszeit der Population mit dem S-Phasenanteil, erhält man die S-Phasendauer. Die mittleren Intensitäten der EdU-positiven und EdU-negativen Zellen wurden als Mittelwert der Intensität jedes Wertes im entsprechenden Polygon berechnet. Die mittleren Intensitäten der WT- und cdc6-1-EdU-negativen Zellen (5.077 bzw. 4.454) wurden auf 1 normalisiert. Die mittleren Intensitäten der WT- und cdc6-1-EdU-positiven Zellen (52.604 bzw. 36.141) wurden durch den Normalisierungsfaktor dividiert, der für jeden Stamm verwendet wurde. Die erhaltenen Werte waren 10,4 bzw. 8,1 (d.h. ein Rückgang um 25%, wie im Text erwähnt). Abkürzungen: WT = Wildtyp; EdU = 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; PI = Propidiumiodid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Bestimmung der S-Phasendauer auf synchronisierten Zellen. (A) Zeitverlaufsanalyse des DNA-Gehalts von WT-Zellen nach α-Faktor-Freisetzung bei 28 °C. Die angegebene Zeit berücksichtigt die Dauer des EdU-Impulses (5 min). (B-I) EdU-PI bivariate FACS-Analysen für synchronisierte WT-Zellen pulsmarkiert für 5 min mit EdU (10 μM) und gesammelt zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Freisetzung aus demG1-Arrest. Abkürzungen: WT = Wildtyp; EdU = 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; PI = Propidiumiodid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: EdU-Detektion und Quantifizierung mittels Mikroskopie. Asynchrone WT- und cdc6-1-Stämme wurden für 2 h bei 28 °C gezüchtet und dann für 3 min mit EdU (10 μM) pulsmarkiert und mittels Weitfeldmikroskopie unter Verwendung geeigneter Anregungs-/Emissionsfilter abgebildet. (A) Repräsentative Bilder aus der Weitfeldmikroskopie für WT und (B,C) einzelne Zellen für WT und cdc6-1, visualisiert durch DIC und gefärbt mit DAPI oder für EdU, wie angegeben. Die Maßstabsbalken in (A) und (B,C) betragen 10 μm bzw. 2 μm. (D) EdU-Intensitätsmessungen an synchronen WT- und cdc6-1-Zellen, die bei 28 °C 30 min nach der Freisetzung aus demG1-Arrest gezüchtet wurden. Die Grafik stellt das Pooling von drei biologischen Replikaten dar (mindestens 50 Zellen wurden in jedem biologischen Replikat gezählt). Mittelwert ± SD werden im Diagramm angezeigt. Ein ungepaarter zweiseitiger t-Test zwischen WT- und cdc6-1-Zellen wird durch **** (p < 0,0001) angezeigt. Abkürzungen: WT = Wildtyp; EdU = 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin; DIC = differentieller Störkontrast; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; A.U. = beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Name Genotyp Abbildungen und Tabellen
WT (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Abb.1, Abb.2A,B,C, Abb.3, Abb.4A,B,D, Supp Abb.1,2,3 Tabellen2,3
cdc6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Abb.2A,B,D, Abb.4 C,D, Supp Abb.1, Tabellen2,3
TK+ (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Supp Abb.4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Abb.4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Supp Abb.4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Abb.4
W303-1A (E001): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Supp Abb.4

Tabelle 1: Liste der in dieser Studie verwendeten Stämme.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Verdopplungszeit (min) 120 90 118 123
SD ± 13 Minuten ± 3 Min. ± 10 min ± 6 Minuten

Tabelle 2: Mittlere Verdopplungszeiten von WT- und cdc6-1-Stämmen , die bei 25 °C und 28 °C angebaut werden. Die Verdopplungszeiten wurden aus drei biologischen Replikaten (vier technische Replikate für jede biologische Replikate) nach folgender Formel berechnet: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), wobei Cf und Ci der End- bzw. Anfangszellkonzentration entsprechen und Δt der Minutendifferenz zwischen tf und ti entspricht, als Cf und Ci gemessen wurden. beziehungsweise.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Prozent Dauer
(min)		 Prozent Dauer
(min)		 Prozent Dauer
(min)		 Prozent Dauer
(min)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Tabelle 3: Mittlere Zellanteile und Dauer der Phasen G 1, S und G2 + M in WT- und cdc6-1-Zellen, die bei 25 °C und 28 °C gezüchtet wurden. Die Zellanteile wurden aus drei biologischen Replikaten (zwei technische Replikate für jedes biologische Replikat) bestimmt. Die Unterschiede in derG1-, S- undG2+M-Dauer zwischen den WT- und cdc6-1-Zellen, die bei 28 °C gezüchtet wurden, waren statistisch signifikant (ungepaarter zweiseitiger t-Test, p < 0,1).

Ergänzende Abbildung S1: Anteil der Zellen in der frühen und späten S-Phase in WT- und cdc6-1-Zellen , die bei 28 °C gezüchtet wurden. Zwei identische Polygone namens S1 und S2 für die frühe bzw. späte S-Phase wurden in den Anteil der EdU-positiven Zellen gezeichnet, um ihn in zwei Hälften auf den bivariaten EdU-PI-FACS-Analysen für (A) WT-Zellen zu teilen, die bei 28 °C und (B) cdc6-1-Zellen bei 28 °C gezüchtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Zellzyklusverlauf von EdU-pulsmarkierten Zellen nach Freisetzung aus demG1-Arrest , visualisiert durch EdU-PI bivariate FACS. Ein Aliquot von Zellen wurde für 5 min mit 10 μM EdU alle 5 min nach der Freisetzung aus dem α-Faktor-Arrest bei 28 °C und bis 80 min, wie angegeben, pulsmarkiert. Abkürzungen: EdU = 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; PI = Propidiumiodid. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Zellzyklusverlauf von DMSO-behandelten Zellen nach Freisetzung aus demG1-Arrest , visualisiert durch EdU-PI bivariate FACS. Dies ist das gleiche wie in der ergänzenden Abbildung 2, aber die Zellen wurden für 5 min mit 1 μL DMSO (Dimethylsulfoxid) inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: BrdU- und EdU-Toxizität in TK hENT1-Hefezellen. Zellen des angegebenen Genotyps wurden in fünffachen seriellen Verdünnungen auf YPD-Platten mit steigenden BrdU- oder EdU-Konzentrationen entdeckt und 40 h bei 30 °C gezüchtet. Abkürzungen: DMSO = Dimethylsulfoxid; BrdU = Bromdesoxyuridin; Edu = 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin; TK = Thymidinkinase; hENT1 = humaner equilibrativer Nukleosidtransporter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Hefe ist ein erstklassiger Modellorganismus für Zellzyklusstudien, aber die Charakterisierung seiner S-Phase wurde lange Zeit durch seine Unfähigkeit behindert, exogene Nukleoside wie BrdU aufzunehmen, die als Tracer der DNA-Replikation verwendet werden. Die Ausstattung der Hefe mit einer hohen Expression von Herpes-simplex-Thymidinkinase (TK) und die Zugabe eines humanen Nukleosidtransporters (hENT) hat dieses Problem weitgehend gelöst15,16. EdU ist vielseitiger als BrdU, da seine Detektion mit kleinen fluoreszierenden Azid- und Click-Chemikalien im Gegensatz zu Anti-BrdU-Antikörpern17 permeabilisierten Hefezellen und FACS-Analysen zugänglich ist. Hier haben wir die Bedingungen der EdU-Markierung und Detektion in diesem TK-hENT1-Stamm optimiert und gezeigt, dass bisher unentdeckte Replikationsdefekte mit diesem Protokoll durch FACS oder Mikroskopie quantifiziert werden können.

Die Untersuchung eines biologischen Mechanismus mit Werkzeugen, die denselben Mechanismus stören können, ist ein häufiges Problem in der Biologie. Da EdU eine bekannte zytotoxische Wirkung hat, suchten wir nach EdU-Konzentrationen, die bei chronischer Exposition gegenüber dem technisch hergestellten TK-hENT1-Stamm nicht toxisch sind, und fanden 10 μM als geeignete Dosis. TK-hENT1-Zellen vermehren sich nicht bei 25 μM EdU, während TK-alone- oder hENT1-alone-Zellen problemlos 100 μM EdU aushalten (ergänzende Abbildung S4). Obwohl Hefezellen wesentlich empfindlicher auf EdU reagieren als BrdU, fanden wir heraus, dass die Proliferation erst nach dem zweiten Zellzyklus nach der EdU-Exposition abnahm, was darauf hindeutet, dass es auf beiden Strängen eingebaut werden muss, um die Zellproliferation zu beeinflussen (Daten nicht gezeigt). Um auf der sicheren Seite zu bleiben, haben wir in diesem Protokoll 10 μM EdU mit nur kurzen Impulsen (3 min für die Mikroskopie; 5 min für FACS) verwendet und festgestellt, dass dies für eine gute Detektion mit diesem optimierten Protokoll geeignet ist.

Subtile Defekte in der DNA-Replikation können einen starken Einfluss auf die Umlagerung von Chromosomen haben4. Daher ist die Entwicklung von Techniken und Protokollen, die in der Lage sind, diese subtilen Defekte zu erkennen, der Schlüssel zur Aufdeckung der Ätiologie von Chromosomenaberrationen. Hier zeigen wir, dass dieses optimierte Protokoll der EdU-Inkorporation und Detektion eine bis zu dreifache Reduktion der Signalintensität messen kann (Abbildung 2 und Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass die Rate der DNA-Synthese in temperaturempfindlichen cdc6-1-Zellen reduziert ist, die bei 28 °C gezüchtet werden, die bisher keine Defekte auf Plattenlebensfähigkeitstests aufweisen (Abbildung 2A ). Dieses Protokoll der EdU-Inkorporation und -Quantifizierung kann daher verwendet werden, um andere Mutanten zu screenen, für die zunächst keine Replikationsfehler vermutet werden. Darüber hinaus kann es nützlich sein, mitotische DNA-Synthese (MiDAS), meiotische Rekombinations-abhängige DNA-Synthese oder andere langspurige DNA-Synthese nachzuweisen.

Ein Nachteil ist, dass die EdU-Detektion nur an festen Zellen durchgeführt werden kann, was eine Live-Analyse wie bei PCNA-GFP oder anderen fluoreszierenden Auslesungen der DNA-Replikation ausschließt, die selbst unter der hohen Phototoxizität der für die Bildgebung verwendeten Laserstrahlen leiden. Das Wachstum von Zellen in einem synthetischen Medium ist entscheidend für eine optimale Erkennung, da YPD-Überreste die Klickreaktion signifikant zu löschen scheinen. Interessanterweise ermöglicht die Aussonderung der S-Phasen-Zellen mittels bivariater EdU-PI-FACS-Analyse an synchronisierten Populationen die Schätzung der Dauer der S-Phase auf 20 min in Einzelzellen (Abbildung 3, ergänzende Abbildung S2 und ergänzende Abbildung S3). Doch selbst wenn die Synchronität nach α-Faktor-Freisetzung so nahezu perfekt erscheint wie in der klassischen Sytox Green FACS-Analyse (Abbildung 3A), wird aus der bivariaten EdU-PI-FACS-Analyse deutlich, dass Zellen relativ asynchron in die S-Phase eintreten (Abbildung 3B-I).

Hier beschreiben wir drei Methoden zur Bestimmung der S-Phasendauer mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie an synchronen und asynchronen Zellen sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene. Die durchschnittlichen S-Phasen-Dauern, die in asynchronen WT-Zellen auf Populationsebene bestimmt wurden, sind mit 29 min bzw. 31 min ähnlich, während unser synchronisierter einzelzellbasierter Ansatz zeigt, dass die Dauer bis zu 20 min betragen kann (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Tabelle 3 ). Die Diskrepanz zwischen diesen Werten ist überraschend, aber leicht erklärbar. Tatsächlich wurde mit unserem einzelzellbasierten Ansatz die S-Phasendauer basierend auf den frühesten Ereignissen bestimmt (d.h. die ersten Zellen, die in die S-Phase eintreten und sie verlassen, Abbildung 3C, G), aber es bedeutet nicht, dass die S-Phase in jeder Zelle innerhalb einer Population 20 Minuten dauert. Diese Daten würden die unerwartete Vorstellung unterstützen, dass es ein gewisses Maß an Heterogenität in der S-Phasendauer zwischen den Zellen gibt.

Verbesserte Protokolle oder neue Techniken können langjährige Dogmen oder neuartige Ideen stürzen. Es gibt drei, die diese Daten herausfordern. Erstens wird angenommen, dass die DNA-Synthese mit der Knospenentstehung in S. cerevisiae einhergeht. Abbildung 4A-C zeigt, dass die EdU-Färbung in unknospten und kleinknospigen Zellen trotz der 3-minütigen Markierungsverzögerung am stärksten ist, was darauf hindeutet, dass die S-Phase eindeutig vor der Knospung beginnt, wie zuvorgezeigt 16. Zweitens wird berichtet, dass Hefezellen keineG2-Phase haben, wobei sich mitotische Spindeln gleichzeitig mit der DNA-Synthese bilden. Die sehr kurzen Pulse in Kombination mit der empfindlichen EdU-Detektion mittels FACS (Abbildung 3, ergänzende Abbildung S2 und ergänzende Abbildung S3) oder Mikroskopie (Abbildung 4) ermöglichen es, genau zu bestimmen, wann die S-Phase in einzelnen Zellen beginnt und endet. Auf diese Weise stellten wir fest, dass die DNA-Synthese 40 Minuten nach der Freisetzung des α-Faktors endet (Abbildung 3, Ergänzende Abbildung S2 und Ergänzende Abbildung S3), während kurze mitotische Spindeln nur 20 Minuten später16 bilden (Daten nicht gezeigt). Wir schlussfolgern, dass Hefezellen eineG2-Phase haben. Drittens wurde kürzlich vorgeschlagen, dass bis zu 30% der Hefezellen die DNA-Synthese in Anaphase-Telophase18 abschließen. Mit diesem optimierten Protokoll haben wir keinen EdU-Einbau in Zellen mit einer Anaphase/Telophase-Spindel nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), aber wir können nicht ausschließen, dass diese zweite Welle der DNA-Synthese unterhalb der verwendeten Nachweisschwelle liegt. Angesichts des starken Signal-Rausch-Verhältnisses halten wir letztere Option für unwahrscheinlich.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken der Agence Nationale de la Recherche (ANR) und der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) für die PhD-Stipendien an J.d.D.B.T. und der Agence Nationale pour la Recherche (ANR) für die finanzielle Unterstützung (Stipendium ANR-18-CE12-0018-01). Zytometrie und Mikroskopie wurden in der Montpellier MRI BioCampus Bildgebungsanlage durchgeführt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

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References

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Biologie Ausgabe 188
Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
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Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

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